Patrón de expresión de tres genes como marcador de predicción pronóstica en neuroblastoma. Mecanismos de regulación transcripcional y función de los genes seleccionados”

Abstract

El neuroblastoma (NB) agrupa un espectro muy heterogéneo de tumores que evolucionan de forma radicalmente distinta. La variedad de comportamiento clínico del NB determina el enfoque terapéutico, que puede variar entre un abordaje terapéutico intensivo multimodal o una actitud expectante. Por lo tanto, la clasificación precisa de los diferentes subtipos de NB es importante para determinar el tratamiento más apropiado. Actualmente los sistemas de clasificación de riesgo clínico en NB se basan en distintos parámetros clínicos, biológicos y morfológicos. No obstante, todavía existen casos donde estos sistemas de clasificación muestran una utilidad clínica limitada.

Existen perfiles de expresión génica que definen el comportamiento biológico de cada subgrupo de NB y que permiten predecir el pronóstico de los pacientes. Sin embargo, las listas de genes son demasiado extensas para poder implementarlas en la rutina clínica. En esta tesis, hemos desarrollado un modelo estadístico de predicción de pronóstico basado en la combinación lineal de los niveles de expresión de tres genes, CHD5, NME1 y PAFAH1B1, diferencialmente expresados en subgrupos de NB con comportamiento clínico distinto y asociados de forma estadísticamente significativa con la evolución clínica del paciente. Su potencial predictivo ha sido validado utilizando datos de expresión obtenidos experimentalmente mediante qRT-PCR y de dos bases de datos públicas de microarrays de expresión. En todas las cohortes analizadas el modelo muestra una excelente capacidad para clasificar a los pacientes con una evolución clínica distinta. Los distintos análisis multivariantes ha identificado el modelo como un marcador de predicción de pronóstico independiente a los marcadores actualmente aceptados para NB. En conclusión, se ha desarrollado un modelo estadístico de predicción de pronóstico basado en una técnica convencional (qRT-PCR), que podría ayudar a refinar los actuales sistemas de estratificación de riesgo clínico en NB.

Uno de los genes incluidos en este modelo, CHD5, es un potencial gen supresor de tumores localizado en la región cromosómica 1p36.31, recurrentemente perdida en NB. Estudios previos han identificado que CHD5 se expresa en tejidos neurales normales y en NB de bajo riesgo clínico. Nosotros hemos descrito por primera vez el perfil inmunofenotípico de CHD5. En tejidos neurales normales se identificó expresión nuclear en células de estirpe neuronal mientras que las células gliales mostraron ausencia de tinción. La caracterización en los tumores neuroblásticos (TN) ha identificado la expresión proteica circunscrita al núcleo de las células neuroblásticas en diferenciación y de las células ganglionares, y ausente en los neuroblastos indiferenciados y las células de tipo Schawnn. En los TN, la tinción nuclear muestra una correlación estadísticamente significativa con una evolución clínica más favorable de los pacientes. Sugiriendo que la tinción inmunohistoquímica de CHD5 podría representar un marcador útil para refinar los actuales sistemas de determinación del pronóstico en NB. El análisis de la expresión de este gen en muestras apareadas de NB obtenidas al diagnóstico y post-tratamiento, también sugiere podría representar un marcador inmunohistoquímico clínicamente útil para una identificación rápida de pacientes que no se benefician del tratamiento convencional ya que actualmente en NB no existe ningún biomarcador de respuesta a tratamiento.

Las modificaciones epigenéticas representan uno de los principales mecanismos de modulación de la expresión génica. Alteraciones en estos mecanismos, como la alteración del patrón de metilación del ADN, podrían estar implicadas en las variaciones de expresión génica identificadas entre subgrupos de NB. En NB se han identificado numerosos genes que sufren hipermetilación así como la asociación entre subgrupos clínicos de riesgo y genes hipermetilados. Sin embargo el patrón global de metilación del NB es aún considerablemente desconocido. Mediante microarrays hemos realizado un análisis global del estado de metilación del genoma del NB que nos ha permitido identificar patrones de metilación específicos del NB, así como patrones distintivos entre subgrupos clínicos y biológicos de NB. Nuestras observaciones muestran como el ADN del NB se ve afectado por una elevada disminución de los niveles de metilación. Dicha hipometilación es gen-específica y afecta a funciones biológicas relacionadas con cáncer así como a genes relevantes para la patogénesis del NB como CCND1. Cabe destacar que la metilación diferencial de CCND1 afecta principalmente a una región evolutivamente conservada y funcionalmente relevante localizada en 3’UTR, sugiriendo que la hipometilación fuera de las regiones promotoras puede tener un papel en el desarrollo del NB. La hipermetilación afecta genes involucrados en el desarrollo celular y en la proliferación, como RASSF1A, POU2F2 o HOXD3 entre otros. Los resultados obtenidos proporcionan nuevos candidatos a biomarcadores epigenéticos asociados al NB, así como nuevos conocimientos sobre las bases moleculares de estos tumores.

Neuroblastoma (NB) is heterogeneous in terms of their biological, genetic and morphological characteristics and exhibit radically different outcomes. Since treatment strategies vary from a “watch and wait” approach to multimodal intensive regimens, precise risk assessment is critical for therapeutic decisions. Various combinations of prognostic markers have been used successfully for risk group distinction, yet there remain cases where these markers have demonstrated limited clinical utility.

Microarray gene studies have contributed to identify set of genes with prognostic importance in NB. However, it use in clinical practice is limited by the large sets of genes identified. We developed a PCR-based predictor model using the expression patterns of three genes (CHD5, NME1 and PAFAH1B1) associated with NB patient’s outcome. The validation process showed that our model could stratify patients into groups with markedly divergent clinical outcome. Multivariate analysis corroborated that the proposed model was an independent predictor marker for survival on NB patients. In conclusion, we propose a robust and technically simple PCR-based one score predictor model, which could help refine current stratification systems of clinical risk stratification of NB.

CHD5, one of the genes included on the predictor model, is a tumor suppressor gene located on chromosome 1p36.31, a region recurrently lost in high risk NB. Previous data showed a restricted gene expression to neuronal-derived tissues and in NB with low risk features. We have described for the first time the immunophenotypic profile of CHD5 in normal human neural tissues as well as primary neuroblastic tumors (NT). In TN, CHD5 immunoreactivity was found restricted to differentiating neuroblasts and absent in undifferentiated neuroblasts and stromal Schwann cells. A strong correlation of CHD5 expression with favorable clinical evolution was found. Our results suggest that CHD5 could represent an outcome marker in NB that can be tested by conventional immunohistochemistry.

Disruption of DNA methylation is a hallmark of human cancer. Several genes have been described as hypermethylated in NB and have been related to NB clinical risk groups and patient outcome. However, genome-wide DNA methylation patterns have not been extensively studied. Differential microarray-based DNA methylation analyses, allowed us to identify patterns characteristic for NB so as NB clinical and biological subtypes. We observed that gene-specific loss of DNA methylation is more prevalent than gene promoter hypermethylation. Remarkably, such hypomethylation affected cancer-related biological functions and genes relevant to NB pathogenesis as CCND1. In particular, CCND1 differential methylation affects mostly an evolutionary conserved functionally relevant 3’-UTR region, suggesting that hypomethylation outside promoter regions may play a role in NB pathogenesis. Hypermethylation targeted genes involved in cell development and proliferation such as RASSF1A, POU2F2 or HOXD3, among others. Our results provide new epigenetic biomarkers candidate associated with NB as well as insights into the molecular pathogenesis of this tumor.