Estudio descriptivo mutacional de pacientes hemofílicos en la Región de Murcia.

Abstract

La Hemofilia se caracteriza por una deficiencia de la actividad de Factor VIII de la coagulación (Hemofilia A) o de Factor IX de la coagulación (Hemofilia B). La prevalencia estimada es de alrededor de 1 por 5000 varones nacidos (para Hemofilia A) y de 1 por 30000 varones nacidos (para Hemofilia B). La transmisión es como un rasgo recesivo ligado al cromosoma X (herencia ligada al sexo). La clínica se basa en la aparición de sangrados recurrentes, cuya intensidad y frecuencia están en estrecha relación con la severidad del defecto de la proteína FVIII o FIX. La complicación más temida actualmente en el tratamiento de la enfermedad es la aparición de aloanticuerpos contra el factor VIII/FIX administrado y que aparece más frecuentemente en las formas graves. El gen del FVIII (F8) se encuentra en la porción telomérica distal del brazo largo del cromosoma X, en la banda Xq28. Consta de 26 exones que se extienden a lo largo de unas 186.000 pares de bases. Las alteraciones genéticas en el gen del FVIII (F8) se pueden clasificar en: grandes reaordenamientos. Inserciones o deleciones, y sustituciones simples. La alteración recurrente más importante clínicamente es un reordenamiento que afecta al intrón 22 (inversión del intrón 22), afectando aproximadamente al 45% de todas las formas graves de Hemofilia A. El gen del FIX (F9) se encuentra localizado en la región telomérica del brazo largo del cromosoma X, en la banda Xq27, tiene un tamaño cercano a las 34 Kb y consta de 8 exones y 7 intrones. Las mutaciones en el gen F9 se pueden clasificar en: mutaciones puntuales, mutaciones hotspots, mutaciones que truncan la proteína y mutaciones que afectan a la región promotora. El grupo más frecuente de alteraciones es el de las mutaciones puntuales. El estudio de las portadoras de Hemofilia constituye una parte fundamental en el manejo de esta patología, tanto para hacer un adecuado asesoramiento genético como para prevenir posibles eventos hemorrágicos en esta población. Para el diagnóstico molecular de la Hemofilia existen dos tipos de metodologías: Técnicas indirectas y la secuenciación nucleotídica directa. Objetivo: El objetivo principal es estudiar las mutaciones que afectan a los pacientes hemofílicos de la Región de Murcia. Material y Método: Estudiamos a 73 pacientes de un total de 80 censados, con una mediana de edad de 26 años (rango 3-76 años). De las 53 familias no relacionadas censadas, estudiamos a 46. La dosificación de los factores VIII y IX se realizó en el laboratorio de Hemostasia del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, que cuenta con la acreditación de la norma 15189 por ENAC. Los afectados fueron distribuidos por familias no relacionadas, detectándose en cada una de ellas a las portadoras posibles y obligadas mediante la relación del árbol genealógico. El estudio genético se llevó a cabo tanto a los afectados como a las portadoras. Para Hemofilia A se estudió en primer lugar la presencia o ausencia de inversión del intrón 22 y del intrón 1 mediante PCR inversa. En los casos negativos se realizó secuenciación directa del gen F8. Para Hemofilia B se realizó secuenciación directa del gen F9 mediante PCR. Resultados: En nuestra región existen 80 pacientes hemofílicos vivos distribuidos en 53 familias. 65 (81,2%) tienen Hemofilia A y 15 (18,5%) Hemofilia B, con una mediana de edad de 28 años (1 mes-76 años). Existen 28 afectados con Hemofilia A grave, 7 con Hemofilia A moderada, 30 con Hemofilia A leve, 8 con Hemofilia B grave, 1 con Hemofilia B moderada y 6 con Hemofilia B leve. De los 73 pacientes estudiados (distribuidos en 46 familias) hemos encontrado la mutación causante de la enfermedad en todos ellos y se ha confirmado el estado de portadora mediante estudio genético en 102 casos de los 149 miembros femeninos de las distintas familias. El grupo de portadoras más numeroso corresponde al de edades entre 16 y 45 años. De las mutaciones encontradas en la población estudiada, las más frecuentes son las de tipo missense, seguidas por la inversión del intrón 22. Se han encontrado 11 mutaciones no descritas en los registros internacionales, correspondiendo la mayor parte a mutaciones de tipo missense. Existe una incidencia de casos sin antecedentes familiares del 52,2%, con predominio en los casos de HAG (28,3%). No se ha encontrado la alteración genética en la madre en 4 casos. Conclusiones: Se ha podido determinar la alteración genética causante de la Hemofilia en todos los pacientes estudiados, siendo el tipo de mutación más frecuente la missense. Existe un porcentaje importante de casos esporádicos, la mayoría con Hemofilia A grave, en los que se ha determinado los casos de portadoras y poder realizar un adecuado asesoramiento genético. La incidencia de inhibidores ha sido del 11%, algunos casos asociados a mutaciones no descritas en registros internacionales. Por otra parte, el algoritmo de estudio genético diseñado para este trabajo ha resultado efectivo.

Hemophilia is characterized by a deficiency in the activity of coagulation factor VIII (Hemophilia A) or coagulation Factor IX (Hemophilia B). The estimated prevalence is about 1 per 5000 male births (Hemophilia A) and 1 in 30,000 male births (for hemophilia B). The transmission as a recessive X-linked (sex-linked inheritance). The clinic is based on the occurrence of recurrent bleeding and the intensity and frequency are closely related to the severity of the defect protein. The most feared complication in the treatment of the disease is the occurrence of alloantibodies against factor VIII / FIX administered and most frequently occurring in severe forms. The F8 gene is in the distal portion of the long arm of chromosome X in the Xq28 band. Consists of 26 exons spanning along some 186,000 base pairs. Genetic alterations in the F8 gene can be classified as: Gross gene rearrangements. Insertions or deletions, and simple substitutions. The most important mutation is the recurrent rearrangement involving the intron 22 (intron 22 inversion), affecting approximately 45% of all severe forms of hemophilia A. The F9 gene is located at the telomeric region of the long arm of the X chromosome, on Xq27 band and has a size close to 34 kb and consists of 8 exons and 7 introns. Mutations in this gene can be classified into: point mutations, hotspots mutations, protein truncating mutations and promoter region mutations. The most common group of disorders is the point mutations. The study of carriers of Hemophilia is an essential part in the management of this condition, both for adequate genetic counseling and to prevent possible bleeding events in this population. For molecular diagnosis of haemophilia two types of methodologies: Indirect techniques and direct nucleotide sequencing Objective: The main objective is to study mutations affecting hemophiliacs patients in the Region of Murcia. Material and Methods: We studied 73 patients with a total of 80 census, with a median age of 26 years (range 3-76 years). Of the 53 unrelated families surveyed, we studied 46. The dosage of factor VIII and IX was held at the Hemostasis Laboratory University Hospital Virgen de la Arrixaca, with the accreditation of the standard 15189 by ENAC. These patients were distributed in unrelated families, detected in each of the carriers by performing the pedigree. The genetic study was conducted both affected and carriers. In Hemophilia A is first examined the presence or absence of intron 22 inversion and intron 1 inversion by inverse PCR. In negative cases direct sequencing was performed of F8 gene. Hemophilia B Direct sequencing was performed by PCR of F9 gene. Results: In our region there are 80 living hemophiliacs distributed in 53 families. 65 (81.2%) have Hemophilia A and 15 (18.5%) Hemophilia B, with a median age of 28 years (1 month-76 years). There are 28 affected with severe Hemophilia A, Hemophilia 7 with moderate, 30 with mild hemophilia A, 8 with severe haemophilia B, one with moderate Hemophilia B and 6 with mild Hemophilia B. Of the 73 patients studied (distributed in 46 families) have found the mutation in all of them and confirmed the carrier status by genetic study in 102 cases of the 149 female members of the different families. The largest carrier group corresponds to ages 16 and 45. Of the mutations found in the study population, the most common are missense, followed by the inversion of intron 22. We have found 11 mutations not described in the international records, being missense mutationts the most frequent. There is an incidence of cases with no family history of 52.2%, predominantly in severe Hemophilia A (28.3%). In four mother no genetic alteration was found. Conclusions: It was possible to determine the genetic alteration responsible for Hemophilia in all patients studied, being the most common type of the missense mutation. There is a significant percentage of sporadic cases, most with severe hemophilia A. In this cases, the carrier diagnosis is essential for an adequate genetic counseling. The incidence of inhibitors was 11%, some cases associated with mutations not described in international registrations. Moreover, genetic analysis algorithm designed for this work has been effective.