Caracterització de microRNAs d’interès en l’espècie porcina

Abstract

El descobriment dels microRNAs (miRNAS) com a nous reguladors de l’expressió gènica ha obert un nou camp en l’estudi de quin és el comportament d’aquests RNAs de mida petita i descriure en quins processos actuen i de quina manera regulen l’expressió gènica. L’aparició de les tècniques de seqüenciació massiva ha permès la descripció i estudi dels perfils d’expressió de miRNAs en diferents situacions, a fi d’observar la seva implicació en els processos biològics, tant fisiològics com patològics. Aquesta tesi exemplifica, mitjançant dues aproximacions diferents, l’ús d’aquestes tècniques per a la descripció, descobriment i estudi de perfils de miRNAs en l’espècie porcina. La primera part del treball es va dissenyar amb l’objectiu d’ampliar el nombre de miRNAs descrits en el porc. Les aproximacions utilitzades per a la determinació de nous miRNAs varen ser, primer de tot, la descripció del perfil d’expressió de miRNAs en el ronyó del porc, incloent els miRNAs ortòlegs i, segon, l’ús d’un protocol de descobriment i validació de nous miRNAs porcins. Una altra motivació del treball va ser el fet d’estudiar possibles canvis en l’expressió dels miRNAs en races de porc de diferents orígens, des de races europees fins a asiàtiques, incloent races europees amb influència asiàtica, on hem descrit miRNAs diferencialment expressats i s’ha estudiat la seva possible funcionalitat. En la segona part del treball es va dur a terme una infecció experimental amb el virus de la malaltia d’Aujeszky (ADV), l’herpesvirus porcí tipus 1 (SHV-1), amb una soca virulenta (NIA-3) i una soca vacunal (Begonia). Es varen realitzar dues aproximacions diferents: un aproximació in vitro utilitzant les línies cel·lulars PK-15 derivades del ronyó de porc, i una aproximació d’infecció experimental in vivo utilitzant el bulb olfactori i el gangli trigemin com a teixits diana per l’estudi. Amb l’objectiu d’estudiar la implicació dels miRNAs, tant virals com de l’hoste, en les interaccions hoste – patogen durant una infecció vírica, s’han descrit els perfils de miRNAs i s’han avaluat les diferències en la seva expressió, no només entre el grup infectat i el grup control, sinó també entre les soques utilitzades i entre les dues aproximacions. També s’han descrit nous miRNAs virals que s’expressen durant la infecció. Finalment, s’ha elaborat, amb estudis funcionals in silico, una xarxa d’interaccions entre els miRNAs virals, els miRNAs de l’hoste diferencialment expressats i els gens que codifica l’agent infecciós SHV-1. Donada la importància de la tècnica de l’RT-qPCR per a la validació de l’expressió de miRNAs, també s’ha realitzat un estudi addicional per avaluar l’estabilitat en l’expressió d’alguns miRNAs per a poder ser utilitzats com a gens de referència en estudis de quantificació relativa de dades d’RT-qPCR, ja que fins l’actualitat s’han fet servir poc per a aquest propòsit.

The discovery of microRNAs (miRNAs) as novel gene expression regulators has opened a new field in the study of the roles of these small RNAs, as well as on describing in what processes they act and how they regulate gene expression. The emergence of next generation sequencing methods has allowed the description and study of miRNA expression profiles in different situations, in order to observe its involvement in biological processes, both physiological and pathological. This thesis illustrates, through two different approaches, the use of these techniques for the description, discovery and study of miRNA profiles in the porcine species. The first part of the study was designed with the aim of increasing the number of described miRNAs in pigs. The approaches used for the determination of novel miRNAs were, first of all, the expression profiling of miRNAs in the swine kidney, including the orthologous ones and, second, using a pipeline for the discovery and validation of new porcine miRNAs. Another motivation of this work was to study the possible changes in the kidney miRNAs expression patterns among pig breeds from different origins, from European to Asian breeds, including European breeds with Asian influences. In this sense, differentially expressed miRNAs have been described and their functional roles have been studied. In the second part of the study, an experimental infection with Aujeszky's disease virus (ADV), also known as suid herpesvirus type 1 (SHV-1), was carried out, using a virulent strain (NIA-3) and a vaccine strain (Begonia). Two different approaches were conducted: an in vitro approach using PK-15 cell lines, derived from pig kidney, and an in vivo approach using the olfactory bulb and trigeminal ganglia as target tissues. With the aim of studying the role of both host and viral miRNAs in host – pathogen interactions during SHV-1 infection, miRNAs expression profiles have been described and their expression differences evaluated, not only between infected and mock-infected groups, but also between strains and between the two performed approaches. New viral miRNAs have been described and their expression during the infection has been confirmed. Finally, a network of interactions between viral miRNAs, host differentially expressed miRNAs and SHV-1 encoded genes was developed using in silico functional studies. Given the importance of RT-qPCR method for validating the expression of miRNAs, we also performed an additional study to assess the expression stability of some miRNAs to be used as reference genes in relative quantification studies of RT-qPCR data, which they have not been widely used for this purpose.