Heterogeneidad genética de blastocystis hominis: implicaciones patogénicas.

Abstract

En los últimos años diversos trabajos ponen de manifiesto la existencia de variaciones intraespecíficas entre aislados de Blastocystis hominis. La descripción de diferentes perfiles proteicos, cariotipos y zimodemas constituyen pruebas de la posible existencia de poblaciones morfológicamente idénticas, que quizás estén dotadas de un potencial patogénico diferente. <br/><br/>El objeto de este estudio es el de establecer asociaciones entre variantes genéticas y enzimáticas y distinta significación clínica, para lo cual se realizaron los siguientes procedimientos:<br/><br/>(1) Obtener aislados clínicos de pacientes sintomáticos y asintomáticos, cultivarlos y axenizarlos.<br/>(2) Comprobar el grado de variación genética críptica en aislados de B. hominis, mediante el análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción a partir de dos amplicones diferentes.<br/>(3) Evaluar el poder discriminatorio de secuencias repetitivas de ADN como marcadores de diversidad.<br/>(4) Demostrar la existencia de poblaciones isoenzimáticas. <br/><br/><br/>Se analizaron un total de 260 muestras fecales, de entre las remitidas al Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario de Valencia; que fueron sometidas al siguiente protocolo: exámen parasitológico para la identificación de B. hominis y de otros posibles parásitos; y un coprocultivo con el objeto de determinar la existencia de enteropatógenos bacterianos. Se observó B. hominis en 56 de estas muestras, lo que supuso una prevalencia del 21,5%; y se procedió a su cultivo en medio BDM para su posterior axenización, todo ello de acuerdo con el protocolo descrito por Lanuza et al. (1997). <br/><br/>Se consiguió la adaptación al cultivo de 38 aislados, de los que se consiguió axenizar 18. Se incluyeron en el estudio 13 cultivos puros procedentes de colección, por lo que finalmente se analizaron un total de 51 aislados: 31 axénicos y 20 monoxénicos. <br/><br/>Una vez obtenidos los aislados se llevaron a cabo los ensayos de "riboprinting" (Böhm-Gloning,1997; Clark, 1997), consistentes en amplificar la secuencia que codifica el ARN de la subunidad menor ribosomal y analizar la longitud de los fragmentos obtenidos tras restricción enzimática de dicha región. <br/><br/>Extraído el ADN de acuerdo con el procedimiento descrito por Clark (1997) consistente en una extracción fenólica; la amplificación se realizó en dos reacciones distintas: la primera con los cebadores RD3 y RD5 (Clark, 1997) que amplifican la totalidad del gen con lo que se obtiene un amplicón de 2.540 pb; y la segunda con F1 y R1 (Böhm-Gloning et al., 1997) que amplifican sólo una parte del gen, por lo que se obtiene un producto de 1.100 pb. Los productos de amplificación fueron digeridos separadamente con las endonucleasas Rsa I, Hinf I y Alu I. <br/><br/>Para el análisis se transformaron las distancias de migración en tamaños relativos al compararlos con marcadores de peso molecular, utilizando el programa informático 1DManager. El criterio establecido para diferenciar entre patrones de RFLP fue considerar que eran distintos los que diferían en uno o en más fragmentos. Analizados los perfiles obtenidos para cada aislado, se obtuvieron los índices de homología entre cepas aplicando el coeficiente de Dice. Los resultados obtenidos tras el análisis conjunto de todos los patrones de bandas fue la obtención de 5 ribodemas (R1 a R5), en los que se valoró si existía relación estadística entre la pertenencia a un ribodema y padecer diarrea aguda o crónica, por lo que se analizaron los datos aplicando el test CHI-CUADRADO y se definieron el riesgo relativo (RR) y el coeficiente de correlación de Pearson (p).<br/><br/>Los resultados demostraron una asociación estadísticamente significativa entre diarrea aguda e inclusión en el ribodema R2. Lo cual nos confirmó que la especie B. hominis es genéticamente heterogénea, y que existían diferentes poblaciones con diferencias en la capacidad patogénica. <br/><br/>En el estudio también se valoró la eficacia de secuencias repetitivas de ADN como marcadores de diversidad, para lo cual se utilizaron los cebadores TR7 y TR8 (Init et al., 1999), demostrando que se podían establecer diferencias intraespecíficas a partir de un fragmento mayoritario, es decir el que más veces se repetía, considerando que eran cepas pertenecientes al mismo patrón las que coincidían en dicho fragmento. Los resultados demostraron que esta técnica es únicamente válida en la detección de variación intraespecífica en cultivos puros, ya que los cebadores no discriminan suficientemente cuando en la muestra existe ADN bacteriano además del de B. hominis. No se encontraron asociaciones estadísticas entre la pertenencia a alguno de los patrones definidos y la presentación de un proceso diarreico determinado. <br/><br/> Finalmente el análisis de las actividades enzimáticas: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, enzima málico, hexoquinasa, fosfoglucomutasa, glucosa fosfato isomerasa, glutámico-oxalacético transaminasa y fosfogluconato deshidrogenasa; consistió en la extracción de las proteínas de los cultivos puros, su separación en geles de poliacrilamida, y el consiguiente revelado utilizando sustancias tamponadas, con los sutratos, cofactores y coenzimas necesarios para cada enzima, de acuerdo con el protocolo de Selander et al. (1985).<br/><br/>Todos los aislados presentaron todas las actividades enzimáticas y compartieron idéntico patrón en todos los enzimas a excepción de la malato deshidrogenasa; cuyas diferencias en la movilidad electroforética de una de sus bandas, permitió definir tres poblaciones isoenzimáticas. No se encontraron asociaciones estadísticas entre los zimodemas definidos y la presentación de un determinado proceso diarreico. <br/><br/>Los resultados permitieron extraer las siguientes conclusiones:<br/><br/>1ª.- Todos los métodos moleculares empleados demostraron, aunque con desigual capacidad de discriminación, que B. hominis es un organismo con marcada heterogeneidad genética.<br/><br/>2ª.- El análisis de la secuencia del ARN ribosomal 16S, mediante técnicas de RFLP, ha detectado variantes asociadas a determinados estados mórbidos. El protocolo que utiliza los cebadores RD3 y RD5 es el que ha mostrado un mayor poder de resolución.<br/><br/>3ª.- Consideramos que para poder comparar datos de RFLP de forma efectiva es necesaria la utilización de protocolos normalizados, con cepas de referencia, un panel común de enzimas de restricción y una nomenclatura consensuada.<br/><br/>4ª.- El estudio de secuencias repetitivas utilizando TR7 y TR8 resulta eficaz en la detección de variación intraespecífica únicamente en aislados axénicos, lo cual limita su utilización como marcador de diversidad.<br/><br/>5ª.- Las diferencias encontradas en la movilidad del enzima malato deshidrogenasa demostraron la existencia de tres poblaciones isoenzimáticas, son que ninguna de ellas se asociara con un proceso determinado.<br/><br/>6ª.- La homología encontrada entre nuestros aislados y los genotipos de origen humano y animal descritos en otras áreas geográficas sustentan la idea del origen zoonótico de la infección y demuestran la ausencia de variaciones genéticas regionales.<br/><br/> Por lo que este trabajo concluye que B. hominis es una especie genéticamente heterogénea, y la asociación estadística observada confirma además la existencia de poblaciones con diferente patogenicidad.

Blastocystis hominis is the most prevalent specie of intestinal protozoa found in men of uncertain role in human disease. This study was undertaken to examine the degree of criptic genetic variation within B. hominis detectable using riboprinting (restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction amplified small subunit rDNA); the analysis of multiple target sequences by a single set of polymerase chain reaction primers; and the existence of demes with different pathogenic potential after to analyse the enzyme activity. <br/><br/> The small subunit ribosomal RNA genes of 51 isolates were amplified using standard polymerase chain reaction conditions and the primers RD5 y RD3 (Clark, CG; 1992). The amplification products were digested with 3 restriction enzymes (Hinf I, Rsa I, Alu I). We used a similar method by the primers F1 y R1 (Böhm-Gloning et al., 1997) and the same restriction endonuclease enzymes. Extensive sequence variation was discovered in B. hominis ribosomal RNA genes and the isolates grouped of at least five differents patterns or ribodemes. The ribodeme R2 was the most frequently isolated variant, is composed of isolates obtained from patients with acute diarrhea. The statistical association found between R2 and acute diarrhea in the absence of other enteropathogens suggest the pathogenic role of this ribodema.<br/><br/> The results based on the amplification products obtaines by a single set of polymerase chain reaction primers TR7 y TR8 (Init et al., 1999) showed intrastrain variations among isolates, but this set of PCR primers only can be used in the detection of variable DNA repeat patterns in axenic cultures because the reaction is not selectivity for lower eukayotes, it is present in prokaryotes too .<br/><br/> The enzyme polymorphism of this organism has been demostrated by enzyme electrophoresis of 31 axenic B. hominis isolates by electrophoresis on polyacrylamide gel under nondenaturating conditions (PAGE). Eight enzyme systems were studied: GOT (EC 2.6.1.1), GPI (EC 5.3.1.9), EM (EC 1.1.1.40), G6PDH (EC 1.1.1.49), 6PGDH (EC 1.1.1.44), MDH (EC 1.1.1.37), HK (EC 2.7.1.1), PGM (EC 2.7.5.1. ). The isolates showed an identical isoenzyme profile by the seven activities, in the case of MDH the presence of one band with different electrophoretic migrations detected the existence the two zimodemes. The description of different zymodemes confirms the heterogeneity of this organism. <br/><br/> This study illustrates the need to reexamine the role of B. hominis in disease taking the genetic diversity of the parasite into account.