Resistencia frente a la infección por Penicillium digitatum durante la postcosecha de los frutos cítricos. Bases moleculares y metabolismo de fenilpropanoides.

Abstract

Penicillium digitatum es el agente causal de la podredumbre verde de los frutos cítricos y constituye uno de los patógenos más importantes durante la postcosecha de los mismos, llegando a causar hasta el 80 % de las podredumbres. Aunque el control de este patógeno se realiza en la actualidad con fungicidas químicos, existe una tendencia al abandono de los mismos y al empleo de estrategias alternativas de control. La inducción de resistencia natural en los frutos constituye una de estas alternativas. En el presente trabajo se pretende profundizar en las bases biológicas y moleculares de la inducción de resistencia en los frutos cítricos frente a un ataque por P. digitatum.<br/>Se han evaluado distintos métodos de inducción de resistencia frente a P. digitatum con el fin de optimizar y seleccionar uno de ellos con el que abordar los estudios posteriores. Se compararon diversos tratamientos químicos (metil jasmonato, ácido &#946; aminobutírico y Brotomax®) y biológicos (hongos no patógenos de cítricos y paredes celulares de P. digitatum), así como un tratamiento de infección previa con P. digitatum y posterior inactivación térmica del patógeno. Se seleccionó este último sistema atendiendo a los buenos niveles de resistencia alcanzados (la incidencia se redujo más de un 70 % y la severidad más de un 85 %) y a la reproducibilidad del mismo.<br/>El tratamiento seleccionado se empleó para estudiar los cambios globales de expresión génica durante la inducción de resistencia. Estos cambios se analizaron en el flavedo y el albedo de frutos cítricos empleando dos micromatrices de cDNA desarrolladas por el Consorcio de Genómica Funcional de Cítricos, denominadas 7k y 12k, que contienen aproximadamente 7.000 y 12.000 genes respectivamente. Las mayores inducciones se detectaron en genes que codifican enzimas del metabolismo de fenilpropanoides, especialmente metiltransferasas (OMTs), de la síntesis de etileno, entre los que se encuentran varios genes ACO (ácido 1-metilciclopropano 1-carboxílico oxidasa), proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR) y oxidorreductasas. También se observó una importante reducción de la expresión de genes regulados por bajas temperaturas, de genes inducibles por la luz y de otros de función desconocida. El análisis de anotación funcional por ontologías génicas mostró que los procesos relacionados con el metabolismo de aminoácidos y de fenilpropanoides se indujeron en los frutos sometidos al tratamiento de inducción de resistencia respecto a los frutos no tratados, siendo estos cambios mayores en el tejido interno.<br/>Una vez finalizado el tratamiento de inducción de resistencia tiene lugar un aumento de la producción de etileno, que es comparable al que se observa en frutos infectados por P. digitatum. Sin embargo, en los frutos en los que se induce resistencia no hay desarrollo del hongo, por lo que todo el etileno procede del fruto. Mediante análisis Northern se ha comprobado que este aumento de los niveles de etileno coincide con una elevada inducción de la expresión del gen CsACO, al igual que ocurre en frutos infectados. Es de reseñar que las mayores inducciones tienen lugar en el albedo.<br/>Para profundizar en el estudio de la implicación de la ruta de fenilpropanoides se procedió a analizar la expresión de genes que codifican las enzimas PAL, 4CL, F3H, IRL1, CADs, SAD y OMTs mediante hibridación Northern. Se observó que la expresión de la mayor parte de estos genes aumentaba en respuesta al tratamiento inductor, con un patrón similar en ambos tejidos. Aunque en general los niveles de expresión fueron superiores en el flavedo, las mayores inducciones se detectaron en el albedo. Además, se realizó un estudio de la expresión de estos genes en respuesta a la infección por P. digitatum, observándose que los cambios fueron, en general, similares a los inducidos por el tratamiento de inducción de resistencia.<br/>El estudio de esta ruta se completó con la determinación del perfil metabólico de compuestos secundarios en los frutos cítricos mediante HPLC. En los frutos no tratados se observó en general una mayor abundancia y concentración de compuestos fenólicos en el flavedo respecto al albedo. Sólo la concentración de algunas flavanonas fue mayor en el albedo. La escoparona, 6,7-dihidroxicumarina, fue el compuesto con mayor inducción en respuesta al tratamiento inductor. Sin embargo, el mayor número de cambios como consecuencia de la infección y posterior inactivación térmica se observó en los derivados del ácido benzoico. Al igual que en respuesta al tratamiento inductor, durante la infección por P. digitatum se observó una modificación en la concentración de derivados del ácido benzoico.<br/>También se ha analizado la posible actividad antifúngica in vitro e in vivo de diversas cumarinas, flavanonas y alcaloides sobre diferentes hongos patógenos. Las cumarinas escoparona y umbeliferona y la flavanona hesperidina fueron los compuestos con mayor actividad antifúngica in vitro, aunque ninguno de ellos inhibió por completo el crecimiento de los hongos patógenos de cítricos. Sin embargo, sólo las dos cumarinas mostraron un efecto in vivo retrasando el desarrollo de P. digitatum en frutos inoculados con este patógeno. La adición al medio de cultivo de algunos alcaloides presentes en los cítricos redujo significativamente el crecimiento de P. digitatum, siendo la cafeina y el ácido 1, 2, 3, 4-tetrahidroharmane 3-carboxílico (THHCA) los compuestos más efectivos.<br/>Este trabajo constituye la primera aproximación en el que se aborda conjuntamente un análisis transcriptómico y metabolómico de procesos relevantes en patología postcosecha. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la importancia que desempeñan tanto el metabolismo secundario, especialmente de fenilpropanoides, como el etileno en el proceso de resistencia inducida en frutos cítricos frente a la infección por P. digitatum.

Penicillium digitatum is the causal agent of green mould and constitutes the major postharvest pathogen of citrus fruit, accounting for up to 80 % of losses due to fungal decay. Although control of this pathogen is achieved by chemical fungicides, there is a trend to adopt new and safer control alternatives. Induction of natural resistance in fruit constitutes one of these alternatives. The aim of this work was to gain an insight into the biological and molecular bases of the induction of resistance in citrus fruit against P. digitatum.<br/>Different methods to induce resistance against P. digitatum have been evaluated in order to optimize and to select one of them for further studies. Various chemical (methyl jasmonate, &#946;-aminobutyric acid and Brotomax®), biological (non pathogenic fungi of citrus and cellular walls of P. digitatum) treatments, as well as the possible resistance induced by a previous infection with P. digitatum followed by its inactivation by a heat treatment were compared. The latter system was selected because of the high resistance achieved (the incidence was reduced more than 70 % and the severity more than 85 %) and its reproducibility.<br/>Global changes in gene expression induced by the selected treatment were analyzed in the flavedo and albedo of citrus fruit. To that end, two cDNA microarrays developed by the Citrus Functional Genomics Project, named 7k and 12k, which contain about 7.000 and 12.000 genes, respectively, were used. The highest inductions were detected in genes that code for enzymes involved in phenylpropanoid metabolism, mainly methyltransferases (OMTs), ethylene biosynthesis, among which there are several ACO genes (1-aminocyclopropane 1-carboxylic acid oxidase), pathogenesis-related proteins (PR) and oxidoreductases. An important reduction in the expression of genes regulated by either cold or light, together with others of unknown function, was also observed. Gene ontology comparisons showed that processes related to amino acids and phenylpropanoid metabolism were upregulated in treated fruits, being these changes more marked in the internal tissue.<br/>An increase in ethylene production was observed after the heat treatment, coincident with the resistance acquisition, reaching a concentration similar to that observed in fruits infected by P. digitatum. Nevertheless, in the treated fruits the fungus does not progress, so the rise in ethylene must be due to the fruit. Northern blot analysis showed that this increase in ethylene paralleled a high induction on CsACO expression, as it occurs in infected fruits, and that the highest induction takes place into the albedo.<br/>In order to get a deeper insight into the role of the phenylpropanoid metabolism in the induction of resistance, the expression of genes encoding PAL, 4CL, F3H, IRL1, CADs, SAD and OMTs was analyzed by Northern blot. The expression of most of these genes increased in response to the induction treatment, showing a similar pattern in both tissues. Although the overall expression levels were higher in the flavedo, the highest inductions were detected in the albedo. In addition, changes in the expression of these genes in response to the infection by P. digitatum were similar to those originated by the induction of resistance treatment.<br/>The putative involvement of this pathway was further studied by examining changes in the metabolic profile by means of HPLC. In the treated fruits a greater abundance and a higher concentration of phenolic compounds in the flavedo with respect to the albedo were observed. Flavanones were the only phenolics whose concentration was higher in the internal tissue. Although the coumarin scoparone was the phenolic compound showing the highest increase in response to the treatment, it has to be pointed out that, among the different phenylpropanoids, benzoic acid derivatives were the most affected. Similar changes were detected during the infection of fruits by P. digitatum.<br/>The possible antifungal activity of diverse coumarins, flavanones and alkaloids was tested both in vitro and in vivo against different pathogenic fungi. The coumarins scoparone and umbelliferone and the flavanone hesperidin showed the highest in vitro antifungal activity, although none of them inhibited completely the growth of the citrus fungal pathogens analyzed. However, only the coumarins had an effect in vivo delaying the development of P. digitatum in inoculated citrus fruit. On the other hand, addition of some alkaloids detected in citrus tissues to the culture medium significantly reduced the growth of P. digitatum, being caffeine and 1, 2, 3, 4-tetrahydroharmane 3-carboxylic acid (THHCA) the most effective.<br/>This is the first work undertaking both a transcriptomic and a metabolomic approach to study changes associated with relevant processes in postharvest pathology. The global results indicate that both the secondary metabolism, mainly phenylpropanoids, and ethylene play important roles in the induction of resistance in citrus fruit against P. digitatum infection.