ANTECEDENTS

El coneixement de Ies diferents activitats de transport d'aminoàcids prové de l'anàlisi del transport d'aquests en cèl.lules o vesícules de membrana provinents del teixit que es vol analitzar. A causa de la presència escassa d'aquestes proteïnes en la membrana i també la seva baixa estabilitat, conèixer la proteïna responsable de la funció per una estratègia clàssica de purificació-reconstitució presenta moltes dificultats. A més, és possible que algunes entitats de transport estiguin formades per diferents polipèptids amb propietats fisicoquímiques diferents, i encara és més difícil poder arribar a tenir una fracció totalment pura del transportador analitzat. Davant d'aquestes dificultats, l'expressió funcional en oòcits de "Xenopus" representa una estratègia altemativa per a l'aïllament molecular de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids, sempre que les seves activitats siguin detectables en expressar-les en l'oòcit.

D'aquesta forma, el nostre grup va expressar activitat independent de Na+ de transport d'aminoàcids injectant en oòcits poli(A)+ de ronyó de conill. Aquesta activitat de transport era d'especificitat àmplia per a aminoàcids neutres i bàsics, i era saturable amb una K(m) al voltant de 0.6 mM. El missatger responsable d'aquesta activitat tenia una mida entre 1.8 i 2.4 kb (evidenciat per separació del poli(A)+ per mida en gradients de sacarosa i injecció de les diferents fraccions en l'oòcit). Amb aquestes evidències, el nostre grup, en col.laboració amb el grup del professor Heini Murer, va clonar per expressió funcional un cDNA que en expressar-se en oòcits induïa la mateixa activitat que es veia en injectar el poli(A)+ de ronyó. A més, l'activitat d'aquest poli(A)+ s'inhibia en incubar aquest amb un oligo antisentit generat a partir de la seqüència d'aquest cDNA. Aquesta proteïna es va anomenar rBAT ("related to b(0,+) amina acid transport activity"), ja que l'activitat que induïa en oòcits era molt similar a la descrita en blastòcits de ratoli (b(0,+) per Van Winkle. La diferencia que hi havia entre aquestes dues activitats era que rBAT també induïa transport de cistina. Independentment, dos grups diferents van clonar la mateixa proteïna de rata. El transport induït per rBAT en oòcits de "Xenopus" era saturable, amb K(m) per a aminoàcids bàsics i cistina entre 50-100 mil.limicres i variable per a aminoàcids neutres que depenen del grup radical: l'afinitat era més alta quan més gran era el grup radical. Així, a per aminoàcids com la L-leucina la K(m) era de l'ordre de mil.limicres, per a altres com ara la L-alanina, de l'ordre de mM i, finalment l'L-glicina no era transportada. Aquesta activitat de transport no és estereoselectiva, els D-aminoàcids es transporten d'igual forma que els L-aminoàcids.

Per tranferència Northem es va analitzar l'expressió de l'RNA missatger. En condicions d'alta astringència, el cDNA d'l'BAT hibrida amb transcrits de 2.2 i 3.8 kb presents en ronyó i mucosa intestinal. Aquestes diferències de mida es deuen a diferències en poliadenilació, fet que es va demostrar posteriorment en clonar-se el cDNA de 3.8 kb emprant també expressió funcional. En condicions de baixa astringència hi ha presència de senyal en cervell (3.8 i 5.4 kb) i en fetge (2.2 kb). Es pensa que deuen ser transcrits homòlegs però no idèntics, ja que no són protegits en un assaig de protecció a RNAases fent servir una sonda d'rBAT de rata. La seqüència d'aminoàcids deduïda a partir de la seqüència de nucleòtids permetia predir una proteïna de 677 aminoàcids amb un pes molecular de 78 kD. A partir de l'anàlisi d'hidrofobicitat i estudis fets amb sistemes de traducció "in Vitro" es va suggerir que la proteïna rBAT seria una glicoproteïna de membrana de tipus II (el domini N-terminal seria citosòlic) amb un únic domini transmembrana. El grup de S. Tate va estudiar més tard la topologia de la proteïna rBAT mitjançant anticossos policlonals dirigits contra diferents parts de la proteïna i, així, va deduir la presència de 4 dominis transmembrana, i que els extrems N i C-terminal són citosòlics. Aquest tipus d'estructura no era usual per als transportadors de membrana descrits fins a aquell moment, fet que va fer plantejar la qüestió de si aquesta proteïna era un transportador per si mateix, un activador de sistemes de transport endògens en l'oòcit, o si formava part d'un complex heterooligomèric amb proteïnes ja presents en l'oòcit.

En mirar el banc de dades de gens clonats, es va trobar que el domini extraceI.lular presentava una homologia alta amb una família d'enzims relacionats amb el catabolisme dels sucres. En canvi, la proteïna rBAT no presenta aquesta activitat, ja que presenta una mutació en un residu implicat en el centre actiu de reconeixement dels sucres. A més, es va trobar que rBAT presentava un 30% d'identitat i un 50% de similitud amb la cadena pesada de l'antigen 4F2 (4F2hc). L'antigen 4F2 (també anomenat CD98) és no heterodimer format per una proteïna glicosilada de 85 kD (4F2hc) que havia estat clonada fent servir l'anticòs monoclonal anti-eD98, unit covalentment per ponts disulfurs a una proteïna d'uns 40 kD altament hidrofòbica, no gIicosilada i que no s'havia pogut microseqüenciar. Es desconeixia la funció que tenia 4F2hc, només s'havia suggerit la seva implicació en el cicle cel.lular, ja que és un marcador de proliferació i també se l'havia implicat en la modulació dels nivells intracel.lulars de calci.

Sorprenentment, en injectar 4F2hc en l'oòcit, es va observar un increment d'una activitat de transport descrita per Rosa Devés com y(+)L en eritròcits. Aquesta activitat es caracteritza per una inducció de transport d'aminoàcids dibàsics de fomm independent de sodi i neutres de forma dependent de sodi. S'ha demostrat que l'efecte del sodi sobre el transport d'aminoàcids neutres consisteix en la reducció de l'afinitat en unes 50 vegades. La predicció d'estructura de 4F2hc deduïda a partir de la seqüència d'aminoàcids era la d'una proteïna amb un únic domini transmembrana, fet que va plantejar els mateixos dubtes que amb la proteïna rBAT respecte a quina era l'entitat molecular responsable del transport.

En analitzar en més detall la seqüència d'aminoàcids de les dues proteïnes es va observar que hi havia un residu de cisteïna, just després del primer domini transmembrana que estava conservat en ambdues proteïnes. Es va hipotetitzar que aquest residu seria el responsable de la formació d'un pont disulfur amb la possible subunitat lleugera de la qual no es coneixia la seqüència.

D'aquesta forma es van identificar dues proteïnes, rBAT i 4F2hc, com una nova família de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids. En aquell moment, i a causa del fet que l'BAT induïa transport de cistina en oòcits, es va plantejar la hipòtesi que rBAT fos un gen candidat per a la cistinúria. La cistinúria és una malaltia autosòmica recessiva que presenta com a fenotip bioquímic la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina. A causa de la solubilitat baixa de la cistina, aquesta precipita formant càlculs renals. Per demostrar aquesta hipòtesi, s'havien de trobar nous fets experimentals que estiguessin d'acord amb totes les alteracions descrites per a aquesta malaltia. Així, es va estudiar la localització subcel.lular i l'expressió durant el desenvolupament de la proteïna rBAT. Es va demostrar que la proteïna l'BAT es localitza en el domini apical del túbul proximal S3 i que la seva expressió era postnatal. Aquests fets coincidien amb el que es coneixia del transport de cistina i del lloc on residia el defecte causant de la cistinúria. D'aquesta forma, tots els fets apuntaven a rBAT com a gen candidat.

Com a primer pas per detenninar si aquesta hipòtesi era certa, el nostre grup va aïllar i caracteritzar el cDNA corresponent a l'rBAT humà i es va iniciar la recerca de mutacions (principalment de tipus puntual) mitjançant la tècnica coneguda com SSCP en la seqüència codificant del gen d'individus cistinúrics. Així, es van descobrir 6 mutacions puntuals, entre les quals destacava la mutació Met461Thr, per trobar-se en homozigosi. Per mutagènesi dirigida es va construir un cDNA de rBAT humà amb aquesta mutació i es va analitzar funcionalment en oòcits. Es va observar que aquest mutant presentava un defecte en el transport mesurat tres dics després de la injecció, fet que reafirmava la implicació d'rBAT en la cistinúria. Sorprenentment, en realitzar el transport sis dies després de la injecció es va veure que no hi havia diferències respecte a la proteïna salvatge. Per poder explicar aquest comportament de manera més detallada i reafirmar de manera més forta la implicació d'rBAT en la cistinúria, vaig construir i analitzar el mutant Met467Lys, resultats que explico més endavant en l'apartat de "resultats".

Aixi i tot, nos resultats obtinguts pel grup d'A Busch a Tübingen, en coI.laboració amb el nostre grup, van suscitar gran controvèrsia. Aquests resultats demostraven que l'activitat induïda per rBAT estava d'acord amb un intercanviador d'aminoàcids. Diferents grups van publicar que no podien comprendre com un intercanviador podria servir com a mecanisme de reabsorció d'aminoàcids. A més, cal recordar, que el fenotip de la cistinúria consisteix en la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina, mentre que rBAT també indueix transport d'aminoàcids neutres. L'explicació d'aquest interrogant ha estat també un dels objectius de la meva tesi.

Un detall important i no comentat fins ara és que la cistinúria és una malaltia heterogènia. S'han descrit tres tipus de cistinúria basant-se en les concentracions d'aminoàcids bàsics i cistina en homozigots i heterozigots per a la malaltia i en funció de l'absorció intestinal.

El nostre grup va observar quc hi havia famílies on no hi havia una cosegregació entre el locus rBAT i la cistinúria, fet que plantejava la possibilitat que la cistinúria fos una malaltia deguda a mutacions en diferents gens, Una anàlisi més precisa del fenotip d'aquestes famílies va permetre dir que els tipus II i III de cistinúria no són causats per mutacions en rBAT. Quins podrien ser aquests altres gens candidats de cistinúria? Un possible candidat seria un altre transportador de cistina que estigués en els segments S1 i S2 del túbul renal. En aquesta línia, Segal, el 1977, va detectar fent servir vesicules apicals de ronyó de rata dos components de transport de cistina: un d'afinitat alta i capacitat baixa compartit amb aminoàcids bàsics (que podria correspondre a l'activitat deguda a rBAn i no altre d'afinitat baixa (K., =0.93 mM) i capacitat alta. A més, per estudis de microperfusió en túbuls aïllats, Vòlkl i Silbemagl van demostrar que al voltant del 90% de la cistina infosa pel túbul era reabsorbida pel túbul contornejat distal i que aquesta reabsorció era inhibida per fenilalanina a una concentració de 10 mM. Així, el gen o els gens responsables d'aquest sistema de transport podrien ser també gens de cistinúria. Un altre gen candidat seria la possible subunitat lleugera, que igual que per a la proteïna 4F2hc estaria lligada a rBAT per ponts disulfur. Quines evidències hi ha sobre la presència d'aquesta subunitat?:

1. Si es fan experiments de transferència western fent servir un anticòs dirigit contra la proteïna rBAT amb membranes de ronyó, el pes que es detecta és diferent en funció de la presència o no d'agents reductors. Així, en absència d'agents reductors es detecten bandes de 125 kD de mobilitat electroforètica i de més alt pes molecular, mentre que la seva movilitat en presència d'agents reductors és de 94 kD. En tractar amb endoglicosidasa F aquesta banda de 94 kD passa a tenir una mobilitat que està d'acord amb el pes molecular deduït a partir de la seqüència d'aminoàcids. Per experiments de transferència western en gels de dues dimensions (primera dimensió no reductora, segona dimensió reductora) i per experiments de "crosslinking" amb reducció posterior, s'ha observat que la banda de 94 kD forma part d'aquest complex. Malauradament, no s'ha pogut immunoprecipitar aquest complex com s'havia fet en el cas de l'antigen 4F2, que demostrava directament que aquestes dues proteïnes interaccionen directament.

2. L'expressió de la proteïna rBAT en cèl.lules heteròlogues (COS, MDCK) no suposa cap activitat de transport: la proteïna o no arriba a la membrana o si hi arriba no indueix cap activitat de transport. En aquestes cèl.lules transfectades no s'han detectat per transferència western aquestes bandes de pes molecular més alt (125 kD).

3. Ens podem preguntar llavors si podem detectar aquests complexos de pes molecular més alt en l'oòcít de "Xenopus". En condicions no reductores s'ha observat una lIeugera banda de 125 kD (en comparació amb la intensilat de la banda de 94 kD), banda que s'ha postulat que seria homòloga a la detectada en membranes de ronyó.

Així, totes aquestes evidències experimentals estan a favor d'un model on la proteïna rBAT estaria associada a una altra proteïna ("subunitat lleugera") mitjançant ponts disulfur. Aquesta possible proteïna seria, doncs, un altre gen candidat de cistinúria.

OBJECTIUS

Tenint en compte els antecedents descrits en l'apartat anterior es van plantejar els següents tres objectius inicials:

1. Reafirmar la implicació d'rBAT en la malaltia cistinúria construint per mutagènesi dirigida cDNA d'rBAT que continguessin alteracions en la seqüència d'aminoàcids.

Així es va construir el mutant Met467Lys i es va caracteritzar en oòcits l'activitat induïda per intentar explicar el possible defecte que patien pacients cistinúrics que tinguessin la proteïna rBAT amb aquesta alteració.

2. Intentar comprendre els mecanismes dc reabsorció d'aminoàcids bàsics i cistina partint de les activitats induïdes per rBAT i 4F2hc en l'oócit de "Xenopus". D'aquesta manera també es volia comprendre com alteracions en l'activitat b(0,+) induïda per rBAT podrien explicar el fenotip cistinúric.

3. Estudiar el paper de les proteïnes rBAT i 4F2hc com a components i/o activadors dels sistemes de transport b(0,+) i (+)L respectivament.

Es volia detenninar primer quina era l'estructura del transportador per poder identificar més tard quina era l'entitat molecular responsable del transport i aixi entendre com aquestes dues proteïnes (la cadena lleugera i la cadena pesada) interaccionaven entre si.

CONCLUSIONS

1. Es reafirma la implicació del gen rBAT en la cistinúria de tipus 1. Dues de les mutacions trobades en pacients cistinúrics, Met467Lys i Met46TThr, no són completament funcionals a causa d'un problema en el trànsit cap a la membrana plasmàtica.

2. El transportador b(0,+) funciona com un intercanviador obligatori d'aminoàcids amb estequiometria 1:1. En aquesta tesi hem vist que el potencial de membrana i l'intercanvi amb aminoàcids neutres són les principals forçes que penneten acumular aminoàcids. Aquest mecanisme explica completament el fenotip de la cistinúria de tipus I. El transportador y(+)L també funciona com un intercanviadar d'aminoàcids, però de forma asimètrica ja que únicament permet la sortida d'aminoàcids bàsics, a causa probablement de les baixes concentracions de sodi intracel·lulars.

3. Els transportadors b(0,+) i y(+)L formen part d'una gran família de transportadors heteromultimèrics constituïts per dues subunitats: una subunitat llengera (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-l, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, etc) responsable de l'especificitat de substracte, i una subunitat pesada (4F2he, rBAT), necessària per a l'expressió en superfície de la subunitat lleugera. Aquestes dues proternes interaccionen a través d'un pont disulfur entre 2 residus de cisteïna que estan altament conservats. A part d'aquesta interacció covalent, són necessàries altres interaccions entre altres dominis com ara l'extrem C-terminal d'rBAT. Així, rBAT determina propietats funcionals del transportador b(0,+).
4. La mutació L334R trobada en un pacient espanyol amb LPI i la mutació V170M trobada en pacients jueus amb cistinúria de tipus no-I, provoquen un defecte en la funció de la proteïna y(+)LAT-1 i b(0,+)AT, respectivament.

5. S'ha identificat una nova família de transportadors lisosomals formada per 3 membres, MfP, LyCAT i LyMAT. LyCAT funciona com un transportador lisosomal d'aminoàcids bàsics, mentre que LyMAT funciona com un transportador lisosomat de múltiples aminoàcids. El domini C-terminal d'aquestes proteïnes en determina la locaIització subcel·lular. Estudis posteriors permetran implicar el transportador Iisosomal LyCAT en la regulació de la síntesi de NO en macròfags, com permeten suggerir les dades obtingudes en la present tesi.