Estudio del proceso de sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR).

Abstract

INTRODUCCIÓN: La adquisición del fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células tumorales las convierte en resistentes a fármacos antineoplásicos y es una de las principales causas del fracaso de la quimioterapia en algunos tumores. La expresión de glicoproteína P (MDR-1, P-gp, ABCB1) contribuye a esta resistencia expulsando los fármacos o regulando la muerte celular programada. Por otro lado, la sobreexpresión de miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 observada en tumores sanguíneos se ha asociado a la resistencia a quimioterapia en varios cánceres humanos. También es importante estudiar alteraciones en las rutas de señalización de MAPKs y la secreción de citocinas en las células con fenotipo MDR. OBJETIVOS: El propósito de este trabajo fue encontrar un estímulo capaz de inducir sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo MDR, y caracterizar el tipo de muerte celular inducida. El segundo propósito fue estudiar la contribución de MDR-1, caspasas, proteínas de la familia Bcl-2, MAPKs y citocinas al proceso de sensibilidad colateral. MATERIALES Y MÉTODOS: Para alcanzar nuestros objetivos, usamos células leucémicas murinas L1210 y su sublínea celular resistente L1210R, así como una línea celular procedente de la línea L1210 transfectada con un plásmido que contenía el gen MDR-1 (CBMC-6). Se realizó western-blot para estudiar la expresión de proteínas, inhibición de MAPKs y caspasas y silenciamiento de ARN de MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 y Bax para estudiar el papel de estas proteínas. RESULTADOS: Se encontró que las células leucémicas resistentes con sobreexpresión de P-gp, pero no sus parentales sensibles, son hipersensibles a estrés hipotérmico produciéndose apoptosis a temperaturas por debajo de 4ºC. La transfección de la línea celular parental con un plásmido que contiene P-gp las convierte en sensibles a estrés hipotérmico, demostrando la asociación entre la expresión de P-gp y la muerte celular provocada por el frío. También observamos un incremento de la expresión basal y actividad del fragmento activo de caspasa 3 a temperatura fisiológica (37ºC) en las células MDR. La inhibición de caspasa 3 rescató parcialmente a las células leucémicas MDR de la apoptosis inducida por el frío, lo que sugiere que el mecanismo de muerte celular depende de caspasa 3. Esto demuestra que la expresión de P-gp juega un papel importante en la supervivencia de las células MDR y es acompañada por un proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico. Se observó que la línea parental leucémica (L1210) y la línea celular CBMC-6 presentan una alta expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL, mientras que la expresión de Bcl-2 es baja. Por el contrario, en las células L1210R se observó una disminución de la expresión de Bcl-xL y un aumento de Bcl-2. La inhibición de dirigida de proteínas anti-apoptóticas confirma que la expresión de Bcl-xL es un regulador clave de la supervivencia de las células leucémicas. En contraste, el silenciamiento de Bcl-2 muestra que la supervivencia de las células L1210R no depende del nivel de expresión de Bcl-2. Así, nuestros datos demuestran que la supervivencia de la línea celular parental depende de la expresión de Bcl-xL, pero la adquisición del fenotipo MDR elimina esta dependencia y podría depender de varios miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. Además, los resultados obtenidos en las células CBMC-6 demuestran que P-gp tiene poca influencia sobre las proteínas de la familia Bcl-2. Resultados similares se obtuvieron bajo condiciones de estrés hipotérmico y exposición al fármaco daunomicina. En relación a la ruta de señalización de MAPKs, demostramos su importancia en el desarrollo del fenotipo MDR, así como en el desarrollo de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico, demostrando que la inhibición de ERK y JNK puede proteger, parcialmente, de la muerte celular inducida por el frío en las células L1210R y CBMC-6. CONCLUSIONES: El proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico está asociado al fenotipo MDR en células murinas, y ocurre a través de un proceso de apoptosis dependiente de caspasas. La expresión y funcionalidad de MDR-1 está asociada a la sensibilidad a hipotermia en células murinas. El desarrollo del fenotipo MDR está acompañado de cambios en la expresión de proteínas Bcl-2, pero éstas no influyen en la sensibilidad colateral. La señalización a través de ERK y JNK está implicada en la sensibilidad colateral observada en las células MDR. La señalización a través de citocinas podría tener un papel importante en la respuesta a estrés de las células MDR.

INTRODUCTION: The acquisition of a multidrug-resistant (MDR) phenotype by tumor cells that renders them unsusceptible to anti-neoplasic agents is one of the main causes of chemotherapy failure in human malignancies. The increased expression of P-glycoprotein (MDR1, P-gp, ABCB1) in tumor cells contributes to drug resistance by extruding chemotherapeutic agents or by regulating programmed cell death. In the other hand, over-expression of anti-apoptotic Bcl-2 family members has been reported in hematologic malignancies and has been associated with chemotherapy resistance in various human cancers. As these findings, it is important to study alterations in MDR cells on MAPKs pathway and citokines secretion. OBJECTIVES: The aim of this work was to find a stimulus able to induce collateral sensitivity in murine and human leukemic MDR cells, and to characterize the type of death induced. The second aim was to study the contribution of MDR-1, caspases, family Bcl-2 proteins, MAPKs and citokines to this collateral sensitivity process. MATERIALS AND METHODS: To reach our objectives we used L1210 murine leukemia cells and its resistant derived cell line L1210R, as well as a transfected with a plasmid containing MDR-1 cell line obtained from L1210 (CBMC-6). It was used western-blot to study proteins expression, inhibition of MAPKs and caspases and RNAm silencing of MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 and Bax family to study the role of this proteins. RESULTS: It was found that resistant leukemic cells with P-gp over-expression, but not their sensitive counterparts, are hypersensitive to cold-induced cell death when exposed to temperatures below 4ºC. Transfection of parental cells with a P-gp-expressing plasmid makes these cells sensitive to cold stress, demonstrating an association between P-gp expression and cell death at low temperatures. Furthermore, we observed increased basal expression and activity of effector caspase-3 at physiological temperature (37ºC) in MDR cells. Treatment with a caspase-3 inhibitor partially rescues MDR leukemic cells from cold-induced apoptosis, which suggests that the cell death mechanism may require caspase-3 activity. Taken together, these findings demonstrate that P-gp expression plays a role in MDR cell survival, and is accompanied by a collateral sensitivity to cold stress. We demonstrate that parental leukemic (L1210) and CBMC-6 cells display high constitutive expression of anti-apoptotic Bcl-xL protein, while Bcl-2 protein expression was very low. By contrast, leukemic cells L1210R display a decrease of Bcl-xL and up-regulation of Bcl-2 protein expression levels. Furthermore, targeted inhibition of individual anti-apoptotic proteins by RNA silencing confirms that Bcl-xL expression is a key regulator of leukemic cells survival. In contrast, the silencing of Bcl-2 shows that L1210R survival doesn’t depend on Bcl-2 expression level. Together, our data demonstrate that parental leukemic cells survival are largely dependent on Bcl-xL protein expression, but acquisition of MDR phenotype by such cells abrogate such survival dependence and suggests that resistant cells became probably dependent on more than one anti-apoptotic protein for survival at physiological conditions. Additionally, the results obtained with CBMC-6 cells demonstrate that P-gp exert slight influence in the expression level of Bcl-2 family members. Similar results were obtained under cold stress and drug exposure. Related to MAPKs signaling pathway, we have addressed it importance in MDR phenotype development, as well as in hypothermia collateral sensitivity, showing that ERK and JNK inhibition can protect, partially, against stress-cold induced-death in L1210R and CBMC-6 cell lines. CONCLUSIONS: Collateral sensitivity to cold stress is associated to MDR phenotype in murine cells, and it occurs by a caspase-dependent apoptosis process in murine cells. Expression and functionality of MDR-1 is strongly associated to hypothermia sensitivity in murine cells. MDR phenotype development is accompanied by changes in Bcl-2 family proteins expression, but it is not shown an association with collateral sensitivity. ERK and JNK signaling pathways are implicated in collateral sensitivity process observed in MDR cells. Citokines signaling could play an important role on MDR cells stress response.