Analysis of Ly-6Chigh CD1lb+ monocytes generated in vitro iniflammatory animal models / Análisis de monocitos Ly-6Chigh CD11b+ generados in vitro en modelos animales de inflamación

Abstract

a. Introduction

The immune system must detect a wide variety of agents, from viruses to parasitic worms, and distinguish them from the organism's own healthy tissue. However, the immune system needs to be well regulated since a disorder in an immune response can result in autoimmune diseases, tissue destruction, inflammatory diseases and cancer.

Within the context of innate immunity, the mononuclear phagocyte system, cells comprising bone marrow progenitors, blood monocytes and tissue macrophages is acquiring great importance in the study of different pathologies and particularly the monocytes/macrophage functions. In this regard, recent studies demonstrate that monocytes present a heterogeneous population of innate cells.

Monocyte was found leading to distinct cell populations with various subtypes with distinct functions. Two types of monocytes were identified in mice. Resident monocytes, with a CD11b+CCR2lowLy-6ClowCX3CR1high phenotype, migrate to uninjured tissues after emigration from bone marrow and differentiate into resident macrophages and dendritic cells. In contrast, a distinct inflamed monocyte subset with a CD11b+CCR2highLy-6ChighCX3CR1low phenotype infiltrates infected tissue and contributes to the development of inflammation.

Currently, all studies performed with monocytes are done in transgenic models (i.e. CCR2-/-; GPF-CX3CR1 models) or with expensive techniques to study and acquire the maximum number of cell possible from mice blood. Monocytes constitute around 2% (100cells/μl) of the total peripheral blood leukocyte pool in mice, where only 1-5% are Ly-6Chigh monocytes. What makes difficult to study it.

b. Objective

1. Development of an in vitro model that allow the generation of large amounts of Ly-6Chigh monocytes from bone marrow from mice.

2. Characterization of the phenotype of Ly-6Chigh monocyte generated in vitro.

3. Analyze the activation function of Ly-6Chigh monocyte generated in vitro.

4. Study the migration of Ly-6Chigh monocytes in to two inflammation models:

- Skin (DNFB model)

- Muscle (Notexin muscle model)

5. Analyze the therapeutic effect of Ly-6ChighCD11b+ monocytes injection in the resolution of inflammation in two experimental models of inflammation.

c. Methodology and Results

To achieve the first aim of our work, bone marrow cells were cultured with different grows factors and FCS at 37ºC in a humidified 5% CO2 atmosphere for 7 days when the population of floating cells was obtained and stained with Ly-6C and CD11b markers. This population was sorted for the acquirement of the Ly-6ChighCD11b+ cells. In order to characterize the phenotype of these cells we stained them with several markers. Our results demonstrated that this Ly-6Chigh enriched population is CD11b+CD62L+CCR2+ F4/80+CX3CR1low, presenting the same phenotype of the cells presents in the blood. To study the functional heterogeneity of enriched Ly-6Chigh cells, these cells were incubated with IFN-γ as typical classical stimuli and IL-4 as an alternative pathway stimulus. Ly-6Chigh cells incubated with IFN induced the expression of TNF and NOS2 with a characterized kinetics similar to macrophages. However, these cells increased arginase-1 levels when were stimulated with IL-4. Thus, the in vitro results have shown the plasticity and heterogeneity of monocytes as previously described by macrophages and thus, suggests us that these cells can also adapt to changing microenvironments as previously described. Further, to observe the migration capacity and functionality of these cells in vivo, we optimized two experimental model of inflammation. In the first model an ear skin irritation with 1%DNFB was induced. In the second model, muscle inflammation was developed by the injection of Notexin in the tibialis anterioris. In both models inflammation was induced and Ly-6Chigh enriched cells stained with an infrared fluorocrome were injected intravenous in mice and migration was observed by in vivo image at different days. Migratory capacity of Ly-6C cells to the inflamed tissues was appreciated in both models, corroborating with data previously described. To analyze the therapeutic effect of Ly-6ChighCD11b+ monocytes injection in the resolution of inflammation, RNA and histology cuts were obtained from both models. The results showed that Ly-6Chigh-injected mice express higher levels of anti-inflammatory genes such as mannose receptor, which corroborate with the histological images where animals treated with Ly-6Chigh cells recover before of the inflammatory process that untreated animals.

d. Conclusion

1. We established a novel in vitro protocol to generate Ly-6ChighCD11b+ monocyte obtained from bone marrow of Balb/C mice.

2. The cells generated in vitro have the same phenotype of the Ly-6C from blood flow.

3. Cells Ly-6ChighCD11b+ monocyte present high plasticyty.

4. Ly-6ChighCD11b+ monocytes generated in vitro migrate in vivo.

5. Injection in acute and chronic in vivo inflammatory models of Ly-6ChighCD11b+ monocytes generated in vitro, display an improvement in the site of inflammation through the presentation of a more anti-inflammatory profile.

Monocitos circulantes proporcionan una defensa contra las infecciones y también a enfermedades autoinmunes. Recientemente dos tipos de monocitos fueran identificaron en la sangre periférica de ratones. El monocito ¿residente¿ con fenotipo CD11b+CCR2lowLy-6ClowCX3CR1high, que migran a tejidos no lesionados y se diferencian en macrófagos residentes y células dendríticas (DC). En contraste, un subconjunto distinto conocido como monocitos ¿inflamatorios¿, con un fenotipo CD11b+CCR2highLy-6ChighCX3CR1low son células que migran al tejido infectado y en lo cual contribuye al desarrollo de la inflamación. Monocitos Ly-6Chigh, el objetivo de nuestro trabajo, representan un 2-5% de los monocitos del torrente sanguínea de los ratones. Dado que estas células son de difícil obtención y que la cantidad obtenida de la sangre de ratones es muy baja, nuestro grupo desarrolló un nuevo sistema para generar monocitos Ly-6Chigh in vitro a partir de médula ósea de ratón, con el objetivo de estudiar sus funciones in vivo en dos modelos animales de inflamación. Nuestro laboratorio ha optimizado dos modelos animales capaces de inducir inflamación local en ratones Balb/c, inmunocompetentes. En el primer modelo, 1-fluoro-2 ,4-dinitrobenceno (DNFB) se aplicó tópicamente en la oreja derecha para crear en la piel condiciones que inducen la migración de estas células para el sitio de la irritación (modelo DNFB). En este modelo de piel, la inflamación en la oreja fue calculada atreves del peso neto, donde el peso de la oreja izquierda es restado del peso de la oreja derecha después de 24h y 48h de la inyección intravenosa (iv) de los monocitos Ly-6ChighCD11b+ en los ratones. En el segundo modelo, la inflamación es inducida atreves de la aplicación de una inyección de Notexin en el tibial anterior (TA) de la pierna derecha del animal la cual induce una inflamación muscular (modelo Notexin). Finalmente en ambos modelos, monocitos Ly-6ChighCD11b+ generados in vitro pre-tratados in vitro con citocinas pro- o anti-inflamatoria (IFN-¿ o IL-4) o no tratados, fueran inyectados iv en la colas de los ratones. Por otra parte, expresión génica fue medida mediante PCR cuantitativa en tiempo real, la migración celular fue evaluada in vivo atreves de imágenes realizadas por el equipo de IVIS, estudios de citometría de flujo y ensayos de histología también fueran realizados para evaluar la función de las células Ly-6Chigh en el sitio de inflamación. El principal objetivo de nuestro estudio es: 1. Desarrollo de un modelo in vitro que permita generar grandes cantidades de monocitos Ly-6Chigh a partir de médula ósea de ratones. 2. Caracterización del fenotipo de los monocitos Ly-6Chigh generados in vitro. 3. Analizar funciones de los monocitos Ly-6Chigh generados in vitro tras su activación in vitro. 4. Estudio de la capacidad migratoria de los monocitos Ly-6Chigh generados in vitro en dos modelos de inflamación. - Piel (modelo de DNFB en oreja). - Músculo (modelo Notexin muscular). 5. Analizar el efecto terapéutico de la inyección de monocitos Ly-6Chigh generados in vitro en la resolución de la inflamación en dos modelos experimentales de inflamación. En ambos modelos animales la inflamación local aumentó en función del número de monocitos Ly-6Chigh inyectados. Migración celular fue analizada por imágenes in vivo en ambos modelos, donde células Ly-6Chigh generated in vitro fluorescentes estaban presentes apenas en el tejido inflamado. Análisis de hematoxilina y eosina en cortes histológicos demostraron una mejoría del tejido de los animales tratados con monocitos Ly6Chigh. En resumen, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral revelar un nuevo método para generar in vitro Ly-6Chigh monocitos de médula ósea de ratones, con una mejora en la eficiencia de la producción celular, que facilitan el estudio de estas células in vitro e in vivo. Además, también han demostrado la capacidad de las células Ly-6Chigh para cambiar el fenotipo de la estimulación in vitro verdadera y la capacidad de migrar, así como la heterogeneidad funcional en dos modelos de inflamación in vivo, lo que indica que estas células accionar de la misma manera como se las células proveniente de la sangre periférica. Además, hemos demostrado que Ly-6Chigh monocitos pueden ser pre-tratados con citoquinas en orther para retrasar o aumentar la reparación de tejidos (IFN-¿ o IL-4), respectivamente Todos estos resultados juntos sugieren que los monocitos Ly-6Chigh generado por nosotros in vitro son células funcionales que se pueden utilizar como una herramienta terapéutica para tratar enfermedades inflamatorias.