Role of connexin 43 in ischemia-reperfusion injury: Effect of genetic connexin 43 manipulation on myocardial cell death and arrhythmias

Author

Sánchez García, Jose Antonio

Director

Rodríguez Sinovas, Antonio

García Dorado, D.

Vila, Elisabet

Date of defense

2013-03-18

ISBN

9788449036781

Legal Deposit

B-17831-2013

Pages

189 p.



Department/Institute

Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Farmacologia, de Terapèutica i de Toxicologia

Abstract

El daño miocárdico por isquemia-reperfusión es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad. La reperfusión es el tratamiento de elección en pacientes con infarto de miocardio. Sin embargo, ésta ocasiona un daño adicional por mecanismos provocados por la restauración del flujo, que puede ser prevenido, al menos en parte y en el escenario experimental, por sustancias aplicadas en el momento de la reperfusión. Una de las posibles dianas terapéuticas es la conexina 43 (Cx43) y los canales que forma (canales de gap junctions (GJ)). La Cx43 es la principal proteína que forma GJ en ventrículo miocárdico, donde es esencial permitiendo el acoplamiento químico y eléctrico entre cardiomiocitos. Sin embargo, se ha sugerido que las GJ participarían en la propagación del daño celular durante la reperfusión, y que la Cx43 estaría implicada en la señalización endógena de cardioprotección durante el precondicionamiento isquémico (IPC). No obstante, la mayoría de los estudios previos se han realizado usando agentes desacoplantes de GJ con baja especificidad y muchos efectos secundarios. Por ello, se han desarrollado modelos de ratones transgénicos deficientes de Cx43. Los objetivos de esta tesis fueron investigar los efectos de la deficiencia en Cx43 en el metabolismo energético del miocardio, en la tolerancia a la isquemia-reperfusión y en la susceptibilidad al precondicionamiento isquémico y farmacológico, así como en la incidencia de arritmias ventriculares. Se usaron dos modelos transgénicos de ratones: el knock-in, en el que la Cx43 es reemplazada por Cx32, una isoforma con una conductancia y permeabilidad más baja; y el knock-out condicional para Cx43 (Cx43Cre-ER(T)/fl). En este modelo, los corazones de ratones Cx43Cre/fl expresan, en condiciones normales, la mitad del contenido de Cx43 observado en los correspondientes controles genéticos (Cx43fl/fl). Sin embargo, 14 días después de iniciar el tratamiento con tamoxifeno, los corazones de estos animales expresan solo un contenido residual de Cx43, inferior al 5%. Se observó que ambas estrategias genéticas de deficiencia de Cx43 alteran el metabolismo energético del miocardio, ya que mostraron niveles de ATP inferiores a los de los correspondientes controles genéticos. Experimentos en corazones aislados, perfundidos en un sistema Langenforff, demostraron una mayor tolerancia a la isquemia-reperfusión en corazones de ratones knock-in HOM y Cx43Cre/fl tratados con tamoxifeno, debido a una disminución del tamaño del infarto y una menor liberación de LDH. Este efecto pareció ser más dependiente de la comunicación por GJ en el modelo Cx43Cre-ER(T)/fl. Además, la protección por IPC, y especialmente la del diazóxido, desapareció en ambos modelos de deficiencia de Cx43. Se demostró que estos efectos fueron independientes de una activación diferente de las cascadas de señalización citosólicas RISK y SAFE, sugiriendo que la activación de estas vías durante el IPC es anterior a los efectos de la deficiencia de Cx43. Finalmente, se observó que ambos modelos de deficiencia de Cx43, simulando una reducción de la conductancia unitaria de las GJ y del número de canales GJ, respectivamente, están asociados a un aumento de la incidencia de taquiarritmias ventriculares, tanto espontáneas como inducidas, durante la isquemia-reperfusión. Este hecho hace que la posibilidad de translación de estas estrategias terapéuticas a la clínica requiera que sean aplicadas de manera muy localizada en el área en riesgo. Como conclusion, esta tesis demuestra un importante, y previamente desconocido, papel de la Cx43 en el metabolismo energético del miocardio, en la tolerancia al daño por isquemia-reperfusión y en la cardioprotección endógena. La Cx43 y las GJ pueden llegar a ser interesantes dianas terapéuticas para aumentar la supervivencia de los pacientes con cardiopatía isquémica, aunque la traslación debe esperar a que se resuelvan los efectos pro-arrítmicos de estos tratamientos.


Myocardial ischemia-reperfusion injury is one of the main causes of morbidity and mortality worldwide every year. Reperfusion is the treatment of choice in patients undergoing myocardial infarction in order to prevent cardiomyocyte death and improve patient’s survival and prognosis. However, reperfusion causes an additional injury, through mechanisms triggered by flow restoration, that can be prevented, at least in part and in the experimental setting, by drugs applied at the time of reperfusion. This fact has led to an intense research in order to identify therapeutic strategies able to limit myocardial infarction when applied at the time of reperfusion. One of the candidate targets is Connexin 43 (Cx43), and the channels that it forms (i.e, gap junction (GJ) channels). Cx43 is the main protein forming GJ in the ventricular myocardium, where it plays an essential role in electrical and chemical coupling between cardiomyocytes. However, previous studies have suggested that GJ play also a role in spreading of cell death during reperfusion, and that Cx43 may be involved in endogenous cardioprotective signaling during ischemic preconditioning (IPC). However, most of these studies have been conducted using GJ uncouplers having low specificity and lots of side effects. This made necessary to find new strategies to study the role of Cx43 in cell death during myocardial infarction and cardioprotection, including the use of transgenic mice models. Thus, the aims of this thesis were to assess the effects of Cx43 deficiency in isolated hearts from transgenic models on cardiac energetic metabolism, tolerance to ischemia-reperfusion injury, susceptibility to ischemic and pharmacological preconditioning, and on the incidence of ventricular arrhythmias. We used a knock-in mice model, in which Cx43 is replaced by Cx32, a connexin with lower conductivity and permeability, and a conditional knock-out model of Cx43 deficiency (Cx43Cre-ER(T)/fl). In this last model, isolated hearts from Cx43Cre/fl animals express, under normal conditions, half of the Cx43 content seen in their corresponding genetic controls (Cx43fl/fl). However, 14 days after tamoxifen treatment, hearts from these animals have only a residual Cx43 content, lower than 5%. We found that both genetic strategies alter myocardial energetic metabolism, with hearts from these mice having reduced ATP levels as compared with hearts from the corresponding genetic controls. Furthermore, isolated, Langendorff-perfused, hearts from homozygous (HOM) knock-in mice and from Cx43Cre/fl animals treated with tamoxifen, depicted an increased tolerance to ischemia-reperfusion injury, as denoted by a reduction in infarct size and in LDH release. In Cx43Cre/fl animals treated with tamoxifen, this effect seems to be more dependent on GJ communication than in HOM knock-in mice. Moreover, susceptibility to IPC and especially to diazoxide protection was abolished in both models of Cx43 deficiency. Furthermore, we have demonstrated that these effects were independent of a differential activation of cytosolic signaling cascades, including the RISK and SAFE pathways, which is suggestive that activation of these pathways during IPC is upstream of Cx43 deficiency. Finally, we have demonstrated that both models of Cx43 deficiency, mimicking a reduction in unitary GJ conductance and in the number of GJ channels, respectively, are associated with an increased incidence of both spontaneous and induced ventricular tachyarrhythmias. This finding indicates that the possibility of translation of these therapeutic strategies to the clinical arena requires that they could be applied locally at the area at risk. In conclusion, this thesis demonstrates an important, and previously unknown, specific role of Cx43 in myocardial energetic metabolism, tolerance to ischemia-reperfusion injury and in endogenous cardioprotection. GJ and Cx43 can become interesting pharmacological targets to improve the clinical outcome in patients with ischemic heart disease. However, translation should wait until the proarrhythmic effects of these treatments are solved.

Keywords

Connexin 43; Ischemia-Reperfusion; Arrhythimias

Subjects

616.1 - Pathology of the circulatory system, blood vessels. Cardiovascular complaints

Knowledge Area

Ciències de la Salut

Documents

jasg1de1.pdf

3.330Mb

 

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