TDX/TDR - Departament de Farmacologia i Química Terapèutica

Estudio de la apoptosis inducida por la inhibición de la vía de la PI3K/AKT

Fri, 03 May 2013 08:51:54 GMT

Estudio de la apoptosis inducida por la inhibición de la vía de la PI3K/AKT Vázquez de la Torre Cervera, Aurelio Una de las vías que se postula que tienen una mayor importancia en las enfermedades neurodegenerativas es la de los inositoles fosfato. Para el estudio de esta vía se ha utilizado un inhibidor farmacológico de la fosfoinositol 3 cinasa (PI3K), el LY294002, en un modelo in vitro de células granulares de cerebelo de rata (CGC). Al tratar las CGC con una dosis de 30μM de LY294002 se produce una muerte celular por apoptosis que es independiente de calpaínas y dependiente de caspasas, además no se observa la fragmentación de p35 ni de α espectrina que se da por activación de las calpaínas. Los ensayos de actividad caspasa nos muestran un incremento significativo de la actividad de las caspasas 6 y 9 pero no de la 3 como sucede en otros modelos de apoptosis como la deprivación de S/K+. Nuestros estudios muestran que aunque existen algunas similitudes entre los modelos de inhibición de la PI3K y la deprivación de S/K+ también existen importantes diferencias. En ambos se produce una desfosforilación de AKT en Ser476 y consecuentemente una desfosforilación de GSK3β en Ser9, lo que indica la activación de GSK3β. Respecto a la proteína Rb en ambos modelos se observa un incremento de su fosforilación, si bien su papel es distinto ya que en la deprivación de S/K+ conduce a la liberación del E2F y a la transcripción de proteínas relacionadas con el ciclo celular. Además, se observó un incremento de la síntesis de DNA. Por el contrario el tratamiento con LY294002, pese a provocar un incremento en la fosforilación del Rb, no lleva a la expresión de ciclinas, CDKs ni un aumento de la síntesis de DNA.. Sin embargo el uso de inhibidores de CDK como flavopiridol y roscovitina muestran una protección significativa frente a la apoptosis inducida por LY294002, nuestros estudios muestran por vez primera que, no solo flavopiridol sino también otros inhibidores de CDK como la roscovitina tienen capacidad para inhibir la actividad GSK3β. Rb puede ser fosforilado por p38, un miembro de la vía de las MAPK las cuales son inhibidas por AKT. Nuestros resultados indican que LY294002 produce un incremento de la actividad de p38, pero no de JNK. Además, los cultivos Knockout de JNK3 no muestran una protección frente al tratamiento con LY294002, lo que refuerza la idea de que JNK no juega un papel central en este modelo. El incremento de actividad de p38 fue revertido con SB203580, un inhibidor de p38, así como por SP600125, inhibidor de JNK. Ambos fármacos mostraron una protección significativa frente a la apoptosis inducida por LY294002 y una reducción de la fosforilación del factor de transcripción c‐Jun, implicado en la apoptosis. La activación de c‐Jun conduce a la expresión de genes proapoptóticos como dp5 relacionados con la vía intrínseca, la inhibición de p38 previno del aumento de expresión de dp5. Por el contrario otras proteínas implicadas en la vía como Bim no están reguladas por c‐Jun ya que la inhibición de esta vía no reduce su activación. En nuestro estudio podemos concluir que, LY294002 produce una apoptosis dependiente de caspasas 6 y 9, sin implicación ni de calpaínas ni de proteínas del ciclo celular. La inhibición de AKT lleva a la activación de GSK3β y de p38. Además, p38 es capaz de fosforilar c‐Jun que regula la expresión de genes relacionados con la apoptosis por la vía intrínseca.; The inositol pathway has been reported that plays a key role in neurodegenerative diseases We study the mechansims involved in the apoptosis induced by inhibiting the phosphoinositol 3 kinase (PI3K) using a pharmacological inhibitor named LY294002 in an in vitro model of rat cerebellar granule cells (CGC). LY294002 induced apoptotic cell death through calpain independent and caspase dependent. Furthermore, we could not observed neither fragmentation of of p35 or α espectrin which is caused by calpains. The caspase activity assays showed a significant increase in caspase 6 and 9 but not in caspasa 3, in contrast with other apoptotic models such as de S/K+ deprivation. Our studies show that although exist several common points between inhibition of PI3K and S/K+ deprivation, also exist important differences between them. In both cases it has been observed AKT dephosphorylation at Ser476 and consequently GSK3β dephosphorylation at Ser9, which indicates GSK3β activation. On the other side, it was observed an increase of Rb phosphorylation in both models. However, it seems that the role played by this protein is different since in the de S/K+ deprivation leads to E2F released which participates in the transcription of proteins related to cell cycle. Moreover, the BrdU assay showed an increase in DNA synthesis. On the contrary, the LY294002 treatment, in spite of the fact that induced an increase of Rb phosphorylation, it did not induce any change of the levels neither cell cycle proteins or However, CDK inhibitors such as flavopiridol and roscovitine protected from the apoptosis induced by LY294002, our studies showed for the first time, that not only flavopiridol, but also other CDK inhibitors such as roscovitine could inhibit the GSK3β activity. Furthermore Rb can be phosphorylated by p38, which is a protein of MAPK pathway that is down‐regulated by AKT. Our results showed that LY294002 produced an increase of p38 activity, but not of JNK. Moreover, JNK3 Knockout cultures were not significantly protected from LY294002 treatment, this reinforces the idea that JNK is not the main target involved in this model. The increase of p38 activity was prevented with SB203580, a specific p38 inhibitor, and either with SP600125, a JNK inhibitor. Both drugs shown a significant protection from the apoptosis induced by LY294002 and prevented from c‐Jun phosphorylation, a transcription factor implied in apoptosis. The activation of c‐Jun triggered the expression of proapoptotic genes such as dp5 which is related to the intrinsic pathway, p38 inhibition prevented from the increase in dp5 expression. On the contrary, other proapoptotic proteins related to this pathway such as Bim was not regulated by c‐Jun since the inhibition of p38 pathway did not reduce its expression. In our study we can conclude that LY294002 induced apoptosis mediated by caspasas 6 and 9. Neither calpains nor cell cycle proteins were involved in this apoptotic model. The inhibition of AKT leaded to GSK3β and p38 activation. Moreover, p38 was able to phosphorylate c‐Jun that triggers the expression of proapoptotic genes implied in the apoptotic intrinsic pathway.

Disseny i síntesi de nous compostos multipotents per al tractament de la malaltia d’Alzheimer

Fri, 19 Apr 2013 08:19:20 GMT

Disseny i síntesi de nous compostos multipotents per al tractament de la malaltia d’Alzheimer Viana Gaza, Maria Elisabet El principal factor desencadenant de la neurodegeneració que caracteritza la malaltia d’Alzheimer (MA) és el pèptid β-amiloide (Aβ). La formació incrementada d’aquest pèptid i la seva agregació es troben a l’inici d’una cascada de processos neurotòxics que culminen amb una disfunció neuronal generalitzada i mort neuronal. Actualment, es troben en fase clínica diferents candidats a fàrmacs anti-Alzheimer denominats “modificadors de la malaltia” que van dirigits a inhibir la formació o l’agregació de l’Aβ. S’espera que aquests compostos puguin prevenir o frenar la neurodegeneració de la MA. L’arsenal terapèutic actual per al tractament de la MA continua estant dominat per un grup de fàrmacs que van estar desenvolupats per a tractar la seva simptomatologia, la qual apareix com a conseqüència de dèficits de diferents neurotransmissors, especialment d’acetilcolina (ACh), al sistema nerviós central. Concretament, quatre dels cinc fàrmacs actualment comercialitzats per al tractament de la MA són un grup d’inhibidors de l’enzim acetilcolinesterasa (AChE), enzim responsable de la hidròlisi de l’ACh. Recentment s’ha demostrat que l’AChE es pot unir a l’Aβ accelerant la seva agregació, augmentant-ne la neurotoxicitat i promovent el deteriorament cognitiu. A través del denominat lloc perifèric, el qual es troba a l’entrada d’una gorja catalítica d’uns 20 Å de longitud, al fons de la qual es troba el lloc catalític de l’enzim. Així, el bloqueig simultani amb ambdós llocs d’unió (actiu i perifèric) ha portat al desenvolupament dels denominats inhibidors d’AChE de lloc d’unió dual, els quals són candidats molt prometedors a fàrmacs anti-Alzheimer amb potencial per modificar positivament el curs de la malaltia. D’altra banda, degut al caràcter multifactorial de l’etiologia de la MA s’està començant a considerar el desenvolupament de nous compostos multipotents capaços d’interaccionar amb diferents dianes biològiques involucrades en la malaltia com a única via per a aconseguir incidir eficientment sobre la malaltia, com ara, l’estrès oxidatiu degut a la sobreproducció d’espècies reactives d’oxigen (ROS). S’ha demostrat que els compostos quelants d’ions metàl•lics són capaços d’inhibir la producció de ROS i s’està considerant la utilització d’antioxidants naturals contra processos en els quals està implicat l’estrès oxidatiu, com és el cas de la MA.; The main factor triggering the process of neurodegeneration characteristic of Alzheimer's disease (AD) is the so-called β-amyloid peptide (Aβ). The increased formation of this peptide and its aggregation are placed at the beginning of a cascade of neurotoxic processes culminating in widespread neuronal dysfunction and death. Currently, there are several "disease-modifying" anti-Alzheimer drug candidates in clinical trials aimed at inhibiting the formation or aggregation of Aβ. It is expected that these compounds can prevent or slow the neurodegeneration of AD. The current treatment available for the treatment of AD is still dominated by a group of drugs that were developed to treat its symptoms, which appear as a result of the decrease in the production of various neurotransmitters, particularly acetylcholine (ACh) at the central nervous system. Consequently, the use of cholinomimetic agents capable to compensate this deficit should reduce cholinergic symptoms of AD. In fact, four out of the five drugs currently marketed for the treatment of AD are a group of inhibitors of the enzyme acetylcholinesterase (AChE), the enzyme responsible for the hydrolysis of ACh at the synapses, which increase levels of the neurotransmitter, thus reducing the symptoms of AD. Recently, it has been demonstrated that the enzyme AChE can bind to Aβ accelerating its aggregation, increasing the neurotoxicity and promoting cognitive decline. The binding site of AChE to Aβ is the so-called peripheral site, which is located at the entrance of a catalytic gorge of about 20 Å length, at the bottom of which the catalytic site of the enzyme is placed, where the hydrolysis of ACh takes place. Thus, the blockade of the peripheral site of AChE should lead to an inhibition of Aβ aggregation and of the neurodegenerative cascade. In addition, the particular architecture of the enzyme where the active and peripheral sites are separated but close enough to allow a molecule to simultaneously interact with the two binding sites has led to the development of dual binding site AChE inhibitors, which are very promising anti-Alzheimer drug candidates expected to positively alter the course of disease. Moreover, due to the multifactorial nature of the etiology of AD, development of multipotent compounds capable of interacting with different biological targets involved in the disease is beginning to be considered as the only way to achieve efficient impact on the course of the disease. Aβ aggregation plays a crucial role in the pathogenesis of AD, inducing processes in the neurodegenerative cascade and oxidative stress due to overproduction of reactive oxygen species (ROS). It also appears that the Cu2+ and Fe3+ ions are capable of generating ROS, after binding to the Aβ For these reasons, the metal ions and oxidative stress are interesting targets to modulate by multipotent anti-Alzheimer drug candidates. Thus, it has been shown that the compounds capable of chelating metal ions are able to inhibit the production of ROS and the use of natural antioxidants is also being considered to block the oxidative stress involved in Aβ. The aim of the present PhD is to develop multipotent compounds capable to interact with different biological targets involved in AD, namely cholinesterases, Aβ and oxidative stress, in order to block its neurodegenerative cascade.

Sistemes basats en sals d’imidazoli: Plataforma pel desenvolupament de compostos d’interès químic i farmacèutic

Tue, 12 Mar 2013 12:18:27 GMT

Sistemes basats en sals d’imidazoli: Plataforma pel desenvolupament de compostos d’interès químic i farmacèutic Ibáñez Jiménez, Anna La Tesi Doctoral s’emmarca dins del projecte de recerca adreçat al estudi de la química de sistemes moleculars basats en sals d’imidazoli, que ve desenvolupant el nostre grup en els darrers anys. En concret la present Tesi Doctoral s’ha proposat una alternativa als mètodes clàssics, poc estudiada fins ara en líquids iònics, pel procés de bescanvi d’anió. La metodologia desenvolupada és senzilla d’aplicar i eficient donat que millora els rendiments descrits en la literatura, a vegades de forma substancial, proporcionant parells iònics lliures d’halur. El mètode basat en l’ús de reïnes de bescanvi iònic, permet obtenir sals de cations orgànics amb l’anió objectiu seguint un procés on es poden diferenciar dues parts. La primera correspon a la carrega de la reïna amb l’anió seleccionat [AER (forma A¯)], on s’han estudiat diferents vies com a font de l’anió i diversos solvents de càrrega segons el seu caràcter més o menys hidròfil. La segona correspon al bescanvi de l’anió halur examinant diferents solvents i mescles segons les característiques dels productes. A la senzillesa del protocol, s’hi afegeix el fet de que es minimitza la formació de productes secundaris tòxics, i la reïna utilitzada pel bescanvi és reciclable, amb el conseqüent benefici medi ambiental, entrant dins l’àrea de la química sostenible. El mètode ha estat aplicat amb èxit al bescanvi del contraanió en sals d’imidazoli, benzimidazoli, piridini i triazoli, així com en sals d’amoni quaternàries, amb propietats com a líquids iònics. La selecció de l’anió permet modular les seves propietats fisico-químiques, obtenir ILs per tasques especifiques, i disminuir la seva ecotoxicitat, entre altres possibilitats. La metodologia s’ha estès amb resultats excel•lents a sensors i receptors d’anions basats en sals d’imidazoli, monocatiònics i dicatiònics de forma que es facilita l’accés a compostos que podran ser útils per a l’estudi de propietats en l’àrea del reconeixement molecular d’anions, el que obre noves perspectives per a l’estudi d’aquests sistemes. Per altre part poden preparar-se sals d’ingredients farmacèutics actius (APIs), estratègia que pot permetre la modulació de les seves propietats proporcionant millores que incloguin el control de la solubilitat, la biodisponibilitat o bioactivitat, l’estabilitat, l'eliminació de polimorfisme, noves formes d’alliberament, o fins i tot permetre l’administració de còctels de fàrmacs personalitzats. Així, el mètode s’ha aplicat en la preparació de sals àcids arilpropiònics amb propietats antiinflamatòries en forma de líquids iònics, accedint als corresponents arilpropionats d’1-butil-3-metilimidazoli amb els que s’ha iniciat l’estudi del perfil d’alliberament del fàrmac. En la darrera part de la tesi, i dins de l’àrea del reconeixement molecular s’ha estudiat el comportament com a receptor abiòtic d’anions de [14]heterofans mitjançant estudis de complexació de RMN de 1H, observant que en CD3CN presenta afinitat pels anions clorur i acetat segons un model d’estequiometria 1:1 amb un valor de Ka (constant d’associació) proper al 104 mol–1 per l’anió acetat. A més a més, els resultats obtinguts en DMSO d6 indiquen una considerable afinitat pel anió H2PO4¯ si bé l’estudi resta pendent de completar; The PhD thesis is part of a research project aimed at studying the chemistry of imidazolium molecular systems, which our group has been developing in recent years. Initially, the current work was focused on the development of a simple and efficient protocol to obtain a halide exchange with a broad range of organic and inorganic anions in imidazolium ionic liquids (ILs) using an anion exchange resin (AER) as an alternative to the classical methods. This approach involves two steps: a) loading the anion in the AER, with different anions of variable hydrophilic character exploring sources and solvents and b) performing the halide exchange with the most suitable solvent mixture to obtain the new halide-free ion pair. Besides the advantage of this simplicity, this protocol minimized the formation of toxic byproducts, essential for sustainable chemistry, as well as featuring a recyclable AER. The AER (A¯ form) method has been applied to swap halides for assorted anions in several quaternary heteroaromatic salts that include imidazolium, benzimidazolium, pyridinium and triazolium salts, and quaternary ammonium salts, providing the halide-free ion pairs in excellent to quantitative yields. The methodology has been extended with excellent results to anion receptors and sensors based on monocationic and dicationic imidazolium salts. Thus, access has been facilitated to potentially useful compounds in the area of anion molecular recognition, which opens new perspectives for the study of these systems. Additionally, the developed protocol was successfully extended to prepare salts from active pharmaceutical ingredients (APIs), modifying their properties. An imidazolium cation was combined with the anion of an anti-inflamatory arylpropionic acid to obtain the ionic liquid salt. A study of the release of API from hyaluronan-based hydrogels as drug delivery system is currently underway. In the final part of the thesis, specifically in the area of molecular recognition, we have explored the behaviour of [14]heterophanes as abiotic receptors using 1H-NMR techniques to study their anion binding properties. As an example, in CD3CN, the acetate anion showed a Ka value of nearly 104 mol–1. The results obtained open perspectives for further work in this field.

New sphingolipid probes for metabolism and trafficking studies

Fri, 18 Jan 2013 11:01:00 GMT

New sphingolipid probes for metabolism and trafficking studies Garrido Martínez, María To study biological systems through the specific labeling of biomolecules by chemical reactions has grown interest in the last few years. In order to perform chemical reactions in living systems, it is essential that these processes fulfill certain criteria: 1) to proceed under physiological conditions; 2) to be high yielding and show fast reaction rates; 3) to require simple reaction conditions, and 4) to be biocompatible with the myriad of functionalities within biological systems. Along this line, to incorporate an azide functionality (chemical reporter) in the biomolecule of interest allows its selective labeling through 1,3-cycloadditions with terminal (copper-catalyzed) or cyclic alkynes. Such reactions are termed as ‘click’ reactions and are very used to label a wide number of biomolecules. Sphingolipids (SLs), a large and diverse class of lipids, are structural components of eukaryotic cell membranes. Besides its structural roles, it has been discovered that some sphingolipids are bioactive molecules which regulate cellular responses such as proliferation, differentiation, apoptosis and cell death. Moreover, sphingolipids dynamically assemble with sterols to form lipid rafts which are intimately associated with cell signaling. All these discoveries have grown interest in the development of molecular and chemical tools to study the metabolism and localization of these molecules. In the present Doctoral Thesis, we designed and synthesized various sphingolipid probes, bearing an azide functionality at omega and C1 positions of sphingoid base. The sphingolipid probes possessing an azide at omega position also comprised variations at C1 and as well as different acyl chains in the amide linkage. This family of omega-azidosphingolipids turned out to be non-cytotoxic and to metabolize as natural sphingolipids in different cell lines. Likewise, we developed new methodologies to study sphingolipid metabolism and intracellular localization based on azide-alkyne cycloaddition reactions. First of all, we developed a new approach for the quantitative analysis of sphingolipids, based on the labeling of different populations of sphingolipids with various azadibenzocyclooctyne-derived tags through click reactions. We optimized the click reaction in cell extracts containing omega-azidosphingolipids, and next we labeled cell extracts with the various cyclooctyne tags. We were able to detect a large number of sphingolipid triazoles, arising from the click reactions, by UPLC-TOF with high sensitivity. Moreover, we developed a method for the labeling of omega-azidosphingolipids in live cells through the click reaction with a fluorescent dye. We first designed and prepared the fluorescent dye, based on an azadibencyclooctyne moiety linked to a fluorescein unit. We next evaluated the internalization of this dye in cell membranes, analyzing cellular fluorescence by flow cytometry. Finally, we labeled cells with the fluorescent dye, and we observed an increase of fluorescence in cells which had been pre-treated with omega-azidosphingolipids. Moreover, we nicely visualized the resulting fluorescent click adducts by confocal microscopy. In the last application of these sphingolipid probes, we developed a method for the visualization of fluorescent ceramides in artificial lipid membranes. We incorporated omega-azidoceramide and C1-azidoceramide probes into artificial membranes and next labeled them using a fluorogenic click reaction with a non-fluorescent naphtalimide. The resulting click adducts, which became fluorescent, were nicely visualized by confocal microscopy. This methodology might be an important approach for the localization of azidoceramides in membranes of live cells by fluorescence microscopy.; Los esfingolípidos son una amplia y diversa familia de lípidos, que cumplen papeles esenciales como componentes de las membranas celulares. Además, recientemente se ha descubierto que son moléculas bioactivas que actúan como mensajeros secundarios en la regulación de funciones celulares como proliferación, diferenciación, adhesión y muerte celular. Por otro lado, los esfingolípidos se asocian dinámicamente al colesterol, formando dominios lipídicos. Estos dominios están relacionados con un gran número de funciones celulares. Muchos procesos patológicos se pueden curar o prevenir actuando directamente sobre el metabolismo de los esfingolípidos y/o su interacción con sus dianas terapéuticas. Por este motivo, el diseño y síntesis de sondas lipídicas para el estudio del metabolismo y localización celular de estas especies es de gran interés. La funcionalidad azida es un chemical reporter que reacciona con alquinos terminales y cíclicos mediante cicloadiciones 1,3-dipolares. Mientras que la reacción con alquinos terminales requiere catálisis de cobre, con alquinos cíclicos no es necesaria. Estas reacciones, denominadas reacciones click, se caracterizan por ser selectivas, biocompatibles, rápidas, eficientes y, además, tienen lugar en condiciones fisiológicas. Son ampliamente utilizadas para el estudio de sistemas biológicos. En esta tesis doctoral, se ha diseñado y sintetizado una familia de esfingolípidos marcados (“sondas”) con una funcionalidad azida en la posición omega y C1. Se han realizado modificaciones en la posición C1 y en el enlace amida para obtener diferentes derivados. Con las “sondas” mencionadas previamente, se han desarrollado diferentes aplicaciones basadas en el uso de reacciones click. En primer lugar, se ha desarrollado una metodología para el análisis simultáneo de diferentes poblaciones de esfingolípidos, marcadas por reacción click con diferentes ciclooctinos. En segundo lugar, se ha diseñado y sintetizado un azadibenzociclooctino con una unidad de fluoresceína, para su uso en la conjugación de omega-esfingolípidos en células vivas. Para ello, se estudió la internalización de dicho ciclooctino fluorescente en membranas celulares, analizando cuantitativamente la fluorescencia mediante citometría de flujo. Seguidamente, células pre-tratadas con algunos de los omega-esfingolípidos fueron conjugadas con el ciclooctino fluorescente. La fluorescencia fue analizada por citometría de flujo y los omega-esfingolípidos conjugados fueron visualizados mediante microscopía confocal. Por último, también se ha desarrollado un método para la visualización de ceramidas en membranas artificiales mediante reacciones click fluorogénicas. Los aductos fluorecentes resultantes de la reacción click fueron visualizados mediante microscopía confocal.

Estudios sintéticos sobre la reacción de Povarov, nuevos sustratos y aplicaciones

Wed, 16 Jan 2013 11:35:14 GMT

Estudios sintéticos sobre la reacción de Povarov, nuevos sustratos y aplicaciones Vicente García, Esther La presente tesis doctoral se centra principalmente, en aumentar la variabilidad del componente olefínico presente en la reacción multicomponente de Povarov y procesos relacionados, así como en explorar la posible actividad como inhibidores de AChE de los productos de oxidación de los aductos Povarov. Dentro de este trabajo, se estudió la reactividad de un variado grupo de lactamas insaturadas. En este grupo se varió la sustitución sobre el nitrógeno, la posición del doble enlace (endo- o exo- cíclico) y el tamaño del ciclo (5, 6 y 7). De este modo se obtuvieron las correspondientes tetrahidroquinolinas, producto de la reacción de Povarov, con un patrón de sustitución interesante. De los aductos obtenidos se sintetizaron las quinolinas correspondientes a partir de una oxidación con DDQ. Este último proceso es de gran interés, ya que este tipo de compuestos son abundantes en productos naturales y bioactivos. De igual modo, se estudió la reactividad de olefinas heterocíclicas del tipo 1,3-tia-, -oxa-, -imidazolona, obteniendo satisfactoriamente las tetrahidroquinolinas Povarov. Con estas nuevas olefinas se pudo estudiar la regioselectividad de su ataque, observando que este se realiza de manera selectiva. Como consecuencia de esta observación se diseño la versión intramolecular de la reacción y de este modo invertir el ataque de las olefinas sintetizadas. De todos los aductos obtenidos se sintetizó las correspondientes quinolinas. Como se ha comentado anteriormente, las quinolinas son de gran importancia, así que se diseñó un nuevo método para su obtención a partir de los aductos Povarov. Para ello se analizaron un gran número de oxidantes, entre ellos se seleccionó el dióxido de manganeso de la casa comercial Wako, ya que fue el único con el que no se obtenían subproductos de reacción y un rendimiento aceptable. Seguidamente, en el grupo de investigación se descubrió una nueva reacción multicomponente de tipo Mannich-Ritter para obtener amidinas cíclicas. Dentro de este trabajo se estudiarón el rango de olefinas activadas validas para el proceso, observando que este componente es clave y condiciona el mecanismo de la reacción. Por último, se estudió la actividad de quinolinas sintetizadas a partir de los aductos Povarov obtenidos a partir de lactamas insaturadas y enaminas cíclicas, como inhibidores de la acetilcolinesterasa. El objetivo es inhibir la actividad que tiene la enzima como catalizador de la agregación del β-amiloide, uno de los responsables de la enfermedad de Alzheimer. Los resultados obtenidos son esperanzadores, ya que muestran una muy buena actividad para compuestos relativamente pequeños.; This thesis is focus on the variability of the activated olefin component on the Povarov multicomponent reaction and related processes. And, explore the possible activity as AChE inhibitors of the obtained oxidized derivatives. One of the aim of this work was to explore the reactivity of the unsaturated lactams and heterocycles as 1,3-thia-, -oxa-, -imidazolone as activated olefins in Povarov multicomponent reaction. Different types of unsaturated lactams were under study, varying the N substitution, the cycle size and the α-position substituent. All the combinations are successfully and the final tetrahydroquinoline was obtained with good yields except for the α-position replaced. In case of the 1,3-thia-, -oxa-, -imidazolone the desire product was obtain in regioselective manner and good yields. An intramolecular version of the reaction was design to inverse the regiochemistry of the process. Finally, all the Povarov adducts were oxidized in presence of DDQ to obtain the corresponded quinoline. Some problems can be observed in the oxidized process, so the next objective was to find a new methodology to this transformation. For this reason a large number of oxidants were studied and manganese dioxide was found as the best option for this transformation, better than DDQ. Following, a new Mannich-Ritter multicomponent reaction was discovered in the research group to obtain cyclic amidines. My work in this project was to study the scope of the activated olefins reactive in this new multicomponent reaction. The results showed that the reaction mechanism depends on the activated olefin was used, for this reason some computational studies were done trying to explain this behavior. Finally, some unsaturated lactams and enamides derivatives were evaluated as AChE inhibitors. The objective was to inhibit the β-amyloid aggregation which is one of the causes of Alzheimer disease.

Synthesis of 1S-ethyl-4-substituted quinolizidines and other potentially bioactive compounds

Wed, 16 Jan 2013 10:47:45 GMT

Synthesis of 1S-ethyl-4-substituted quinolizidines and other potentially bioactive compounds Semak, Vladislav Esta Tesis Doctoral se presenta como Compendio de publicaciones. Los capítulos en los que se ha dividido la presente Tesis son los siguientes: Capítulo 1 – parte A: Enantioselective, Protecting Group-Free Synthesis of 1S-Ethyl-4-Substituted Quinolizidines Se ha descrito una síntesis enantioselectiva que no implica grupos protectores para acceder a la quinolizidina clave 6 a partir de la lactama bicíclica derivada de fenilglicinol 1. La adición de un reactivo organometálico a 6 ocurre de manera estereoselectiva para conducir a las quinolizidinas 1S-etil-4-sustituidas 4-epi-207I y 7-9. Siguiendo una secuencia sintética análoga, se preparó el compuesto 9a-epi-6. Sin embargo, la adición de reactivos de Grignard al compuesto 9a-epi-6 no ocurre de manera estereoselectiva. Capítulo 1 – parte B: A practical procedure for the removal of the phenylethanol moiety from phenylglycinol-derived lactams Las lactamas bicíclicas no racémicas derivadas de fenilglicinol se han relevado como intermedios clave en la preparación de compuestos nitrogenados enantiopuros. En este capítulo se describe la eliminación del inductor quiral de piperidonas sustituidas utilizando aire u oxígeno en medio básico. Capítulo 2: Synthesis of triheptanoin and formulation as a solid diet for rodents En el presente estudio se describe la síntesis eficaz de triheptanoina de elevada pureza a partir de glicerol y ácido heptanoico, en presencia de carbono sulfonado como catalizador. La triheptanoina se formula como un sólido estable para que constituya la base de una dieta cetogénica mediante la combinación de custro gentes de formulación comerciales; dos tipos de sílica, celulosa microcristalina y talco. La adecuación de la dieta se prueba en ratones C57BI/6 en un periodo de 15 días, comparando el estado general y el cambio de peso corporal. Capítulo 3: Toluene dioxygenase (TDO) mediated oxidation of halogen-substituted benzoate esters Una serie de esteres benzoicos metílicos sustituidos en o-, m- y p- se han sometido a hidroxilación enzimática via fermetación con E. coli JM109 8pDTG601A). Solo se metabolizaron los benzoatos sustituidos en orto. El 2-fluorobenzoato de metilo produjo regioselectivamente solo un diol mientras que el 2-cloro, 2-bromo y 2-iodobenzoato de metilo proporciona una mezcla de regioisómeros. Capítulo 4: Dauben–Michno oxidative transposition of allylic cyanohydrins Enantiomeric switch of (–)-carvone to (+)-carvone Cuando cianohidrinas alílicas se someten a la reacción de oxidación de Dauben-Michno a bajas temperaturas se accede a β-cianoenonas en buenos a excelentes rendimientos. El potencial de esta trasposición oxidativa se pone de manifiesto en enonas que contienen un plano latente de simetría como por ejemplo la conversión de la (-)-carvona en su enantiomero.; A dissertation submitted by Vladislav SEMAK to obtain a doctoral degree from University of Barcelona. This thesis was developed under the supervision of Dr. Carmen Escolano Mirón from Faculty of Pharmacy, University of Barcelona. This doctoral thesis is presented as a compendium of publications. The thesis is divided in four chapters: CHAPTER 1 – PART A: Enantioselective, Protecting Group-Free Synthesis of 1S-Ethyl-4-Substituted Quinolizidines (Amat, M.; Semak, V.; Escolano, C.; Molins, E.; Bosch, J. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 6866-6875.) A practical enantioselective protecting group-free four-step route to the key quinolizidinone 6 from phenylglycinol-derived bicyclic lactam 1 is reported. The organometallic addition reaction upon 6 takes place stereoselectively to give 1-ethyl-4-substituted quinolizidines 4-epi-207I and 7-9. Following a similar synthetic sequence, 9a-epi-6 is also accessed. However, the addition of Grignard reagents upon 9a-epi-6 proceeds in a non-stereoselective manner. In order to gain insight into the different stereochemical outcome in the two series, theoretical calculations on the iminium salts A and B have been performed. The study concludes that the addition of the hydride, which is the step that determines the configuration of the final products, occurs in a stereoelectronic controlled manner. CHAPTER 1 – PART B: A practical procedure for the removal of the phenylethanol moiety from phenylglycinol-derived lactams (V. Semak; C, Escolano; C. Arróniz; J. Bosch; M. Amat Tetrahedron: Asymmetry 2010, 21, 2542-2549.) Chiral non-racemic bicyclic lactams derived from phenylglycinol have been appointed as key building blocks for the preparation of enantiopure nitrogen compounds. The removal of the chiral inductor leading to substituted piperidones by using air or oxygen in basic media is presented in this chapter. CHAPTER 2: Synthesis of triheptanoin and formulation as a solid diet for rodents (Semak, V.; Semakova, J.; Halbaut, L.; Asó, E.; Ferrer, I.; Calpena, A.; Escolano, C.; Perales, J. C. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2012, 114, 889-895.) In the present study, we successfully synthesized triheptanoin to the highest standards of purity from glycerol and heptanoic acid, using sulfonated charcoal as a catalyst. Triheptanoin oil was then formulated as a solid, stable and palatable preparation using a ketogenic base and a combination of four commercially available formulation agents: hydrophilic fumed silica, hydrophobic fumed silica, microcrystalline cellulose, and talc. Diet compliance and safety was tested on C57Bl/6 mice over a 15-week period, comparing overall status and body weight change. CHAPTER 3: Toluene dioxygenase mediated oxidation of halogen-substituted benzoate esters (Semak, V.; Metcalf, T. A.; Endoma-Arias, M. A. A.; Mach, P.; Hudlicky, T. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 4407-4416.) A series of ortho-, meta-, and para-halogen-substituted methyl benzoate esters was subjected to enzymatic dihydroxylation via the whole-cell fermentation with E. coli JM109 (pDTG601A). Only ortho-substituted benzoates were metabolized. Methyl 2-fluorobenzoate yielded one diol regioselectively whereas methyl 2-chloro-, methyl 2-bromo- and methyl 2-iodobenzoates each yielded a mixture of regioisomers. Absolute stereochemistry was determined for all new metabolites. Computational analysis of these results and a possible rationale for the regioselectivity of the enzymatic dihydroxylation is advanced. CHAPTER 4: Dauben–Michno oxidative transposition of allylic cyanohydrins. Enantiomeric switch of (–)-carvone to (+)-carvone. (Hudlicky, J. R.; Werner, L.; Semak, V.; Simionescu, R.; Hudlicky, T. Can. J. Chem. 2011, 89, 535-543.) Allylic cyanohydrins were subjected to Dauben–Michno oxidation at low temperatures to provide β-cyanoenones in good to excellent yields. The potential of this oxidative transposition as a means of an enantiomeric switch of enones containing a latent plane of symmetry was tested by conversion of (–)-carvone to its enantiomer.

A modular approach to sphingolipid analogs mediated by aziridines: Synthesis and biological studies

Mon, 07 Jan 2013 09:05:55 GMT

A modular approach to sphingolipid analogs mediated by aziridines: Synthesis and biological studies Alcaide López, Anna Sphingolipids are essential biomolecules for the physiological cell function. In addition to its structural role in cell membranes, these lipids have also crucial functions in signal transduction and cell regulation. As a consequence of the important biological roles of sphingolipids, the synthesis of their analogs and the development of chemical inhibitors of sphingolipid enzymes are the object of current interest. Furthermore, it has been reported that slight modifications on the natural C1 (phyto)sphingosine scaffold or variations in its chain lengths can potentially alter the role and bioactivity of sphingolipid analogs. On the other hand, cyclitols are an important group of compounds due to their remarkable biological activities as well as their synthetic usefulness in the synthesis of other natural compounds or pharmaceuticals. Specially, the development of carbohydrate mimetics prompted primarily by their properties as glycosidase inhibitors, has led to a wide variety of novel structures by themselves or when considering them as key synthetic precursors of more complex molecules such as glycosphingolipids. For the above‐mentioned reasons, we developed a synthetic methodology towards sphingolipid analogs based on the regioselective ring‐opening reactions of N‐acylaziridines with different nucleophiles such as thiols or beta‐glycosil thiols, amines, phosphate derivatives or phosphorothioate derivatives. This approach is a short and flexible route for the synthesis of a variety of (phyto)sphingolipid analogs from aziridine derivatives and this method leads to molecules with different groups bonded to the C‐1 position of the sphingoid backbone from common intermediate aziridines by changing the nucleophile in the ring‐opening reaction step. Moreover, the diversity of compounds obtained is extended by introducing different N‐acyl groups at the nitrogen aziridine. Once, the desired sphingolipid analogs were obtained, a representative selection of them was tested in enzyme assays to identify inhibitors of mammalian sphingolipid metabolism enzymes, such as sphingomyelin synthase (SMS) and glucosylceramide synthase (GCS). Some of the tested analogs were potent inhibitors of GCS and none of them inhibited SMS at concentrations relevant for activity. In general, the inhibitory activity was higher for phytosphingosine analogs than their corresponding sphingosine analogs and the presence of the double bond between C4 and C5 of the sphingosine backbone in analogs was important for their bioactivity, since the dihydroceramide analogs were less active. In addition, a collection of (phyto)sphingolipid analogs were tested in an assay to identify inhibitors against yeast inositol phosphorylceramide synthase (IPCS). Generally, the inhibitory activities were lower than the inhibitions against GCS. However, one analog depicted selectivity against baker’s yeast IPCS since no inhibition of mammalian SMS and GCS was observed. For that reason, this analog showed potential properties as antifungal agent. Some (phyto)sphingolipid analogs were also tested as antigens for CD1d‐restricted iNKT cells and some of them were active, although this activity was lower when comparing with the endogenous glycolipid beta‐glucosylceramide. In particular, the most active compound was a nonglycosidic phytoceramide analog, but some glycosphingolipid analogs were also active in the activation of iNKT cells. However, these compounds were considered weak antigens. Finally, in order to obtain glycolipid analogs a synthetic methodology to obtain enantio‐ and diastereomerically pure galacto‐configured aziridines based on olefin aziridination reactions was examined. This consists in the use of nitrene precursors and a galactose related cyclohexene. The results obtained with this method showed potential for the preparation of the aziridine compounds.; Los esfingolípidos (SL) son biomoléculas esenciales para las funciones fisiológicas de las células. El metabolismo anómalo o la expresión de SL específicos o glicoesfingolípidos (GSL) es el origen de diferentes enfermedades como las esfingolipidosis, causadas por la presencia de mutaciones en las enzimas que intervienen en la biosíntesis de SL o GSL. Debido a la importancia biológica de los SL, el desarrollo de inhibidores químicos de las enzimas que intervienen en el metabolismo de los SL de mamíferos y hongos, es un tema de gran interés científico. Por otro lado, cabe remarcar que los ciclitoles son un tipo de compuestos muy interesantes debido a su remarcable actividad biológica y a su utilidad como precursores sintéticos de moléculas más complejas como los GSL. Teniendo en cuenta las consideraciones comentadas anteriormente, se ha desarrollado una nueva metodología sintética para la obtención de análogos de SLs basada en las reacciones de apertura de Nacilaziridinas con diferentes nucleófilos como tioles, beta‐glicosil tioles, aminas, fosfatos y fosforotioatos. Esta aproximación es una ruta corta y flexible para la obtención de análogos lipídicos con diversidad estructural. Una selección representativa de los compuestos sintetizados se ensayó frente a la inhibición de enzimas del metabolismo de los mamíferos tales como la esfingomielin sintasa (SMS) y la glucosilceramida sintasa (GCS), y enzimas del metabolismo de los hongos como la inositol fosforilceramida sintasa (IPCS). Algunos de estos análogos resultaron ser inhibidores potentes de la GCS pero ninguno de ellos fue inhibidor de la SMS. Mientras que la inhibición frente a la IPCS en levaduras fue más baja en comparación con la inhibición de la GCS. A pesar de ello, uno de los análogos ensayados mostró selectividad frente a la IPCS ya que no se observó inhibición de la SMS y la GCS de mamíferos, mostrando así propiedades interesantes como agente antifúngico. De manera adicional, algunos análogos de (fito)esfingolípidos fueron ensayados como antígenos de células iNKT restringidas por la proteína CD1d y resultaron activos. Curiosamente, el compuesto más activo resultó ser un análogo de fitoceramida no glicosídico, aunque otros GSL también resultaron activos. Por otro lado, se desarrolló una metodología sintética para obtener aziridinas con configuración galacto (análogos de galactosa) enantiomericamente y diastereomericamente puras para obtener análogos de glicolípidos. El text dels capítols 3, 5, 6 i 7 ha estat retirat seguint instruccions de l’autora de la tesi, en existir participació d’empreses, existir conveni de confidencialitat o existeix la possibilitat de generar patents / El texto delos capítulos 3,5, 6 y 7 ha sido retirado siguiendo instrucciones de la autora, al existir participación de empresas, convenio de confidencialidad o la posibilidad de generar patentes / The text of chapters 3, 5, 6 and 7 has been withdrawn on the instructions of the author, as there is participation of undertakings, confidentiality agreement or the ability to generate patent

Functional and molecular characterization of maize open stomata 1 protein kinase

Mon, 07 Jan 2013 08:28:54 GMT

Functional and molecular characterization of maize open stomata 1 protein kinase Vilela, Belmiro Plant growth and productivity are compromised by environmental stresses such as pathogens, extreme temperatures, drought and high salinity. Being sessile organisms, plants had to develop different physiologic and biochemical strategies to cope with these potential harmful situations. Drought in particular is one of the major environmental stresses that plants are forced to endure during their life cycle. The adaptation to water deficit is controlled by a cascade of molecular networks that start with the perception of water shortage which leads to increases in the ABA levels. Even though the ABA signalling model is well described for Arabidopsis, little is known for other plant species. With this thesis we proposed to increase the knowledge of maize response to drought, focusing on a maize kinase of the SnRK2 family ‐ ZmSnRK2.8/ZmOST1 ‐ which is highly homologous to the Arabidopsis OST1. We divided our work on three chapters, namely the biochemical characterization of ZmOST1, the functional characterization of ZmOST1 and the study of ZmOST1 regulation. 1) ZmOST1 biochemical characterization With Chapter 1 we characterized ZmOST1 at the biochemical level, making parallels with the Arabidopsis system whenever pertinent. We found a very close biochemical relationship between the maize and Arabidopsis kinases that suggests a conserved mechanism of plant responses to ABA and drought stress and point to the potential use of this kinase in improvement programs of drought tolerance in crops. 2) ZmOST1 functional characterization With Chapter 2 we described ZmOST1 as a functional kinase that is activated by different osmotic stresses and that is able to complement the Arabidopsis ost1‐2 mutant with effects on stomata closure. We also present a transcription factor of the NAC superfamily (ZmSNAC1) as a novel cognate substrate of ZmOST1. Under abiotic stresses ZmOST1 is capable of phosphorylating this transcription factor with further implications on stomata regulation. 3) ZmOST1 regulation With the results presented in Chapter 3 a larger picture of ABA signalling appears that implicates new partners on ZmOST1 regulation, specifically the CK2 kinase and the proteasome degradation. Ample evidence is shown suggesting CK2 phosphorylation is implicated in ABA signalling by affecting ZmOST1 localization, protein levels, protein degradation and interaction with PP2C phosphatases. At the plant level, overexpressing ZmOST1 mutagenized on the CK2 loci of phosphorylation grants several potential beneficial traits that could prove important for crop biotechnology, such as higher protein levels, better protein stability, enhanced phosphorylation activity and better stomata regulation. Working model: Taken the results presented in this thesis together, we propose a change in the current ABA signalling model. First we believe that there is an important role for CK2 in ABA sensing and SnRK2 activation that could affect the binding of the kinase to the PP2C phosphatises and regulate SnRK2 through degradation. Second, we propose that, apart from the always off and transiently fast on/off modes of SnRK2 activity, there is a third always on mechanism in which the kinase is fully detached from the phosphatase.; La sequía es actualmente el factor abiótico más limitante para el crecimiento de las plantas y se está agravando con los actuales cambios climáticos, aumento de población y reducción de las reservas de agua. Se estima que en el 2050 el 50% de las tierras cultivadas tengan problemas de salinidad o sequía. Por ello, la intensificación de la agricultura y el desarrollo de la mejora biotecnológica de adaptación al estrés son áreas que tienen que reforzarse. En esta tesis se pretende ampliar los conocimientos sobre la respuesta del maíz a la sequía haciendo un estudio profundizado de una quinasa de tipo SnRK2, designada ZmOST1 que está implicada en la respuesta de las plantas al déficit hídrico. - Capítulo 1: Caracterización bioquímica de la quinasa de maíz ZmOST1 en que se establece que ZmOST1 se localiza en el núcleo y citoplasma, se activa por ABA, es capaz de autofosforilar su centro activo y directamente interacciona con una fosfatasa ZmPP2C a través de su dominio regulador. - Capítulo 2: Caracterización fisiológica de ZmOST1. Se determinan los niveles de expresión y de actividad de la quinasa en diferentes tratamientos y estadios de desarrollo; se establece que ZmOST1 es capaz de recuperar el fenotipo de cierre estomático en mutantes OST1 de Arabidopsis; y se identifica un factor de transcripción que se caracteriza como un nuevo substrato de esta quinasa. - Capítulo 3: Se describe una nueva ruta de regulación de ZmOST1 en que esta quinasa es fosforilada por la CK2 (casein kinase 2) en el dominio regulador. Mutagenizando los residuos diana de la CK2 en la ZmOST1 lleva a una mayor acumulación, una menor degradación por el proteasoma y una hipersensibilidad a ABA.

PPAR β/δ, inflamació i resistència a la insulina en adipòcits

Wed, 05 Dec 2012 09:00:23 GMT

PPAR β/δ, inflamació i resistència a la insulina en adipòcits Serrano Marco, Lucía Des de fa un parell de dècades s’ha establert una relació causa efecte entre l’estat inflamatori crònic de baixa intensitat que es presenta en obesitat i l’aparició de resistència a insulina i Diabetis Mellitus tipus 2 associades a aquesta patologia. Aquest estat inflamatori es caracteritza per la sobreproducció de citocines proinflamatòries com el TNF-α(factor de necrosi tumoral-α) o la interleucina 6 (IL-6), que són produïdes en gran mesura pel teixit adipós. Els Receptors Activats per proliferadors Peroxisòmics (PPAR) s'han proposat com a possibles dianes terapèutiques per al tractament i la prevenció del procés inflamatori i de la resistència a la insulina. D’aquests receptors nuclears el subtipus PPARβ/δ juga un paper important en la prevenció del procés inflamatori, ja que diversos estudis han demostrat que pot evitar la producció de IL-6 induïda per lipopolisacárid en el teixit adipós, i a més pot inhibir l’activació del factor de transcripció proinflamatori NF-κB. Per això, els objectiu d’aquesta tesi doctoral han estat, d'una banda, avaluar els efectes de l’obesitat i la inflamació sobre PPARβ/δ, i d’altra banda, conèixer si l’activació d’aquest receptor nuclear per GW501516 és capaç de prevenir la resistència a la insulina induïda per la via IL-6/STAT3/SOCS3 i els mecanismes implicats en adipòcits. Els resultats que es van obtenir a partir de mostres de teixit adipós humà indiquen que en presència d’obesitat hi ha un increment de citocines proinflamatòries (IL-6 i TNF-α) i de NF-κB, ambdós factors afavoreixen el procés inflamatori. Aquesta situació s’acompanyà d'una disminució de l’activitat de PPARβ/δ, la qual es va veure reflectida en la disminució dels gens diana d'aquest. Però l'activació de PPARβ/δ i la inhibició de NF-κB en estudis in vitro amb cèl•lules adiposes SGBS van ser capaços de revertir aquest efecte (Serrano-Marc L, BBA of Lipids, 2012). D'altra banda, estudis en ratolins i en cèl•lules 3T3-L1 van demostrar que l’activació de PPARβ/δ per GW501516 podria evitar l’aparició de resistència a la insulina inhibint l’activació de la via IL-6/STAT3/SOCS3 mitjançant dos mecanismes. L’activació del receptor nuclear va impedir la fosforilació en el residu de Tyr705 de STAT3 (Signal Transductor and Activator of transcription 3, un factor de transcripció) i d’aquesta manera va inhibir la unió de Hsp90 amb aquest (necessària per a queSTAT3 s’activi). D’altra banda, l’activació per GW501516 va impedir la fosforilació de la ERK1 / 2 (Extracellular Receptor Kinase 1/2) i d’aquesta manera es va evitar la fosforilació en el residu de Ser727 de STAT3, necessària per a la seva activació transcripcional. La inhibició del factor de transcripció STAT3 va implicar una disminució en els seus gens diana, entre ells SOCS3 (Supressor of Citokine Signaling 3), que és el responsable de la degradació d'IRS-1 (Insulin Receptro Substrate-1), proteïna essencial per donar resposta a la insulina (Serrano-Marco, L, Diabetis, 2011).; It has been established a causal link between the chronic inflammatory state of low intensity that occurs in obesity and the onset of insulin resistance and type 2 diabetes. This inflammatory condition is characterized by the overproduction of proinflammatory citokines such TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) or interleukin 6 (IL-6), which are largely produced by the adipose tissue. The Peroxisomic Proliferator Activated Receptors (PPAR) have been proposed as potential therapeutic targets for the treatment and prevention of inflammation and insulin resistance. Of these nuclear receptors the subtype PPARβ/δ plays an important role in preventing the inflammatory process. Therefore, the objective of this work is, one hand, to evaluate the effects of inflammation in obesity and in PPARβ/δ; and secondly, to determine whether the activation of PPARβ/δ with GW501516 in adipocytes is capable of preventing insulin resistance induced through the IL-6/STAT3/SOCS3 pathway, and also the mechanisms involved. The results obtained from human adipose tissue samples show that in the presence of obesity there is an increase of proinflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) and of NF-κB. This was accompanied by a decrease in the PPARβ/δ activity. But the activation of PPARβ/δ and the inhibition of NF-κB in in vitro studies with SGBS adipose cells were able to reverse these effects (Serrano-Marco L, BBA of Lipids, 2012). Furthermore, studies in mice and in 3T3-L1 cells demonstrated that activation of PPARβ/δ by GW501516 could prevent the development of insulin resistance by inhibiting the activation of the IL-6/STAT3/SOCS3 pathway (Serrano-Marco L, Diabetes, 2011). Taking all these data together the final conclusion of this work is: PPARβ/δ is involved in the regulation of the chronic inflammatory state that links obesity and insulin resistance. Therefore, the activation of this nuclear receptor could prevent IL6 induced insulin resistance.

Enantioselectivitat de derivats de prolina com a selectors quirals en cromatografia en contracorrent

Thu, 29 Nov 2012 08:20:40 GMT

Enantioselectivitat de derivats de prolina com a selectors quirals en cromatografia en contracorrent Pérez Montero, Anna Maria En les últimes dècades, el fenomen de l’enantioselectivitat ha adquirit una importància creixent per a la indústria farmacèutica a l’hora del desenvolupament de nous fàrmacs. Això és degut a la observació d’una diferent resposta per part de l’organisme en funció de l’estereoquímica de la molècula exògena administrada, ocasionada per l’elevada estereoselectivitat dels processos fisiològics. Diferents exemples es poden trobar a la literatura a partir del desastre produït pel fàrmac anomenat talidomida, en què es va responsabilitzar la forma S de l’efecte teratogen mentre s’assignà l’acció sedant a la R. Molts altres fàrmacs quirals presenten una dicotomia d’efecte pels enantiòmers. A mode d’exemple l’anestèsic prolocaïna presenta diferències d’activitat entre enantiòmers. En aquest cas la forma de configuració S posseix majoritàriament l’acció anestèsica, mentre que la R és responsable dels efectes tòxics del fàrmac, que pot produir metahemoglobinèmia. Així, doncs, l’adiministració, i per tant la comercialització de fàrmacs enantiomèricmanet purs, simplifica aspectes farmacològics, farmacocinètics, terapèutics i toxicològics de l’acció dels fàrmacs. Altres avantatges que s’aconsegueixen amb aquest procedir són la disminució de la dosi de fàrmac requerida per a produir l’efecte desitjat i la menor variabilitat interpersonal de l’efecte produït per una determinada dosi. Degut a la importància de l’administració de fàrmacs enantiomèricament purs, en el present treball s’estudia l’aplicació de la cromatografia en contracorrent (CPC/CCC) en la separació de mescles racèmiques. La CCC/CPC és una variant de la cromatografia líquida, en la què la fase mòbil i la fase estacionària estan formades per dos líquids immiscibles entre sí. Així, s’han dissenyat i sintetitzat noves entitats quirals derivades de l’aminoàcid L-prolina. Una vegada caracteritzades, s’ha estudiat la seva aplicació en la separació de racèmics, a la vegada que s’ha estudiat el seu mecanisme d’enantioreconeixment per poder establir unes pautes a l’hora de dissenyar nous selectors quirals (SQ). D’altra banda, la CCC/CPC al tractar-se d’una tècnica que es dona entre dos líquids immiscibles. S’ha estudiat l’aplicació de nous sistemes de dissolvents menys contaminats, com es el cas de l’etoxinonafluorobutà. Així, s’han construït diferents sistemes de dissolvents que contenen el dissolvent fluorat, a l’hora que s’han utilitzat SQs fluorats.; Nowdays, the significance of the enantiomèric purity in the chiral active ingredients used in drug manufacture is well recognized. In addition, the strict regulations established by health authorities on the commercialisation of chiral drugs, has led to the requirement for analytical and preparative methods for enantioseparation. Although diverse procedures exist, chromatographic techniques are amongst the most used to resolve mixtures of enantiomers at a preparative level. In the present doctoral thesis we intend to study the enantioselectivity phenomena of L-proline derivatives as chiral selectors in countercurrent chromatography (CCC) using diferent solvent systems. CCC is an effective separation technique base don the differences in partitioning of solutes in a sample between two non-miscible solvents or solutions that constitute the solvent system. Therefore, the mobile and the stationary phases in the chromatographic process are liquids. The absence of a solid support opens a whole range of possibilities to apply alternative elution modes alternatives to the classic one. The exchange between mobile phase and stationary phase during the separation, that CCC only involves the change of a valve position, allows the dual and mutidual mode. Also, the application of ph-zone refining, a kind of displacement chromatography that involve the addition of a displacement agent in the mobile phase, has been evaluated in order to improve the separation of ionizable racemates. Finally, the evaluation of the enantioselectivite capacity of fluorinated solvents and chiral selectors has been tested in CCC and in liquid membranes.

Els quàdruplex de guanina: Estudis estructurals i diana farmacològica

Mon, 26 Nov 2012 11:40:14 GMT

Els quàdruplex de guanina: Estudis estructurals i diana farmacològica Ferreira Aguilera, Rubén La tesi gira a l’entorn del estudi del quàdruplex de guanina i la síntesis i avaluació de lligands selectius a aquestes estructures. En el capítol 1 es descriu una metodologia per obtenir estructures de G‐quàdruplex molt estables. Aquesta metodologia permet introduir modificacions en una sola cadena o modificar la polaritat d’una cadena respecte les altres tres. En el segon capítol es presenta una revisió de les metodologies d’espectroscòpia de masses aplicades als G‐quàdruplex i s’estudia la formació de G‐quàdruplex induïda per co‐dissolvents. En el tercer capítol es descriu el complex format pel G‐quàdruplex telomèric humà amb unes acridines en avaluació preclínica, així com els estudis estructurals i d’estabilitat realitzats per RMN i per dinàmica molecular. Els altres capítols formen la part de la tesi dedicada al desenvolupament de nous lligands selectius a estructures de G‐quàdruplex amb interès biològic. Així doncs, en el quart capítol es descriu una nova estratègia per obtenir oligòmers d’acridina amb un esquelet de PNA i s’estudia les seves propietats d’unió a diverses estructures de DNA així com les seves propietats antitumorals. En el capítol 5 es determinen les propietats d’unió al DNA d’una sèrie completa d’oligòmers d’acridina i/o quindolina. També es realitza un estudi per RMN i per dinàmica molecular del complex format pel dímer de la quindolina i un G‐quàdruplex. En l’últim capítol es descriu un nou mètode per obtenir uns derivats d’acridina DACA, un inhibidor de la topoisomerasa I/II. Es van realitzar experiments de diàlisis competitiva, RMN i de viabilitat cel•lular per determinar‐ne les seves propietats d’unió al DNA a més de les seves propietats antiproliferatives.; The thesis is focused on G-quadruplex and the design, synthesis and evaluation of G-quadruplex ligands. In the first chapter we describe a method to prepare highly stable G-quadruplexes by linking four G-rich DNA strands to form a monomolecular G-quadruplex. This approach allows the introduction of specific modifications in only one of the strands or to prepare a quadruplex where one of the strands has a different polarity. In the second chapter we survey the state of the art mass spectrometry methodologies for investigating G-quadruplexes, and illustrated them with a new study on a simple model system: the dimeric G-quadruplex of the 12-mer telomeric DNA sequence d(TAGGGTTAGGGT). We also studied the G-quadruplex formation and the structural changes induced by organic co-solvents. In the third chapter, we developed the structural models of the complexes with the telomeric DNA G-quadruplex with 9-amino acridines based on NMR measurements and further examined by molecular dynamics simulations and free energy calculations. The others chapters are based on the development of new G-quadruplex ligands. Specifically we described the synthesis of oligomers containing two or three acridine units linked through 2-aminoethylglycine using solid-phase methodology. The cytotoxic properties and DNA affinity of these compounds were studied by cell viability and competitive dialysis studies. The DNA binding properties of 4-aminoproline oligomers functionalized with one, two or three units of acridine and/or quindoline have been analyzed by competitive dialysis in chapter five. A NMR/molecular dynamics study was performed on G-quadruplex sequence and the dimer carrying two quindolines. A model of the complex with the telomeric DNA quadruplex was also described. Finally, several acridine derivatives were synthesized and their anti-proliferative activity was determined. The DNA binding properties of these derivatives were analyzed by competitive dialysis and NMR titrations.

Ingesta de fructosa líquida, fetge gras i intolerància a la glucosa

Thu, 13 Sep 2012 07:15:20 GMT

Ingesta de fructosa líquida, fetge gras i intolerància a la glucosa Rebollo de Grado, Alba En les ultimes dècades s’ha produït un increment notable de la prevalença d’alteracions metabòliques com l’obesitat, la síndrome metabòlica i la resistència a la insulina que s’han relacionat, entre altres factors, amb l’increment en el consum de carbohidrats, especialment fructosa, sobretot en forma de begudes edulcorades. Estudis anteriors del nostre grup de recerca van demostrar que l’administració de fructosa al 10% (p/v) en l’aigua de beguda a rates mascle durant 14 dies produeix hipertrigliceridèmia i esteatosi hepàtica. En rates femella, provoca, a més, hiperglucèmia, hiperinsulinèmia i un estat d’intolerància a la glucosa. Per tant, els resultats d’aquest estudi semblen indicar que les rates femella són mes susceptibles als efectes negatius de l’administració de fructosa. En aquest context, els objectius que s’han pretès assolir en la present tesi doctoral han estat: 1) Determinar en quin moment apareixen la hipertrigliceridèmia i l’esteatosi hepàtica en rates femella com a conseqüència del consum de fructosa i estudiar quins són els mecanismes moleculars subjacents. 2) Esbrinar en quin moment té lloc l’augment dels nivells d’insulina i glucosa en plasma, quan apareix la intolerància a la glucosa, i determinar quins són els mecanismes moleculars pels quals la fructosa causa aquestes alteracions en rates femella. En relació al primer objectiu, els resultats indiquen que la hipertrigliceridèmia i la esteatosi hepàtica apareixen als 14 dies, però no als 7 dies de tractament. La repressió de l’expressió de PPARα i els seus gens diana té un paper fonamental en la reducció del catabolisme lipídic i l’augment dels nivells de triglicèrids a nivell plasmàtic i hepàtic. Els cultius de diferents tipus d’hepatòcits en presència de fructosa i altres compostos activadors i inhibidors de determinades proteïines han permès aprofundir en el mecanisme molecular responsable, i han mostrat que la reducció de l’expressió de PPARα per la fructosa també té lloc en hepatòcits d’origen humà. Els resultats obtinguts indiquen que l’activació de ChREBP podria tenir un paper important en la repressió del sistema PPARα. Pel que fa al segon objectiu, la hiperglucèmia, hiperinsulinèmia i intolerància a la glucosa només després de 2 setmanes de tractament. També a aquest temps, es produeix una alteració de l’expressió de molècules necessàries per a la correcta senyalització de la insulina en el fetge, entre elles IRS-2. La reducció dels nivells de proteïna IRS-2, malgrat ser important per provocar un dèficit de senyalització de la via PI3K/AKT, no condueix a un estat clàssic de resistència hepàtica a la insulina, ja que l’activitat gluconeogènica no es troba incrementada. Aquestes observacions suggereixen, en primer lloc, que la intolerància a la glucosa té un origen extrahepàtic, i en segon lloc, l’existència d’un mecanisme compensatori per evitar precisament que el fetge augmenti la producció hepàtica de glucosa.; In previous studies, our research group showed that fructose administration (10% w/v) into drinking water during 14 days induces hypertriglyceridemia and fatty liver in male rats. In addition, this 14-day fructose supplementation caused, hyperglycemia, hyperinsulinemia and glucose intolerance in female rats. Thus, female rats seem to be more sensitive to the deleterious effect of fructose on glucose homeostasis than male rats. In this context, the main goals of the present work have been: 1) To determine the temporal evolution of fructose-induced hypertriglyceridemia and hepatic steatosis in female rats, and to study the molecular mechanisms involved; 2) To determine the temporal evolution of the hyperglycemia, hyperinsulinemia and glucose intolerance induced by fructose ingestion in female rats, and to elucidate the underlying molecular mechanisms. The results of the present work show that hypertriglyceridemia and fatty liver take place at 14 days but not at 7 days of fructose treatment. Fructose-mediated PPARα repression plays a key role in the reduction of lipid catabolism and in the increased plasma and liver triglyceride concentrations. Cell culture of different types of liver cells in presence of fructose and other compounds have made possible to study the molecular mechanisms involved in PPARα repression, an effect also observed in a primary culture of human hepatocytes. Further, the results of this work suggest that the hyperactivation of ChREBP may have an important role in fructose-mediated PPARα repression. On the other hand, hyperglycemia, hyperinsulinemia and glucose intolerance only take place after 14 days of fructose consumption. At this time, there is a lack of expression of several molecules involved in insulin pathway, such as IRS-2. The reduction of IRS-2 expression, despite contributing to an improper insulin signaling in liver, does not lead to a classic state of hepatic insulin resistance, since the expression of the main gluconeogenic enzymes is not increased. These observations suggest that fructose-induced glucose intolerance has not a hepatic origin, and also the existence of a compensatory mechanism that avoids an increase of hepatic glucose production.

Sistemes bicel•lars com a nova estratègia d’aplicació tòpica

Wed, 12 Sep 2012 10:17:04 GMT

Sistemes bicel•lars com a nova estratègia d’aplicació tòpica Rubio Toledano, Laia Durant les últimes dècades, hi ha hagut gran interès en l'exploració de noves tècniques per modular l'absorció d’un fàrmac a través de la pell. Aquests estudis apunten a la necessitat d'obtenir vehicles de mida adequada, alta estabilitat i biocompatibilitat. Els sistemes bicel•lars són nanoagregats constituïts per fosfolípids de cadena alquílica llarga i fosfolípids de cadena curta. Depenent de la composició i de la temperatura aquests sistemes poden tenir diferents formes sent les més comunes les nanoestructures discoïdals anomenades bicel•les, on els fosfolípids de cadena llarga estan ordenats com una bicapa plana i els fosfolípids de cadena curta s’organitzen en les vores, tancant l’estructura. Tenint en compte l'estructura, composició i nanodimensions d'aquests sistemes, el seu ús com a sistemes tòpics d’ alliberació pot ser interessant. El diclofenac de dietilamina (DDEA) i l'àcid flufenàmic (FFA) són potents fàrmacs antiinflamatoris no esteroides (AINEs) amb efectes analgèsics. DDEA i FFA poden provocar efectes secundaris quan s'administren per via oral o per injecció intramuscular. Per tant, la identificació d'estratègies per reduir la toxicitat i augmentar l'efecte farmacològic dels AINEs pot ser de gran rellevància. A més, el FFA és insoluble en aigua i els dissolvents orgànics que són capaços de solubilitzar aquesta droga podrien afectar a la pell. A causa d'això, la inclusió del DDEA o del FFA en sistemes bicel•lars com a vehicle podria ser una bona alternativa. Normalment, els estudis d’absorció percutània de fàrmacs es realitzen en biòpsies de pell amb la funció barrera del estrat corni (SC) intacta. No obstant això, sota diferents condicions patològiques, la funció de barrera del SC es veu afectada. Es per això que s’ha cregut interessant el fer estudis d’absorció percutània tan en pell sana com en pell amb la funció barrera deteriorada. Anteriorment als estudis d’absorció percutània in vitro amb pell porcina s’ha fet una caracterització fisico-química exhaustiva dels sistemes bicel•lars estudiats amb i sense fàrmac. Aquesta caracterització s’ha dut a terme mitjançant diverses tècniques específiques com ara: DLS, DSC, Cryo-TEM, FFEM, SAXS i WAXS. Posteriorment als estudis de permeació cutània, s’ha estudiat els efectes produïts pels sistemes bicel•lars a la pell mitjançant les tècniques de FS-TEM, ATR-FTIR i SAXS-SR. Els resultats obtinguts en la caracterització fisico-química indiquen que els sistemes bicel•lars són capaços d’incorporar tant un principi actiu amfifílic (DDEA) com un lipofílic (FFA). La inclusió de DDEA en els sistemes bicel•lars ocasiona una disminució del seu tamany de partícula i de l’amplada de la bicapa, i un empaquetament lateral ortoròmbic. En canvi la inclusió de FFA indueix un augment del tamany de l’estructura bicel•lar. S’ha visualitzat la formació de nous agregats, com grans estructures multilaminars, estructures ondulades, discoïdals o tubulars, en funció de la temperatura. Els resultats de SAXS indiquen que a 25 °C aquests nanoagregats formen làmines apilades i a 32.5 i 37 °C no es detecta cap apilament ni reducció del tamany de la bicapa respecte als sistemes sense fàrmac. Dels resultats de WAXS es va deduir que la incorporació del FFA indueix un desordre en l’empaquetament lateral passant d’ortoròmbic a hexagonal. En ambdós casos els resultats d’absorció percutània indiquen un efecte retardant de l’absorció del fàrmac quan aquest és inclòs en els sistemes bicel•lars. En canvi quan es fa un pretractament de la pell amb sistemes bicel•lars sense fàrmac i després s’aplica una solució aquosa de DDEA, l’efecte és de potenciador de l’absorció percutània. S’ha dissenyat un protocol in vitro d’absorció percutània utilitzant com a compostos de referència l’àcid salicílic i la cafeïna, que permet simular el comportament d’una pell patològica amb la seva funció barrera deteriorada. Aquest mètode d’absorció percutània contempla unes condicions més realistes per obtenir un perfil d’absorció percutània més rigorós en el cas d’una pell patològica. Utilitzant aquest protocol específic d’absorció percutània, s’ha pogut constatar que els sistemes bicel•lars que contenen DDEA poden exercir un efecte protector sobre la funció barrera de la pell. A més, l’efecte retardant dels sistemes bicel•lars podria afavorir l’acció antiinflamatòria del DDEA a nivell de l’epidermis i la dermis i disminuiria el possible efecte toxicològic a nivell sistèmic. Considerant conjuntament els resultats es pot deduir que els sistemes bicel•lars poden ser bones estratègies de vehiculització de principis actius per a la seva aplicació tòpica.

Nanoemulsiones de nistatina para el tratamiento de candidiasis muco-cutáneas

Tue, 17 Jul 2012 11:19:47 GMT

Nanoemulsiones de nistatina para el tratamiento de candidiasis muco-cutáneas Fernández Campos, Francisco Se han desarrollado y optimizado dos nanoemulsiones que contienen Nistatina (N1 y N2) para su aplicación en piel y mucosa oral, respectivamente. Estas formulaciones tuvieron un tamaño de gota nanométrico y resultaron ser estables a lo largo del tiempo. Adicionalmente se determinó el comportamiento reológico de ambos sistemas resultando ser fluidos newtonianos. Se evaluó la actividad antifúngica in vitro, observado que la potencia de la nistatina aumentó al ser introducida en las nanoemulsiones, cuando se comparaba con la nistatina libre. El mecanismo de liberación de la nistatina de las nanoemulsiones siguió una cinética de orden uno para ambas formulaciones. Trás el ensayo de permeación ex vivo en piel humana con la nanoemulsion N1 se observó que la cantidad de fármaco permeada fue muy baja, pudiendo descartarse la posible aparición de efectos adversos a nivel sistémico. De la misma manera se realizó el ensayo de permeación ex vivo en mucosa oral porcina para la formulación N2 llegando a la misma conclusión que en el caso de la permeación en piel. En ambos casos la cantidad de fármaco retenido en el tejido (tanto en piel o mucosa) es suficiente para observar un efecto fungistático, fungicida y un prolongado efecto post-antifungico (PAFE). Con el fin de determinar el efecto de la nanoemulsion N2 sobre la mucosa oral se visualizó la ultra-estructura del tejido y no observándose variaciones significativas cuando se comparaban con el control (mucosa no tratada con la nanoemulsion). Las nanoemulsiones N1 y N2 son formulaciones prometedoras para el potencial tratamiento clínico de candidiasis muco-cutáneas.; Muco-cutaneous candidosis is a common opportunistic infection must be treated to prevent other tissue invasion. Nystatin is one of the most prescribed drugs to treat this pathology, but due to its physicochemical properties its pharmaceutical-technological requirements make it a challenge. The purpose of this work was the development and characterization of an optimal nystatin delivery system for the potential treatment of oral candidosis avoiding undesirable side effects and toxicity of potential systemic absorption. Two nanoemulsion (N1 and N2) was developed, evaluated and characterized. It has been formulated successfully as a stable nanoemulsion with a droplet size of 75 and 138 nm, respectively. First order release parameters were estimated using different mathematical approaches and ex vivo permeation of nystatin through human skin and porcine buccal mucosa were found no systemic effects would happen. Microbiologic studies performed revealed an enhanced antifungal effect of the nystatin loaded nanoemulsion. Also the evaluation of buccal mucosa ultrastructure by transmission electron microscopy methodology showing a harmless effect in the mucosa microstructure. We can infer that the selected nystatin nanoemulsion could be potentially used on candidosis infection under mucositis conditions.

Disseny, síntesi, avaluació farmacològica i modelatge molecular de nous inhibidors de l’acetilcolinesterasa de lloc d’unió dual

Fri, 18 May 2012 07:32:06 GMT

Disseny, síntesi, avaluació farmacològica i modelatge molecular de nous inhibidors de l’acetilcolinesterasa de lloc d’unió dual Galdeano Cantador, Carlos El principal factor desencadenant del procés de neurodegeneració que caracteritza la Malaltia d’Alzheimer (MA) és el pèptid beta-amiloide (BA). La formació incrementada d’aquest pèptid i la seva agregació en forma d’oligòmers i fibrilles estan a l’origen d’una cascada de processos neurotòxics que culminen amb una disfunció neuronal generalitzada i mort neuronal. Recentment s’ha descrit una funció no colinèrgica de l‘enzim acetilcolinesterasa (AChE) d’importància fonamental en el context de la MA, ja que col•loca l’enzim a l’inici de la cascada de neurodegeneració de la malaltia. El Prof. Inestrosa va demostrar que l’enzim AChE, que coexisteix amb el BA en les plaques senils, es pot unir al pèptid accelerant in vitro la seva agregació. L’AChE no només promou l’agregació del BA sinó que a més promou l’agregació d’altres pèptids amiloidogènics, com pot ser el pèptid priònic. El lloc d’unió de l’AChE d’aquests pèptids és l’anomenat lloc perifèric de l’enzim, una zona d’unió que es troba a l’entrada de una cavitat o gorja d’uns 20 Å de longitud, al fons de la qual es troba el centre catalític de l’enzim. Així, en aquesta Tesi Doctoral quatre noves famílies d’híbrids que interaccionen simultàniament amb el centre catalític i el lloc perifèric de l’enzim han estat dissenyades, sintetizades i avaluades per la seva habilitat d’inhibir l’AChE, la butirilcolinesterasa, l’agregació del pèptid BA i l’agregació d’aquests pèptids amiloidogènics induïda per AChE. A més, els estudis de modelatge molecular realitzats han demostrat el caràcter d’inhibidors d’unió dual d’aquests nous híbrids.; The design of novel classes of inhibitors of acetylcholinesterase (AChE) have been mostly driven during the last years by the pivotal finding that AChE can promote aggregation of the β-amyloid peptide. Blockade of the peripheral site of AChE, the Aβ recognition zone within the enzyme, is therefore expected to affect the AChE-induced Aβ aggregation and could be a potential strategy to modulate the progression of Alzheimer’s Disease. On the basis of this premises novel classes of AChE inhibitors able to simultaneously bind to both peripheral and catalytic sites of AChE have emerged as promising anti-Alzheimer drug candidates. In this Thesis, new families of dual binding site inhibitors have been designed, synthesized and tested. To gain insight into the molecular determinants that modulate the AChE inhibitory activity of these novel inhibitors, the binding mode of the most active compounds was investigated by means of molecular modelling studies.

Desarrollo de Nuevas Reacciones Multicomponente basadas en la activación de isonitrilos. Aplicaciones en biomedicina

Mon, 23 Jan 2012 08:49:44 GMT

Desarrollo de Nuevas Reacciones Multicomponente basadas en la activación de isonitrilos. Aplicaciones en biomedicina Kielland, Nicola Una reacción multicomponente (MCR) se define como un proceso en el cual tres o más reactivos forman un aducto final a través de un único mecanismo. Las MCRs tienen muchas ventajas en comparación con las síntesis clásicas, en las cuales el producto final se obtiene utilizando una secuencia multietapa con formación de un solo enlace en cada paso. En la presente tesis se describen dos nuevas MCRs, desarrolladas a través de una estrategia racional, en la cual un isonitrilo es activado por un agente electrofílico para generar un intermedio de reacción. Tal interacción desencadena una reacción dominó que comporta la incorporación de una o dos ulteriores especies químicas. Cada proceso está precedido por una amplia revisión bibliográfica del tema en forma de capítulo de libro (Capitulos 1 y 3).(1,2) A continuación se describen las aplicaciones en biomedicina de los aductos obtenidos. El primer proceso (Capitulo 2)(3) describe nuevas MCRs de aldehídos, isonitrilos, organoboranos y dipolarófilos para generar de forma eficiente varios scaffolds como aziridinas, oxazolidinas y pirrolidinas diversamente sustituidas. Esta química inspirada por una comunicación breve de Hesse en 1965 es simple y requiere condiciones suaves. El proceso describe la interacción de isonitrilos, boranos y aldehídos para generar un iluro de azometíno, que reacciona en una cicloadición con un segundo equivalente de aldehído para formar oxazolidinas. Se ha logrado sustituir el segundo equivalente de aldehído por una amplia selección de dipolarofilos y sintetizar de ese modo pirrolidinas sustituidas de una forma alternativa a las síntesis tradicionales. Se ha investigado la reactividad de cada componente. Adicionalmente se han hecho consideraciones sobre la estereoquímica observada en la formación de oxazolidinas y de aductos de cuatro componentes con el soporte de estudios computacionales, que han permitido identificar los factores que gobiernan el resultado de la MCR. En conclusión, los resultados obtenidos constituyen una innovación sustancial, validan el descubrimiento original de Hesse y describen nuevas vías de reactividad en la interacción de boranos, isonitrilos y compuestos carbonílicos. El segundo proceso (Capitulo 4) (4) describe una nueva MCR de azinas con TFAA (anhídrido trifluoroacético) e isonitrilos para dar fluoruros de ácido mesoiónicos en un proceso dominó. Esta reacción tiene un carácter general, tolera una amplia gama de sustituyentes en cada componente y la conectividad de los átomos en los aductos finales sugiere una secuencia mecanística sin precedentes. El grupo funcional sintetizado en la mayoría de las reacciones es un fluoruro de acido mesoiónico: un tipo estructural inédito en la literatura y que presenta características de gran interés. Los aductos muestran la reactividad esperada con nucleófilos (alcoholes, tioles o aminas), permitiendo la introducción de un componente sintético adicional. En este contexto, la novedad más relevante reside en la baja reactividad del fluoruro, posiblemente disminuida por la presencia del dipolo; consecuentemente, esta especie resulta muy estable. Ello ha posibilitado su aislamiento, caracterización, así como su almacenamiento, lo que ha devenido un factor clave en sus aplicaciones, que se basan en su reactividad en disolventes acuosos, tampones básicos o incluso en cultivos celulares. En el capitulo 5 y en la adenda se describen dos aplicaciones en biomedicina de algunos de los aductos obtenidos en el capitulo 4. En el primer caso (5) se describe la síntesis de conjugados de oligonucleótidos con nuevos marcadores fluorescentes con una estructura de tipo imidazo[1,2-a]azina. Se detalla la preparación de esos oligonucleótidos modificados por incorporación del fluoróforo ligado a la posición 3’ o 5’, a través de un espaciador aminado, en fase solución. Los oligonucleótidos autocomplementarios marcados forman dímeros estables. El análisis de las curvas de punto de fusión demuestra que el dímero de ADN modificado con el marcador de fluorescencia a una de las extremidades presenta un ligero aumento en la estabilidad de la doble hélice. Adicionalmente la desnaturalización provoca un aumento en la fluorescencia. Estudios de cultivos celulares han permitido observar la internalización de los oligonucleótidos marcados en células HeLa, en presencia de agentes de transfección. En la adenda (6) se describe el desarrollo de un nuevo biosensor de histamina aplicando los dipolos descritos en el capítulo 4 a la metodología DOFLA. Estos estudios se han llevado a cabo en los laboratorios del Singapore Bioimaging Consortium (Biopolis) en colaboración con el grupo del Prof. Chang. La formación de un aducto covalente entre los fluoruros de ácido mesoiónicos con histamina causa un sensible aumento en la intensidad de fluorescencia y un desplazamiento ratiométrico del máximo de emisión. El proceso es selectivo frente a varios metabolitos, incluyendo otros neurotrasmisores. Se ha evidenciado experimentalmente el papel clave de la cinética de la reacción en la selectividad del proceso. Se ha empleado el sensor para marcar células RBL 2H3 (basófilos, que almacenan histamina) frente a células RAW 264.7 (macrófagos, sin histamina). También se ha usado el sensor para marcar cambios en los niveles de histamina en células RBL 2H3 (estimulando, por vía immunitaria, la liberación de histamina) o en células RAW 264.7 (induciendo la formación de histamina con thapsigargina). En definitiva, se ha desarrollado un nuevo biosensor para la visualización de histamina en células funcionales. BIBLIOGRAFIA: (1) R. Ramon, N. Kielland, R. Lavilla. in Isocyanide Chemistry - Applications in Synthesis and Material Science, WILEY, (in press) (2) N. Kielland, R. Lavilla. in Synthesis of Heterocycles via Multicomponent Reactions II, Series: Topics in Heterocyclic Chemistry, Vol.25 eds. R. V. A.Orru, E. Ruijter, Springer, 2010, ISBN: 978-3-642-15454-6. (3) N. Kielland, F. Catti, D. Bello, N. Isambert, I. Soteras, F. J. Luque, R. Lavilla, Chem. Eur. J. 2010, 16, 7904-7915. (IF 5.476; 3 cites) (4) M. J. Arévalo, N. Kielland, C. Masdeu, M. Miguel, N. Isambert, R. Lavilla, Eur. J. Org. Chem. 2009, 617–625. (IF 3.206; 5 cites) (5) S-P. Rentero, N. Kielland, R. Lavilla, R. Eritja, Bioconj. Chem., 2010, 21, 1622–1628. (IF 5.002) (6) N. Kielland, M. Vendrell, R. Lavilla, Y. T. Chang. New selective histamine biosensor for in vivo imaging. (Manuscript in preparation).; Development of new MCRs based on activation of isocyanides. Applications in biomedicine. A multicomponent reaction is defined as a process in which three or more reactants form a final adduct through a unified reaction mechanism. MCRs show several advantages if compared with classical organic synthesis, in which the final product is obtained through a multistep sequence with formation of one single bond in each step. In this thesis two new MCRs are described, discovered through a rational approach, in which an isocyanide is activated by an electrophylic reactant to generate a reaction intermediate. This interaction triggers a domino process in which one or more components are involved. Each process is preceded by a related general review in form of book chapter.1-4 Applications in biomedicine of the obtained products are described in the last two sections.5,6 Bibliography 1 R. Ramon, N. Kielland, R. Lavilla. in Isocyanide Chemistry - Applications in Synthesis and Material Science, WILEY, (in press) 2 N. Kielland, R. Lavilla. in Synthesis of Heterocycles via Multicomponent Reactions II, Series: Topics in Heterocyclic Chemistry, Vol.25 eds. R. V. A.Orru, E. Ruijter, Springer, 2010, ISBN: 978-3-642-15454-6. 3 N. Kielland, F. Catti, D. Bello, N. Isambert, I. Soteras, F. J. Luque, R. Lavilla, Chem. Eur. J. 2010, 16, 7904-7915. (IF 5.476; 3 cites) 4 M. J. Arévalo, N. Kielland, C. Masdeu, M. Miguel, N. Isambert, R. Lavilla, Eur. J. Org. Chem. 2009, 617–625. (IF 3.206; 5 cites) 5 S-P. Rentero, N. Kielland, R. Lavilla, R. Eritja, Bioconj. Chem., 2010, 21, 1622–1628. (IF 5.002) 6N. Kielland, M. Vendrell, R. Lavilla, Y. T. Chang. New selective histamine biosensor for in vivo imaging. (Manuscript in preparation).

Síntesi i aplicació de phi-dipèptids amb estructura de 3 aminopiperidona. Síntesi de phi-melanotans

Mon, 14 Nov 2011 08:35:54 GMT

Síntesi i aplicació de phi-dipèptids amb estructura de 3 aminopiperidona. Síntesi de phi-melanotans Mas Pons, Jordi Els melanotans son pèptids derivats de la hormona melanotropínica (alfa-MSH). Aquesta forma part del sistema melanocortínic, juntament amb altres hormones com la ACTH, la beta-MSH o la gamma-MSH entre d’altres. Els pèptids melanocortínics presenten una mateixa seqüència central basada en els residus de His3-Phe4-Arg5-Trp6 que és la seqüència activa dels pèptids. Aquests, realitzen les seves funcions per interacció amb 5 receptors melonocortínics que es troben ampliament distribuïts per l’organisme. Amb anterioritat a aquest treball, s’havien sintetitzat una gran quantitat de pèptids derivats de la hormona alfa-MSH. Concretament la substitució de la Met de la posició 4 per Nle i la recemització de la Phe de la posició 7 en D-Phe van conduir a la síntesi del Melanotan-1 (MT1) un tridecapèptid linear el qual mostrava una millor estabilitat metabòlica i una activitat més potent quan es comparava amb la hormona model però que era poc selectiu per cap dels receptors de melanocortina humans. Per tal de restringir la conformació de l’MT1 i fer-lo més selectiu, el grup del Prof. Hruby de la Universitat d’Arizona va sintetitzar l’heptapèptid cíclic Melanotan-2 (MT2) el qual era molt més potent que MT1 però que com aquest va resultar ser poc selectiu. Degut a aquesta manca de selectivitat, és d’una importancia capital trobar lligands per a cadascun d’aquests receptors per tal de poder determinar el paper fisiològic que té cadascun d’ells. Així, la present tesi doctoral té per objectiu el disseny i la síntesi de pseudomelanotans a partir del pèptid model MT2 per tal de millorar-ne la selectivitat per a un determinat receptor. L’MT2 és un cicloheptapèptid que presenta un gir beta centrat en els residus d’His3-D-Phe4 i una ciclació per la cadena lateral dels residus d’Asp2 i Lys7. Treball previs d’altres autors s’han centrat sobretot en modificar la part activa de la molècula, mentre que en el present treball ens volem centrar en la part flexible per tal de no alterar-ne la seva activitat. En primer lloc, per tal de rigidificar la zona flexible de l’MT2 es va dur a terme la síntesis de diferents estructures pseudopeptídiques rígides: el lactam 13, la oxazolopiperidona 15 i els diazanorbornans 101b, 108 i 114 i el diazanorborné 115. Posteriorment, es descriu la incorporació d’aquestes estructures rígides en els pseudomelanotans derivats d’MT2 per síntesi peptídica en fase sòlida. Els pseudomelanotans obtinguts es poden classificar en 3 grups: a) Els compostos 13 i 108 es fan servir per substituir el Trp, donat que aquest es troba just al costat del gir beta. D’aquesta manera se sintetitzen els pèptids 120 i 121a i 121b. b) L’oxazolopiperidona 15 al ser un mimètic de gir beta es fa servir per substituir els redidus centrals del gir beta (His3-D-Phe4) per tal d’obtenir el pseudomelanotan 122. c) Pseudomelanotans en que la part flexible de la molècula ha estat modificada. D’aquesta manera s’obtenen els pseudopèptids 123, 124, 125 i 126 al modificar la Lys7 per l’oxazolopiperidona 15, els diazanorbornans 101b i 114 o pel diazanorbornè 115. Finalment, un cop sintetitzats els derivats d’MT2 van ser sotmesos a estudis de RMN. Aquesta tècnica és particularment útil ja que permet determinar la formació d’enllaços d’hidrogen, les distàncies interprotòniques i els angles diedres. A més a més, les dades ens serveixen com a restriccions per a càlculs de modelització molecular. Destaquen els resultats obtinguts pel compost 121a el qual manté el gir beta present en el compost model i a més a més mostra un gir complementari. En el cas dels pèptids 122 i 123 que inclouen l’oxazolopiperidona 15 en la seva estructura i de l’azapèptid 120 també s’observa un restricció conformacional respecte al model.; Alpha-melanocyte stimulating hormone (alpha-MSH) is a linear tridecapeptide which plays a role in a wide range of biological responses like feeding behaviour, pain modulation, sexual function, energy homeostasis and thermoregulation. The principal pharmacophore groups of alpha-MSH were found to be the side chains of the central tetrapeptide His-Phe-Arg-Trp. Since the discovery of alpha-MSH, numerous linear analogues of native alpha-MSH have been synthesized to enhance melanotropic potency. Hence, substitution of the Nle for Met at the 4-position and racemization to D-phenylalanine at the 7-position led to Melanotan-1 (MT1) which showed enhanced metabolic stability and improved potency compared with alpha-MSH. In order to constrain MT1, the group of Prof. Hruby synthesized the cyclic heptapeptide MT2 which was a very potent but non-selective agonist for the human melanocortin receptor subtypes MC1R, MC3R, MC4R and MC5R. Because of the lack in selectivity, finding selective ligands for each of the receptors is crucial for the determination of their individual physiological roles. The aim of the present work is the design and synthesis of a collection of phimelanotans to improve their biological properties with respect to MT2. First of all, we have prepared several constrained pseudodipeptides (lactam 13, diazanorbornanes 101b and 108) or -turn mimics (oxazolopiperidone 15, diazanorbornane 114 and diazanorbornene 115) to replace native residues of MT2. Then, we describe the synthesis of the phi-melanotans incorporating our constrained scaffolds by SPPS. Three types of phi-melanotans are obtained: a) Compounds 120, 121a and 121b with modification of the active part of the molecule. b) Pseudopeptide 122 is obtained by substitution of oxazolopiperidone 15 for the central residues of the beta-turn (His3-D-Phe4). c) Pseudomelanotans 123, 124, 125 and 126 are prepared by modification of the flexible part of the model peptide. Finally, we have demonstrated by NMR studies that incorporation of our constrained scaffolds led to the formation of conformational constrained pseudopeptides.

Síntesi total de productes marins amb l’estructura triptòfan-pirroloindole

Tue, 04 Oct 2011 10:05:55 GMT

Síntesi total de productes marins amb l’estructura triptòfan-pirroloindole Ruiz Sanchis, Pau L’estudi d’espècies marines (micro- i macroorganismes) és interessant perquè ha conduit a l’aïllament de substàncies amb una estructura química totalment diferent de les trobades en productes naturals aïllats d’organismes terrestres i a més amb una amplia gama de activitat biològica força interessant. La mayotlida és un producte natural d’origen marí aïllat per la empresa Pharmamar d’una mostra de Spongia sp. La mayotlida presenta activitat inhibidora del creixement (GI50) del ordre nanomolar. Des del punt de vista estructural, la mayotlida és un sistema octapeptídic i té la peculiaritat de la unió entre dos triptòfans (Trps), mitjançant l’enllaç entre el N indòlic d’un i el C3a de l’altre, que es troba ciclat constituint una unitat hexahidropirroloindole (HPI). Aquesta estructura triptòfan-pirroloindole ha sigut detectada, fins el moment en pocs productes naturals, i la mayotlida és el primer exemple d’un compost bis-macrocíclic amb aquest enllaç. En el capítol 1 de la memòria s’estudia la formació del sistema triptòfan-pirroloindole, per a lo qual s’ha assajat la reacció entre un Trp i un anàleg halogenat de l’HPI en diferents condicions experimentals a fi de trobar les més adients. Estàn descrites dues rutes sintètiques que condueixen a la formació de l’HPI halogenat en la posicióo 3a, conduint cadascuna a un diastereòmer distint. A més, en la formació de l’enllaç entre el C3a de l’HPI i el N indòlic del Trp, s’han escollit els grups protectors més adients i amb ortogonalitat entre ells per al creixement ordenat i selectiu del sistema Trp-HPI. En el capítol 2 s’inicia la síntesis de la mayotlida. En primer lloc, s’ha estudiat la formació de l’anell A, que és l’anell petit de la mayotlida. L’anell A és un macrocicle de tretze puntes format per tres aminoàcids: un Trp, l’HPI i l’Ile. S’han assajat tres posicions de macrociclació per a comprovar el punt idoni per tancar l’anell. S’ha determinat l’estereoquímica relativa dels estereocentres d’aquest anell mitjançant experiments de RMN mono i bidimensionals. La segona part d’aquest capítol es dedica a la formació del segon macrocicle, que anomenem anell B. S’ha sintetitzat, en fase sòlida, la cadena lineal pentapeptídica que unida als grups àcid i amina de l’anell A conduirà a l’anell B de la mayotlida. S’ha acoblat aquesta cadena amb l’anell A i s’ha realitzat la macrociclació de l’anell B per fornir la mayotlida. S’ha comparat la mayotlida sintètica amb la natural, coeluint ambdues al mateix temps. En el capítol 3 s’ha plantejat la síntesi de dos anàlegs de la mayotlida, els quals tenen la mateixa seqüència peptídica que l’anell B de la mayotlida i es diferèncien en que no tenen l’enllaç Trp-HPI, és a dir, no contenen l’anell A en la seva estructura; a més, un d’ells té un Trp enlloc de l’HPI. Endemés, s’ha assajat l’activitat de l’anell A de la mayotlida i d’un dels anàlegs sintetitzats.; Marine natural products research is interesting because marine species (micro- and macroorganisms) biosynthesize compounds with different chemical structures and bioactivities from terrestrial natural products. Mayotlide is a marine natural product; it was isolated by Pharmarmar from a sample of Spongia sp. Mayotlide shows a nanomolar GI50 activity. Structurally, mayotlide is an octapeptidic system and it has the characteristic trait: the bond between Trp’s – the N-indole of a Trp and the C3a of a cycled Trp: a hexahydropyrroloindole unit (HPI). Few natural products contain this Trp-HPI system in their structures until the moment, and mayotlide is the first example of a bis-macrocyclic compound with this bond. The chapter 1 of the manuscript studies the synthesis of tryptophan-pyrroloindole system, which requires the reaction between a Trp and a halogenated HPI. Two synthetic routes have been reported to afford the halogenated HPI at C3a, each of which afford one mainly different diastereomer. In addition, the most suitable orthogonal protecting groups have been selected to allow the selective growing from the Trp-HPI system. The chapter 2 is about the beginning of the synthesis of mayotlide. First, the synthesis of the A ring has been studied, which is the small ring of mayotlide. The A ring is composed of three amino acids: Trp, Ile, and HPI. Three closing points of macrocycle have been tested. Several mono and bidimensional NMR experiments have made relative stereochemistry of stereocenters possible. The second half of this chapter is about the second macrocycle formation. The elongation of peptide chain of mayotlide has been synthesized on solid phase. Then, the couplings between the peptide chain and the A ring have been performed, affording the synthetic mayotlide. The natural and synthetic mayotlide have coeluted at the same time in a HPLC. The syntheses of two analogues of mayotlide have been studied in chapter 3. The structures of these analogues are one cycle which contain the same peptide sequence of the B ring of mayotlide; one of them has change the HPI for a Trp. In addition, the activities of the A ring and one analogue have been tested.

Metodologies d’anulació en substrats heterocíclics: Reaccions de RCM i ciclacions de Heck

Tue, 12 Jul 2011 10:25:39 GMT

Metodologies d’anulació en substrats heterocíclics: Reaccions de RCM i ciclacions de Heck Alonso Serrano, Sandra La present Tesi Doctoral es situa en el context de l’estudi d’estratègies sintètiques per a la formació d’anells en l’àrea heterocíclica. En particular, s’han avaluat les possibilitats sintètiques de la combinació de dues reaccions d’eficàcia prou reconeguda per a la formació d’enllaços carboni-carboni, la reacció de RCM i la reacció intramolecular de Heck d’halurs vinílics, per a la construcció de les estructures policíliques amb pont característiques dels alcaloides ervitsina i aparicina, així com també de la unitat superior de la vinorelbina. Els principals aconseguiments del treball i les conclusions més significatives que se’n deriven s’exposen a continuació: • La reacció de RCM de diens indòlics ha mostrat ser un bon procediment per a la formació d’anells de 8 baules fusionats amb el nucli indòlic. L’eficiència de la ciclació, combinada amb la facilitat de preparació dels substrats diènics a partir de compostos indòlics senzills, determina que l’estratègia pugui ser emprada com a via d’accés a les subestructures tricícliques tant de l’alcaloide aparicina com de la unitat superior de la vinorelbina. • L’aminació reductora d’indole-3-carbaldehids amb alquenilamines permet instal•lar cadenes d’alquenilaminometil a la posició 3 de l’heterocicle, d’interès per la preparació dels substrats diènics precursors de diversos azacicles per RCM. En el cas particular de 2-vinil-3-indolecarbaldehids, el procés d’aminació reductora no és compatible amb la presència d’un grup fenilsulfonil a l’àtom de nitrogen indòlic, ja que en comptes d’obtenir-se la corresponent amina secundària, s’observa la formació ràpida del nucli de tetrahidro-γ-carbolina. L’anulació és el resultat de l’addició conjugada de l’amina primària a l’agrupació d’aldehid γ, δ insaturat del substrat, seguida d’un procés d’aminació reductora intramolecular. • La metodologia de doble anulació RCM-Heck possibilita l’accés al sistema amb pont de 2-azabiciclo[4.3.1]decà característic de l’alcaloide ervitsina. En concret, la reacció de RCM quimioselectiva d’un triè indòlic genera un ciclohepta[b]indole, amb un doble enllaç adequat per al tancament subsegüent de l’anell de piperidina mitjançant un acoblament intramolecular de Heck amb l’halur vinílic, connectat al sistema anular a través de l’àtom de nitrogen. Si bé s’ha accedit al sistema tetracíclic de l’alcaloide que incorpora el substituent E-etilidè a la posició 20, l’estratègia no s’ha pogut estendre a la preparació de compostos tetracíclics funcionalitzats a la posició 3. • S’ha dut a terme la primera síntesi total de l’alcaloide aparicina mitjançant una via sintètica concisa que implica com a etapas clau: (i) la reacció de RCM d’un diè indòlic per construir l’anell central de 8 baules; (ii) la isomerització promoguda per base del doble enllaç resultant de la ciclació, amb desprotecció concomitant de l’àtom de nitrogen indòlic; i (iii) la ciclació de Heck d’un halur vinílic per completar la formació de l’esquelet amb pont d’1-azabiciclo[4.2.2]decà i al mateix temps introduïr els dos dobles enllaços exocíclics de l’alcaloide. • La inserció de l’agrupació de 2-etilpropè entre l’àtom de nitrogen alifàtic i la posició 4 d’un azocino[4,3-b]indole mitjançant una seqüència d’N-alquilació seguida de ciclació de Heck permet la formació del sistema amb pont d’1-azabiciclo[5.3.1]undecà característic de la unitat superior de la vinorelbina. Aquest resultat, juntament amb l’obtingut en el context de la síntesi de l’aparicina, posa de manifest la validesa dels acoblaments intramoleculars de Heck en els quals intervenen dobles enllaços inclosos en anells mitjans.; The first part of this thesis work focus attention to: • The new synthetic route to the azocino[4,3-b]indole system relying on RCM of 2-allyl-3-(allyl-aminomethyl)indoles. The efficiency of the cyclization combined with the easy preparation of the dienic precursors from simple indolic derivates make this strategy attractive for the construccion of medium-sized indolo 2,3-fused carbo- and azacycles, which are scaffolds found in many bioactive compounds. • Our efforts in getting more azepinoindole systems leads to tetrahydro γ-carbolines. The reaction of N-(phenilsulfonyl)-2-vynil-3-indolecarbaldehydes with primary amines under mild reductive amination conditions leads to tetrahydro-γ-carbolines. The process can be suppressed by changing the protecting group at the indole nitrogen for a methoxymethil group, thus allowing the preparation of RCM substrates for azepinoindole synthesis. In the second part: • An efficient approach to the bridged framework of the indole alkaloid ervitsine have been done. The RCM reaction from a 2,3-disubstituted indole followed by a vynil halide Heck cyclazation upon the resulting cycloheptene ring gives short access to the Ervitsine alkaloid skeleton. • The first total synthesis of (±)-apparicine has been accomplished by a concise route employing a vynil halide Heck cyclization to close the bridged piperidine ring in the last synthetic step. • An efficient approach to the high subunit of Vinorelbin has been done. The subunit has been successfully assembled developing an indole-templated RMC followed by an intramolecular Heck cyclization.

Regulació de l’expressió gènica en monòcits/macròfags per factors pro-aterogènics. Modulació farmacològica

Tue, 12 Jul 2011 09:45:16 GMT

Regulació de l’expressió gènica en monòcits/macròfags per factors pro-aterogènics. Modulació farmacològica Pou Sánchez, Jordi La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial que depende en gran parte de factores ambientales, pero con una fuerte base genética que puede predisponer a padecerla. Además de la susceptibilidad individual, en el desarrollo de esta patología tienen una gran importancia las modificaciones en la expresión génica que se producen en las células como una respuesta homeostática ante estímulos de tipo pro-aterogénico. Esta respuesta es un intento de corregir o adaptar la función celular ante el estímulo, pero puede acabar contribuyendo al desarrollo de la enfermedad. Por otra parte, muchos de los fármacos empleados en el tratamiento y prevención de la aterosclerosis y sus complicaciones actúan en gran parte modificando la expresión o actividad de algunos de los genes relacionados con esta patología. La complejidad de estos procesos y el elevado número de genes que pueden estar implicados constituyen un reto para la comunidad científica. Su conocimiento permitirá una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo de la aterosclerosis, y por tanto, permitirá diseñar estrategias terapéuticas para prevenirla o frenarla. En este contexto, el objetivo general de la presente tesis doctoral ha sido contribuir al estudio de la regulación de la expresión génica en monocitos y macrófagos, células clave en todas las etapas de la aterogénesis, como respuesta ante diferentes condiciones pro-aterogénicas y/o fármacos. La consecución de este objetivo ha llevado a la realización de los cuatro trabajos que se presentan, cuyos objetivos específicos fueron: I. Determinar el perfil de expresión génica en monocitos de pacientes con hiperlipemia familiar combinada (HFC), antes y después de un tratamiento con atorvastatina, mediante la utilización de microarrays de cDNA. II. En un modelo in vitro (monocitos THP-1 diferenciados a macrófagos), determinar el efecto de estímulos pro-aterogénicos sobre la expresión de los genes más relevantes identificados en el anterior objetivo, explorando las vías de señalización intracelulares que resultan afectadas. III. En el mismo modelo, estudiar el efecto del inhibidor de proteasas ritonavir sobre la expresión de genes que controlan la acumulación de colesterol en el macrófago. Las principales conclusiones del trabajo experimental de la presente tesis doctoral han sido las siguientes: I. Los monocitos de pacientes con HFC presentan un perfil de expresión génica diferente de los individuos controles sanos. Los genes diferencialmente expresados corresponden a proteínas con funciones clave en los monocitos, relacionadas con el proceso aterosclerótico. El tratamiento de los pacientes con ATV durante un mes es capaz de revertir algunos de los cambios inducidos por la HFC en el patrón de expresión génica de los monocitos circulantes. II. La expresión de IL-1R2 se halla reducida en monocitos de sangre periférica de pacientes con HFC, en macrófagos THP-1 tratados con LDL acetiladas o con VLDL, y también en lesiones ateroscleróticas humanas. La represión génica de IL-1R2 observada en los tratamientos con lipoproteínas se relaciona con la acumulación intracelular de lípidos en el macrófago. Además, las lipoproteínas evitan el incremento en la expresión de receptores de IL-1 y reducen la expresión proteica de la cinasa asociada IRAK-1 en macrófagos activados por LPS. III. La expresión de TFPI-2 se encuentra incrementada en monocitos de pacientes con HFC en comparación con sujetos control. El tratamiento con trombina provoca el aumento de la expresión, tanto génica como proteica, de TFPI-2 en macrófagos THP-1 y macrófagos derivados de monocitos humanos, mediante un mecanismo en el que se encontrarían implicados NF-kB, ERK1/2 y JNK. IV. El tratamiento de macrófagos THP-1 con ritonavir induce un incremento en la expresión de genes implicados en el transporte de colesterol (CD36, ABCA1 y CYP27), por un mecanismo en el que intervendrían SREBP-1, PPARγ y LXR.; Atherosclerosis is a multifactorial disease, in which development are very important changes in gene expression that occur in cells as a homeostatic response to pro-atherogenic stimuli. Moreover, many of the drugs used in the treatment and prevention of atherosclerosis and its complications largely act by modifying the expression or activity of some genes associated with this pathology. In this context, the objective of this thesis was the study of regulation of gene expression in monocytes and macrophages, in response to different pro-atherogenic conditions and/or drugs. Achieving this goal has led to the creation of four works presented, whose specific objectives were: I. Determine the profile of gene expression in monocytes from patients with familial combined hyperlipidemia, before and after treatment with atorvastatin. II. In an in vitro model, determine the effect of pro-atherogenic stimuli on the expression of most relevant genes identified in the above objective, exploring intracellular signaling pathways that are affected. III. In the same model, study the effect of the protease inhibitor ritonavir on the expression of genes that control the accumulation of cholesterol in the macrophage. The main conclusions of the experimental work are: I. Monocytes from patients with FCH have a different gene expression profile of healthy control individuals. Treatment with ATV is able to reverse some of the HFC-induced changes in the pattern of gene expression in circulating monocytes. II. IL-1R2 expression is reduced in peripheral blood monocytes from patients with HFC, in THP-1 macrophages treated with lipoproteins, and also in human atherosclerotic lesions. Repression of IL-1R2 gene observed in treatments with lipoproteins is associated with intracellular accumulation of lipids in the macrophage. In addition, lipoproteins modify LPS-induced expression of IL-1R2 and IL-1 signalling. III. TFPI-2 expression is increased in monocytes from patients with FCH compared with control subjects. Thrombin treatment causes increased expression in THP-1 macrophages and human monocyte-derived macrophages through a mechanism that would be found involved NF-κB, ERK1/2 and JNK. IV. Treatment of THP-1 macrophages with ritonavir induces an increased expression of genes involved in cholesterol transport (CD36, ABCA1 and CYP27), by a mechanism which would involve SREBP-1, PPARγ and LXR.

Interacció dels derivats amfetamínics amb els receptors nicotínics: Aspectes moleculars i funcionals

Thu, 30 Jun 2011 07:23:21 GMT

Interacció dels derivats amfetamínics amb els receptors nicotínics: Aspectes moleculars i funcionals Garcia Ratés, Sara En treballs anteriors del nostre grup de recerca es va demostrar que l’antagonista específic del receptor nicotínic α7, metillicaconitina (MLA), inhibia in vitro la producció d’espècies reactives d’oxigen (EROS) i protegia de la neurotoxicitat in vivo induïda per metamfetamina (METH) i per la 3,4-metilendioxi-N-metamfetamina (MDMA). En aquesta tesi, es descriu un nou mecanisme d’acció dels derivats amfetamínics. Mitjançant assajos de fixació de radiolligands, es va comprovar que ambdós derivats amfetamínics competien amb els radiolligands específics dels receptors nicotínics α7 ([3H]Metillicaconitina), i dels heteromèrics ([3H]Epibatidina), el que indicava que en les cèl•lules PC12, el nostre model experimental, i també en una preparació de cervell total de ratolí, aquestes substàncies interaccionaven directament amb els receptors nicotínics. L’MDMA mostrava més afinitat per ambdós subtipus de receptors. Està descrit que el tractament crònic amb nicotina provoca un augment en la densitat de receptors nicotínics tan in vivo com in vitro en cèl•lules PC12. Ambdós derivats amfetamínics van provocar una regulació a l’alça dels dos subtipus de receptors ja a les 6 hores de pretractament. A la vegada, in vivo, l’MDMA i la Nicotina van provocar la regulació a l’alça que va ser potenciada per la seva associació en determinades zones cerebrals on s’expressen cada subtipus de nAChR. De l’estudi dels mecanismes implicats en aquesta regulació a l’alça, mitjançant inhibidors a diferents nivells, es va concluir que, igual com passa amb la nicotina, es produeixen a nivell postraduccional. A nivell funcional, vam determinar que aquests derivats amfetamínics eren capaços d’activar els receptors nicotínics i, d’acord amb les hipòtesis de treballs anteriors, induir una entrada de calci i de sodi que podria estar implicada en els esdeveniments que comportarien la seva neurotoxicitat. Per una banda, l’MDMA i la METH es van comportar com agonistes parcials dels nAChR α7 induïnt un increment de Ca2+ citosòlic. Per altra banda, l’MDMA es va comportar com antagonista dels nAChR heteromèrics i la METH com agonista parcial induint l’entrada de Na+ de la mateixa manera, el qual explicaria diferències a nivell de dependència, ja que els nAChR α4β2 estan implicats en la via mesolímbica o de recompensa. Paral•lelament a l’increment de fixació de radiolligands, es va determinar que la preincubació amb MDMA indueix un increment en la resposta per activació de receptors nicotínics, demostrant que l’ MDMA també indueix regulació a l’alça funcional. Alhora, es va observar que la preincubació de les cèl•lules durant 24 hores amb MDMA dona lloc a un increment perllongat dels nivells basals de Ca2+, el qual indica que l’MDMA inhibeix la desensibilització dels receptors i fa que entri calci durant un temps més llarg. Aquesta entrada persistent podria estar implicada en fenòmens de neurotoxicitat ja que va seguida de l’activació de vies dependents de calci com la calpaïna i la caspasa-3.; During the last years, our emphasis has focused in the study of the neurotoxic effects of MDMA and methamphetamine (METH) on central nervous system and their pharmacological prevention. It has been demonstrated that these amphetamine derivatives produce oxygen species (ROS) in an in vitro model of synaptosomes. In previous works, we demonstrated that blockade of alpha7 nicotinic receptors with methyllycaconitine (MLA) prevented ROS production induced by MDMA and METH, consequently the alpha7 receptor would be involved in the neurotoxicity induced by these drugs. Studies at molecular level, using radioligand binding assays, showed the interaction of METH and MDMA with homomeric alpha7 nAChR and heteromeric subtypes of nicotinic receptors, such as aplha4 beta2. In addition, we investigated the effects of pretreatment with METH and MDMA on nAChR densities. We used PC 12 cells as an experimental model due to the fact other authors have similarly utilised them to evaluate the neurotoxicity of amphetamines. Moreover, they not only express nAChR, including the alpha7 subtype, but also provide an in vitro model for the up-regulation of nAChR, which occurs in vivo following chronic exposure to nicotine. In recent works, we demonstrated in vitro that Ca2+ chelation with EGTA prevented the production of reactive oxygen species (ROS) to a similar extent as nAChR blockade. This indicates that calcium influx, probably through alpha7 nAChR, is a key step in this process. Consequently, one of the objectives of this work was to use a fluorimetric method to investigate the effect of MDMA on Ca2+ and Na+ levels in cultured PC12 cells and the involvement of different nAChR subtypes and other cell pathways related to Ca2+ mobilization. In addition, we used electrophysiology in transfected Xenopus oocytes to corroborate the effects on alpha7 and alpha4 beta2 nAChR. Moreover, pretreatment with MDMA induced functional upregulation by potentiating the effects of specific nAChR agonists or whether it provoked a persistent Ca2+ increase, leading to calpain, caspase 3, NFκB, GSK-3 and Cyt C activation, which was involved in toxicity.

Estudi dels mecanismes moleculars implicats en l’associació entre inflamació i alteracions metabòliques en cèl∙lules cardíaques

Mon, 27 Jun 2011 09:12:43 GMT

Estudi dels mecanismes moleculars implicats en l’associació entre inflamació i alteracions metabòliques en cèl∙lules cardíaques Álvarez Guardia, David El canvi en l’estil de vida que s’ha produït en les societats desenvolupades els darrers anys ha tingut com a contrapartida l’aparició de conductes sedentàries i modificacions en la dieta. Com a conseqüència d’aquests factors s’han produït diverses alteracions metabòliques que han causat un augment de la prevalença de l’obesitat. Aquesta obesitat té una sèrie d’efectes adversos sobre la fisiologia cardiovascular i és considerada un important factor de risc pel desenvolupament de la insuficiència cardíaca. De fet, el consum de dietes amb un elevat contingut en greixos (HFD) s’ha relacionat amb una sèrie d’alteracions cardíaques directes com són la inflamació, la hipertròfia i la disfunció contràctil. Durant el procés inflamatori que es produeix en les esmentades malalties cardiovasculars, les cèl•lules cardíaques humanes secreten citocines i quimiocines proinflamatòries com el TNF-α, MCP-1, i IL-6, molècules que es troben sota el control transcripcional del factor de transcripció ubic i induïble anomenat NF-κB. Aquestes citocines exerceixen diversos efectes pleiotròpics autocrins en les cèl•lules cardíaques, tot produint un efecte de retroalimentació positiva del procés inflamatori que contribueix al desenvolupament d’aquestes malalties. En condicions normals, el cor de mamífers adults obté energia en forma d’ATP principalment a partir de la β-oxidació d’àcids grassos en el mitocondri, encara que aquest orgànul és capaç de catabolitzar altres substrats com la glucosa o el lactat per tal d’assegurar una font constant d’energia. Ara bé, en determinades circumstàncies, com és el cas de la hipertròfia i la insuficiència cardíaques, aquesta flexibilitat de substrat es veu compromesa i la β-oxidació d’àcids grassos es redueix degut a que la font principal d’energia passa a ser la glucosa. Aquests canvis metabòlics comporten una desregulació del control transcripcional de gens relacionats amb el transport, captació i catabolisme dels àcids grassos i la glucosa. En el miocardi, els factors de transcripció implicats en el control d’aquests gens inclouen ERRα i PPARβ/δ. Ambdós factors de transcripció, participen en l’activació de la PDK4, enzim clau en la modulació homeostàtica de la glucosa. Aquesta cinasa regula l’activitat de la PDC, enzim que catalitza la reacció de descarboxilació del piruvat a acetil-CoA, tot limitant l’ús de carbohidrats com a font d’energia en mitocondris i afavorint així la β-oxidació d’àcids grassos. En l’activació de la transcripció de PDK4 també hi participa PGC-1α, que interacciona amb ERRα i PPARβ/δ, tot incrementant-ne la seva activitat transcripcional. Estudis recents però, semblen indicar que no només aquests dos factors de transcripció participen en la regulació de PDK4. És el cas d’E2F1, un factor de transcripció clau en la regulació de la transició de la fase G1 a la fase S del cicle cel•lular i del qual la regió promotora del gen que codifica per PDK4 en presenta dos llocs d’unió. Estudis recents suggereixen que PPARβ/δ, que és la forma predominant en les cèl•lules cardíaques, pot atenuar les vies de senyalització inflamatòries i, per tant, interferir en la remodelació cardíaca. Aquesta funció és en gran mesura deguda a la capacitat dels PPAR, un cop han estat activats per agonistes, de formar complexos amb altres factors de transcripció activats, com ara NF-κB i STAT resultant així en la inhibició de l’activitat transcripcional d’aquests últims. Així l’ús d’agonistes PPARβ/δ podria ser un camí força interessant de cara a trobar potencials fàrmacs per tal de pal•liar les afeccions cardíaques derivades d’alteracions metabòliques i amb un rerefons inflamatori. En conjunt en aquest treball es presenten una sèrie de resultats destinats a conèixer de forma més detallada els mecanismes moleculars que relacionen les alteracions metabòliques i els processos inflamatoris en cor, per tal de poder buscar potencials dianes farmacològiques amb l’objectiu de prevenir i tractar aquests estats patològics.; The change in lifestyle that has occurred in developed societies in recent years has been accompanied by the rise of sedentary behavior and changes in diet that have caused an increasing obesity prevalence. Obesity has a huge number of adverse effects on cardiovascular physiology and is considered an important risk factor for heart failure developement. In fact, high fat diets have been linked with direct cardiac abnormalities such as inflammation, hypertrophy and contractile dysfunction. During the inflammatory process that occurs in these diseases, human cardiac cells secrete proinflammatory cytokines and chemokines such as TNF-α, MCP-1, and IL-6, molecules that are under the control of the ubiquitous and inducible transcription factor NF-κB. In certain circumstances, such in hypertrophy and heart failure, the substrate flexibility in heart is compromised and the fatty acids β-oxidation is reduced because the main source of energy becomes the glucose. These metabolic changes lead to a deregulation on the transcriptional control of genes associated with transport, uptake and catabolism of fatty acids and glucose. In the myocardium, among the transcription factors involved in the control of these genes we found ERRα and PPARβ/δ. Both transcription factors, are involved in PDK4 activation, an important enzyme in the homeostatic modulation of glucose. This kinase regulates PDC activity, an enzyme that catalyzes the decarboxylation from pyruvate to acetyl-CoA, limiting the use of carbohydrates as energy source in mitochondria and thus favoring the fatty acid β-oxidation. In the PDK4 transcription activation also participates PGC-1α, which interacts with ERRα and PPARβ/δ, increasing its transcriptional activity. However recent studies, suggest that not only these two transcription factors are involved in PDK4 regulation. Other transcription factors as E2F1, which is crucial for cell cycle control, may regulate PDK4 expression. Overall, the results shown in this work are aimed to learn in more detail the molecular mechanisms linking the metabolic disorders and inflammatory processes in heart, in order to find potential drug targets to prevent and treat these pathological states.

Disseny i síntesi de compostos policíclics que contenen el nucli indòlic. Avaluació de l’activitat antitumoral

Fri, 10 Jun 2011 09:23:56 GMT

Disseny i síntesi de compostos policíclics que contenen el nucli indòlic. Avaluació de l’activitat antitumoral Basset Olivé, Joan L’el•lipticina, un compost aïllat originàriament d’Ocrosia elliptica Labill. (família Apocinaceae), posseeix una elevada activitat antiproliferativa. La seva estructura química consisteix en un esquelet tetracíclic format de carbazole fusionat amb una piridina. L’el•lipticina i els seus derivats exerceixen els seus efectes citotòxics i antineoplàstics a través d’un mecanisme multimodal d’acció biològica (inhibició de l’ADN-topoisomerasa II, intercalació a l’ADN, unió covalent a l’ADN i generació de radicals lliures citotòxics mitjançant reaccions d’oxidació-reducció). Prèviament en el grup de treball, s’han estudiat les 1,4-benzodioxinoisoquinolines dissenyades i sintetitzades com a anàlegs de l’el•lipticina. Tenint en compte els precedents bibliogràfics i la recerca duta a terme pel nostre grup en relació amb la preparació de compostos amb activitat anticancerígena, els objectius d’aquest treball van adreçats a la preparació i avaluació biològica de compostos policíclics que continguin el nucli de carbazole unit a un anell D pentacíclic i incorporin diferents cadenes alquíliques laterals. Es tracta d’estructures dissenyades a partir de l’el•lipticina principalment per farmacomodulació modulativa. Els intermediaris clau per a la obtenció d’aquestes estructures tetracícliques són diens de tipus furo[3,4-b]indole. En un primer lloc s’estableix una ruta sintètica a partir de l’àcid indole-2-carboxílic (ruta A, de 8 etapes i un rendiment global del 8-22%). D’aquesta ruta, cal destacar-ne la utilització d’N,N-dimetilhidrazida com a grup ortodirigent de metal•lació, que s’oxida a àcid mitjançant MnO2 en una etapa posterior. També es proposen d’altres rutes a partir del propi nucli indòlic (ruta B, de 5 etapes i un rendiment global del 31-76%). De la ruta B en destaquen la utilització de la funció acetal com a grup orto-dirigent de metal•lació i la utilització de resina àcida d’intercanvi iònic com a reactiu sòlid. D’altres rutes a partir de l’àcid indole-3-carboxílic o de l’indole-3-acetonitril no han resultat satisfactòries. El tractament dels diens obtinguts amb els dienòfils adients condueix als compostos tetracíclics desitjats. De la sèrie de compostos sintetitzats, s’han realitzat proves de citotoxicitat en les línies cel•lulars de leucèmia K562, càncer de pulmó NCIH460 i càncer de còlon HT-29. Per tal d’avaluar també la selectivitat dels compostos respecte a les cèl•lules no canceroses, s’ha realitzat un control en cèl•lules no canceroses de tipus HuDe (fibroblasts). Tots els productes obtinguts i els principals intermediaris s’han caracteritzat per tècniques d’RMN, IR i p.f. Es posa especial èmfasi en l’estudi de la reactivitat i en l’estabilitat dels intermediaris implicats i aïllats de les diferents rutes sintètiques. Finalment, durant una estada a la Universitat de Huddersfield (Anglaterra), s’ha realitzat la síntesi en fase sòlida de derivats indòlics, així com la posta al punt d’un mètode analític basat en les tècniques d’HPLC-Masses (ESI-ToF) per a la quantificació del pèptid fosfo-pRbING procedent de la reacció de fosforilació del pèptid pRbING mediada per CDK4/6. Aquest nou mètode constitueix una alternativa a la determinació de l’activitat de compostos inhibidors de CDK4/6 amb l’avantatge que no necessita de derivats de fòsfor marcats radioactivament i, per tant, ofereix menys riscos i major seguretat en el treball del laboratori.; “Design and synthesis of polycyclic compounds that contain the indolyc nucleus. Evaluation of antitumor activity.” Ellipticine is a natural product isolated from Ochrosia elliptica with significant cytotoxic activity by several mechanisms of action. Its tetracyclic structure exhibits antineoplasic activity against several human cancer cell lines. Many syntheses have been reported by Gribble and col. and other authors, and its structure has been widely modified in order to obtain more efficacious, selective and less toxic new compounds. Our group had previously reported a series of ellipticine analogues including 1,4-benzodioxin nucleus. Herein, we present two new alternative pathways to prepare the intermediate isobenzofuroindole starting from either indole-2-carboxylic acid (8 steps, 8-22% overall yield) or 3-indolylalkanones (4 steps, 31-76% overall yield). Some interesting steps (involving protection of indole, directed ortho-metallation and cyclization) had been studied and developed in our laboratory. These methods lead us to the intermediate diene, which reacts with the corresponding dienophiles to obtain the desired compounds. These compounds were tested in cancer cell lines K-562 (leukaemia), NCI-H460 (lung) and HT-29 (colon), as well as in fibroblasts cell line HuDe to evaluate toxicity. All compounds were characterized by NMR, IR and m.p. techniques. Finally, over a PhD stage at the University of Huddersfield (England), some indole derivatives were synthesised by solid phase and a new HPLC-MS CDK4/6 inhibition test was designed. It was developed a 22-min HPLC-MS method to elute and quantify the phospho- pRbING product and the pRbING substrate from reaction samples containing buffer solution, ATP and CDK4/6. Peptide pRbING was efficiently quantified by HPLC-MS (ESI-ToF), within a range between 1 – 100 ppm and a detection limit as low as 3 pmol. This method should allow the evaluation of new CDK4/6 inhibitors.

Caracterización del receptor benzodiacepínico periférico en tejidos de rata y humanos

Tue, 12 Apr 2011 13:38:08 GMT

Caracterización del receptor benzodiacepínico periférico en tejidos de rata y humanos Camins Espuny, Antoni 1) INTRODUCCIÓN

Las benzodiacepinas son unos fármacos ampliamente usados en nuestros días para el tratamiento clínico de síntomas relacionados con la ansiedad, pero estos fármacos producen por otro lados efectos miorrelajantes, anticonvulsivantes e hipnóticos. Las benzodiacepinas median estos efectos a través del receptor benzodiacepínico central el cual está unido a receptor del GABA y del ionóforo del cloro.

Aunque estos efectos farmacológicos están mediados a través del receptor benzodiacepínico central (Costa y col, 1979), existe otra clase de lugares de unión a las benzodiacepinas cuyo mecanismo de acción es menos claro. Estos lugares de unión se encuentran localizados tanto a nivel de tejidos periféricos (Baestrup and Squires, 1977) y en el cerebro, concretamente a nivel de la glia (Awad and Gavish, 1987, 1989). A este lugar de unión se le denomina receptor benzodiacepínico periférico, existiendo ligandos específicos para este lugar como son el Ro 5-4864 (que presenta una estructura de tipo benzodiacepínica y se diferencia del diazepam, que presenta una elevada afinidad por el receptor benzodiacepínico central, por la presencia de un cloro en posición 4') y el PK 11195 que presenta una estructura de isoquinoleínico.

Los objetivos del presente trabajo han consistido en llevar a cabo un estudio a nivel molecular para la caracterización del receptor benzodiacepínico periférico en tracto genital de rata. Asimismo, se ha realizado un estudio para demostrar una posible interacción entre este receptor con el receptor de la testosterona y con el receptor mitocondrial de las dihidropiridinas de alta capacidad y baja afinidad. También hemos considerado de interés ver el papel que puede desempeñar el ligano endógeno propuesto para este receptor, la protoporfirina IX.

Se planteó la necesidad de realizar estudios con tejido humano y más concretamente en próstata humana, debido al posible interés de este receptor como marcador de neoplasias.

En el presente trabajo se ha realizado un estudio para demostrar la existencia de un transporte de la adenosina a nivel mitocondrial y el papel que desempeñan las benzodiacepinas a nivel periférico inhibiendo dicho transporte.

2) METODOLOGÍA

Los tejidos de roedores se han obtenido a partir de ratas Sprage-Dawley macho adultas de 250-275 gramos ce peso (C.E.R.J., Le Genest, Francia). Los animales fueron estabulados en condiciones estándar de temperatura y mantenidos en un ciclo de oscuridad de 12 horas. Los animales se sacrificaron y los tejidos se homogeneizaron con un Polytron. El extracto crudo mitocondrial se obtuvo por doble centrifugación a 3000 rpm durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante obtenido en este proceso se centrifugó a 8000 rpm durante 10 min. Para cuantificar el contenido proteico del "pellet" obtenido se utilizó el método de Bradford, que se fundamenta en la utilización de un colorante Coomasie Brillant Blue G-250 que se une a la proteína al cabo de 2 min., formándose un complejo que se lee al espectrofotómetro a 595 nm.

Los estudios de Binding se realizaron usando [(3)H]-Ro 5-4864 y [(3)H]-PK 11195. El volumen del ensayo fue de 0.250 ml incluyendo 0.125 de la preparación mitocondrial. Las muestras fueron incubadas entre 0-4ºC durante 60 min. La incubación se terminó por filtración con ayuda del vacío a través de filtros Whatman GF/B que habían sido tratados previamente con polietilenenimna. Los filtros se colocaron son viales de centelleo y se añadió "cockteil" de centelleo, determinándose la radioactividad retenida en los filtros al cabo de 24 horas.

Para les estudios de transporte [(3)H] adenosina se utilizó testículo de rata realizándose los estudios a los 5 min.

3) RESULTADOS

Los estudios realizados en tejido de trata muestran la existencia de un lugar de unión de elevada afinidad tanto para el Ro 5-4864 en vesícula seminal, próstata y conducto deferente como para el PK 11195 en próstata de rata. En tejido de próstata humana se observa una disminución muy patente en la afinidad del Ro 5-4864 mientras que el PK 11195 continua teniendo en humanos una afinidiad dentro de un orden nanomolar. Los estudios cinéticos vienen a confirmar la elevada afinidad del PK 11195. Estos resultados confirman que en la especie humana el receptor benzodiacepínico periférico se aleja de una estructura relacionada con la molécula benzodiacepínica para reconocer de manera selectiva una estructura de tipo isoquinoleínico.

Se ha realizado un estudio comparativo entre tejido prostático de rata y humano y dentro del tejido humano se han comparado muestras control con muestras de adenoma de próstata. Se ha comprobado una mayor población de receptores benzodiacepínicos periféricos en tejido humano respecto a roedores y no se encuentran diferencias significativas entre tejido de adenoma de próstata y control, con lo cual el papel del receptor benzodiacepínico periférico como marcador de neoplasias queda en entredicho. Los estudios de competición demuestran que el PK 11195 presenta una afinidad de orden nanomolar en tejido de rata y humano, mientras que el Ro 5-4864 presenta una elevada afinidad en roedores. Se demuestra una interacción de tipo no competitivo entre los inhibidores del "carrier" ADP/ATP y el receptor benzodiacepínico periférico. Los compuestos que actúan inhibiendo el transporte de la adenosina desplazan con una afinidad dentro del orden micromolar la unión del Ro 5-4864 y del PK 11195. La protoporfirina IX presenta una afinidad dentro del orden micromolar para el receptor benzodiacepínico periférico en roedores. Se demuestra que este efecto no se realiza a través del receptor benzodiacepínico periférico.; The clinical use of benzodiazepines is due to their specific binding to the central benzodiazepine receptor, which is linked to the GABA receptor and ion chloride channel. At present there are no clinical applications based on the interaction of drugs peripheral benzodiazepine receptor. The aim of the present study is to investigate and characterize [(3)H]-Ro 5-4864 and [(3)H]-PK 11195 binding sites in rat and humans. PK 11195 had higher affinity by the peripheral type benzodiazepine receptor than Ro 5-4854 in human prostate. In rat the affinity was in nanomolar range for this receptor. The Ro 5-4864 binding in rat was inhibited no competivively by atractyloside and alpha, beta-methylene ATP, suggesting a modulation by the ADP/ATP mitochondrial carrier. We postulate that [(3)H]-Ro 5-4864 binding sites are regulated by purine nucleotides in a allosteric fashion, a result suggesting the involvement of these binding sites in mitochondrial metabolism, which could explain why both Ro 5-4864 and PK 11195 decrease respiratory control in isolated rat kidney mitochondria. Protoporphyrin IX the most potent endogenous ligand inhibitor of [(3)H]-PK 11195 binding (Verma and Snyder, 1989) was also able to displace [(3)H]-Ro 5-4864 binding but only a micromolar concentration range. Clonazepam, a characteristic central benzodiazepine ligand, did not displace [(3)H]-binding site. Flutamide is able to displace Ro 5-4864 and PK 11195 only a micromolar concentrations. However, the slopes of competition curves not differ from unity, we have characterized an adenosine carrier in rat mitochondria. Peripheral benzodiazepines inhibited the adenosine transporter in the micromolar range.

Implicación de las especies reactivas del oxígeno en el síndrome de isquemia y reperfusión provocado por medios farmacológicos en el intestino delgado de rata

Tue, 12 Apr 2011 13:38:07 GMT

Implicación de las especies reactivas del oxígeno en el síndrome de isquemia y reperfusión provocado por medios farmacológicos en el intestino delgado de rata Giménez Crouseilles, José Se han empleado multitud de modelos experimentales para estudiar la lesión por isquemia/reperfusión, tanto in vivo como in vitro. De los modelos empleados in vivo el denominador común en ellos es que la isquemia/reperfusión está provocada mediante un procedimiento mecánico, que es lo que a partir de ahora se denominará método físico, para distinguirlo del método farmacológico, que es el modelo que pretendemos estudiar y comparar con el primero, demostrando con ello que se puede producir lesión por isquemia/reperfusión mediada por sustancias químicas, y que en esta última están implicados las especies reactivas derivadas del oxígeno y el óxido nítrico.

El objetivo del estudio es desarrollar un modelo en el intestino de rata que permita:

- Cuantificar, si se producía, la magnitud de alteraciones propias del síndrome de isquemia/reperfusión provocado por medio de un mecanismo farmacológico, y comparar diferentes aspectos de la lesión: daño tisular y permeabilidad vascular (valorados respectivamente por los niveles de LDH y azul de Evans en el líquido perfundido por la luz del intestino sometido a intervención), en función del método empleado para producirla (físico o farmacológico).

- Determinar si factores clásicamente implicados, como las especies reactivas del oxígeno, y el óxido nítrico, que intervienen en la lesión por isquemia/reperfusión producida por un mecanismo físico (pinza hemostática) contribuyen de igual manera en la producción de la lesión por isquemia/reperfusión farmacológica.

Efecte de l'activació de PPARβ/δ sobre l'oxidació d'àcids grassos i el procés inflamatori

Tue, 12 Apr 2011 13:38:06 GMT

Efecte de l'activació de PPARβ/δ sobre l'oxidació d'àcids grassos i el procés inflamatori Barroso Fernández, Emma Nombroses evidències mostren l'important paper dels receptors nuclears PPAR en el control de l'homeòstasi energètica a través de les seves accions reguladores sobre el metabolisme lipídic i glucídic, a més de la seva implicació en processos inflamatoris, tumorals i en la reproducció i el desenvolupament embrionari. La falta de lligands específics de PPARβ/δ fins fa relativament poc ha fet que els efectes fisiològics d'aquest subtipus hagin estat poc estudiats en relació als altres subtipus de PPAR, PPARα i PPARγ. Actualment però, la disponibilitat d'agonistes selectius de PPARβ/δ com GW501516, ha ajudat a conèixer i entendre l'important paper fisiològic que juga aquest receptor com regulador de múltiples funcions cel·lulars, especialment en la regulació del metabolisme i la resposta inflamatòria. Encara, però, resta per determinar els mecanismes moleculars responsables d'aquets efectes provocats per l'administració d'aquests fàrmacs, ja que només han estat parcialment estudiats.

Els objectius d'aquesta tesi doctoral han estat:

1. Establir els mecanismes responsables de l'efecte hipotrigliceremiant de l'agonista de PPARβ/δ GW501516 en ratolins alimentats amb una dieta rica en greixos (HFD).

2. Establir els mecanismes responsables pels quals l'activador de PPARβ/δ GW501516 és capaç d'inhibir la resposta inflamatòria en queratinòcits humans estimulats amb TNF-α.

Respecte el primer objectiu els resultats obtinguts indiquen que l'agonista PPARβ/δ GW501516 podria reduir els nivells de triglicèrids en plasma en un model animal de hipertrigliceridèmia evitant la reducció de l'AMPK i activant la via PGC1-α-Lipin 1-PPARα. D'altra banda, respecte el segon objectiu els resultats també demostren que GW501516 pot evitar la inflamació induïda per TNF-α en queratinòcits humans reduint l'activació del factor de transcripció pro-inflamatori NF-κB per l'activació de l'AMPK i SIRT1.; The effects of PPARβ/δ subtype and its role in the metabolic syndrome and the inflammatory diseases has been elucidated in the last years, in part, by the availability of PPARβ/δ agonist GW501516, althought the mechanism involved is still unkonwn.

In this study we examined the effects of PPARβ/δ activator GW501516 on high-fat diet (HFD)-induced hypertriglyceridemia. Our results showed that the hipertrigliceridemia caused by the HFD was reduced by the drug treatment. Also the PPARβ/δ activation prevented the reduction in the AMPK-Lipin1-PGC-1α pathway caused by the HFD, leading to an increase in hepatic fatty acid oxidation. This effect, together with increased hepatic expression in VLDL-receptor might be responsible for the hypotriglyceridemic effect of GW501516.

Moreover, the PPARβ/δ activation by GW501516 also prevented TNF-α-induced NF-κB activation in human HaCaT cells by reducing p65 acetylation through AMPK and SIRT1.

Contribució a l'Estudi dels Receptors de Serotonina. Molècules Basades en Indens i Indans

Tue, 12 Apr 2011 13:38:06 GMT

Contribució a l'Estudi dels Receptors de Serotonina. Molècules Basades en Indens i Indans López Pérez, Sara El punt de partida de la present Tesi Doctoral se situa entorn a l'estudi d'estructures basades en (Z)-estilbens: disseny, síntesi i examen de quimioteques dirigides a l'obtenció de nous compostos bioactius a nivell de sistema nerviós central (SNC), en el marc d'una col·laboració amb la indústria farmacèutica.

Així, el projecte es va iniciar amb una recerca bibliogràfica per la selecció del scaffold, la qual ens posà de manifest com els (Z)-arilmetilidenindens constituïen un conjunt de compostos amb diferents perfils farmacològics.

Valorant aquests antecedents, la dificultat radicava en l'elecció de l'estructura prototipus. Els (Z) arilmetilidenindens podien ésser un inici ja que el fragment estructural cis estilbè s'integra en el scaffold. A més, la química de sistemes basats en indens i l'estudi de les seves propietats biològiques estaven menys explorats que la d'altres famílies de compostos, la qual cosa permetria desenvolupar temes específics d'investigació amb probabilitat raonable d'èxit.

Concretament, se sintetitzaren els cis-indens I i les seves formes reduïdes II, basats en una selecció estructural, a partir de les indolilsulfonamides per substitució de l'indol per l'indè, i que incorporaven el grup sulfonamido en la posició 5.

L'accés a les indenilsulfonamides II es portà a terme inicialment mitjançant una via específica, de cinc etapes, on els àcids (sulfonilamino)indenilacètics eren els intermedis claus, els quals es prepararen, després d'examinar diferents alternatives sintètiques, per reacció aldòlica.

Els assajos d'afinitats pel receptor 5-HT6 mostraren valors diferents, sent moderats pels compostos I i augmentant de forma important per les indenilsulfonamides II. A més, cal destacar la funcionalitat agonista d'aquests derivats, ja que en els darrers anys, la majoria de lligands descoberts per aquest receptor havien estat identificats com antagonistes.

Per aquesta raó, i tenint en compte que els canvis responsables de l'augment d'afinitat enfront el receptor 5-HT6 venien limitats per la química de l'indè, ens plantejàrem la síntesi d'altres estructures mitjançant una ruta més general de quatre etapes, on la sulfonilació es duia en la darrera etapa, sent les inden-5-amines els precursors de nous lligands II diversificats en la posició 5.

Les noves indenilsulfonamides II exhibiren afinitats variables pel receptor 5 HT6, destacant dos compostos que s'identificaren com a potents agonistes selectius amb excel·lents perfils farmacològics in vitro (Ki ≥ 4,5 nM).

Alhora, s'ha estudiat la influència de la cadena N,N-dimetilaminoetil de la posició 3 sobre l'indè, amb a la preparació d'indenilsulfonamides restringides III i derivats simplificats, en base als requeriments estructurals establerts prèviament per augmentar l'afinitat dels lligands pel receptor 5 HT6. La síntesi d'aquests compostos es portà a terme mitjançant una via de tres etapes, a partir de les indanones convenientment substituïdes per preparar les indenamines precursores, aplicant la reacció aldòlica anteriorment emprada, adaptada a les lactames.

Aquestes indenilsulfonamides restringides III exhibiren elevades afinitats pel receptor 5-HT6 actuant com antagonistes, tot i que amb potències moderades a nivell micromolar. D'altra banda, l'absència de la amina bàsica en els compostos estructuralment simplicats no implicava pèrdua d'afinitat, indicant com els grups N,N aminoetil o l'amina restringida sobre la posició 3 de l'indè no eren necessàris per mantenir l'afinitat pel receptor.

Finalment, també s'ha portat a terme el canvi de la cadena aminoetílica per un grup guanilhidrazona rígid, que ens ha permès la identificació de les indanilguanilhidrazones sulfonamides IV com a potents i selectius antagonistes del receptor 5-HT6 amb elevades afinitats, a nivell nanomolar.

Aquest conjunt de nous lligands basats en indens podrien ser útils eines d'elucidació d'aspectes funcionals i usos terapèutics d'altres lligands del receptor 5-HT6 en el tractament de malalties del SNC tals com l'ansietat, depressió o altres desordres mentals. Així, com l'interès que representen els agonistes enfront alteracions alimentàries tals com l'obesitat o la bulímia.; The background of this thesis is the study of structures based on (Z)-stilbenes: design, synthesis and testing of libraries designed to obtain new bioactive compounds in central nervous system, in collaboration with the pharmaceutical industry. So the structure proptotype, the (Z)-arylmethylideneindenes were chosen as the structural fragment cis-stilbenes integrated into the scaffold could form a set of compounds with different pharmacological profiles. In addition, chemical-based systems indenes such as I and the study of their biological properties were less explored than other families of compounds, which permit the development of specific topics of research with responsible likelihood of success.

By developing an indole-to-indene core change, we have synthesized the cis indenes I and their reduced forms II, which incorporate the sulfonamido group in 5 position. These compounds have presented affinity for serotonin 5-HT6 receptor (Ki ≥ 20 nM). The novel indenylsulfonamides II exhibited variable binding affinities for the 5-HT6 receptor and the in vitro profiles of the most active compounds revealed them to be selective 5 HT6 receptor agonists in the low-nanomolar range (Ki ≥ 4.5 nM).

Moreover, we have studied the influence of the N,N-dimethylaminoethyl side chain on the indene 3-position. Preparation of a few examples of ring-constrained III type indenylsulfonamides and the structurally simplified counterparts, based on previously established structural requirements for enhancing the affinity of indene based ligands towards the 5-HT6 receptor, gave access compounds which exhibited a high binding affinity and functioned as antagonists, although with moderate potency at the micromolar level.

Finally, changing the N,N-(dimethylamino)ethyl side chain for a conformationally rigid guanylhydrazone moiety on the indene 3 position led to the identification of novel indanylguanylhydrazone sulfonamides IV with excellent binding affinities and an antagonistic response at the 5-HT6 receptor in the nanomolar range.

The ensemble of indene-based frameworks constituted by the (aminoethyl)indenylsulfonamide agonists II, the conformationally rigid antagonists III and the structurally simplified counterparts, as well as the indanylsulfonamide guanylhydrazone antagonists IV (see Figure 1) resulted in a range of compounds which may be useful biological tools for the fundamental understanding of the 5-HT6 receptor.

Contribución al estudio de polifenoles y aceites esenciales en el género "Thymus" L.

Tue, 12 Apr 2011 13:38:04 GMT

Contribución al estudio de polifenoles y aceites esenciales en el género "Thymus" L. Vila Casanovas, Roser En el presente trabajo de investigación se determina por primera vez la composición flavónica de "Thymus willkomii", "T. aestivus" y "T. glandulosus", y se efectúan nuevas aportaciones sobre los polifenoles de "T. membranaceus", "T. longiflorus", "T. moroderi", "T. funkii", "T. capitellatus", "T. camphoratus", "T. vulgaris", "T. baeticus" y "T. orospedanus".

Se aislan 27 flavonoides de las hojas de "T. moroderi". Veintiuno son aglicones que se distribuyen en catorce flavones: 5-desmetilnobiletina 8-ome-cirsilineol cirsilineol xantomicrol pilloina 5 4'-(OH)2-7 8-(OME)2-flavona genkwanina sideritoflavona apigenina timusina sorbifolina 7-0-ME-luteolina luteolina y 6-OH-luteolina; un flavonol: kempferol; cuatro flavanonas; cinco 4'-(OH)2-6, siete 8-(OME)3-flavanona, sakuranetina, naringenina y eriodictiol; y dos dihidroflavonoles: taxifolina y dihidrokempferol. Seis son heterosidos: cinco o-heterosidos: 7-0-glucuronil-luteolina 7-0-xilosil-luteolina 7-0-glucosil-luteolina 3'-0-allosil-luteolina (nuevo producto natural) y un diglicosido acetilado de luteolina; y un c-heterosido: vicenina-2. Además, dos de ellos se encuentran por segunda vez en la naturaleza, uno es nuevo para la familia Labiadas y seis son nuevos para el género "Thymus" L.

El estudio de los aceites esenciales permite identificar más del 90% de las esencias de "T. moroderi", "T. membranaceus", "T. moroderi", "T. glandulosus" y "T. willkomii" que no habían sido investigadas. Se aportan nuevos datos sobre la composición de las de "T. membranaceus", "T. funkii", "T. aestivus", "T. baeticus" Y "T. camphoratus". Por lo menos veinte de los componentes identificados son nuevos para el género "Thymus". Se estudian también los aceites esenciales de individuos de "T. moroderi", "T. membranaceus" y su hibrido, observándose una mayor variabilidad en los componentes sesquiterpénicos que en los monoterpénicos.

Hacia una síntesis convergente del dodecaedrano: Estudios, modelo, preparación de precursores y primeros ensayos de las rutas 10 + 10 y 12 + 8.

Tue, 12 Apr 2011 13:38:02 GMT

Hacia una síntesis convergente del dodecaedrano: Estudios, modelo, preparación de precursores y primeros ensayos de las rutas 10 + 10 y 12 + 8. Vázquez Cruz, Santiago En la presente tesis doctoral se han preparado dos alquenos altamente piramidalizados tricíclicos que han sido atrapados en forma de aductos Dielsalder. En ausencia de dienos se obtienen los correspondientes dimeros ciclobutánicos que experimentan una retrocicloadición térmica (2 + 2) a dimeros diénicos. Por otro lado se han llevado a cabo varios intentos para sintetizar tetrasecododecaedradienos bien por la dimerización de un alqueno piramidalizado tetracíclico de 10 átomos de carbono, bien por el acoplamiento cruzado de dos alquenos piramidalizados, uno tricíclico de 18 átomos de carbono y otro pentacíclico de 12 átomos de carbono.

Paralelamente a este trabajo sintético se ha realizado un estudio teórico utilizando métodos de mecánica molecular, semiempíricos y "ab inicio", de los alquenos piramidalizados descritos en la tesis, de los C-dimeros ciclobutánicos y de los dimeros diénicos preparados. En general los cálculos teóricos correlacionan bien con los datos experimentales de los que disponemos.

Acción analgésica de la T.R.H. Contribución al estudio de su mecanismo de acción.

Tue, 12 Apr 2011 13:38:01 GMT

Acción analgésica de la T.R.H. Contribución al estudio de su mecanismo de acción. Palop Palop, Daniel Se estudia la acción analgésica de la TRH comparativamente con la morfina. La TRH es un potente analgésico frente a estímulos mecánicos y químicos pero no sobre estímulos térmicos. No posee acción sobre receptores y opiáceos ni "in vivo" ni "in vitro". La acción analgésica de la TRH no está relacionada con su transformación metabólica en histiclil prolina diceto piperacina. La acción analgésica de la TRH es central e independiente de sus acciones endocrinas y analépticas.

La reserpina disminuye la acción analgésica de la morfina no modificando la de la TRH. El 5-HTP tiende a potenciar la acción analgésica de la TRH. La apomorfina a dosis bajas potencia la acción analgésica de la TRH. Por otra parte, la estimulación colinérgica central antagoniza el efecto analgésico, mientras que el bloqueo colinérgico central potencia su acción, hecho que puede tener trascendencia clínica.