Identificació de noves dianes terapèutiques i miRNAs implicats en la resistència al metotrexat mitjançant genòmica funcional

Author

Mencía Trinchant, Núria

Director

Ciudad i Gómez, Carlos Julián

Noé Mata, Verónica

Date of defense

2013-04-30

Legal Deposit

B. 14345-2013

Pages

230 p.



Department/Institute

Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

Abstract

Una de les accepcions de la farmacogenòmica es l'estudi dels efectes d'un tractament farmacològic sobre els nivells d'expressió gènica. Aquesta estratègia inclou la identificació de les variacions de gens individuals, l'avaluació de les interaccions entre els seus productes i la caracterització dels fenotips derivats de la resposta al fàrmac El metotrexat (MTX) és un fàrmac inhibidor de l'enzim dihidrofolat reductasa (DHFR) utilitzat en el tractament del càncer. El treball presentat en aquesta memòria es troba emmarcat dins de l'estudi de l'expressió gènica diferencial derivada de la resistència al MTX i pretén identificar aquells canvis adaptatius que tenen lloc en les cèl•lules sota tractaments perllongats amb el MTX. Alguns d’aquests gens diferencialment expressats poden contribuir a la resistència al fàrmac. Així doncs, s'identifica el gen S100A4 com a diana diferencialment expressada en 5 de les 7 línies cel•lulars resistents a MTX estudiades, i en cèl•lules de càncer de còlon HT-29, la via de Wnt sembla ser la responsable d’aquesta sobrexpressió. També en cèl•lules HT-29, la disminució dels nivells de proteïna S100A4 contribueix a augmentar la sensibilitat cap al MTX, fet que evidencia el paper important de la sobrexpressió de S100A4 en la resistència al MTX. En els últims anys s'ha descobert que les seqüències codificants representen només el 2% de tot el genoma i que la major part és transcrita com a molècules de RNA que no codifiquen per cap proteïna. Això implica que el que abans es considerava com a "junk DNA", en realitat és transcrit donant molècules de RNA reguladores de múltiples processos cel•lulars. Un dels tipus de RNAs no codificants més estudiats són els microRNAs (miRNAs). Actualment hi ha una extensa quantitat d'informació que descriu un clar paper dels miRNAs en tots els passos del desenvolupament del càncer, així com altres malalties. També s'estudia el paper dels microRNAs (miRNAs) en la resistència al MTX en cèl•lules de càncer de còlon. Els resultats presentats identifiquen el miR-224 i els seus gens diana, SLC4A4, CDS2 i HSPC159 com a dianes importants en la resistència al MTX en càncer de còlon. La reducció dels nivells del miR-224, acompanyada de l’augment dels seus gens diana CDS2, HSPC159 i SLC4A4, comporta una insensibilització cap al MTX, de manera que s’afavoreix la resistència al fàrmac. A més, es presenten altres miRNAs identificats com a sobrexpressats en la mateixa línia cel•lular de càncer de còlon (miR-149, miR-193b, miR-210, miR-27b, miR-320, miR-361-5p, miR-365, miR-455-3p i miR-615-3p) i s'identifiquen els gens diana putatius per a cadascun d'aquests miRNAs. La identificació dels gens diana per un determinat miRNA es realitza mitjançant algoritmes bioinformàtics que requereixen validació experimental. La interacció d’un miRNA amb el seu gen diana s’acostuma a estudiar mitjançant la co-transfecció del miRNA amb un vector reporter que contingui la regió 3’-UTR del gen. Tot i que aquest mètode suggereix una interacció física i funcional, no prova la interacció del miRNA amb el seu gen diana de forma directa. Finalment, es presenten resultats que demostren que els assajos de canvi de la mobilitat electroforètica (EMSA) constitueixen un mètode alternatiu per confirmar de manera directa i específica si un miRNA s’uneix o no al seu mRNA diana.


Pharmacogenomics study the effects of a drug on the expression levels of the genes. This strategy includes the identification of changes in individual genes, evaluating the interactions between their products and the characterization of phenotypes resulting from the response to the drug Methotrexate (MTX) is an inhibitor of the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) used in the treatment of cancer. The work presented in this report studies gene expression patterns derived from MTX resistance and seeks to identify the adaptive changes that occur in cells under prolonged treatment with MTX. Some of these differentially expressed genes may contribute to drug resistance. S100A4 was identified as a target gene overexpressed in 5 out of the 7 studied cell lines resistant to MTX. In HT-29 colon cancer cells, the Wnt signaling pathway appears to be responsible this overexpression. Also in HT-29 cells, S100A4 reduced protein levels contribute to increased sensitivity to MTX, which shows the important role of S100A4 overexpression on MTX resistance. MiRNAs are small non-coding RNAs that negatively regulate gene expression. There is an extensive amount of information that clearly describes the role of miRNAs in all stages of development of cancer as well as other diseases. It is also studied the role of microRNAs (miRNAs) in MTX resistance in colon cancer cells. The results presented identify the under expression of miR-224 and, therefore, the overexpression of its target genes, SLC4A4, and HSPC159 CDS2 as important targets for MTX resistance in colon cancer cells. The reduced levels of miR-224, accompanied by the increase of its target genes CDS2, HSPC159 and SLC4A4 lead to a desensitization toward MTX, which favors the drug resistance. Furthermore, the results identify a group of overexpressed miRNAs in the same colon cancer cell line (miR-149, miR-193b, miR-210, miR-27b, miR-320, miR-361-5p, miR -365, miR-455-3p and miR-615-3p) and the putative target genes for each of these miRNAs are predicted. Finally, we present results of tests showing that electrophoretic mobility shift (EMSA) are an alternative method to confirm directly and specifically whether or not miRNA binds to its mRNA target.

Keywords

Càncer; Cáncer; Cancer; Quimioteràpia; Quimioterapia; Chemotherapy; mRNAs

Subjects

577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Knowledge Area

Ciències de la Salut

Documents

NMT_TESI.pdf

23.92Mb

 

Rights

ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

This item appears in the following Collection(s)