Augment de l'eficàcia antitumoral d'adenovirus replicatius mitjançant l'expressió de hialuronidasa i proteïnes fusogéniques de membrana

Abstract

Els adenovirus oncolítics són una estratègia molt prometedora pel tractament del càncer, però l'augment de la seva potència i dispersió intratumoral és imprescindible per tal que aquests vectors presentin una eficàcia òptima pel seu ús en humans. Una estratègia molt prometedora per tal d'augmentar l'eficàcia dels adenovirus oncolítics és la inserció de transgens terapèutics en el genoma adenoviral. En aquest treball es presenta la generació i evaluació d'adenovirus oncolítcs armats amb dos transgens diferents: les glicoproteïnes fusogèniques de membrana (FMG) per una banda, i la hialuronidasa PH20 per l'altre. <br/><br/>Les FMG són altament citotoxiques per les cèl·lules tumorals degut a la seva capacitat de fusionar les cèl·lules en grans sincitis multinucleats. En aquest treball hem generat dos adenovirus fusogenics salvatges: l'AdwtRGD-F, que expressa la proteïna F del paramixovirus SV5 i l'AdwtRGD-GALV que expressa la proteïna de l'envolta del virus de la leucèmia de gibbó (GALV). L'expressió de la proteïna F pel virus AdwtRGD-F va resultar en la formació de sincitis petits, però la fusió induïda per la proteïna F no va ser capaç d'augmentar la potència de l'adenovirus AdwtRGD-F. En canvi, l'expressió de la proteïna GALV pel virus AdwtRGD-GALV va resultar en la formació de grans sincitis i en la millora de la potència citotòxica de l'adenovirus in vitro. A continuació, el gen de la glicoproteïna GALV va ser inclós en el genoma d'un adenovirus de replicació selectiva de tumor: l'ICOVIR5. Per tal d'insertar el gen de la glicoproteïna GALV en el genoma de l'ICOVIR5 sense afectar la capacitat d'encapcidació de l'adenovirus vam eliminar una part del genoma d'aquest virus (els ORFS 1,2 i 3 de la regió E4) per tal de generar l'ICOVIR9dE4. L'expressió de la glicoproteïna GALV per part de l'ICOVIR9dE4 va augmentar significativament la capacitat citotòxica del virus respecte l'ICOVIR5 in vitro. Tot i això, les diferents modificacions realitzades en l'ICOVIR9dE4 van resultar en una disminució de la producció viral i en una potència antitumoral in vivo molt similar a la presentada per l'ICOVIR5. A continuació, vam insertar el gen de la glicoproteïna GALV en el genoma de l'ICOVIR15 (un adenovirus oncolític molt similar a l'ICOVIR5 però amb un genoma més curt) per tal de generar l'ICOVIR16. La inserció del gen GALV en l'ICOVIR16 no va requerir l'eliminació de cap gen viral. In vitro, l'adenovirus fusogènic ICOVIR16 va presentar una elevada capacitat citotòxica i una producció viral similar a la de l'ICOVIR15. In vivo, l'administració d'ICOVIR16 (tan per via intratumoral com sistèmica) va controlar el creixement tumoral més eficientment que l'adenovirus control en tots els models tumorals analitzats. <br/><br/>Per una altra banda, per tal que l'adenovirus sigui capaç d'eliminar la totalitat de la massa tumoral es necessari que el virus sigui capaç de distribuir-se eficientment pel tumor. En aquest treball hem analitzat si l'eliminació de la matriu extracel·lular mitjançant l'enzim hialuronidasa facilita la dispersió d'adenovirus oncolítics. Primer vam demostrar que la coadministració intratumoral de hialuronidasa soluble i un adenovirus oncolític en tumors xenografts de ratolí millora l'activitat antitumoral de l'adenovirus oncolític en monoteràpia. A continuació, vam construir l'adenovirus AdwtRGD-PH20, un adenovirus salvatge que expressa una forma soluble de la hialuronidasa testicular PH20. L'administració de l'AdwtRGD-PH20 a ratolins amb tumors de melanoma humà va resultar en la degradació de l'àcid hialurònic present en el tumor, una millor distribució del virus per la massa tumoral i la regressió de tots els tumors tractats. Finalment, vam insertar el cDNA de la hialuronidasa PH20 en el genoma de l'adenovirus oncolític ICOVIR15 per generar l'adenovirus ICOVIR17. L'ICOVIR17 va demostrar una millor eficàcia i distribució antitumoral que l'ICOVIR15 després de ser administrat via intratumoral o sistèmica en ratolins amb tumors humans preestablerts. <br/><br/>Els resultats obtinguts en aquesta tesi indiquen que els adenovirus ICOVIR16 i ICOVIR17 són bons candidats per ser analitzats en assajos clínics de fase I.

<i>Oncolytic adenoviruses hold considerable promise for treating solid tumors, although the potency and spread of the virus needs improvement if its full clinical potential is to be realized. On the one hand, we tested here whether the insertion of the gene encoding the gibbon ape leukemia virus envelope (GALV) glycoprotein into the genome of a replication competent adenovirus is able to increase adenovirus potency. The GALV glycoprotein efficiently kills tumor cells by inducing fusion of neighboring cells to form multinucleated syncytia. The in vitro characterization of the fusogenic adenovirus (AdwtRGD-GALV) showed that this virus can induce massive syncytia formation, leading to a significantly increased tumor cytotoxicity compared with a nonfusogenic virus. Next, the GALV gene was inserted into an oncolytic adenovirus which selectively kills pRb pathway-defective tumor cells. The antitumoral activity of the oncolytic adenovirus expressing GALV (ICOVIR-16) was compared to that of the parental virus ICOVIR-15 in nude mice with pre-established human tumors. GALV expression greatly improved the antitumor efficacy of ICOVIR16. When injected directly to the tumor, ICOVIR16 induced tumor regression in 70% of treated tumors, whereas only 30% of tumors treated with ICOVIR15 regressed. When injected systemically, ICOVIR16 showed a greater reduction in tumor progression that was significant compared with the parental virus, ICOVIR15. On the other hand, we tested whether the expression of hyaluronidase, an enzyme which dissociates the extracellular matrix, could enhance the intratumoral distribution of an oncolytic adenovirus and improve its therapeutic activity. As a proof of concept, we demonstrated that intratumoral coadministration of hyaluronidase in nude mice bearing tumor xenografts improves the antitumor activity of an oncolytic adenovirus. Next, we constructed a replication competent adenovirus (AdwtRGD-PH20) and an oncolytic adenovirus (ICOVIR17) expressing a soluble form of the human sperm hyaluronidase (PH20). The antitumoral activity of both adenoviruses expressing PH20 was compared to that of the parental viruses AdwtRGD and ICOVIR-15. Both AdwtRGD-PH20 and ICOVIR-17 showed more antitumor efficacy following intratumoral administration in mice with pre-established tumors, along with an improved spread of the virus within the tumor mass. Importantly, a single intravenous dose of ICOVIR-17 induced tumor regression in 60% of treated tumors. Our results indicate that ICOVIR-16 and ICOVIR-17 are promising candidates for clinical testing. </I>