A) INTRODUCCIÓ:

Membres de la superfamilía de TGF-β regulen una varietat de processos biològics, com inhibició del creixement, diferenciació, formació del patró embriònic i inducció d'apoptosi. Aquest lligants secretats s'uneixen i activen uns receptors serin/threonin quinasa tipus I i II. Aquests receptors activats fosforilen i activen unes proteïnes SMADs intracel·lulars, les quals transloquen a nucli regulant l'exprressió de gens diana. A més, al TGF-beta se li ha atribuit un paper com a factor proangiogènic "in vivo". "In vitro", s'ha observat que TGF-beta inhibeix la proliferació de les cèl·lules endotelials en cultius de dues dimensions, però que indueix la formació de capilars quan les cèl·lules endotelials es cultiven en tres dimensions dins de gels de col·làgen.

A partir de cèl·lules endotelials cultivades en tres dimensions es va generar una col·lecció de cDNAs, en absència (condicions basals) o en presència de TGF durant un tractament de 4 hores. Posteriorment, aquests gens es van seqüenciar i analitzar per Northern Blot en cèl·lules endotelials en condicions basals i tractades amb TGF-β. Mitjançant aquesta tècnica es va aconseguir aïllar gens induïts o reprimits per TGF-β. Entre aquests gens induïts es va trobar la F-box28.

Una de les vies de degradació de proteïnes més comú és la via de la ubiquitina/proteasoma. Aquesta via està formada per tres enzims: l'E1, que és l'encarregat d'activar les molècules d'ubiquitina; l'E2, que és l'enzim conjugador de les molècules d'ubiquitina;, i les E3 ubiquitines lligases, la funció principal de les quals és la de reconèixer el substrat específic que serà ubiquitinat, i degradat posteriorment pel complexe del proteasoma. Dins de la família d'E3 ubiquitines lligases trobem el complex tipus SCF. Aquest complex proteic està format per quatre subunitats molt ben conservades: Cul1, Rbx1, Skp1 y una proteïna F-box. Rbx1 y Cul1 formen un centro catalític que participa en el reclutament d'E2. La proteïna F-box és qui reconeix específicament el substrat diana i l'uneix. Finalment, Skp1, és una proteïna adaptadora, la funció de la qual és la de unir la F-box a Cul1.

En aquest treball, ens hem plantejat l'estudi d'una nova E3 ubiquitina lligasa, la F-box28, que es va identificar en un primer moment com un gen estimulat per TGF-β1 en cèl·lules endotelials 1G11. Aquest treball planteja la caracterizació d'aquesta proteïna, així com la identificació de la seva funció en relació a l'acció de TGF-β.

B) OBJECTIUS

1) Estudi de l'expressió d'F-box28 i la seva localització cel·lular.
2) Estudi de la F-box28 com a E3 ubiquitina lligasa, de la seva regulació i de la seva vida mitja.
3) Estudi de les possibles funcions d'F-box28 i la seva implicació en la regulació del cicle cel·lular.
4) Estudi dels possibles substrats candidats de la F-box28.

C) RESULTATS

1) La proteïna identificada per PCR-substractiva com a F-box28 és una nova proteïna que pertany al complex E3 ubiquitina lligasa tipus SCF, ja que hem vist que interacciona con les proteïnes Cul1 y Skp1.

2) La F-box28 presenta una expressió baixa en estat basal i la seva expressió és induïda pel factor TGF-β1, a nivell d'mRNA i de proteïna, en cèl·lules endotelials 1G11 i en cèl·lules HeLa.

3) La F-box28 és una proteïna de localització nuclear gràcies a una seqüència NLS en el seu extrem C-terminal.

4) La F-box28 és una proteïna inestable de 4-5 hores de vida mitja que és regulada a través del proteasoma.

5) La sobreexpressió d'F-box28 en cèl·lules HeLa causa una parada parcial en la fase G1 del cicle cel·lular. Aquest efecte requereix la seva localització nuclear i podria ser mediat per la seva interacció amb la ciclina A i la disminució dels nivells d'aquesta.