http://www.tdx.cat:80/handle/10803/407 Tue, 21 May 2013 22:17:26 GMT 2013-05-21T22:17:26Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/81537 Mecanismes d'especificitat funcional dels complexes CDK-Ciclines CLN Quilis Bayarri, Inma La progressió del cicle cel.lular en les cèl.lules eucariotes es deu a l'activació seqüencial de diferents complexos CDK-ciclina. En Saccharomyces cerevisiae una sola CDK, Cdc28, s'associa amb nou ciclines diferents i és la ciclina la que determina la funció del complexe al llarg de cada fase del cicle cel.lular. Les ciclines Cln1 i Cln2 controlen la transició G1 / S. Aquestes ciclines havien estat considerades equivalents per la seva homologia de seqüència, regulació i funció, però una diferència funcional entre elles va ser descrita establint a Cln2 com l'efector principal dels processos morfogenètics durant la transició G1 / S. En aquest treball s´han tractat de descriure les bases moleculars de l´especificitat funcional de Cln2. S'ha realitzat un anàlisi funcional utilitzant ciclines quimèriques que contenen diferents fragments de Cln1 i Cln2 per tal d'identificar les regions responsables de la funcionalitat específica de Cln2 en comparació amb Cln1. Els nostres resultats ens porten a concloure que la regió entre els aminoàcids 225 i 299 del Cln2 és necessària i suficient per a la seva funció específica. També hem estudiat la localització de Cln2 i Cln1. Ambdues ciclines es distribueixen entre el nucli i el citoplasma, però Cln1 mostra una major acumulació nuclear. La via clàssica d´importació participa en l´entrada de les dues ciclines al nucli, però només Cln2 és exportada fora del nucli per la carioferina Msn5. Hem identificat els senyals de localització de les ciclines. El senyal de localització nuclear no es correspon amb cap NLS clàssic descrit i es troba en la regió entre els aminoàcids del 130 al 226 d´ambdues ciclines. Sorprenentment, l´exportació de Cln2 depén de la regió entre els aminoàcids 225 i 299. Aquesta correlació entre la seqüència d´exportació i la regió responsable de la funció específica de Cln2 dóna suport a que siga l'exportació al citoplasma el mecanisme que confereix les seves funcions específiques a Cln2 durant la transició G1/ S. Quan dita regió s´introdueix en Cln1 la ciclina resultant presenta una distribució menys nuclear i és capaç de realitzar les funcions citosòliques pròpies de Cln2. Per tant, sembla ser la seua regulació espacial la que determina la funcionalitat diferencial de Cln1 i Cln2. Paralel.lament s´ha estudiat la degradació de les ciclines i s´ha observat que Cln1 i Cln2 presenten la mateixa estabilitat. Tanmateix, mentre que Cln2 és degradada per SCFGrr1 i SCFCdc4, Cln1 és degradada preferentment per SCFGrr1. La seqüència N-terminal de la ciclina determina el seu patró de degradació: la seqüència de Cln2 és necessària per a que la proteïna siga degradada per SCFCdc4. En conclusió, la degradació no determina la funcionalitat de les ciclines però estableix un nivell més de regulació diferencial entre Cln1 i Cln2 relacionat amb l´anterior, ja que l´estabilitat de les ciclines depén de la localització. Per una altra part s´ha analitzat el paper de Cdc24 en la funció específica de Cln2 concluint que si bé Cln2 sembla més eficient que Cln1 en facilitar l´eixida del nucli de Cdc24, no és aquesta eixida sinò altres funcions en el procés de gemmació les que Cln2 realitza de forma específica. S´han identificat les carioferines responsables del transport de Cdc24: és importada al nucli per la via clàssica d´importació i exportada per Xpo1. S´han identificat tres possibles senyals de localització diferents, un NES i dos NLS, però els anàlisis de mutants en residus d´aquestes regions no han permés demostrar la dependència de la localització de la proteïna Cdc24 d´aquests senyals. Finalment es va realitzar una caracterització dels mutants en les diferents carioferines de la família de la importina β, la cual va mostrar que molts dels mutants podien relacionar-se amb el cicle cel.lular en processos com la regulació d´Start, la replicació o la morfogènesi cel.lular.; Cell cycle progression in eukaryotic cells is driven by sequential activation of different CDK-cyclin complexes. In Saccharomyces cerevisiae a single CDK, Cdc28, associates with nine different cyclins and it is the cyclin who determines the complex function along each cell cycle stage. Cln1 and Cln2 cyclins control the G1/S transition. These cyclins had been considered equivalent due to their sequence homology, regulation and function, but a functional difference between them was described establishing Cln2 as the main effector of the morphogenetic processes during G1/S transition. In this work we are trying to describe the molecular basis of Cln2 functional specificity. Functional analysis have been performed using chimeric cyclins containing different fragments of Cln1 and Cln2 in order to identify specific functional regions of Cln2 compared to Cln1. Our results lead us to conclude that the region between amino acids 225 and 299 of Cln2 is necessary and sufficient for its specific function. We have also studied Cln2 and Cln1 localization. Both cyclins are distributed between the nucleus and the cytoplasm but Cln1 shows stronger nuclear accumulation. Karyopherin Kap95 imports both cyclins into the nucleus but only Cln2 is exported out of the nucleus by karyopherin Msn5. We have detected localization signals in cyclins. Strikingly, Cln2 export depends on the region between amino acids 225 and 299. This strongly supports that the export to cytoplasm confers its specific functions to Cln2 during G1/S transition. Fri, 01 Jun 2012 08:18:23 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/81537 2012-06-01T08:18:23Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/81336 Diseño, desarrollo e implementación de una plataforma bioinformática orientada al análisis y gestión de infomación en epidemiología molecular Amadoz Navarro, Alicia La investigación genética y epidemiológica de las enfermedades infecciosas requiere actualmente grandes cantidades de datos. En un laboratorio de tamaño medio, la información necesaria para realizar estudios de investigación suele almacenarse de forma independiente en diferentes formatos y lugares, lo que dificulta su gestión y análisis. Esta organización de la información conlleva que el trabajo habitual en un laboratorio se realice de forma lenta y desordenada. En esta situación, la integración de la información es de vital importancia para poder llevar a cabo estos trabajos de forma eficiente, sistematizada y común a todos los investigadores del laboratorio. La principal motivación de esta tesis fue cubrir la necesidad de un sistema de gestión y análisis de datos de forma sencilla, flexible y fiable. El objetivo principal de esta tesis consistió en el desarrollo de un sistema de información orientado al área de epidemiología molecular de patógenos infecciosos, que permitiese almacenar y analizar de forma centralizada la información clínica de pacientes junto con la información molecular de los patógenos de interés. En los últimos años, la bioinformática se ha convertido en una parte esencial de las soluciones eficientes de integración, transformación y creación de nueva información. epiPATH, la plataforma bioinformática que presentamos en esta tesis, consta de dos grupos de herramientas diferenciadas pero, a su vez, diseñadas para interactuar entre sí facilitando el manejo y análisis de grandes cantidades de datos. Por un lado, diseñamos y desarrollamos una base de datos junto con varias aplicaciones que facilitan su gestión y, por otro lado, integramos y desarrollamos diferentes aplicaciones de análisis que permitiesen realizar estudios epidemiológicos, evolutivos y poblacionales de las secuencias moleculares de los patógenos. El almacenamiento conjunto de datos clínicos de pacientes y de datos moleculares de patógenos en una base de datos centraliza la búsqueda y la gestión de información, facilitando comparaciones entre ellos y estudios sobre infecciones múltiples. Además, permite el estudio de la variación que existe dentro de los distintos patógenos y los cambios que registran a lo largo de su evolución, hasta su distribución en distintos pacientes con diferentes afecciones y cuadros clínicos. En este sentido, epiPATH también facilita la vigilancia epidemiológica basada en señales específicas de la enfermedad, mediante la identificación de regiones patógenas a través de la comparación de secuencias cuyos pacientes tengan un perfil clínico determinado. epiPATH incluye información desde el momento en que un paciente acude a un centro de salud hasta el análisis molecular del patógeno en el laboratorio. La información que recoge esta base de datos comienza en los lugares donde se puede encontrar un patógeno. Después, se puede recoger información clínica del paciente cuando acude al médico, se le realizan pruebas clínicas y se puede obtener información sobre el tipo de transmisión. Posteriormente, se aplica un tratamiento y se recogen muestras del patógeno que siguen un procesado de laboratorio. En el laboratorio, se obtienen secuencias que corresponden a un patógeno determinado asociado, en algunos casos, a un brote epidemiológico. Por otro lado, las secuencias pueden analizarse con métodos filogenéticos y publicarse en distintos trabajos generando una bibliografía. La integración de herramientas de análisis junto con la información almacenada en la base de datos facilita las tareas del flujo de trabajo habitual en un laboratorio y en colaboraciones con otras instituciones, preservando la información del acceso público. Además, los programas de análisis de genética poblacional y evolutiva desarrollados en esta tesis (epiPATH-tools) son de gran utilidad y permiten el análisis masivo de datos. Las epiPATH-tools incluyen el cálculo de parámetros relevantes en el estudio de la divergencia, posiciones sinónimas y no-sinónimas, pruebas de neutralidad y estudio de polimorfismos.; Large volumes of data are currently needed in genetics research and infectious diseases epidemiology studies. In a medium size laboratory, information needed in research studies is usually stored independently within different formats and places, which makes information management and data analysis a difficult task. This organization of information involves that the common laboratory workflow is made in a slow and disorganized way. In this situation, information integration is of vital importance to perform these kind of studies in an efficient, systematized and common manner for all the researchers in a laboratory. The main aim of this thesis was to cover the necessity of a data management and analysis system for molecular epidemiology studies of infectious diseases, that allow researchers to store and analyze clinical information of patients together with molecular data of pathogens in a centralized way. epiPATH, the bioinformatics platform that is presented in this thesis, has two different groups of tools designed to interact between them in order to ease the management and analysis of huge amounts of data. We designed and developed a database together with data management applications, and we also integrated and developed different analysis applications to perform molecular epidemiology, population and evolutionary genetics studies. From the moment a patient arrives to a hospital until the processing and analysis of molecular sequences obtained from infectious pathogens in the laboratory, lots of information is collected from different sources. Our database covers many aspects of samples, laboratory processes, molecular sequences, clinical information, treatments, pathogens, transmissions and outbreaks information. epiPATH allows researchers to perform comparisons between pathogens and multiple infections studies. Moreover, it allows studies from variability within pathogens and evolutionary changes to their distribution among patients with different clinical conditions. In this respect, our platform is also useful for the facilitation of surveillance based on either syndromic or disease-specific signals. We also developed the epiPATH-tools, a group of applications for population and evolutionary genetics that calculate parameters relating to a large amount of sequences. They include parameters of interest in the study of population divergence, synonymous and non-synonymous positions, neutrality tests and polymorphism studies. Wed, 23 May 2012 14:20:49 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/81336 2012-05-23T14:20:49Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/81299 Fragmento N-terminal del propéptido natriurético tipo B (NT-proBNP), respuesta inflamatoria y estrés oxidativo en la hipertensión esencial Roselló Lletí, Esther El sistema circulatorio humano es una intrincada red de mecanismos destinados a mantener la homeostasis de presión y flujo pese a las diferentes perturbaciones que sufre y por tanto, una elevación de la presión arterial puede provocar un trastorno en las relaciones de los factores que mantienen este equilibrio. La hipertensión esencial, es el resultado de una compleja interacción entre cambios genéticos, neurohormonales, inflamatorios y bioquímicos. Como consecuencia el paciente hipertenso tiene una gran cantidad de moléculas circulantes en concentraciones elevadas que podrían servir como marcadores de la situación clínica y del pronóstico de la enfermedad. Por todo ello, nuestra hipótesis de trabajo es que en un grupo de pacientes hipertensos asintomáticos, sin insuficiencia cardiaca, estables clínica y funcionalmente, aun estando sometidos a tratamiento farmacológico, las concentraciones del fragmento aminoterminal del propéptido natriurético tipo B (NT-proBNP) y de diferentes marcadores de inflamación, apoptosis, fibrosis miocárdica y estrés oxidativo podrían estar aumentadas en el subgrupo de pacientes hipertensos con presencia de hipertrofia ventricular izquierda. Por otra parte, nos planteamos evaluar su poder predictivo para la detección de hipertrofia. También hemos querido investigar la relación entre los marcadores inflamatorios apoptóticos estudiados y los marcadores de fibrosis miocárdica. Por último, nos planteamos evaluar la relación entre diferentes factores de riesgo cardiovascular y la inflamación con el estrés oxidativo en este grupo de pacientes asintomáticos con hipertensión esencial. Observamos que los niveles en suero de NT-proBNP están incrementados en pacientes con hipertensión esencial e hipertrofia ventricular izquierda (HVI) al compararlos con sujetos sin hipertrofia. Además, NT-proBNP es capaz de discriminar entre hipertensos hipertróficos y no hipertróficos. No hemos encontrado diferencias en sus niveles entre individuos obesos y no obesos. Estos hallazgos contrastan con los estudios publicados previamente en la literatura en pacientes con insuficiencia cardiaca, y plantean interrogantes sobre el papel de la obesidad per se considerada como causa primaria de la disminución de los niveles de NT-proBNP, en otras situaciones fisiopatológicas. NT-proBNP puede ser cuantificado en la orina y puede ser un nuevo marcador para el diagnóstico de HVI. Estos hallazgos abren la posibilidad de utilizar este análisis relativamente simple y no invasivo en condiciones específicas en las que la obtención de muestras sanguíneas pueda resultar especialmente problemática o cuando su utilización se considere más apropiada. Existe una buena estabilidad en los niveles de NT-proBNP en un seguimiento de 24 meses en pacientes asintomáticos con hipertensión e hipertrofia. Como consecuencia, la evaluación de las concentraciones de NT-proBNP puede ser una herramienta útil para monitorizar el seguimiento de pacientes hipertensos con HVI. Por otra parte, los niveles plasmáticos de diversas citocinas están incrementados en pacientes hipertensos, sobre todo en los hipertróficos. El receptor soluble tipo 1 del factor de necrosis tumoral alfa (sTNF-R1) es un predictor independiente del índice de masa del ventrículo izquierdo y de hipertrofia. Estos hallazgos demuestran que existe una relación entre la activación del sistema inmunológico y la presencia de HVI en pacientes con hipertensión esencial. Hay un incremento en los niveles circulantes de PINP y PIIINP y marcadores de apoptosis (sFas y sTNF-R1) en nuestro grupo de pacientes hipertensos con HVI. Además, estas moléculas están relacionadas entre ellas. Los parámetros de función diastólica mostraron una correlación significativa con estos marcadores. Los niveles urinarios de 8-hidroxi-2´-desoxiguanosina están incrementados en pacientes hipertensos con hipertrofia ventricular izquierda. Sin embargo, la presencia de factores de riesgo cardiovascular, no alteran las concentraciones de este marcador de estrés oxidativo, aunque el tabaquismo incrementa de manera significativa sus niveles. Además, encontramos una correlación positiva entre los niveles de esta molécula con diferentes mediadores inflamatorios, especialmente con el factor de necrosis tumoral alfa.; Hypertension (HT) is one of the most important risk factors for cardiovascular disease. We observed that the levels of NT-proBNP were increased in hypertensive patients with left ventricular hypertrophy (LVH) and can be used for detect it. There is no evidence of difference in plasma NT-proBNP levels between obese- and nonobese patients in asymptomatic patients with essential HT. These findings are in contrast with those of previously published literature on heart failure, and raise questions about the role of obesity per se being considered as primary cause of decreased NT-proBNP levels in other pathophysiological situations. The urinary NT-proBNP concentration can be useful for detecting LVH in patients with HT. These findings suggest the possibility of utilizing this relatively simple, noninvasive analysis under specific conditions in which the collection of plasma samples may be especially difficult or in situations in which its use is considered more appropriate, such as in the primary care setting. There is good stability in NT-proBNP levels in a 24-month follow-up study of asymptomatic patients with clinically and functionally stable hypertension and LVH. As a consequence, assessment of NT-proBNP concentrations may be a useful tool for monitoring the follow-up of hypertensive patients with hypertrophy. The results of this study show that the profile of circulating cytokines and cytokine receptors is altered in patients with essential HT. There was a significant increase in the plasma levels of these inflammation markers in hypertensive patients with LVH. These findings support the relationship between the immune system activation and the presence of hypertrophy in patients with essential HT. This study showed increased circulating levels of PIIINP and PINP, and anti-apoptotic cytokines (sFas and sTNF-R1) in hypertensive patients with LVH. Furthermore, collagen turnover and anti-apoptotic cytokines are significantly related among them. The interstitial fibrosis could reflect a process of myocardial scarring as a result of individual cardiomyocyte apoptosis. Thus, an increased amount of sFas and sTNF-R1 would suggest the activation of apoptotic process and could be associated with an increase in fibrotic tissue. In this sense, our results could involve new therapeutic strategies, which would improve the evolution of hypertensive patients. Tue, 22 May 2012 10:27:13 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/81299 2012-05-22T10:27:13Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/80916 Baxalpha5 at lipid membranes: structure, assembly and pore formation Fuertes Vives, Gustavo Las proteínas de la familia Bcl-2 controlan la liberación de citocromo c, y otros factores apotogénicos, desde la mitocondria hacia el citosol. Los miembros proapoptóticos de la familia, como Bax, facilitan dicha liberación probablemente a través de la formación de poros proteolipídicos a nivel de la membrana mitocondrial externa. Por el contrario, los miembros antiapoptóticos, como Bcl-xL, bloquean la acción de Bax. Con el objetivo de mejorar nuestro conocimiento sobre la estructura y formación de poros por parte de Bax así como de la estructura y cinética de los poros inducidos por Bax, optamos por una aproximación reduccionista consistente en el estudio de un dominio activo derivado de la hélice quinta de Bax, Bax5. A través del trabajo desarrollado en este Tesis, hemos encontrado que dicho péptido se une espontáneamente a membranas lipídicas, plegándose en forma de hélice-. Bax5 es capaz de formar dímeros, tanto en micelas de SDS como en membranas de POPC, así como oligómeros mayores en presencia de lípidos mitocondriales. Dicha capacidad de autoensamblaje depende especialmente de la presencia de un residuo de tirosina. Asimismo, Bax5 forma heteroligómeros con polipéptidos derivados de Bcl-xL, si bien dicha interacción no conduce a una inhibición de su capacidad formadora de poros. Un análisis mediante modelado de cuerpo rígido sugieren que la mejor orientación de Bax5 con respecto a la normal de la membrana, compatible con los datos experimentales, corresponde a un dímero esencialmente paralelo a la superficie de la bicapa. La formación de poros en membranas se ha estudiado tanto en poblaciones de vesículas como en liposomas individuales. Hemos puesto a punto métodos para analizar la actividad de los poros a cualquier tiempo tras la mezcla de Bax5 con vesículas, bien mediante la adición de reactivos que extinguen la fluorescencia de los lípidos marcados, o bien a través de la observación de entradas sucesivas de sondas fluorescentes en vesículas individuales gigantes. Como resultado observamos que las vesículas mantienen el estado porado a través del tiempo. Además, el radio de los poros individuales a tiempos largos o en estado de equilibrio es más pequeño (2.3 nm) que el de los poros “cinéticos”, o de tiempo corto. Finalmente, hemos demostrado que la actividad formadora de poros de Bax5 depende de la presencia de lisinas en posiciones específicas de la secuencia peptídica.; Proteins of the Bcl-2 family control the release of cytochrome c, and other apoptogenic factors, from the mitochondria to the cytosol. Proapoptotic members of the family, like Bax, facilitate such release most likely through the formation of proteolipidic pores in the outer mitochondria membrane (MOM). On the other hand, antiapoptotic members, like Bcl-xL, inhibit the permeabilization of the MOM by blocking Bax activation. The structure of membrane-bound species of Bax responsible for the formation of pores as well as the structure and kinetics of Bax-induced pores remain largely unexplored. In order to gain insight into the pore-forming mechanism of Bax, we have characterized the structure, assembly and pore formation properties of a minimal active domain derived from the fifth helix of Bax, Baxα5. We have found that Bax5 binds readily to lipid interfaces where it folds mainly as an α-helix. Both FRET and SDS-PAGE data suggest that Baxα5 is able to self-associate in lipid membranes and lipid-mimetic media, respectively. A detailed analysis of the residues involved in Bax5-Bax5 interactions suggests the presence of a glycophorin-like dimerization motif supplemented with a tyrosine residue. Interestingly, the number of Baxα5 molecules in the oligomers is dependent on the lipid composition, with mitochondrial lipids inducing higher-order oligomeric assemblies. Baxα5 is also able to interact with Bcl-xL-derived polypeptides. However, such heterotypic associations do not inhibit but rather enhance Baxα5-induced leakage from lipid vesicles. The structure of complexes of Baxα5 with membranes has been extensively studied by infrared spectroscopy and X-ray scattering. Two strategies have been used to best interpret the experimental data in terms of the orientation of Bax5 with respect to the membrane normal: an implicit orientational landscape model including distributions of the orientation angles and a rigid body modeling approach. Best fits are achieved using a dimeric starting structure which shows an almost flat alignment of Bax5 in POPC membranes and a more tilted state in DMPC bilayers. Importantly, the orientation displayed by Bax5 depends on lipid properties, such as fluidity and hydrophobic thickness. In turn, Bax5 seems to affect the properties of the surrounding lipid matrix. The pore-forming activity of Bax5 has been addressed both at the ensemble and single-vesicle level. Experiments with suspensions of liposomes allow recording the kinetics of dye release. However, these experiments are restricted to short times. In order to capture the activity of pores at any desired time after peptide/vesicle mixing we have developed two approaches. As a first approach, the quenching of fluorescent lipids by externally added reagents in ensembles of liposomes suggests the presence of pores or membrane defects at long times. Direct visualization of leakage events can be done observing single giant unilamellar vesicles (GUVs) under the fluorescence microscope. Successive leakage events in single GUVs indicate that the vesicle pore-state is maintained over time. Interestingly, individual long-term equilibrium pores have a smaller radius (2.3 nm) than short-term/kinetic pores suggesting that pores shrink with equilibration. Finally we have shown that the leakage activity of Bax5 depends on the presence and location of lysine residues within the primary structure. Tue, 15 May 2012 12:17:03 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/80916 2012-05-15T12:17:03Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/80906 Marcadores de estrés oxidativo en la obesidad mórbida y su modulación tras cirugía bariátrica De tursi Rispoli, Cataldo Leonardo El estrés oxidativo (E.O) es un tipo de estrés químico que acontece en el organismo, secundario a una excesiva producción de sumamente reactivas, conocidas como Radicales Libres (RL), responsables, del deterioro progresivo de los distintos órganos y sistemas. Para contrarrestar los efectos deletéreos de estas especies reactivas, el organismo dispone de agentes antioxidantes responsables del control homeostático de los RL y de lo que se conoce hoy en día como Fisiología Oxidativa. Numerosas son las investigaciones realizadas que demuestran la influencia que el E.O tiene en la patogenia de diversas enfermedades. Así mismo, hay estudios que demuestran su relación con metabolopatías tal como la resistencia insulínica, el síndrome metabólico, la dislipidemia yla obesidad mórbida (O.M). Dado que el E.O asume un papel preponderante en la etiología de múltiples patologías asociadas a la obesidad, y que la O.M adquiere una importancia socio-sanitaria cada vez más relevante, hemos considerado la misma una herramienta útil para profundizar en el estudio de ambas. Todo ello nos ha inducido a formular como hipótesis de nuestro trabajo investigador: • el E.O está presente en los pacientes OM • la pérdida de peso obtenida tras cirugía bariátrica mejora el EO presente en ellos Para comprobar estas hipótesis nos hemos propuesto como objetivo principal: valorar si la pérdida de peso tras cirugía bariátrica en pacientes con OM, se asocia a una reducción del EO y como objetivos secundarios valorar si los pacientes con OM tienen mayor EO que los pacientes de un grupo control, identificar los principales factores relacionados con la mejora del EO, valorar las complicaciones de la cirugía y la evolución de las comorbilidades asociadas a la O.M Entre Noviembre 2005 y Diciembre 2006, se ha dado una asistencia multidisciplinar a una muestra de 28 pacientes obesos mórbidos, que presentaron un valor medio de IMC de 50,3 kg/m2. Los pacientes cumplían los criterios de inclusión para cirugía bariátrica realizándose en todos ellos el cruce duodenal (CD): hemigastrectomía vertical con by-pass yeyuno ileal. En el postoperatorio, se realizó un control exhaustivo de la evolución ponderal, del E.O, de la evolución de las comorbilidades asociadas a la O.M. Para la valoración del E.O se han determinado los productos de oxidación molecular: MDA, 8-oxo-dG, GSSG, GSSG/GSH y para los sistemas antioxidantes el GSH. Se utilizó la prueba de la t-Student y la ordinal de Spearman para evaluar las comparaciones y la posible correlación entre E.O y las distintas variables a estudio, antes y un año después. Tras la cirugía, se produjo una disminución progresiva del peso y todas sus variables derivadas, con diferencias significativas (p ≤0.001) en todos los periodos estudiados. Similar evolución, con diferencias significativas (p<0,001) y tendencia progresiva hacía la normalización se apreció en los representantes de la oxidación como en los antioxidantes determinados. Se obtuvo la corrección de las comorbilidades en la casi totalidad de los pacientes que las presentaban. No hubo mortalidad y solo un 14,5% de morbilidad como complicaciones relacionadas con la cirugía Como conclusiones de nuestro trabajo de investigación, podemos afirmar que: la oxidación está presente en los obesos mórbidos con valores patológicos y significación estadística (p<0,001). Tras la pérdida de peso obtenida con la cirugía, ha sido evidente la progresiva disminución (p<0,001) de E.O. respecto a los valores iniciales del estudio. Hemos comprobado la existencia de una correlación significativa, entre los metabolitos del EO y las distintas comorbilidades asociadas a la obesidad. Con la técnica del cruce duodenal hemos obtenido una pérdida de peso adecuada, con buena calidad de vida, escasa morbi-mortalidad y con complicaciones metabólicas aceptables y fácilmente controlables.; Oxidative stress (OS) is a type of chemical stress that occurs in the body, secondary to excessive production of highly reactive molecules, free radicals, responsible for the gradual deterioration of various organs and systems. To counteract the deleterious effects of these reactive species, the organism has antioxidants responsible for the homeostatic control of the radicals and what is known today as Oxidative Physiology. Because oxidative stress plays a leading role in the etiology of many diseases associated with morbid obesity (MO), and obesity becomes an important socio-medical importance, we considered it as a useful tool for further study of both. This has led us to formulate the hypothesis of our research: • oxidative stress is present in morbidly obese patients • weight loss after bariatric surgery obtained better oxidation present in them To test these hypotheses we have proposed as main objective: to assess whether weight loss after bariatric surgery in patients with MO is associated with a reduction in the OS and secondary objectives to assess whether the patients endured more than a control group OS, identify factors associated with improved OS, assess the complications of surgery and the development of comorbidities associated with the MO. Between November 2005 and December 2006 were 28 morbidly obese patients operated by the duodenal switch. The sample had a mean BMI of 50.3 kg/m2. Postoperatively, we conducted a thorough survey of the evolution of weight, stress and obesity-associated comorbidities. For the assessment of oxidative stress have been determined: MDA, 8-oxo-dG, GSSG, GSSG / GSH and the antioxidant GSH. After surgery, there was a progressive decrease in weight and all derived variables (p ≤ 0.001). Similar trends, with progression towards normalization (p <0.001) was observed in oxidants and antioxidants. We obtained the total correction of comorbidities present. In conclusion we can say that rust is present in the morbidly obese and pathological values. It was evident the progressive decrease (p <0.001), oxidation compared to baseline study. A significant correlation between the metabolites of oxidative stress and various comorbidities associated with obesity. Tue, 15 May 2012 10:18:56 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/80906 2012-05-15T10:18:56Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/80902 Estudio de la expresión génica de diversos componentes del sistema fibrinolítico de las metaloproteasas y de la angiogénesis en la endometriosis. Correlación de los niveles de expresión con algunos polimorfismos estudiados Ramón Nuñez, Luís Andrés INTRODUCCIÓN: La endometriosis, definida como la presencia de tejido endometrial fuera del útero, es una de las enfermedades ginecológicas benignas más frecuentes. La endometriosis es una entidad multifactorial y poligénica en la que tanto factores endometriales como peritoneales, relacionados con los sistemas de activación del plasminógeno (PA) y de las metaloproteasas (MMPs) y la angiogénesis, pueden estar implicados en esta enfermedad. OBJETIVO: Analizar los niveles de mRNA y proteína de factores angiogénicos (factor de crecimiento del endotelio vascular, VEGF-A y trombospondina-1, TSP-1) y componentes de los sistemas PA (uroquinasa, uPA; inhibidor del PA tipo 1, PAI-1) y de las MMPs (MMP-3; inhibidor de MMPs de tipo 1, TIMP-1) en tejido endometriósico y endometrio de mujeres con y sin endometriosis. También se estudiaron los niveles proteicos de estos componentes en el líquido peritoneal (LP) de pacientes y controles. Por otra parte, se estudiaron los polimorfismos 4G/5G del gen del PAI-1, 5A/6A del gen de la MMP-3 y tres polimorfismos funcionales del gen del VEGF-A (-460C/T, +405G/C y 936C/T) en pacientes y controles y se analizó la influencia de estos polimorfismos en la expresión de PAI-1, MMP-3 y VEGF-A en tejido endometrial y LP. Por último, se evaluó la influencia del LP sobre la expresión de factores proteolíticos y angiogénicos en cultivos de células endometriales procedentes de pacientes y controles. MÉTODOS: Los niveles de mRNA se cuantificaron mediante qRT-PCR en tiempo real y los niveles proteicos mediante ELISA. El polimorfismo 4G/5G del gen del PAI-1 se evaluó mediante PCR con cebadores específicos de alelo. El polimorfismo 5A/6A de la MMP-3 y los polimorfismos del VEGF-A se determinaron mediante PCR-RFLP. Por último, se aislaron y cultivaron células endometriales (de pacientes y controles) y se trataron con LP de pacientes y controles. Posteriormente, se evaluaron los niveles de mRNA y proteína de los factores estudiados. RESULTADOS y CONCLUSIONES: El endometrio y el LP de las mujeres con endometriosis mostró unos niveles de uPA, MMP-3 y VEGF-A superiores a los controles. Este incremento puede facilitar la adhesión del tejido endometrial al peritoneo y ovario, la invasión de la matriz extracelular y la angiogénesis, contribuyendo a la formación de las lesiones endometriósicas tempranas. El tejido endometriósico ovárico mostró unos niveles superiores de PAI-1, TIMP-1 y TSP-1 que el endometrio, lo que podría explicar la presencia del quiste endometriósico con ausencia de invasión al tejido ovárico adyacente. Las frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo 4G/5G del gen del PAI-1 no difieren entre pacientes y controles, aunque los niveles de PAI-1, en tejido endometrial y LP de controles, parecen estar asociados con este polimorfismo. Las pacientes mostraron una mayor frecuencia del alelo 936T, del gen del VEGF, que los controles. Sin embargo no se encontraron diferencias en la distribución de frecuencias genotípicas y alélicas en los otros dos polimorfismos del VEGF-A (-460C/T, +405G/C) entre pacientes y controles. Estos hallazgos sugieren que el polimorfismo 936C/T puede estar asociado con el riesgo de padecer endometriosis, aunque el incremento en los niveles de VEGF-A, observado en las mujeres con endometriosis, no parece estar asociado con ninguno de los polimorfismos estudiados. Por último, el LP de las mujeres con endometriosis indujo un incremento en los niveles de uPA y VEGF-A en cultivos de células endometriales de pacientes y controles. Los mayores niveles de uPA y VEGF-A se observaron en cultivos de células endometriales de pacientes tratados con LP de mujeres con endometriosis. Por tanto, el LP induce, en las células endometriales, una mayor expresión de factores proteolíticos y angiogénicos que pueden contribuir al desarrollo de las lesiones endometriósicas.; INTRODUCTION: Endometriosis, defined as the presence of endometrium outside the uterus, is one of the most frequent benign gynaecological diseases. It is a multifactorial and polygenic entity in which both endometrial and peritoneal factors, related to plasminogen activator and matrix metalloproteinase systems and angiogenesis, can be implicated. OBJETIVE: To analyze mRNA and protein levels of angiogenic and proteolytic factors in endometriotic and endometrial tissues from patients and controls. The protein levels were also studied in peritoneal fluid (PF). PAI-1 4G/5G, MMP-3 5A/6A and VEGF-A -460C/T, +405G/C and 936C/T polymorphisms were evaluated. Finally, the influence of PF on proteolytic and angiogenic factor expression in endometrial cell cultures (ECCs) was evaluated. METHODS: mRNA and protein levels were quantified by real-time qRT-PCR assay and ELISA, respectively. PAI-1 4G/5G polymorphism was determined by allele–specific PCR. MMP-3 5A/6A and VEGF polymorphisms (-460C/T, +405G/C, and 936C/T) were determined using a PCR-RFLP assay. Finally, ECCs were treated with PF from patients and controls. RESULTS and CONCLUSIONS: Endometrium and PF from patients showed higher uPA, MMP-3 and VEGF-A levels than controls. This increase may facilitate the attachment of endometrial tissue to the peritoneum and ovarian surface. This process would lead to the formation of early endometriotic lesions. Ovarian endometrioma had higher PAI-1, TIMP-1 and TSP-1 levels than endometrium, which could explain the finding of one endometrioma without adjacent tissue invasion. The PAI-1 4G/5G genotypes and allele frequencies did not differ between patients and controls. However, endometrial and peritoneal PAI-1 levels seem to be associated with PAI-1 4G/5G polymorphism in controls. Patients showed a higher VEGF 936T allele frequency than controls. These findings suggest that the VEGF 936C/T polymorphism may be associated with the risk of endometriosis. Finally, PF induced an increase in uPA and VEGF-A levels in ECCs. The highest levels were observed in ECCs from patients with endometriosis treated with PF from women with endometriosis. So, PF induces a higher expression of proteolytic and angiogenic factors in EECs, which could contribute to the development of endometriotic lesions Tue, 15 May 2012 08:50:09 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/80902 2012-05-15T08:50:09Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/78999 Sistemas de dos componentes: Búsqueda de inhibidores, caracterización estructural y nuevos mecanismos de señalización López Redondo, Mª Luisa En la última mitad de los años ochenta emergió el término “dos componentes” para describir una nueva clase de sistemas de transducción de señal encontrados en bacterias. Los sistemas de dos componentes (TCS) responden a múltiples estímulos, controlando a su vez una amplia variedad de procesos esenciales para la célula. El sistema prototipo consta de dos proteínas: Una histidina quinasa (HK) y un reguladora de la respuesta (RR). En general la transducción de la señal en un TCS incluye tres reacciones: la autofosforilación en un residuo de histidina específico de una HK dímerica, posteriormente este mismo grupo fosforilo es transferido a un aspartato del correspondiente RR, y finalmente el RR se desfosforila, bien por un actividad fosfatasa intrínseca o bien inducido por la HK. El nivel de fosforilación del RR altera sus propiedades transcripcionales, enzimáticas o mecanísticas. Como antes hemos dicho, los TCS están relacionados con procesos de virulencia y resistencia a antibióticos, por lo que estos sistemas constituyen una excelente diana para la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos. Es obvio que esta circunstancia no ha pasado desapercibida para la industria farmacéutica que ha gastado grandes sumas de dinero en la búsqueda de inhibidores para estos sistemas, habiéndose desarrollado diferentes familias de compuestos con alta actividad inhibitoria, aunque su mecanismo de acción esta mal caracterizado y es muy inespecífico, hechos que han impedido su uso terapéutico (Stephenson, K., Yamaguchi, Y. and Hoch, J.A. (2000) J. Biol. Chem. 275: 38900-38904), debido al desconocimiento del mecanismo molecular de su inhibición, además de presentar múltiples efectos secundarios. El análisis de datos estructurales existentes, de estos TCS, nos informará sobre las regiones de máxima especificidad y potencialidad de los inhibidores, y nos permitirá el rediseño de nuevas drogas más específicas. Además de en bacterias, estos TCS, también se han encontrado en otro tipo de microorganismos, como son las cianobacterias. Un espectacular ejemplo de su adaptación es el proceso de clorosis (Collier y Grossman, 1992) en el cual la pérdida de ficobilisomas y la reducción en el contenido de clorofila son las responsables de la aparición de una coloración amarilla en las poblaciones de cianobacterias. Los actores específicos incluyen una pequeña proteína NblA, uno de los principales efectores del proceso de blanqueado, y otras tres proteínas con diferentes funciones en este proceso: el regulador de la respuesta NblR, de la familia OmpR/PhoB (Schwarz y Grossman, 1998), una histidina quinasa sensora NblS (Van Waasbergen et al. 2002), y , más recientemente, el factor NblC de la familia SpoIIAB (Sendersky et al ., 2005). A pesar del hecho de que NblS y NblR fueron identificados como histidina quinasa y su regulador, no existe ninguna prueba directa de las interacciones entre ellos. Estudios de doble híbrido en Synechococcus dieron como resultado la identificación de una nueva proteína llamada SipA, que se une a la región c-terminal de NblS y de función desconocida. (Espinosa et al., 2006). En esta tesis se presenta el siguiente trabajo: - Cristalización y resolución de la estructura, por difracción de rayos X, de la proteína SrrB, una histidina quinasa de Staphylococcus aureus. - Búsqueda de nuevos inhibidores de histidina quinasas mediante técnicas “in silico” e “in vitro”. - Estudio de la función y participación en un sistema de dos componentes de NblS, una histidina quinasa encontrada en Cianobacterias. - Estudio de la función de SipA en los TCS y de su modulación con respecto a NblS. - Búsqueda del regulador de la respuesta de NblS mediante ensayos enzimáticos clásicos, y estudio de su función dentro de este sistema de dos componentes. - Mediante ensayos bioquímicos y de biología molecular se descarta a NblR como regulador de la respuesta de NblS.; The structural data available of the domains CA of different HK, is a valid starting point for in silico search of molecules capable of occupying the nucleotide binding site, and therefore potential inhibitors of HKs. SrrB three-dimensional structure, together with counterparts from other HKs show that the CA domain performs a rigid body motion on a conserved area to catalyze different reactions involved in the mechanism of signal transduction by TCS. NblS, the most conserved histidine kinase in cyanobacteria, regulates photosynthesis and acclimatization to a variety of environmental conditions. We used in silico, in vivo and in vitro approaches to identify RpaB and SrrA as the cognate response regulators of NblS and to characterize relevant interactions between components of this signalling system. While genetic analysis showed the importance of the NblS to RpaB phosphorylation branch for culture viability in Synechococcus elongatus PCC 7942, in vitro assays indicated a strong preference for NblS to phosphorylate SrrA. Our results provide a paradigm for regulatory interactions between response regulators in a branched two-component system. The small regulator SipA, interacts with the ATP-binding domain of NblS. We show here that SipA is a b-II class protein and that has a fold type SH3. In Synechococcus sp. PCC 7942, phycobilisome degradation and other acclimation responses after nutrient or high-light stress require activation by the orphan response regulator NblR, a member of the OmpR/PhoB family. NblR was not phosphorylated in vitro by the low-molecular-mass phosphate donor acetyl phosphate and mutation of Asp57 to Ala had no impact on previously characterized NblR functions in Synechococcus. To acknowledge the peculiarities of these atypical ‘two-component’ regulators with phosphorylation-independent signal transduction mechanisms, we propose the term PIARR, standing for phosphorylation-independent activation of response regulator. Wed, 28 Mar 2012 12:39:21 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/78999 2012-03-28T12:39:21Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/77726 Funció de membres de la família de transportadors copt en l'homeòstasi del coure d'Arabidopsis Thalina García i Molina, Antoni El coure (Cu) és un element essencial per tal de dur a terme les reaccions de transferència d’electrons en els organismes de metabolisme aerobi. Tanmateix, la citotoxicitat associada a l’excés de Cu, deguda a la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS), implica l’existència de mecanismes homeostàtics regulats de forma precisa. La majoria dels elements de la xarxa homeostàtica del Cu està conservada en els organismes eucariotes. Els transportadors de Cu d’alta afinitat CTR/COPT hi participen durant el procés d’adquisició del metall sota condicions de deficiència. En la present tesi s’escomet l’establiment dels rangs nutricionals de Cu i la identificació de marcadors moleculars associats en la planta model Arabidopsis thaliana. En base als resultats obtesos, se suggereix que els medis ½MS suplementats amb una concentració entre 0.5 i 1 M de CuSO4 comprenen el rang de suficiència de Cu. Per altra banda, l’excés de Cu s’associa als medis suplementats amb una concentració igual o superior a 5 M CuSO4, mentre que la deficiència de Cu s’estableix en els medis suplementats amb una concentració inferior a 0.5 M de CuSO4. El patró d’expressió dels mRNA regulats per Cu suggereix que COPT2 i FSD1 esdevenen marcadors moleculars per detectar el dèficit de Cu, mentre que l’expressió de CCS i CSD1 s’associa a rangs òptims. Atenent a aquests paràmetres, s’ha aportat noves evidències de què el medi ½ MS comercial, considerat un medi estàndard per créixer plantes, esdevé un medi deficient en Cu. En segon lloc, s’ha abordat la caracterització de les proteïnes COPT2, COPT6 i COPT5 d’Arabidopsis thaliana. Podem concloure que COPT2 i COPT6 constitueixen, junt amb COPT1, els transportadors de membrana plasmàtica. Ara bé, mentre que sota condicions de deficiència de Cu COPT1 i COPT2 s’expressen fonamentalment a l’arrel principal amb un patró no solapant, COPT6 és un gen d’expressió exclusiva a la part aèria, els nivells del qual no s’alteren per Cu. La importància del Cu en la planta es reflecteix en què tots tres transportadors de membrana plasmàtica s’expressen a l’embrió i als teixits reproductius, i s’evidencia pels fenotips dels mutants per pèrdua de funció. Tot i que els mutants de pèrdua d’expressió copt2 no exhibeixen alteracions en deficiència de Cu, els mutants COPT1 antisentit manifestaven una disminució en el contingut de Cu endogen i alteracions morfològiques en el gra de pol•len, mentre que la línia mutant copt6 produeix menys llavors que les línies silvestres en condicions de dèficit de Cu. COPT5, per la seua banda, esdevé un transportador intracel•lular probablement associat al compartiment prevacuolar (PVC) d’expressió àmplia en el cos de la planta, a excepció de les anteres i del gra de pol•len, preferentment a nivell de feixos vasculars i nervadures. La manca d’expressió de COPT5 en els mutants per pèrdua de funció causa una hipersensibilitat al dèficit sever de Cu que es tradueix en la inhibició del creixement de l’arrel principal, pèrdua de pes fresc i un estat avançat de clorosi. De la mateixa manera, el dèficit sever de Cu implica en els mutants copt5 una disminució dràstica en el flux de la cadena de transport d’electrons entre fotosistemes, probablement degut a alteracions en la distribució del Cu a la plastocianina. Tot plegat, COPT5 constitueix una via essencial per a la distribució del Cu en condicions de dèficit sever i perllongat de Cu. Les dades aportades en la present tesi doctoral contribueixen a millorar el coneixement de la resposta d’Arabidopsis thaliana al dèficit de Cu i bastiran el desenvolupament de futures estratègies biotecnològiques enfocades tant a la millora de l’adquisició del Cu com a la fitorremediació.; Copper (Cu) is an essential element that participates in electron transfer reactions in aerobic organisms. Nevertheless, Cu excess causes toxicity among others reasons due to reactive oxygen species generation. Eukaryotic cells display conserved homeostatic networks in which the CTR/COPT proteins are involved in high affinity Cu uptake under environmental deficient conditions. In this thesis, we have first studied the availability of Cu in the Arabidopsis thaliana growth medium ½MS. We show that the ½MS medium supplemented with 0.5-1 M CuSO4 represents the Cu sufficiency range, whereas Cu excess is achieved in media with more than 5 M CuSO4 and Cu deficiency results from growth in media with a concentration of CuSO4 bellow 0.5 M. Furthermore, gene expression studies at different Cu concentrations suggest that COPT2 and FSD1 are appropriate markers for Cu deficiency in Arabidopsis. We have also characterized the role played by COPT2, COPT6 and COPT5 in Arabidopsis. According to the expression studies performed with COPT::GFP fusion constructs, COPT2 and COPT6 are plasma membrane proteins. By using COPTp::GUS plants, we show that COPT2 is a Cu-regulated gene, mostly expressed in roots, whereas COPT6 is predominantly expressed in aerial tissues in a Cu-independent manner. Interestingly, our studies demonstrate that Arabidopsis COPT5 is a protein associated to the prevacuolar compartment and expressed through the whole plant, except in anthers and pollen grains. Moreover, copt5 knock-out lines are hypersensitive to Cu deficiency and exhibit an inhibition of the main root growth and a decrease in both fresh weight and chlorophyll when compared to the wild type. Furthermore, Cu deficiency causes the impairment of copt5 electron transport between photosystems, probably due to problems in Cu delivery to plastocyanin. Altogether, these data suggest that COPT5 functioning is crucial for Cu delivery under severe Cu deficiency conditions. Mon, 20 Feb 2012 11:03:49 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/77726 2012-02-20T11:03:49Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/57146 Determinantes de la osteoporosis posmenopáusica: aspectos genéticos e inmunológicos y modulación por diferentes tratamientos Pineda Merlo, Begoña La pérdida ósea acelerada puede desencadenar en osteoporosis, una enfermedad esquelética caracterizada por una menor resistencia ósea y riesgo aumentado de fractura. Es la enfermedad metabólica más prevalente entre la población femenina ya que afecta al 35% de las mujeres españolas mayores de 50 años, y por lo tanto es un problema de salud pública muy importante. El tipo de osteoporosis más frecuente es la osteoporosis posmenopáusica, una enfermedad multigénica que se inicia con la retirada de la protección estrogénica. No obstante, a pesar de que todas las mujeres aceleran su tasa de pérdida ósea con la menopausia, no todas desarrollarán osteoporosis en el futuro. La causa hay que buscarla en el pico de masa ósea alcanzado por cada mujer y que está determinado principalmente por factores genéticos. Históricamente, los factores genéticos se han buscado en genes que regulan el metabolismo óseo y en genes de diversas citoquinas. Recientemente, se ha descrito la relación que existe entre el sistema inmune con la pérdida ósea, debida a la deficiencia estrogénica, y con la regulación ósea basal. De hecho, se ha relacionado la participación de células T, células B, monocitos, incluso de células dendríticas, con la osteoporosis. En este trabajo de Tesis Doctoral se ha estudiado la asociación a masa ósea de genes importantes en el metabolismo óseo, como RUNX2, y otros genes relacionados con el sistema inmune, como OCIL, CD40 y CD40L, en una población de mujeres posmenopáusicas. Debido a que la principal causa de la osteoporosis es la deficiencia estrogénica, el tratamiento más utilizado para esta patología ha sido la terapia hormonal sustitutiva (THS) mediante la administración de estrógenos. Pese a los efectos beneficiosos de la THS en el hueso, se ha descrito diversos efectos adversos, como el aumento en el riesgo de cáncer de mama o alteraciones cardiovasculares, que han llevado a la búsqueda de alternativas terapéuticas a la THS. Entre las alternativas terapéuticas utilizadas actualmente, encontramos compuestos agonistas del receptor de estrógenos, como los moduladores selectivos del receptor de estrógenos (raloxifeno) y fitoestrógenos (genisteina), y también extractos vegetales (Cimicífuga racemosa). En el presente trabajo de Tesis Doctoral se ha estudiado, comparativamente, el efecto sobre la pérdida de hueso y microestructura ósea, mediante micro-TC, de la administración del estradiol, el raloxifeno y la genisteina en el ratón ovariectomizado como modelo animal de pérdida ósea. Asimismo, también se ha evaluado en una población pequeña de mujeres posmenopáusicas, el efecto sobre el metabolismo óseo de un extracto isopropanólico vegetal de Cimicífuga racemosa (Remifemin).; Osteoporosis is a disease characterized by the progressive loss of bone mineral density (BMD) that may compromise bone strength leading to an increased risk of fracture. Although osteoporosis affects an elevated percentage not only of women but also of men, the most frequent form of the disease is the postmenopausal osteoporosis associated with the estrogenic deficiency that occurs in the menopause. Genetic factors have been recognized as playing an important role in the pathogenesis of osteoporosis, although, as a multifactorial disease, it is influenced by other parameters such diet, physical activity, medication use and lifestyle. Twin and family studies have demonstrated a high heritability of BMD. Most of the genetic studies have been focused on genes than regulated the bone metabolism and on several citoquines. Recently, the immune system have been associated with the posmenopausal osteoporosis. In fact, the participation of T cells, B cells, monocytes and dendritic cells have been related with osteoporosis. In this doctoral thesis work we have analyzed the association with BMD of polymorphisms in bone metabolism genes, as RUNX2, and other genes related with the immune system, as OCIL, CD40 and CD40L. The hormone replacement (HRT), with the estrogen administration, has been the main treatment used in the postmenopausal osteoporosis to prevent bone loss. However, there were some studies that have demonstrated some adverse effects in the HRT as cancer and cardiovascular risk. Therefore, attention has been centered on other therapeutic possibilities with lesser side-effects. Among the alternative treatments we can list the estrogen receptor agonist, as the selective estrogen receptor modulators (raloxifene) and phytoestrogens (genistein), as well as vegetable extracts (Cimicífuca racemosa). In this work, we also have studied the effect of estradiol, raloxifene and genistein administration on bone loss and bone microarchitecture in an animal model of accelerated bone loss by using ovariectomized young female mice. Likewise, we studied the effect of an isopropanolic extract of Cimicífiga racemosa on the bone metabolism in a group of postmenopausal women. Thu, 02 Feb 2012 10:04:47 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/57146 2012-02-02T10:04:47Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52190 Mecanismos moleculares de proliferación y diferenciación durante el desarrollo embrionario del pez medaka (Oryzias latipes) Sánchez Sánchez, Ana Virginia A lo largo del desarrollo embrionario las células que forman el embrión deben dividirse numerosas veces hasta alcanzar la cantidad celular capaz de asegurar la diferenciación de todos los tejidos y órganos. Por tanto, la correcta regulación de la proliferación y diferenciación celular es fundamental para evitar defectos durante el desarrollo embrionario y la aparición de enfermedades en el individuo adulto. Aprovechando las numerosas ventajas que ofrece el pez Medaka (Oryzias latipes; Ol), hemos estudiado los mecanismos moleculares que regulan la proliferación y diferenciación en los embriones de Medaka en dos momentos distintos del desarrollo, uno temprano durante la segmentación y otro tardío durante la organogénesis. El estudio en la etapa temprana de desarrollo se ha centrado, por una parte, en describir el patrón de expresión de Nanog y Oct4 a lo largo del desarrollo embrionario, y por otra parte, en estudiar la función endógena de Nanog. Tanto Ol-Nanog como Ol-Oct4 presentan patrones de expresión muy similares a los de mamífero, localizándose en el núcleo de los blastómeros durante la segmentación y más tardíamente, concentrándose principalmente en las células del primordio germinal. En el adulto, ambos se expresan en las células germinales de las gónadas de Medaka. El estudio funcional de Ol-Nanog reveló que es necesario para la transición de la fase de síntesis del ciclo celular al regular la expresión de Ciclina A, así como para la proliferación del embrión, sin embargo, no parece desempeñar un papel directo en la diferenciación de las capas germinales embrionarias. Además, Ol-Nanog media la migración de las células del primordio germinal mediante la regulación directa de la expresión de Cxcr4b. Por otra parte, centramos el estudio de la etapa tardía del desarrollo en conocer la función de la vía de señalización canónica de Wnt sobre los progenitores neurales de la retina. Para realizar este estudio utilizamos una aproximación con animales transgénicos y otra farmacológica que nos permitió manipular la señalización de Wnt en distintos momentos del desarrollo de la retina de Medaka. De este modo, determinamos que la vía de señalización de Wnt tiene dos funciones temporales distintas sobre los progenitores neurales de la retina, una temprana donde regula la progresión del ciclo celular a través de Ciclina D1, proliferación, apoptosis y diferenciación; y otra tardía, donde sólo regula la expresión del gen Vsx1, que es un marcador de células bipolares. Por tanto, la respuesta de los progenitores neurales de la retina a la vía de Wnt es dependiente del estadio de desarrollo.; During embryonic development, cells must divide many times until reaching the number required to ensure the correct differentiation of all tissues. The proper regulation of cell proliferation and differentiation is essential to avoid defects during development and the emergence of diseases in the adult. Due to the favourable experimental characteristics of Medaka fish (Oryzias latipes; Ol), we used it to study the molecular mechanisms that regulate proliferation and differentiation at two different times of development. The study undertaken during the early stage of development has focused on characterising the expression pattern of two key factors involved in maintaining pluripotency, Nanog and Oct4, and also investigating the function of the Medaka Nanog homologue (Ol-Nanog) during development. Both transcripts in medaka are expressed in a similar pattern to the mammalian Nanog and Oct4. Both proteins are located in the nucleus of the blastomeres during segmentation and later in primordial germ cells. In adults, both are expressed in the gonadal germ cells. Ol-Nanog is required for the correct transition of cells within the synthesis phase of the cell cycle by regulating the expression of Cyclin A. Although having an important role in proliferation, Ol-Nanog does not appear to play a direct role in the differentiation of embryonic germ layers. In addition, Ol-Nanog mediates correct primordial germ cell migration by directly regulating the expression of Cxcr4b, the receptor for Sdf1. To study the mechanisms that regulate proliferation and differentiation in later stages, we focused on investigating the role of canonical Wnt signalling using retina neural progenitors as a model system. To perform this study we used a transgenic and pharmacological approach to manipulate Wnt signalling at different stages. We determined that Wnt has two functions on the retina neural progenitors which depend on the stage of development. During early development Wnt controls the progression of the cell cycle by regulating the expression of Cyclin D1. During a later stage of development Wnt regulates the expression of Vsx1, a bipolar cell marker. Thu, 15 Dec 2011 11:40:15 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52190 2011-12-15T11:40:15Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52179 Análisis de la respuesta de las levaduras a las condiciones de estrés osmótico y ausencia de nitrógeno durante la vinificación Jiménez Martí, Elena La fermentación alcohólica es un proceso complejo en el que los azúcares presentes en el mosto se convierten mayoritariamente en etanol y CO2 (Fleet and Heard, 1993), gracias a la acción de las levaduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae. Durante la vinificación, las levaduras tienen que hacer frente a un conjunto de situaciones de estrés, de las que destacamos el estrés hiperosmótico al inicio del proceso, debido las elevadas concentraciones de azúcares en los mostos (150-250 g/L) (Attfiled, 1997), o el causado por el agotamiento de nutrientes, especialmente la depleción de nitrógeno. Existen diferentes trabajos en los que se estudia la respuesta de las levaduras a diferentes situaciones de estrés. En el llevado a cabo por Gasch et al. (2000) se describen alrededor de 900 genes que ven alterada su expresión cuando se exponen a diferentes tipos de estrés, lo que se denominó respuesta a estrés ambiental (ESR). Existen otros trabajos centrados en el proceso de la fermentación alcohólica, como el de Rossignol et al. (2003) donde se observó que más de 2000 genes variaban sus niveles durante la vinificación. En la primera parte se describe la respuesta de las levaduras al agotamiento de nitrógeno y la adición de diferentes fuentes. Se observa que la adición de estas fuentes a vinificaciones limitantes permite completar el proceso fermentativo de forma similar a la vinificación control, aunque la naturaleza de éstas sí influye, en el perfil organoléptico del producto final (Jiménez-Martí et al., 2007), como también influye en la reprogramación celular tras las adiciones (Jiménez-Martí et al., 2008). Asimismo, se han descrito posibles marcadores moleculares de la limitación de nitrógeno como la actividad arginasa o los niveles de expresión del gen ACA1 (Jiménez-Martí et al., 2007). En la segunda parte se estudia la respuesta de las levaduras al estrés hiperosmótico causado por elevadas concentraciones de glucosa. Se deduce que hay una mayor represión por catabolito de carbono en 20% de glucosa que en 2%. Se analizó también la implicación de algunas de las principales rutas de señalización en respuesta a este tipo particular de estrés; observándose la implicación de la ruta HOG y también una cierta participación de las rutas PKA y TOR. Se identificaró un grupo de genes de función desconocida más expresados en 20% de glucosa que en 2%. Uno de ellos es YHR087W, cuyo mutante de deleción muestra defectos de crecimiento y consumo de glucosa en medios conteniendo elevadas concentraciones de glucosa, además de presentar mayor susceptibilidad a otras condiciones de estrés que su cepa parental, por lo que se considera un gen de respuesta a estrés. Estudios proteómicos comparativos entre dicho mutante y su cepa parental en medios con 20% de glucosa muestran cambios en los niveles de expresión de proteínas pertenecientes a la categoría de plegamiento de proteínas. También se realizó un estudio transcriptómico global comparativo entre una cepa vínica y de laboratorio frente a elevadas concentraciones de azúcares. Los resultados sugieren que la mayor viabilidad de la vínica en estos medios podría estar relacionada con una mayor expresión de los genes implicados en glicolisis, fermentación y procesos biosintéticos. Finalmente, se llevaron a cabo diferentes aproximaciones con la intención de mejorar el comportamiento fermentativo de algunas cepas vínicas. Esto se consiguió, por un lado con la preadaptación de cepas con problemas al inicio de la fermentación en medios de rehidratación con determinadas concentraciones de glucosa. Por otro lado, se realizaron manipulaciones genéticas de los genes HSP26 e YHR087W. Éstas resultan, en general, en un aumento de los niveles de expresión de los genes, y en algunos casos en una mayor resistencia a diferentes condiciones de estrés, así como un menor tiempo para finalizar la fermentación (Jiménez-Martí et al., 2009).; Alcoholic fermentation is a complex process in which sugars presents in grape must become ethanol and CO2 through the action of yeasts, especially Saccharomyces cerevisiae. Throughout wine production yeast cells are affected by a plethora of stress conditions, such as nitrogen starvation, or osmotic stress due to high glucose concentrations. In this work we analyzed the effect of adding different nitrogen sources (ammonia, amino acids or a combination of both) under nitrogen depletion condtions in order to understand yeast metabolic changes. We found that the nature of the nitrogen source added introduces changes to the volatile compounds profile and to the gene expression, and also there is a differential cellular reprogramming after addition depending on the nitrogen source. On the other hand, arginase activity and the expression of ACA1 gene are useful as a molecular markers of nitrogen depletion/addition during vinification. Besides, we present a comprehensive study of the response to high glucose stress which indicates important transcriptomic changes, especially in terms of the genes involved in both stress response and respiration, and the implication of the HOG pathway. We also describe several genes of an unknown function highly expressed under 20% (w/v) glucose than under 2% . In this work we focus on the YHR087W gene, whose relevance for the response to high sugar and other stress conditions and the relationship of the encoded protein with several Hsp proteins suggest its implication in stress response. Indeed, we introduce several genetic manipulations in HSP26 and YHR087W in two different wine yeasts in order to improve their fermentative behavior. Our results indicate that some of these modifications result in strains with higher expression of these genes, better resistance to certain stress conditions, and even improved fermentative behavior. We also compare several laboratory and wine yeast strains in terms of their ability to start growth in must. We propose several clues for yeast strains to adapt to the wine production conditions: the high expression of genes involved in both biosynthetic processes and glycerol biosynthesis and content. Moreover, we demonstrate the usefulness of pre-adaptation of wine yeast with problems at the beginning of the process introducing a certain percentage of glucose in the rehydratation media. Thu, 15 Dec 2011 09:25:56 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52179 2011-12-15T09:25:56Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52123 Caracterización de mutaciones identificadas en el sistema de la proteína C: Asociación con el riesgo trombótico y estudio de su interacción con otros defectos trombofílicos Navarro Rosales, Silvia INTRODUCCIÓN: La vía anticoagulante de la proteína C (PC) es un potente mecanismo fisiológico antitrombótico. Prueba de ello es que la mayoría de los factores de riesgo trombótico de origen genético conocidos, se localizan en las proteínas que componen esta vía o bien en aquellas que modulan su actividad. OBJETIVOS: Nos planteamos caracterizar las principales mutaciones identificadas en los genes que codifican para los dos receptores endoteliales implicados en la activación de la PC, el receptor endotelial de la PC (EPCR) y la trombomodulina (TM), con la finalidad de conocer cómo modifican el riesgo de tromboembolismo venoso (TEV) en pacientes consecutivos o en individuos que ya tienen un factor de riesgo trombótico conocido, como son los portadores de la mutación 20210A del gen de la protrombina (PT), en pacientes con la enfermedad de Behçet y pacientes que han sufrido un infarto de miocardio precoz, patologías en las que la inflamación juega un papel muy importante, y en las que las acciones antiinflamatorias y citoprotectoras del sistema de la PC pueden jugar un papel relevante. Además, nos planteamos estudiar los niveles de glucosilceramida (GlcCer), con actividad anticoagulante, así como identificar las posibles mutaciones en el gen que codifica para el enzima responsable de la síntesis de la GlcCer, la UGCG, que pudieran influir sobre los niveles de GlcCer y sobre el riesgo trombótico. MATERIAL Y MÉTODOS: Tras la selección del grupo de pacientes y controles adecuado a cada estudio, se realizó una extracción de sangre periférica empleando tubos con diferentes tipos de anticoagulantes según el ensayo a realizar para la determinación de los diferentes parámetros plasmáticos. La detección de las diferentes mutaciones se realizó empleando diferentes técnicas de biología molecular. RESULTADOS: En presencia del haplotipo A3 del gen del EPCR aumenta el riesgo de TEV en portadores de la mutación 20210A del gen de la PT, posiblemente debido a los niveles aumentados de EPCR soluble asociados con este haplotipo. Por otra parte, el alelo 1418T del gen de la TM reduce significativamente el riesgo trombótico. Este efecto protector puede deberse a la asociación de este alelo con una mayor estabilidad de la TM en la membrana de la célula endotelial. Así, en el estudio con células endoteliales de cordón umbilical humano, se observó que las células portadoras del alelo 1418T muestran un elevado nivel de TM en la membrana y un menor nivel en el sobrenadante del cultivo. Los resultados también demuestran que niveles reducidos de GlcCer y de PC activada (APC) constituyen un factor de riesgo independiente para el TEV, además, la deficiencia combinada de ambos eleva el riesgo individual de cada uno de ellos. El estudio del gen de la UGCG mostró que la inserción de 10 pb en posición -222 en homocigosis, se asocia con niveles aumentados de GlcCer y con una reducción del riesgo trombótico. Además, individuos portadores de los haplotipos A1 y A3 del gen del EPCR tienen un menor riesgo de infarto de miocardio precoz. Este efecto protector se debe, posiblemente, a los elevados niveles circulantes de APC y EPCR soluble asociados con estos haplotipos. Por último, los resultados preliminares para la enfermedad de Behçet sugieren que los haplotipos A1 y A3 del gen del EPCR también parecen disminuir el riesgo de sufrir un TEV en pacientes con esta enfermedad. CONCLUSIONES: Estos resultados reflejan el papel de las principales mutaciones descritas en las proteínas que componen o regulan la vía de la PC, mediadas por las diferentes funciones que pueden ejercer tanto la APC como el EPCR soluble. Así, la APC muestra efectos anticoagulantes y citoprotectores en la trombosis venosa y arterial, mientras que el EPCR soluble puede expresar una función procoagulante en la trombosis venosa y una función citoprotectora en la trombosis arterial.; The protein C (PC) anticoagulant pathway plays a crucial role in the regulation of blood coagulation. In the last years, several reports have suggested the association between mutations in the proteins that form or those that regulate this pathway and an increased risk of thrombosis. In the present study, we evaluated the functionality of the main mutations identified in the genes of two of the membrane-bound proteins involved in the activation of PC, thrombomodulin (TM) and endothelial PC receptor (EPCR), in a group of consecutive patients with venous thromboembolism (VTE), carriers of the prothrombin 20210A mutation, patients with premature myocardial infarction patients with Behcet’s disease, and in an age and sex-matched control group for each patients group. On the other hand, we assessed the association between levels of GlcCer, a glycolipid with anticoagulant activity, activated PC (APC) and the risk of VTE. The UGCG is the enzyme that synthesizes GlcCer, so we evaluated if any mutation in the UGCG gene modify the risk of VTE. Our results were as follow: 1) carriers of the 20210A mutation and the A3 haplotype of EPCR have increased risk of VTE, probably due to the increased levels of soluble EPCR observed, associated with this haplotype; 2) Carriers of EPCR A1 and A3 have lower risk of premature myocardial infarction, probably due to the increased levels of APC and soluble EPCR observed, associated with these haplotypes; 3) Patients with Behçet disease present a lower risk for VTE in the presence of EPCR A1 and A3 haplotypes; 4) Patients with VTE carrying the TM 1418T allele have lower risk of VTE, probably due to an increased stability of the membrane-bound TM in the presence of this allele; 5) Decreased levels of GlcCer are an independent risk factor for VTE, potentiated by low levels of APC; 6) The presence of the ins10pb -222 in the UGCG gene, is associated with elevated levels of GlcCer and reduced risk of VTE. In conclusion, these results showed the role of the main mutations described in the proteins that form or regulate the PC pathway, such as EPCR, TM and GlcCer. These functions are mediated by the anticoagulant and cytoprotective properties of the APC and soluble EPCR in venous and arterial thrombosis. Tue, 13 Dec 2011 11:56:32 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52123 2011-12-13T11:56:32Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52091 Interacciones entre activadores y represores en el inicio de la transcripción en Saccharomyces cerevisiae Peiró Chova, Lorena Autosomic dominant lateral temporal epilepsy (ADLTE) is a form of partial epilepsy with secondary generalized seizures, caused by mutations in LGI1. This gene was initially identified in 1998, as a tumour suppressor in multiform glioblastoma, affecting to the malignancy of these tumours. In silico analysis of the primary sequence of LGI1, revealed four paralogues of the gene, which shared a very similar domain structure and were named as LGI1, LGI2, LGI3 and LGI4. The existence of similar types of epilepsy with common features for that seen for ADLTE, suggests that some other members of this gene family could be involved in these pathologies. Moreover, the presence of four paralogues, makes the idea of a certain degree of functional redundancy, possible. This fact, could be explained by the complementary distribution of cells expressing the genes of this family in the brain. In this work, we show a detailed expression analysis of the mRNA of the members of the LGI family in adult mouse brain. The distribution of these genes is regionally heterogeneous, suggesting that since their origin as a common ancestral gene, a subfunctionalization might have occurred. In this work, we try to shed light on these possible functions.; Negative cofactor 2 (NC2) has been described as an essential and evolutionarily conserved transcriptional repressor, although in vitro and in vivo experiments suggest that it can function as both a positive and a negative effector of transcription. NC2 operates by interacting with the core promoter and components of the basal transcription machinery, like the TBP. In this work, we have isolated mutants that suppress the growth defect caused by depletion of NC2. We have identified mutations affecting components of three different complexes involved in the control of basal transcription: the mediator, TFIIH, and RNA pol II itself. Mutations in RNA pol II include both overexpression of truncated forms of the two largest subunits (Rpb1p and Rpb2p) and reduced levels of these proteins. Suppression of NC2 depletion was also observed by reducing the amounts of the mediator essential components Nut2p and Med7p, as well as by deleting any of the nonessential mediator components, except Med2p, Med3p, and Gal11p subunits. Interestingly, the Med2p/Med3p/Gal11p triad forms a submodule within the mediator tail. Our results support the existence of different components within the basic transcription complexes that antagonistically interact with NC2 repressor and suggest that the correct balance between the activities of specific positive and negative components is essential for cell growth. In the second part of this work, we study a novel and highly conserved factor that physically interacts with most of the RNA pol II subunits, Iwr1p. Here we show that Iwr1p genetically interacts with components of the basal transcription machinery and plays a role in both basal and regulated transcription. We report that mutation of IWR1 gene is able to bypass the otherwise essential requirement for the transcriptional regulator NC2, which occurs with different components of the basal transcription machinery, including TFIIA and subunits of the mediator complex. Deletion of the IWR1 gene leads to an altered expression of specific genes, including phosphate-responsive genes and SUC2. Our results show that Iwr1p is a nucleocytoplasmic shuttling protein and suggest that Iwr1p acts early in the formation of the pre-initiation complex by mediating the interaction of certain activators with the basal transcription apparatus. Mon, 12 Dec 2011 13:08:11 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/52091 2011-12-12T13:08:11Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/39086 Lipopoliplejos y complejos monomoleculares de ADN como vectores de terapia génica Sanmartín Santos, Isaías La terapia génica no viral avanza al ritmo que marca el desarrollo en sus vectores de transferencia génica. Vectores más eficientes, más sofisticados y con posibilidades nuevas, son el frente de avance y motor del campo. La presente tesis doctoral describe el desarrollo de dos nuevos vectores para terapia génica no viral, pertenecientes a ámbitos de aplicación muy diferenciados. El LPP (lipopoliplejo) es un vector de asociación liposomas/ADN/PEI cuya característica esencial es la capacidad para transportar en compartimentos independientes una gran carga de antígenos y genes u otras moléculas, que son transferidos conjuntamente a la misma célula, y cuyo ámbito de aplicación más apropiado sería la dispensación de antígenos en estrategias terapéuticas de inmunización. Adicionalmente, he desarrollado varios métodos nuevos que permiten una caracterización completa de los vectores de asociación liposomas/policatión/ADN, desarrollándose un protocolo que permite una caracterización completa de estos vectores previa a su uso en ensayos de inmunización. Por otro lado, se han diseñado vectores basados en tensoactivos dimerizables, dotados de una cabeza polar de dos aminoácidos que proporcionan las funciones químicas tiol y amino, y una cola hidrofóbica de diez carbonos de longitud; que son capaces de compactar monomolecularmente un plásmido de ADN, consiguiendo partículas de tamaño nanométrico que constituyen el primer paso fundamental en la construcción de un vector de terapia génica no viral con estructura y tamaño semejantes a las de los virus. Los vectores desarrollados se han sometido a diversos ensayos biológicos, en particular en modelos de inmunización antitumoral en ratón contra un antígeno lipídico de melanoma (el gangliósido de membrana GD3), y también con antígenos proteicos hidrosolubles de la membrana de células tumorales de melanoma, obteniéndose en ambos casos respuesta humoral.; This assay describes the development and characterization of new gene transfer vectors. The lipopolyplex (LPP) constitutes a new microtechnological device able to simultaneously deliver plasmids and other molecules, such as drugs, proteins or lipids, to a cell. It is have been developed based on the association of anionic liposomes and cationic DNA:PEI complexes, with a set of novel analytical techniques for the characterization of these complexes. Most effective noncellular genic vaccines against cancer tried at the present time are based on the simultaneous use of one or more antigen combined with DNA that codifies for cytokines or other inmunoestimulatory molecules. Frequently it is not had the genes that codify these antigens, so they are purified and incorporated like such in the vaccine. Nevertheless, these molecules are of diverse chemical nature, and sometimes the combination of antigens selected is chemically incompatible to each other, not being possible its association. We show a novel LPP particle for the vehiculization of antigens based on two different compartments, lipidic and hidrosoluble, associated to a third compartment for the nucleic acids transport. Additionally, we present the new chemical agents RCC10 and HCC10 for the compactation of a DNA plasmids cariying therapeuthics genes into a single and stable globular nanometric system. Thu, 06 Oct 2011 11:40:55 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/39086 2011-10-06T11:40:55Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/38245 Efectos moduladores del etanol sobre el sistema inmunitario: papel de los receptores TLR4 Fernández Lizarbe, Sara Trabajos clínicos y experimentales han demostrado que el etanol altera al sistema inmunitario. Aunque los mecanismos moleculares se desconocen, se ha demostrado que sus acciones sobre el sistema inmunitario son complejas y dependen de la dosis, el tiempo de exposición (agudo o crónico), tipo celular y presencia o ausencia de estímulos adicionales, como patógenos. Evidencias recientes indican el papel de los receptores tipo Toll (TLR) en la respuesta inmunitaria innata y, posiblemente, en la adquirida. De hecho, el tratamiento agudo de alcohol parece inhibir la respuesta inflamatoria y la liberacion de citocinas mediada por los receptores TLR en macrófagos. Por el contrario, el tratamiento crónico causa una activación de la vía NFκB, incrementando la expresión de citocinas, que a su vez, activan diferentes vías de señalizacion en hígado, hepatocitos y cerebro, que pueden conllevar a daño inflamatorio. Estos resultados sugieren que el etanol podría activar las vías de señalización asociadas a los receptores IL-1RI/TLR4. En el presente trabajo se han estudiado las posibles interaciones del etanol con los receptores TLR y se han evaluado los mecanismos por los que el etanol puede modular las respuestas de estos receptores, tomando como variables: diferentes dosis de etanol, tipos celulares y presencia o ausencia de ligandos. Para estos objetivos hemos utilizado las celulas RAW 264.7 (línea celular de macrófagos de ratón), macrófagos peritoneales y células microgliales en cultivo primario (principales células inmunes del sistema nervioso central). Los resultados obtenidos demuestran: 1) El etanol, a dosis moderadas, activa la respuesta innata inmunitaria tanto in vivo como in vitro, en macrófagos y en microglía, induciendo la cascada de señalización asociada al receptor TLR4 e incrementando la liberación de mediadores inflamatorios. En ratones deficientes en el TLR4-/- no se observa la inducción por el etanol de citocinas y mediadores inflatorios. 2) Los efectos del etanol sobre la activación de los macrófagos dependen de la dosis suministrada: concentraciones moderadas (50 mM), activan la respuesta de los TLR4 y su cascada de señalización, mientras que altas dosis (100 ó 200 mM) inhiben esta respuesta. 3) El etanol inhibe la respuesta de los TLR4 inducida por su ligando LPS. Refrente al mecanismo de la activacion del TLR4 por el etanol, demostramos que el etanol, a través de sus interacciones con los lípidos de membrana, induce un reclutamiento de este receptor y de las moléculas asociadas a su señalización hacia los microdominios de membrana “lipid rafts”. Sugerimos que a través de sus interaciones con estos microdominios podría interacionar con otros receptores de membrana, como el TLR2. Además, demostramos que tratamientos agudos de etanol modulan la inmunidad adaptativa produciendo un aumento de la expresión de moléculas que interviene en la presentación antigénica (MHC-I y MHC-II) y su reclutamiento hacia lipid rafts. Por el contrario, el consumo crónico de etanol inhibe la expresión de estas moléculas, lo que podría causar supresión de la respuesta a patógenos, tal y como se observa en pacientes alcohólicos. Globalmente, nuestros resultados no sólo proporcionan la primera evidencia del papel crítico de la respuesta del TLR4 en la activación inducida por el etanol en células fagocitarias, sino también una nueva comprensión de los mecanismos básicos que participan en el daño inducido por etanol a nivel sistémico y en procesos neuroinflamatorios.; Clinical and experimental research have shown that ethanol alters the immune system, although the molecular mechanisms are unknown. Recent evidence indicates the role of Toll-like receptors (TLRs) in immune responses. In fact, alcohol treatment modulate the inflammatory response and cytokine release in macrophages suggesting the role of TLR4 in the ethanol-induced damage. We have studied the interactions of ethanol with TLRs and evaluated the mechanisms by which ethanol can modulate the responses of this receptor in RAW 264.7 cells, and primary culture of peritoneal macrophages and microglial cells. Our results show: 1) Moderate doses of ethanol activates the innate immune response both in vivo and in vitro, in macrophages and microglia, inducing a signalling pathway associated with TLR4 and increasing the release of inflammatory mediators. The inflammatory response induced by ethanol is completely abrogated in microglia of TLR4 deficient mice 2) The effects of ethanol on the activation of macrophages depend on the dose administered: low/moderate concentrations (10-50 mM) activates the response of TLR4 and its signalling pathways, whereas high doses (100 or 200 mM) inhibit TLR4 response. 3) Ethanol interferes and inhibits the response induced by the TLR4 ligand, LPS. An important finding of this study is the involvement of lipid rafts in the activation mechanism of the TLR4 by ethanol. We demonstrated that ethanol, through its interaction with membrane lipids induces a recruitment into the lipid rafts of this receptor, as well as signalling molecules. We suggest that ethanol, through interactions with these microdomains, might modulate other membrane receptors such as TLR2. Furthermore, we demonstrate that acute ethanol treatment modulate adaptive immunity leading to increased expression of molecules involved in antigen presentation (MHC-I and MHC-II) and their recruitment into lipid rafts. By contrast, chronic ethanol consumption inhibits the expression of these molecules, which might lead to the suppression of the immune response to pathogens, as observed in alcoholic patients. Overall, our results not only provide the first evidence of the critical role of TLR4 response in ethanol-induced activation in phagocytic cells, but also a new understanding of the basic mechanisms involved in ethanol-induced damage and causes neuroinflammatory processes. Wed, 28 Sep 2011 10:31:07 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/38245 2011-09-28T10:31:07Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/31948 Estudio teórico de procesos fotoinducidos en sistemas biológicos Olaso González, Gloria En la presente Tesis Doctoral se investiga, desde un punto de vista teórico, procesos de transferencia de carga y/o energía inducida por la luz en distintos sistemas biológicos. En concreto se estudian tres procesos paradigmáticos: la transferencia de carga en la fotosíntesis, la fotofísica y fotorreactividad de las bases nitrogenadas del DNA y el proceso de fotoisomerización del cromóforo de la Rodopsina, desencadenante de la visión. La metodología empleada para la realización de estos estudios es principalmente la CASPT2//CASSCF, una herramienta químico-cuántica especialmente adecuada para el tratamiento de los estados moleculares excitados, debido a su carácter multiconfiguracional.; This Doctoral Thesis investigates, from a theoretical point of view, charge and energy transfer processes in biological systems that are induced by light. In particular, three paradigmatic processes are studied: the charge transfer in photosynthesis, photophysics and photoreactivity of DNA nucleobases and the photoisomerization of the chromophore of Rhodopsin, which is the first step in the vision process. These studies has been carried out by using CASPT2//CASSCF methodology, a quantum chemistry tool very useful for the study of excited molecular states due to their multiconfigurational character. Thu, 16 Jun 2011 10:07:08 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/31948 2011-06-16T10:07:08Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/31922 Cambios en la fosforilación de proteínas nucleares y cascadas de señalización inducidos por el ácido retinoico Laserna Mendieta, Emilio Jósé La vitamina A, a partir de una serie de transformaciones metabólicas, se convierte en el ácido retinoico (RA), su metabolito activo más potente biológicamente. La vitamina A y sus derivados juegan un importante papel como reguladores fisiológicos de un gran número de procesos biológicos. Concretamente, el RA posee un papel relevante en el desarrollo embrionario temprano y en la generación de varios órganos y sistemas, como es el caso del Sistema Nervioso. El RA es capaz de inducir la parada proliferativa y la diferenciación in vitro de líneas celulares de muy diferente origen, incluyendo muchos tipos celulares tumorales como el neuroblastoma. Estudios previos realizados en la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y han mostrado que, además de las acciones clásicas sobre la transcripción de genes específicos, el receptor nuclear de RA (RAR), perteneciente a la superfamilia de los receptores nucleares de hormonas, media cambios rápidos en el estado de activación de rutas de señalización, como la ruta de PI3K/Akt y la vía de la MAP kinasa ERK. Este tipo de acciones rápidas independientes de transcripción, también llamadas no genómicas, constituyen el tema de interés principal de esta Tesis Doctoral, siendo nuestro objetivo general tratar de comprender cómo contribuyen este tipo de acciones en los procesos celulares y cómo se integran con las acciones genómicas transcripcionales para conseguir una única respuesta al RA. Un primer estudio de los intermediarios de estas rutas, mediante el empleo de fosfoanticuerpos específicos de residuo e inhibidores de las vías de señalización, demostró que la activación de PI3K/Akt y ERK por un tratamiento a tiempos cortos con RA se traduce en la fosforilación de sustratos corriente abajo (downstream), como mTOR y p70S6 en el caso de Akt, y MSK1 para ERK. Además, se estableció que ERK es activada independientemente de PI3K, aunque existe cierta relación entre ambas, pues la inhibición de PI3K con LY294002 modificaba el grado de inducción de ERK. Mediante un abordaje proteómico, se trató de identificar a aquellas proteínas nucleares que sufrían un cambio en su estado de fosforilación como consecuencia de las acciones atípicas del RA. Primeramente, se realizó una comparación de geles bidimensionales teñidos con Coomassie de fosfoproteínas nucleares de las células control y tratadas con RA. Este estudio fue ampliado con un ensayo LC-MS/MS cuantitativo empleando la metodología iTRAQ. Los resultados mostraron que el RA modifica el patrón de fosforilación de dos grandes grupos de proteínas: 1) aquellas que participan en transcripción y en la remodelación de la cromatina, y 2) las relacionadas con el procesamiento del mRNA, y dentro de ellas, sobre todo las implicadas en splicing. Además, estos resultados pudieron ser validados para algunas de estas proteínas mediante el empleo de otras metodologías. Los estudios funcionales mostraron que efectivamente el RA participa en la regulación del splicing alternativo, a través de la activación de la vía de PI3K/Akt. El mecanismo molecular podría implicar alteraciones en la unión al mRNA de algunos factores de splicing ricos en Ser y Arg (proteínas SFRS) y la promoción de la interacción entre las proteínas de splicing SF2 y U1- 70K. Por otro lado, el RA también desempeña un papel en la regulación del inicio de la traducción, que requiere de la inducción de la vía de PI3K/Akt/mTOR, responsable de fosforilar a 4E-BP1, y de la MAP kinasa ERK. Como conclusión, la activación de vías de señalización por las acciones no genómicas del RA en células de neuroblastoma puede regular el procesado del mRNA como parte de la respuesta orquestada por el receptor nuclear RAR.; Retinoic acid (RA), the biologically active form of vitamin A, is an important molecular signal for the early embryonic development and the differentiation of many cell types. RA induces the differentiation of neuroblastoma cells when added in vitro, and a therapeutic effect for RA has been demonstrated in a multicenter clinical assay with high-risk neuroblastoma patients. RA signaling is mediated by the retinoic acid receptor (RAR), belonging to the nuclear hormone receptor superfamily. In addition to its classical transcriptional actions, RAR also mediates rapid transcription-independent (nongenomic) actions, consisting in the activation of signal transduction pathways, as the phosphatidyl-inositol-3-kinase or the ERK MAPK-signaling pathways. RA-induced rapid transcription-independent actions play a role in different physiological contexts, being our main goal to elucidate how these rapid actions converge with the transcriptional actions and integrate together to achieve a physiological response to RA. First, several experiments using phospho-specific antibodies and signaling pathways inhibitors showed that activation of PI3K/Akt pathway downstream targets, like mammalian target of rapamycin (mTOR) and p70S6 kinases, was rapidly induced by RA treatment. On the other hand, mitogen- and stress-activated protein kinase 1 (MSK1) was shown to be an ERK target induced by RA addition. Secondly, we identified nuclear proteins whose phosphorylation state was rapidly modified by RA treatment in neuroblastoma cells, by comparing nuclear phosphoproteins from control and RA-treated cells using two proteomic approaches: 2DE-gels stained with Coomassie and quantitative LC-MS/MS assay based on the iTRAQ (isolated tags for relative and absolute quantification) methodology. Our results showed that RA addition led to changes in the phosphorylation patterns in two families of proteins: 1) those related to chromatin dynamics in relation to transcriptional activation, and 2) those related to mRNA processing and, in particular, mRNA splicing. Finally, functional assays showed that RA treatment in neuroblastoma cells led to the alteration of pre-mRNA alternative splicing and mRNA translation patterns, through a molecular mechanism involving SFRS (splicing factor, serine/arginine-rich) proteins. Therefore, we conclude that RA activation of signaling pathways converge at multiple levels with RAR-dependent transcriptional regulation to generate the cellular response to RA orchestrated by RAR receptor. Tue, 14 Jun 2011 07:31:09 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/31922 2011-06-14T07:31:09Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9562 Caracterización estructural y funcional de los promotores humanos SREBP1 y su regulador INSIG2 Fernández Álvarez, Ana Julia La homeostasis lipídica está regulada por factores de transcripción llamados Proteínas de unión a elementos de respuesta a esteroles ó SREBP. Estas porteínas activan a nivel transcripcional enzimas de las vías de síntesis de colesterol, ácidos grasos, triglicéridos y fosfolípidos. Además estos factores regulan la diferenciación adipocitaria y la expresión génica dependiente de insulina. Alteraciones funcionales en SREBP han sido relacionadas con el desarrollo de diversas patologías metabólicas humanas como la obesidad y la diabetes tipo 2. <br/>Existen tres miembros de la familia SREBP. Las variantes SREBP1a y SREBP1c, son producidas por splicing alternativo a partir de un único gen mientras que SREBP2 es codificada por un gen diferente. Las proteínas SREBP son sintetizadas como precursores inactivos anclados a la membrana del retículo endoplásmico. En condiciones de bajos niveles de esteroles, los precursores inactivos son transportados hasta el aparato de Golgi donde son activados mediante cascada proteolítica liberando la proteína nuclear activa. El precursor inactivo permanece anclado en el retículo debido a su interacción con otras dos proteínas de membrana: SCAP e INSIG (insulin-induced gene), ambas reguladas por esteroles. Se conocen dos isoformas de INSIG denominadas INSIG1 e INSIG2. En humanos, ambas proteínas tienen un 59% de homología y difieren principalmente en su forma de regulación. En ratones se han encontrado dos variantes de RNA mensajero de INSIG2 denominadas INSIG2a, específica de hígado y regulada negativamente por insulina, e INSIG2b, de expresión ubicua. <br/>Teniendo en cuenta que variaciones en la expresión de las proteínas SREBP se han relacionado con enfermedades complejas, así como la importancia que se está dando a las regiones reguladoras en la etiopatogenia de estas enfermedades, el objetivo de esta tesis ha sido caracterizar la regulación a nivel transcripcional de la vía SREBP con tres objetivos concretos: 1, caracterización del Promotor humano SREBP1a, 2, caracterización del Promotor humano SREBP1c, y 3, identificación del Promotor humano INSIG2.<br/>El estudio del promotor humano SREBP1a nos permitió identificar la región correspondiente al promotor proximal. Este promotor, al igual que el promotor murino, está comprendido en una pequeña zona del DNA de 75pb que se caracteriza por una región rica en GC. Esta región contiene 3 sitios superpuestos SP1/EGR1 capaces de unir ambos factores de transcripción tanto in vitro como in vivo, siendo SP1 un activador de la transcripción y EGR1 un inhibidor de su actividad<br/>Hemos estudiado también la regulación del promotor humano SREBP1c tanto a nivel basal como la respuesta a factores nutricionales. Nuestros resultados demuestran que la regulación de los promotores de ambas especies presenta gran similitud. Los estudios realizados in vivo demostraron además que el receptor nuclear PPAR es capaz de unirse al promotor en presencia de RXR y que tanto el promotor SREBP1c humano como el de rata son activados por un agonista de este receptor. El cofactor PGC1 está también involucrado en la regulación de este promotor.<br/>Hemos clonado y caracterizado la región proximal del promotor humano INSIG2. Los resultados obtenidos demuestran por primera vez que proteínas de la familia de factores de transcripción Ets están involucradas en la regulación de este promotor. Se ha identificado la acción de la proteína SAP1a que controla su actividad basal en forma dependiente de su estado de fosforilación. Este promotor está además regulado por insulina en forma positiva. <br/>Este estudio funcional y estructural de los promotores humanos de SREBP1 y su regulador INSIG2 nos ha permitido delinear parte de la regulación trancripcional de la vía SREBP, así como similitudes y diferencias entre especies. Esta información nos permitirá analizar las alteraciones que puedan tener relevancia fisiológica así como los mecanismos indispensables para la correcta funcionalidad de estas vías metabólicas.; ABSTRAC<br/>Sterol regulatory-element-binding proteins (SREBPs) are transcription factors with a central role in cholesterol and fatty acid metabolism. Functional alterations in these proteins have been implicated in the development of several human metabolic diseases such as obesity or type 2 diabetes. <br/>The SREBP family of transcription factors consists of three isoforms, SREBP1a and 1c, encoded by a unique gene by alternative splicing, and SREBP2 encoded by a separate gene. SREBPs are synthesized as inactive precursors embedded in ER membranes until they are transported to the Golgi apparatus where they are activated by proteolysis. The ER-to-Golgi migration of SREBPs is crucially dependent on its interaction with two other membrane proteins: SCAP (SREBP cleavage-activating protein) and INSIG (insulin-induced gene), both regulated by cell sterol levels. <br/>Two INSIG isoforms are known, designated INSIG1 and INSIG2. In humans, both proteins are 59% identical but they differ in their mode of regulation. Transcription of INSIG2 gene in mice give rise to alternative mRNA transcripts named INSIG2a which is liver specific and INSIG2b. <br/>In the present work we aimed to analyze the transcripcional regulation of the SREBP pathway focusing on the characterization of the functional al structural organization of SREBP1a, SREBP1c and INSG2 human promoters.<br/>Human SREBP1a promoter is characterized by three GC boxes responsible for its SP1 activation and EGR1 inactivation. Human SREBP1c is regulated by nutricional factors in a similar way as the mouse and rat promoter. A response mediated by PPAR nuclear receptor and its coactivator PGC1 is present in rat and human promoter. INSIG2 transcriptional regulation has not been previously studied. Human INSIG2 promoter was identified and cloned for analysis. The proximal promoter is comprised in a 300 pb fragment. The results show this region is regulated by Ets family of transcriptional factors with a particular participation of phosphorilated Sap1a protein. Human promoter is also positively regulated by insulin in primary culture hepatocytes.<br/>This study on human promoters of SREBP1 and INSIG2 allowed us to delineate part of the transcriptional regulation of SREBP pathway wich would be of great relevance for the analysis of physiologically relevant alterations related with metabolic pathology. Tue, 12 Apr 2011 19:00:40 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9562 2011-04-12T19:00:40Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9561 Caracterización de las alteraciones en la membrana basal pulmonar de ratas deficientes en vitamina A y su reversibilidad por ácido retinoico. Esteban Pretel, Guillermo La deficiencia de vitamina A (VAD) es un problema importante de salud pública, que afecta<br/>clínicamente a más de 5 millones de personas al año. En países en vías de desarrollo afecta<br/>gravemente a niños aumentando la morbilidad y mortalidad de diferentes infecciones y<br/>enfermedades del tracto respiratorio.<br/>Los retinoides, metabolitos activos de la vitamina A, son necesarios en mamíferos para el<br/>desarrollo pulmonar y la diferenciación de células pulmonares, y su deficiencia altera la estructura<br/>y función de los pulmones. Las membranas basales (MBs), que están asociadas al epitelio y<br/>endotelio alveolar y forman parte de la pared alveolar, también están implicadas en estos procesos,<br/>y el ácido retinoico, principal forma biológicamente activa de la vitamina A, modula la expresión<br/>de macromoléculas de la matriz extracelular.<br/>Por este motivo, el propósito de nuestro trabajo ha sido analizar los efectos de la deficiencia<br/>crónica de vitamina A en la estructura y composición de la MB pulmonar durante el desarrollo<br/>postnatal de los pulmones, y el del tratamiento posterior con ácido all-trans-retinoico sobre las<br/>alteraciones encontradas. Crías macho, recién destetadas, fueron alimentadas con dieta completa o<br/>deficiente en vitamina A hasta que cumplieron 60 días de vida. Y un grupo de crías VAD fueron<br/>recuperadas con inyecciones intraperitoneales de ácido all-trans-retinoico durante 10 días. El<br/>análisis concreto de la MB alveolar, cuya integridad es de gran importancia para el intercambio de<br/>gases durante la función respiratoria, mostró en la deficiencia un engrosamiento de la misma,<br/>deposiciones ectópicas de fibrillas de colágeno I en su interior, un aumento del contenido total de<br/>los colágenos I y IV, y cambios en su composición en cadenas &#945;. Además, la deficiencia de vitamina<br/>A produjo una disminución en el contenido de las cadenas de laminina mayoritarias en las MBs<br/>pulmonares, y modificó la actividad proteolítica de la MMP2 y MMP9, encargadas de la<br/>degradación y renovación de las MBs, disminuyéndola. También observamos que la privación de<br/>vitamina A durante este periodo del desarrollo provocó un aumento del factor fibrogénico TGF-<br/>&#946;1, un incremento del estrés oxidativo y una respuesta inflamatoria leve en los pulmones. Por otro<br/>lado, también demostramos que la mayoría de estas alteraciones, al menos parcialmente,<br/>revirtieron al estado control tras tratar con ácido all-trans-retinoico. Interesantemente, la<br/>capacidad de recuperación por parte del ácido retinoico ocurre aún existiendo un estrés oxidativo<br/>aumentado. En conclusión, la deficiencia de vitamina A ocasiona alteraciones en la estructura y<br/>composición de la MB alveolar que probablemente estén mediadas por el TGF-&#946;1 y el ácido<br/>retinoico es capaz de revertirlas. Estas alteraciones podrían contribuir a un mal funcionamiento<br/>pulmonar y predisponer a diferentes enfermedades pulmonares.; Vitamin A deficiency (VAD) is an important public health problem, affecting clinically more than 5<br/>millions of persons per year. Particularly, VAD affects children of developing countries, increasing<br/>the morbidity and mortality of several respiratory tract infections and illnesses.<br/>Retinoids, active metabolites of Vitamin A, are essential for lung development and pulmonary cell<br/>differentiation and its deficiency results in alterations of lung structure and function. Basement<br/>membranes (BMs), that are associated with the alveolar epithelium and endothelium and<br/>constitutes part of the air-blood barrier, are also involved in those processes, and retinoic acid, the<br/>main biologically active form of vitamin A, influences the expression of extracellular matrix<br/>macromolecules.<br/>Therefore, the aims of our work have been to analyze the ultrastructure and collagen content of<br/>lung alveolar BM in growing rats deficient in vitamin A and the recovering effect of all-trans<br/>retinoic acid. Alveolar BM, which is very important for the gas exchange and lung function, was<br/>enlarged in VAD rats (doubled its thickness) and contained irregularly scattered collagen fibrils.<br/>Immunocytochemistry revealed that these fibrils were composed of collagen I. Total content of<br/>both collagen I protein and its mRNA was greater in vitamin-deficient lungs. In agreement with<br/>the greater size of the BM the amount of collagen IV was also increased. VAD altered the &#945; chain<br/>composition of collagen I and IV, and also reduced the content of the main laminin chains of lung<br/>BMs. Moreover proteolitic activity of MMP2 and MMP9 were decreased in VAD animals.<br/>Proinflammatory cytokines, IL-1&#945;, IL-1&#946; and TNF-&#945;, did not change, but myeloperoxidase and<br/>TGF-&#946;1 were increased. Treatment of VAD rats with retinoic acid reversed to the control state<br/>nearly all the alterations, at least partially. Interestingly, retinoic acid recovering activity occurred<br/>in the presence of increasing oxidative stress. In conclusion, vitamin A deficiency results in<br/>alterations of the structure and composition of the alveolar BM which are probably mediated by<br/>TGF-&#946;1 and reverted by retinoic acid. These alterations could contribute to the impairment of<br/>lung function and predispose to pulmonary disease. Tue, 12 Apr 2011 19:00:40 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9561 2011-04-12T19:00:40Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9560 Estudio genómico de la trasncripción y de la degradación de los mRNAs en Saccharomyces cerevisiae Pelechano García, Vte. José En este trabajo se ha realizado un estudio exhaustivo sobre el recambio de los mRNAs a escala genómica en la levadura Saccharomyces cerevisiae.<br/>Se ha confirmado que la asunción de estado estacionario para la expresión génica en condiciones de crecimiento exponencial, y por lo tanto la validez del cálculo indirecto de valores de estabilidad de mRNAs a partir de datos de cantidad y tasa de transcripción. También se han caracterizado ligeras desviaciones del estado estacionario específicas de grupos funcionales y se ha calculado la contribución a estas variaciones de mRNA dependientes de cambios en la transcripción o en la estabilidad de mRNAs.<br/>Una vez comprobada la validez del estado estacionario para la expresión génica en las condiciones estudiadas, se ha realizado un cálculo alternativo de estabilidades de mRNAs usando un método directo. Concretamente se ha realizado una parada general de la transcripción usando tiolutina y se ha cuantificado la desaparición de los mRNAs. Durante este experimento se detectó un efecto inhibitorio de la tiolutina sobre la degradación de los mRNAs. Los datos obtenidos por cada procedimiento, directo e indirecto, se han comparado.<br/>Por otra parte, se ha desarrollado un método para medir la tasa de transcripción a escala genómica basado en la inmunoprecipitación de cromatina (RPCC). Este método ha permitido descubrir y corregir alguno de los sesgos técnicos presentes en el GRO contribuyendo a generar unos datos genómicos de transcripción en levadura más robustos y fiables. Además, la comparación de estas dos técnicas también ha permitido descubrir diferencias biológicas en la forma que tiene la célula de transcribir los genes pertenecientes a diferentes grupos funcionales. Se ha profundizado en el estudio de la regulación de estas diferencias y se ha descrito un posible mecanismo de acción para el caso de los genes de las proteínas ribosómicas.<br/>Finalmente se ha puesto a punto una variante del GRO basada en la purificación selectiva de mRNAs nacientes. Esta alternativa permitirá en un futuro el estudio de la transcripción a una mayor resolución usando chips de DNA de embaldosado u otras técnicas genómicas de nueva generación.; We have confirmed the assumption of a steady state for gene expression during exponential growth in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Therefore, we also have confirmed that it is possible to compute the mRNA stability for all yeast genes in an indirect way using mRNA amounts and transcription rates data. We also have studied minor gene group-specific deviations from the steady state, and have determined witch part of the mRNA amount variation is due to changes in the transcription rate or in the mRNA stability.<br/>The mRNA stabilities have also been studied genome wide by using a direct method: inhibition the mRNA transcription with thiolutin and measurement of the mRNA decay. During this study we have been able to characterize a secondary effect of the thiolutin inhibiting the mRNA degradation. We also have done a comparison between the different genomic methods used to study the mRNA decay.<br/>On the other hand, we have implemented a new method for measuring the transcription at genomic level using chromatin immunoprecipitation (RNA Pol ChIP-on-chip, RPCC). This method has allowed us to improve the quality of the transcription rate data obtained by GRO. Moreover, using the comparison between the GRO and RPCC methods we have been able to discover transcription elongation differences specific for gene groups. The case of the ribosomal proteins genes has been studied with more detail and we have postulated a model for its transcription based in the repressive effect of Rap1 protein.<br/>Finally, we have developed a new version of the GRO technique using a selective purification of the nascent mRNAs that allows fluorescent labeling. This variation will allow high resolution studies of the transcription using tiling arrays or massive parallel DNA sequencing. Tue, 12 Apr 2011 19:00:39 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9560 2011-04-12T19:00:39Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9559 Estudio estructural y funcional de proteínas de movimiento viral de virus de plantas. Martínez Gil, Luis Los virus de plantas para extender la infección necesitan, en su movimiento célula-célula, atravesar la barrera que supone la pared celular, para lo cual aprovechan los plasmodésmos (PD). Éstos son aperturas en la pared celular atravesadas por un canal membranoso (desmotúbulo) que permiten el intercambio de agua, nutrientes y moléculas de señalización. En el caso de los virus de RNA de polaridad positiva la entrada de la partícula viral en la planta provoca el desensamblaje de la cubierta. Proceso ligado al inicio de la transcripción de las primeras proteínas virales, implicadas en la replicación del genoma viral. A continuación se sintetizan el resto de proteínas del virus entre ellas las encargadas de transportar el RNA viral de una célula a la célula adyacente, conocidas como proteínas de movimiento (MP). Estas proteínas son imprescindibles para el transporte del genoma del virus, en un primer lugar al PD (empleando la red de membranas derivadas del retículo endoplasmático (ER)) y a continuación a través de éstos; en este caso necesariamente en intensa interacción con el desmotúbulo. <br/><br/> Los virus de plantas se agrupan en tres grandes categorías según el número de MP que presenten, así encontramos aquellos que presentan una única MP de gran tamaño (la superfamilia 30k), otro gran grupo conocido como DGB (double gene block) con dos pequeñas MP y por último el TGB (triple gene block) con tres MP. La relación entre las membranas de la planta y las MP es imprescindible para el transporte del genoma viral pero únicamente ha sido estudiada en profundidad en el caso del TGB. Es por esto que en la presente tesis se planteó el estudio del tipo de interacción establecida entre la membrana y las MP del los virus MNSV y TCV ambos del DGB y PNRSV y TMV (pertenecientes a la superfamilia 30k). Para lo cual se emplearon métodos bioquímicos de transcripción y traducción in vitro en presencia de microsomas y diferentes técnicas biofísicas como dicroísmo circular o la balanza de Langmuir así como ensayos in vivo tanto en E.coli como en N.bentamiana. <br/><br/>El MNSV tiene dos MP, una soluble y capaz de unir RNA (p7A), la otra p7B presenta una única región hidrofóbica (RH) entre los aminoácidos 13 y 32 identificada por los programas de predicción empleados como un fragmento transmembrana (fTM). Dicha región es capaz de insertarse en membranas del ER. Es además capaz de dirigir e insertar la proteína en la membrana de manera cotraduccional. p7B adopta tanto en membranas del ER como en E.coli una topología N-t citosólico/C-t extracelular. La MP p9 del TCV al igual que p7B se inserta de manera cotraduccional en membranas del ER, donde adopta una topología N-t citosólico/C-t luminal determinada por su único fTM (residuos 3-20).<br/><br/>La MP del PNRSV, p30 presenta una RH incapaz de insertarse en la membrana. La proteína si se asocia a las membranas aunque de manera periférica no de manera integral. Su dominio hidrofóbico (aa 89-110) es probablemente responsable de esta interacción y juega un papel fundamental en la capacidad de la proteína para transportar el RNA viral de una célula a otra. La prolina 96 (en la RH) además de determinar la estructura de este dominio es imprescindible para la correcta función de la proteína. La MP del TMV p30, ha sido considerada hasta la fecha como una proteína integral de membrana. Los estudios realizados en esta tesis demuestran que si bien si se asocia a la bicapa lipídica no lo hace de manera integral sino más bien periféricamente, análogamente a p32.; The cell-to-cell movement of RNA plant virus require the function of the so-called movement proteins (MP). These proteins interact with the plasmodesmata, an aperture in the plant cell wall crossed by a membranous channel formed by prolongations of the Endoplasmatic Reticulum (ER), to facilitate the passage of the viral RNA from one cell to the next one. The interaction of the MP with the ER has been reported for several MP in different stages of the infectious process, but the nature of this association has only been fully studied in few cases. To gain further knowledge of the infection process we have examined the type of association of three different MP, p7B (MNSV), p9 (TCV), p30 (TMV) and p32 (PNRSV) with membranes derived from the ER. In this study we have use a broad range of biochemical techniques, from in vitro transcription and translation to circular dichroism, monolayer studies and membrane isolation from plant tissue. The experimental approach was supplemented with a computer-assisted analysis of the MP sequences. <br/><br/>In this work we have found that p7B inserts into the membrane in a co-translational manner using its hydrophobic region (aminoacids 13-32) as a signal sequence and as a stop transfer sequence. The N-t of the protein faces the cytosol while the C-t its located within the lumen of the ER. p9 from TCV is also a Type II integral membrane protein with just one transmembrane region (aminoacids 3-20). <br/><br/>The MP from PNRSV has one hydrophobic region (aminoacids 89-110), which it is not capable of being inserted into microsomal membranes by the translocon machinery. In despite of not being transmembrane this segment seems to be essential for the membrane association of the MP and for the cell-to-cell RNA transport shown by p32. Our results indicate that p30 is not integral membrane proteins but a membrane associated protein.<br/><br/>It seems that the association of MP to membranes it is necessary for the infectious process, although plant virus have evolve different strategies to accomplish this task. Tue, 12 Apr 2011 19:00:37 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9559 2011-04-12T19:00:37Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9558 Toxicidad "in vitro" en granulocitos de sangre periferica: Aplicación de la citometría de flujo al estudio de las alteraciones inmunitarias en el ejercicio. Blasco Lafarga, Nieves Maria El desarrollo de modelos de toxicidad in vitro es de gran interés en los campos de la Farmacología y la Toxicología bioquímicas tanto para la detección inicial de fenómenos fármaco-tóxicos, como para el estudio de los mecanismos moleculares implicados.<br/> Los granulocitos de sangre periférica desempeñan un papel esencial en la inmunidad inespecífica con funciones que implican a la membrana plasmática, las mitocondrias y los lisosomas. Las funciones bioquímicas de los granulocitos de sangre periférica son muy sensibles a los cambios metabólicos en el indivíduo entero y se relacionan con la presencia de diferentes mediadores fisiológicos o moléculas tóxicas circulantes. <br/> La citometría de flujo es una técnica muy útil para el análisis multiparamétrico de células individuales y la detección de alteraciones estructurales y funcionales. Por sus características estructurales, los granulocitos son identificados fácilmente por citometría de flujo, permitiendo su análisis específico, sin necesidad de etapas de purificación. <br/> Es evidente el beneficio que el ejercicio físico supone sobre prácticamente todos los aspectos de la salud y se han realizado estudios que demuestran que el ejercicio es un regulador de la función inmunológica. Aunque aún existen aspectos poco claros en cuanto a su influencia sobre el sistema inmune, parece existir relación entre la intensidad y duración del ejercicio, y la magnitud y dirección de los cambios en los contajes y porcentajes de los leucocitos circulantes en sangre. Lo mismo sucede con la función aunque las alteraciones funcionales no están relacionadas con los cambios numéricos.<br/> El presente trabajo evalúa la utilidad de los granulocitos de sangre periférica como célula diana para el desarrollo de modelos de alteración funcional "in vitro" que pudieran ser aplicados a la detección de efectos tóxicos, así como al estudio de los mecanismos funcionales implicados en situaciones fisiopatológicas que afecten al Sistema Inmunitario. <br/>También se plantea aplicar la capacidad analítica de la citometría de flujo multiparamétrica para el análisis funcional de los granulocitos y la comparación de sus respuestas con la de otras células inmunitarias en los modelos de toxicidad a desarrollar. Se plantea así mismo aplicar los aspectos metodológicos desarrollados al estudio del posible papel del estrés oxidativo en las alteraciones funcionales inducidas en los granulocitos y otras células inmunitarias por el ejercicio físico de alta intensidad.<br/>Los objetivos planteados se abordan a través de un estudio integrado, mediante citometría de flujo (EPICS Elite) para el estudio de suspensiones de leucocitos de sangre periférica, obtenidas tras la depleción de hematíes por sedimentación sobre Ficoll-Histopaque y separación celular por "cell sorting". Los granulocitos son identificados y preseleccionados por sus cacterísticas morfológicas, mediante análisis de la dispersión frontal y lateral de luz. Una primera fase in vivo analiza muestras procedentes de indivíduos sometidos a un esfuerzo físico de alta intensidad. El posible papel del estrés oxidativo en las alteraciones funcionales de los granulocitos observadas in vivo, se estudia en una segunda fase en un modelo in vitro de exposición controlada a concentraciones subletales de agentes pro-oxidantes, solubles (como el peróxido de hidrógeno (H2O2)) y de membrana (como el peróxido de tert-butilo (tBOOH)). En las suspensiones de leucocitos aislados se determina el Potencial de Membrana Mitocondrial (PMM, con Rhodamina 123), la generación de H2O2- y Superóxido (con Dihydrodiclorofluoresceina (DHDCF) e Hydroethidina (HE)) y los niveles de Glutation (GSH con Naranja de Mercurio), así como la expresión de CD69 y CD25. La expresión de las &#946;2-integrinas CD18, CD11a, CD11b y CD11c, se han determinado en condiciones basales y tras estimulación con PMA o FMLP. <br/> En ambos modelos se analiza la distribución, estado de activación, respuesta mitogénica y generación de especies reactivas de oxígeno en las diferentes subpoblaciones leucocitarias. Los estudios citométricos sobre el modelo in vitro aborda fundamentalmente los fenómenos de expresión de moléculas de adhesión de la familia de las integrinas, en condiciones basales y tras estimulación quimiotáctica o activación de la protein kinasa C, por la especial relevancia de dichas moléculas en la funcionalidad de los granulocitos y su papel en los fenómenos de interacción de los mismos con otras células implicadas en las alteraciones funcionales inducidas por el ejercicio físico intenso.<br/>Las determinaciones demuestran que el ejercicio físico intenso induce una disminución en el porcentaje de linfocitos T citotóxicos, linfocitos T inductores de cooperación y células Natural Killer, aumentando el porcentaje de linfocitos T inductores de supresión. En este modelo se produce un incremento de las células T que expresan el receptor de Interleukina-2, acompañado de una mayor capacidad de respuesta a la activación mitogénica in vitro. Sin embargo, dichas células utilizan con menos eficacia la Interleukina-2 exógena, sugiriendo la existencia de interferencias con el mecanismo de transducción de la señal de activación. Además la incubación in vitro con dosis no letales de prooxidantes exógenos induce un estrés oxidativo intracelular en los leucocitos, pero no provoca la activación de los linfocitos. Los prooxidantes exógenos, en general, incrementan la expresión espontánea de moléculas de adhesión, los niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno y modifican la sobreexpresión inducida por estímulos quimiotácticos o activadores de la protein kinasa C en granulocitos y monocitos, lo que sugiere la existencia de un posible estrés oxidativo en dichas células y por tanto de un desequilibrio entre prooxidantes y antioxidantes que puede participar en las alteraciones de la función inmunitaria específica e innata. Los granulocitos han respondido de forma más sensible y consistente que los monocitos a la acción in vitro de los oxidantes exógenos. Por último, la utilización de la citometría de flujo multiparamétrica para determinar la funcionalidad de los granulocitos, células fáciles de estudiar selectivamente, podría representar una aproximación de interés para la detección y análisis de fenómenos de citotoxicidad que afecten al Sistema Inmunitario.; AIMS: To evaluate the utility of whole blood granulocytes as useful cells in the development of in vitro models of functional disturbance in order to detect toxic effects, to study the functional mechanisms of the Inmunitary System and to determine by flow cytometry (CMF) the in vitro effects of oxidative stress on the functional status of leukocytes in whole blood, assessed by analysis of mitochondrial function, intracellular prooxidants, early- and late activation markers and cell adhesion molecules. <br/>METHODS: Whole blood samples were in vivo processed by CMF after a high intensity physical exertion and in vitro incubated with sublethal concentrations of soluble (H2O2) and membrane (t-Butyl hydroperoxyde) prooxidants. Mitochondrial membrane potential (MMP, with Rhodamine 123), H2O2- and superoxide generation (with dihydrodiclorofluorescein (DHDCF) and hydroethidine) and glutathione levels (GSH with Mercury Orange) were determined in isolated leukocytes suspensions. CD69 and CD25 expression was determined in whole blood leukocytes. &#946;2-integrins (CD18, CD11a, CD11b and CD11c) were determined in basal conditions and following cell stimulation with PMA or FMLP. All the analysis were performed with an EPICS XL flow cytometer.<br/>RESULTS: High intensity physical exertion modified lymphocyte subpopulations with different functional implication and also the activation state of these cells, and increased metabolic activity, basal integrin expression and H2O2 intracellular levels in granulocytes and monocytes. Extracellular prooxidants induced in all leukocytes significant increase of intracellular oxidants and MMP and decreased cell GSH. There were no changes in the distribution of lymphocyte subpopulations. CD69 and CD25 were not affected. The effects on &#946;2-integrins were complex and more significant in granulocytes: in general, low-concentration of prooxidants enhanced basal integrin expression, while higher concentrations tended to decreased the expression. Also, oxidative stress decreased the sttimulatory effect of FMLP and PMA, specially in the granulocyte subpopulations. In all cases, CD11b and CD11c were the most affected molecules by prooxidants.<br/>CONCLUSIONS: The effect of intense physical exercise increase T-cells with an IL-2 receptor and more responsive to the mitogenic activation, but used less effectively exogenous IL-2. In intense physical exercise occur functional changes in granulocytes which are evident by increased metabolic activity, basal integrin expression and intracellular levels of reactive oxygen species. Exogenous prooxidants in vitro induce intracellular oxidative stress and have complex effects on the expression of &#946;2-integrins in leukocytes, specially in granulocytes. The use of flow cytometry to determine the functionality of granulocytes could be of interest to detect and study cytotoxicity events that affect the Inmune System. Tue, 12 Apr 2011 19:00:37 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9558 2011-04-12T19:00:37Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9557 Leucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea. Estudio del rol de las mutaciones de IgVH y BCL-6 en esta heterogeneidad: aproximaciones genómica y funcional. Jantus Lewintre, Eloisa La leucemia linfática crónica B (LLC-B) presenta un comportamiento clínico variable. Los pacientes sin mutaciones en la región variable del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IgVH) sufren una enfermedad agresiva con menor tiempo libre de progresión y supervivencia global que los pacientes con IgVH mutado. Además, las mutaciones en el gen BCL6 proveen información clínica valiosa, permitiendo identificar un subgrupo de pacientes con alto riesgo de progresión, a pesar de tener mutaciones en IgVH. Sin embargo, el conocimiento de la biología subyacente en estos subgrupos moleculares de LLC-B aún no ha sido completamente dilucidado. El objetivo de este trabajo es el de valorar la implicación de las mutaciones en IgVH y BCL-6 como responsables de la heterogeneidad en el comportamiento biológico y expresión génica en la LLC-B en pacientes en estadío temprano de la enfermedad, para luego integrar la información obtenida con el fin de hallar genes y/o rutas metabólicas implicados e identificar posibles dianas diagnósticas/ pronósticas en LLC-B.<br/>Los estudios funcionales en células de LLC-B indican que, la inducción de apoptosis in vitro por Bortezomib (inhibidor de proteasoma) es estadísticamente diferente cuando las muestras se agrupan de acuerdo al estdo mutacional del gen BCL6, en el grupo de muestras mutadas en IgVH. Además, pudimos demostrar que esta inducción de apoptosis es dependiente del tiempo, de la dosis del fármaco utilizado, y de la activación de caspasas. Avanzando sobre los mecanismos que pudieran ocasionar un fracaso terapéutico, mediante modelos de co-cultivos, hemos comprobado que tanto células dendríticas como de estroma medular, son capaces de proteger a las células de LLC de la inducción de apoptsis por Bortezomib.<br/>En el estudio transcriptómico, encontramos unos 150 genes con expresión diferencial de acuerdo al estado mutacional de IgVH, mientras que no pudimos identificar ninguna diferencia significativa de acuerdo a las mutaciones en BCL6. Un grupo de 15 genes fueron escogidos para validar nuestros resultados, y cuantificamos su expresión por PCR cuantitativa a tiempo real, corroborándose los hallazgos obtenidos en el estudio de microarrays. Además, el uso de herramientas bioinformáticas para asignar perfiles funcionales, permitió distinguir cambios de expresión de manera coordinada en grupos de genes pertenecientes a la determinadas vías KEGG o agrupados dentro de un mismo término de ontología génica.<br/>La identificación de nuevos marcadores pronósticos en LLC fue el siguiente paso realizado en este estudio, para lo cual utilizamos un grupo muestral independiente para validar biológicamente los hallazgos provenientes del estudio de perfiles de expresión. Así, mediante el uso de PCR cuantitativa a tiempo real demostramos que la expresión de LPL, ZAP70, CRY1, BCL7A, DUSP22/BCL7A o CD82/BCL7A, determinados en linfocitos CD19+, correlacionan con el estado mutacional de IgVH y con el tiempo libre de tratamiento en pacientes con LLC en estadíos tempranos. Nuestros resultados mostraron además que CRY1 exhibía muy buena sensibilidad y especificidad al ser utilizado como marcador subrogado del estudio mutacional del gen IgVH . CRY1 también resultó ser un excelente biomarcador de necesidad de tratamiento, pudiendo utilizarse sobre muestras de LLC sin necesidad de seleccionar linfocitos B, por lo que este marcador podría ser introducido en la práctica clínica debido a lo simple de su metodología de cuantificación que es menos laboriosa de realizar que el estudio mutacional de IgVH. <br/>En conclusión, los estudios de expresión génica señalan que existen subgrupos moleculares bien definidos dentro de la LLC-B, sobre todo en base al estado mutacional de IgVH. Existen varios genes cuya expresión podría utilizarse como marcador de pronóstico en LLC-B, siendo CRY1, un componente esencial del reloj biológico, uno de los que proponemos para ser incorporado en la práctica clínica.; CLL is a heterogeneous disease with a variable clinical course. Patients with unmutated IgVH gene show a shorter progression free and overall survival than patients with IgVH mutated. In addition, BCL6 mutations identifies a subgroup of patients with high risk of progression. Anyway, the underlying biologic process involved in the different behaviour of the CLL molecular subgroups is not very well understood. The aim of this work is to evaluate the role of IgVH and BCL6 mutations as responsible of the different biologic behaviour and gene expression profiles encounter in subgroups of early-stage CLL patients and also, the identification of new diagnostic/prognostic markers for the disease.<br/>Functional in vitro studies reveal that IgVH/BCL6 subgroups have different behavior in response to apoptosis induction by Bortezomib, a farmacologic agent use for proteasome inhibition.<br/>Gene expression analysis was performed using a high density microarrays. Around 150 genes differentially expressed were found according to IgVH mutations, whereas no difference was found according to BCL6 mutations. Functional profiling methods allowed us to distinguish KEGG and GO terms showing coordinated gene expression changes across subgroups of CLL. <br/>Biologic validation of a set of differentially expressed genes by RTqPCR revealed that LPL, ZAP70, CRY1, BCL7A, DUSP22/BCL7A or CD82/BCL7A, quantified on CD19+cells are reliable biomarkers to assess IgVH mutational status and also prognostic markers in early-stage CLL patients.<br/>Among them, CRY1, a gene involved in circadian rhythm control, performed as good or better than other well established biomarkers in CLL. This observation, along with the easiness of CRY1 determination by RTqPCR on B lymphocytes or unselected PBMC, indicate that CRY1 may be used as a new marker of disease progression for the initial prognostic assessment of early-stage CLL. In addition, it would be interesting to introduce this marker in clinical trials for its evaluation in larger cohorts of patients. Tue, 12 Apr 2011 19:00:36 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9557 2011-04-12T19:00:36Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9556 Análisis estructural y modificación funcional de la glucoamilasa de Saccharomyces cerevisiae var diastaticus. Latorre García, Lorena La glucoamilasa (GA) es uno de los enzimas producidos en mayor cantidad por la industria biotecnológica. Se emplea en el procesado del almidón degradándolo y liberando residuos de glucosa al medio. <br/>Saccharomyces cerevisiae (var. diastaticus) posee genes denominados STA que codifican GAs (Yamashita et al 1987). Este enzima presenta una estructura atípica ya que posee un dominio N-terminal, rico en residuos de serina y treonina (STRD o "Ser and Thr rich-domain") ausente en las otras GAs fúngicas y carece de un dominio de unión al almidón o (SBD o "Starch Binding domain) presente en la mayoría enzimas. La ausencia de este dominio hace que la GA de S. cerevisiae sea ineficaz en la degradación de almidón insoluble, necesaria para el procesado de las formas de almidón utilizadas en la industria. <br/>La presente tesis doctoral tiene como objetivo el estudio de las propiedades estructurales y funcionales de la glucoamilasa codificada por el gen STA1 de Saccharomyces cerevisiae así como la modificación del enzima, utilizando técnicas de ingeniería de proteínas, para obtener variantes con propiedades mejoradas y con mayor eficiencia catalítica. La mejora de sus propiedades abre interesantes posibilidades en el desarrollo de nuevos procedimientos fermentativos que permitirían la transformación directa de almidón en etanol.<br/>Se han obtenido estirpes de S. cerevisiae, de laboratorio y de origen industrial, capaces de sobreproducir el enzima ya que la levadura produce glucoamilasa en baja proporción. La mejora en la producción ha permitido la caracterización bioquímica del enzima, en concreto, se han analizado sus propiedades fisico-químicas y catalíticas. Especialmente se han estudiado las propiedades derivadas de la extrema glicosilación que presenta esta proteína.<br/>Por otro lado, se ha caracterizado estructuralmente la GA de S. cerevisiae obteniendo y analizando modelos tridimensionales de los dominios que conforman el enzima. En base a los estudios de los modelos obtenidos se ha construido un enzima híbrido, por adición de un dominio SBD, para conferir al enzima de mayor afinidad por el substrato y en consecuencia mayor capacidad catalítica.<br/> Por último se han mejorado las propiedades intrínsecas del enzima, mediante técnicas de mutagénesis aleatoria obteniendo una estirpe de levadura que secreta una variante enzimática más eficaz.; The glucoamylases (GAs) are important enzymes in the biotechnological industry. They are widely used for processing starch to simple sugars and ethanol.<br/><br/> Saccharomyces cerevisiae (var diastaticus) carries genes designated STA that encode secreted glucoamylase (Yamashita et al., 1987). These enzymes present an atypical structure with two well defined parts, an amino-terminal domain, rich in residues of serine and threonine and a carboxy-terminal domain that contains catalytic domain. These enzymes in yeast lack a starch binding domain (SBD) present in others fungi glucoamylases that represent an important shortcoming for the digestion of insoluble starch.<br/><br/> In this doctoral thesis we have studied the structural and functional properties of the Saccharomyces STA1- encoded glucoamylase. Furthermore we have modificated the enzyme using directed evolution to obtain mutant variants with improved properties. The improvement of activity opens interesting possibilities for the development of new fermentatives procedures that would allow the direct transformation of starch in ethanol.<br/><br/> We have obtained S. cerevisiae strains, of laboratory and industrial origin, capable of overproducing this enzyme. The improvement of the production has allowed the biochemical characterisation of the enzyme, focusing on the study of the properties derivated from the extreme glycosilation that the protein presents.<br/><br/> On the other hand, S. cerevisiae GA has been characterized structurally, obtaining and analyzing three-dimensional models of the enzyme domains. This model allowed the construccion and analysis of an engineered version of S. cerevisiae GA, which contains the starch binding domain from Aspergillus niger. The resulting hybrid enzyme has substrate binding capability and hydrolyses insoluble starch.<br/><br/> Last but not least, we have improved the catalytic efficiency of the enzyme using random mutagenesis and recombination in yeast. Thus, we have obtained a yeast strain that secretes a more effective enzymatic variant. Tue, 12 Apr 2011 19:00:36 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9556 2011-04-12T19:00:36Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9555 Caracterización y mejora de la resistencia de las levaduras vínicas a la deshidratación en la producción de Levadura Seca Activa. Garré García, Elena Actualmente en la mayoría de las bodegas, los vinos se elaboran a partir de mostos inoculados con cultivos de levaduras vínicas seleccionadas, cultivos iniciadores que suelen comercializarse en forma deshidratada denominada Levadura Seca Activa (LSA). La producción de LSA conlleva el procesado y deshidratación de la biomasa de levadura hasta obtener un producto final con un porcentaje de humedad residual por debajo de 8 %. Este procesamiento produce cierta pérdida de viabilidad y vitalidad en las células de levadura que puede reflejarse en su eficiencia para desarrollar el proceso posterior de vinificación. Los análisis comparativos realizados en nuestro grupo de investigación entre células de levadura frescas y células deshidratadas, incluido este trabajo, muestran que se produce una importante pérdida de capacidad fermentativa durante la deshidratación indicando la necesidad de conocer a nivel molecular el efecto de este proceso sobre las células de levadura con el fin de diseñar estrategias de mejora biotecnológicas.<br/>En este trabajo se ha abordado el estudio del estado fisiológico de la levadura vínica T73 durante la etapa de procesamiento y deshidratación. Por un lado, se ha caracterizado la respuesta a estrés desencadenada en la célula de levadura vínica durante el proceso de deshidratación a partir de muestras obtenidas en simulaciones de la producción industrial de LSA a escala de laboratorio, para las cuales fue necesario el diseño previo de dicha simulación, y su contrastación con muestras obtenidas en simulaciones a escala de planta piloto y lotes industriales de LSA. Este análisis comparativo de simulaciones del proceso industrial a diferentes escalas muestra diferencias evidentes en las propiedades tecnológicas de las levaduras, dependientes de la modalidad del cultivo empleado para la propagación de la biomasa y de los protocolos de deshidratación aplicados, aunque sin invalidar el uso de aproximaciones a escala de laboratorio como herramienta inicial para el abordaje de los puntos críticos del proceso industrial. La respuesta molecular observada en las células de levadura a nivel de expresión génica y parámetros bioquímicos de estado redox y la evaluación del daño oxidativo celular en las diferentes simulaciones presentaron ciertas similitudes que condujeron a destacar la existencia de estrés oxidativo durante la deshidratación y la respuesta a este estrés como una de las más relevantes.<br/>Por otro lado, se ha estudiado el efecto de la acumulación de trehalosa en el estado fisiológico de la levadura durante el secado. Esta molécula se ha descrito como metabolito de protección frente a diversos estreses, entre ellos la deshidratación, por lo que se han construido mediante técnicas de ingeniería genética cepas vínicas sobreacumuladoras de trehalosa en las que han sido eliminadas sus actividades degradativas por deleción de los genes correspondientes. El estudio previo realizado en cepas de laboratorio en condiciones de deshidratación osmótica por adición de NaCl, y posteriormente el estudio en la cepa vínica T73 en condiciones de simulación de la deshidratación industrial, indicaron que la actividad trehalasa ácida Ath1p participa en la movilización de trehalosa intracelular y que, junto con la trehalasa neutra Nth1p y la trehalasa Nth2p, de la que se desconocía su participación en la hidrólisis de este metabolito, constituyen una maquinaria degradativa de trehalosa que compatibiliza la acumulación de este disacárido durante la respuesta a estrés con su rápida eliminación para la adecuada recuperación del crecimiento. Además la deleción del gen ATH1 en la cepa vínica T73 se perfiló como una estrategia de modificación genética adecuada para la mejora de la resistencia a la deshidratación.; Nowdays, the use of yeast starter cultures for grape must inoculation is an extended practice in wineries. They are mainly in the form of Active Dry Yeast (ADY) with less than 8 % residual moisture. The wine yeast dehydration can produce viability and vitality lost affecting negatively to the subsequent vinification process. This study includes a molecular and physiological characterization of the stress response in the wine yeast strain T73 during handling and drying processes to obtain ADY under laboratory simulation and in pilot plant scales, and results have been compared to industrial stocks. Similars results at different ADY production scales were observed in the analysis of the stress gene markers expression, and also in redox biochemical parameters and oxidative cell damage evaluations, indicating that the oxidative stress was predominant during the wine yeast drying process. <br/>Furthermore, the trehalose protective effect in wine yeast during dehydration was analyzed. Trehalose overaccumulating wine yeast strains were obtained by deletion of the genes coding for trehalose degradative activities. Previous studies with laboratory yeast strains and the subsequent study with T73 industrial strain showed the relevance of neutral trehalase activity Nth1p, but also acid trehalase activity Ath1p and a novel trehalase activity coding for Nth2p that also participates in intracellular trehalose movilization. This trehalose degradative machinery is necesary for yeast cells to recover growth after stress. In addition, the ATH1 gene deletion in T73 wine yeast was a suitable genetic modification strategy to improve drying resistance in yeast. Tue, 12 Apr 2011 19:00:35 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9555 2011-04-12T19:00:35Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9554 Activación del eosinófilo en la pancreatitis aguda. Montañana Llorens, Consuelo Concepción La pancreatitis aguda (PA) es un proceso inflamatorio del páncreas que puede afectar<br/>también a otros órganos más distantes y que puede cursar como una forma leve o<br/>como una forma grave con aparición de complicaciones locales o sistémicas que<br/>pueden conducir al desarrollo de un fallo multiorgánico. En la PA se produce una<br/>inflamación local como fenómeno inicial, observándose la acumulación de neutrófilos,<br/>macrófagos y mastocitos en el páncreas; en cambio, existe poca información sobre la<br/>participación del eosinófilo en este proceso.<br/>El proceso de hematopoyesis en la médula ósea, así como la atracción y la activación<br/>del eosinófilo en los tejidos está mediado por citocinas y quimiocinas, moléculas<br/>medidadoras liberadas por los leucocitos, células endoteliales y algunas células<br/>tisulares, siendo la citocina IL-5 el principal factor de diferenciación y la quimiocina<br/>eotaxina el factor quimiotrayente más selectivo del esonófilo.<br/>Nuestro estudio se propone evaluar la participación del eosinófilo en la pancreatitis<br/>aguda mediante el análisis de eotaxina e IL-5, citocinas implicadas en la<br/>diferenciación, activación y migración del eosinófilo, a lo largo de la evolución de la<br/>pancreatitis aguda.<br/>Nuestros resultados muestran que el número de eosinófilos en sangre se incrementa<br/>progresivamente desde el día del ingreso hasta el mes del episodio agudo, aunque no<br/>supera los límites considerados normales. La concentración de IL-5 en suero se<br/>incrementa en los primeros días, recuperando el valor control a los 5 días del ingreso,<br/>comportamiento similar al de otras citocinas proinflamatorias, lo cual podría indicar que<br/>efectivamente se está produciendo una activación de la hematopoyesis del eosinófilo<br/>en el momento agudo. Sin embargo, la concentración de eotaxina se mantiene similar<br/>al control hasta pasados 2 días del ingreso, momento en el que inicia su incremento,<br/>que es máximo al mes del episodio agudo. Estos resultados sugieren la activación del<br/>eosinófilo en el tejido y su papel inmunoregulador en el proceso inflamatorio de la<br/>pancreatitis aguda.; Acute Pancreatitis (AP) is a pancreas inflammatory process that can affect to other<br/>distant organ. AP exhibits a wide variability in its severity, in most cases the course is<br/>fairly benign (mild AP) while in others it may progress to a more severe form (severe<br/>AP) with local complications or systemic -inflammatory response which can led to<br/>multiple organ dysfunction syndrome. Local inflammatory response is an early event in<br/>AP and has been revealed neutrophils, macrophages and mast cells infiltrated in<br/>pancreas; however, there is no information about eosinophil participation in this<br/>process.<br/>Eosinophil development from the bone marrow, trafficking into tissues and activation<br/>are mediated by a regulated process involving cytokines and chemokines, chemical<br/>mediators secreted from leukocytes, endotelial cell and tissue resident cells. IL-5<br/>cytokine is the most selective for eosinophils differentiation and eotaxin has a<br/>selectively chemoattractant activity that regulates eosinophil trafficking.<br/>There are no studies about eosinophils role in inflammatory process of acute<br/>pancreatitis. Our study try to evaluate eosinophil responsability through the eosinophils<br/>number quantification and eotaxin and IL-5 determination, cytokines involved in<br/>differentiation, activation and survival eosinophil.<br/>Results show a progresive increase in eosinophils number from inclusion to month<br/>from acute onset, whereas eosinophils number remain in normal range. Serum IL-5<br/>concentration increases at day 1 to 4, and become in normal values at day 5 after the<br/>inclusion, similar fact to other proinflammatory cytokines. This results are in line with<br/>eosinophil hematopoiesis activation in early phase. However, eotaxin concnetration is<br/>similar to control from day 1 to day 2, and increases from day 4 to month. This results<br/>suggest eosinophil activation in tissue and an inmunoregulatory role in inflammatory<br/>process of acute pancreatitis. Tue, 12 Apr 2011 19:00:34 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9554 2011-04-12T19:00:34Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9553 Influencia de los niveles de colesterol sobre el metabolismo de la arginina y el estrés oxidativo. Efectos del tratamiento con estatinas. Serra Lluch, María INTRODUCCIÓN: La hipercolesterolemia, como factor de riesgo cardiovascular,<br/>provoca aumento de la producción de radicales libres de oxígeno y disminución de la<br/>biodisponibilidad de óxido nítrico (NO) a nivel vascular. Ambos mecanismos se<br/>postulan precursores del desarrollo de arteriosclerosis. El NO asegura la correcta<br/>función endotelial; es un derivado directo de la arginina a través de la óxido nítrico<br/>sintasa endotelial (eNOS). El LDL oxidado es capaz de desplazar a la eNOS. Otros<br/>derivados de la arginina, metilargininas y poliaminas, pueden tener implicación en la<br/>disfunción endotelial provocada por la hipercolesterolemia (HC). A las estatinas se les<br/>atribuyen efectos antiateroscleróticos al margen del efecto hipolipemiante, debido a<br/>acciones antioxidantes y antiinflmatorias entre otras. MATERIAL-MÉTODOS: Estudio<br/>transversal, 90 pacientes distribuidos en tres grupos: control (CT<200 mg/dL),<br/>hipercolesterolémico (HC) (CT>200 mg/dL) y hipercolesterolémico tratado con<br/>estatinas. Ninguno presentaba enfermedad arteriosclerótica ni recibía tratamiento con<br/>nitratos. Se realizaron dos determinaciones separadas por 6 meses. Se determinaron<br/>diversos parámetros del metabolismo de la arginina (nitrato plasma y orina; arginina y<br/>derivados metilados ADMA, SDMA y L-NMMA, y poliaminas putrescina, espermidina<br/>y espermina) y parámetros del daño oxidativo a lípidos (hidroperóxidos lipídicos y<br/>TBARM) y proteínas (grupos carbonilo y sulfhidrílo). En el laboratorio clínico perfil<br/>lipídico y bioquímica básica. La mayoría se cuantificaron espectrofotométricamente o<br/>mediante diversas modalidades de HPLC. RESULTADOS-DISCUSIÓN: Media de CT<br/>en el grupo HC bastante moderada (244 mg/dL) y HDLc relativamente elevada en los<br/>tres grupos (55-60 mg/dL). Nuestros resultados apoyan una inactivación del NO por<br/>radicales libres como ha sido descrito en trabajos previos. La arginina y sus derivados<br/>metilados muestran tendencia a disminuir en el grupo HC, sin estar descrito con<br/>claridad su significado en la hipercolesterolemia. Los niveles de poliaminas disminuyen<br/>en el grupo hipercolesterolémico, hecho que no apoyaría su elevación en general en<br/>casos de hiperproliferación (como la arteriosclerosis) sino su relación con la situación<br/>de estrés oxidativo asociada a la hipercolesterolemia. Los marcadores de daño oxidativo<br/>a lípidos muestran tendencia cualitativa a aumentar en los casos de hipercolesterolemia,<br/>que se hace estadísticamente significativa al fraccionar en función de la presencia de<br/>HTA, apoyando la contribución de dos FRCV a la oxidación lipídica. Un<br/>comportamiento similar se observa con los grupos sulfhidrilo proteicos. En cuanto a los<br/>grupos carbonilo sí muestran una elevación clara y significativa en los dos grupos<br/>hipercolesterolémicos, que no se modifica cuando se fracciona la población en función<br/>de las diversas variables registradas, y que muestra una excelente correlación con los<br/>diversos parámetros del metabolismo lipídico. En términos generales, las estatinas no<br/>afectan significativamente ninguno de los parámetros analizados. Sin embargo, la<br/>atorvastatina, sí disminuye los niveles de TBARM y nitrato en orina, apoyando la<br/>hiperproducción compensatoria de NO frente a situación de daño oxidativo en la HC.<br/>CONCLUSIONES: Existe una situación de estrés oxidativo asociada a la<br/>hipercolesterolemia, que se hace más evidente cuando confluye con la presencia de<br/>HTA. Los grupos carbonilo proteicos serían el marcador más sensible y fiable de daño<br/>oxidativo a proteínas en situaciones de HC moderada y pacientes sin complicaciones<br/>ateroscleróticas. Los diversos metabolitos de la arginina analizados no se alteran en<br/>situaciones únicamente de HC. La alteración de la biodisponibilidad del NO asociada a<br/>la HC sería debida a su inactivación por ROS. La disminución de ADMA en mujeres<br/>junto con la elevación de los niveles de nitrato apoya el descrito efecto protector de los<br/>estrógenos sobre el endotelio. La constancia en los niveles de ADMA en los grupos de<br/>estudio apoya el efecto protector del HDL sobre el endotelio vascular. Se confirma la<br/>estabilidad de las poliaminas sanguíneas ante diversos cambios fisiopatológicos.; INTRODUCTION: Hypercholesterolemia increases free oxygen radicals production<br/>and diminishes nitric oxide (NO) biodisponibiliy at endothelium. Both precursory<br/>mechanisms of arteriosclerosis. NO, direct derived from arginine through endotelial<br/>nitric oxide sintasa (eNOS), assures endothelial function. The oxidized LDL is able to<br/>move eNOS. Other derivatives from arginina, methylarginines and polyamines, could<br/>have implication in endothelial dysfunction caused by hypercolesterolemia (HC).<br/>Statins have antiarterosclerotic effects attributed to antioxidant and antiinflmatory<br/>actions. METHODS: 90 patients; groups: control, hypercholesterolemic (CT><br/>200mg/dL) and treated with statins. Without arteriosclerosis or treatment with nitrates.<br/>Parameters determined of arginine metabolism (plasma and urine nitrate, arginine,<br/>ADMA, SDMA, L-NMMA, putrescine, spermidine and spermine) and oxidative<br/>damage parameters to lipids (lipidic hidroperoxids and TBARM) and proteins (carbonyl<br/>and sulphydryl groups). Spectrophotometryc procedures and HPLC were used.<br/>RESULTS: Average of quite moderate CT (244 mg/dL) and relatively elevated HDLc<br/>(55-60 mg/dL). Our results support the described inactivation of NO by ROS. Arginine<br/>and its derivates show tendency to diminish in group HC. Polyamines diminish in<br/>hypercholesterolemic group, fact that support its relation with oxidative stress in<br/>hypercholesterolemia. Lipidic oxidative stress markers show tendency to increase in<br/>hypercholesterolemia, that reaches statistical meaning when dividing by hypertension.<br/>Similar results observed with sulfhydryl groups. Carbonyl groups shows clear elevation<br/>in both hypercholesterolemic groups, with an excellent correlation with parameters of<br/>lipidic metabolism. Statins significantly do not affect any of the analyzed parameters.<br/>Although atorvastatina diminishes TBARM and urine nitrate, supporting the<br/>hyperproduction of NO as opposed to the oxidative damage in HC. CONCLUSIONS:<br/>Associate to hypercholesterolemia exists an oxidative stress, that becomes more evident<br/>when comes together with hypertension. Carbonyls would be the most sensible marker<br/>of protein oxidative damage in mild HC and patients without aterosclerotic disease. The<br/>analyzed arginine metabolites aren´t altered in only HC situations. The alteration of NO<br/>biodisponibility in HC would be associated to its inactivation by ROS. The diminution<br/>of ADMA in women along with the elevation of urine nitrate levels supports the<br/>protective endothelium effects of estrogens. The stability in ADMA levels supports the<br/>protective endothelium effect of HDL. The stability of sanguineous polyamines is<br/>confirmed as in several fisiopathologycal changes. Tue, 12 Apr 2011 19:00:34 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9553 2011-04-12T19:00:34Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9552 Caracterització bioquímica i funcional de ROT1, una proteïna essencial de S.cerevisiae Juanes Ortiz, Mª Angeles El creixement polaritzat és un fenomen que ocorre pràcticament en totes les cèl.lules, des de procariots fins a organismes pluricel.lulars sent fonamental per a nombrosos processos cel.lulars incloent la proliferació, diferenciació i morfogènesi. En S. cerevisiae tots els aspectes del creixement polaritzat deriven del citoesquelet d´actina.<br/>Atès que el gen ROT1 és un gen essencial de Saccharomyces cerevisiae amb funció desconeguda que es va identificar en un rastreig genètic on es buscaven mutacions supressores de la letalitat de la soca mutant tor2ts . TOR2 està implicat en el control del creixement cel·lular i en l´organització del citoesquelet d´actina i com que ROT1 suprimeix a la mutació tor2, podria ser que ROT1 estiguera relacionat amb aquestes funcions.<br/>Els resultats obtesos indiquen que la inactivació de ROT1 origina un defecte en la progressió del cicle cel.lular amb l´acumulació de cèl.lules en les últimes etapes de divisió cel.lular i l´aparició de cèl.lules regemmades que no finalitzen correctament la divisió cel.lular per un defecte en la septació. Hem averiguat que Rot1 està implicat en el funcionament del citoesquelt d´actina. Encara que no és necessari per al procés de gemmació, Rot1 és essencial per al manteniment del creixement apical en la gemma i per a la repolarització del citoesquelet d´actina al coll entre la cèl.lula mare i filla al final de la mitosi. La supressió del mutant cdc42 per la sobreexpressió de ROT1 i la letalitat sintètica entre la mutació rot1 i mutacions en la ruta d´integritat cel.lular (ruta PKC) reforcen la connexió entre Rot1 i el citoesquelet d´actina. <br/>Les funcions del citoesquelet d´actina afectades en el mutant rot1 i el fet que la inactivació de ROT1 suprimeix el defecte d´hiperpolarització del mutant clb2 però no la hiperpolarització de cèl.lules que sobreexpressen CLN2, indica que Rot1 afecta exclusivament els processos del citosquelet d´actina regulats per Clb2 i no per Cln2. Les dades genètiques i fenotípiques obteses reflecten un antagonisme funcional entre Rot1 i Clb2 en el control del citoesquelt d´actina al llarg del cicle cel.lular. Les cèl.lules rot1 són hipersensibles a la sobreexpressió de Clb2 mentre que la seua letalitat se suprimeix per la deleció clb2. A més a més, les mutacions rot1 i clb2 originen efectes contraris en la funció del citoesquelt d´actina, de fet, aquests efectes es compensen en les cèl.lules doble mutant clb2 rot1. Rot1 controla específicament l´estabilitat de la ciclina Clb2, ja que en les cèl.lules mutants rot1 s'activa la ruta MEN i la fosfatasa Cdc14. De fet, la inactivació de ROT1 en cèl.lules que estan degradant activament Clb2 origina l´estabilització de la ciclina. Interaccions sintètiques de ROT1 amb gens implicats en el proteasoma, APC o SCF, i el fet que Rot1 participe en la degradació de Cln2 i substrats de les rutes de degradació de la regla de l´N-terminal i UFD suggereixen una funció més general de Rot1 en degradació de proteïnes.<br/>Hem obtés que Rot1 és una proteïna integral de membrana localitzada en la membrana del reticle endoplasmàtic/embolcall nuclear amb orientació luminal modificada per N-glicosilació en les Asn 103, 107 i 139. Analitzant possibles dominis funcionals en la proteïna hem demostrat que l´extrem C-terminal (aminoàcids 229-256) és necessari per a l´ancoratge de la proteïna a la membrana i a més té un paper essencial per a la seua funció. L´extrem N-terminal (aminoàcids 1-25) és essencial per la funcionalitat de Rot1 però no és necessari per a la translocació. La proteïna s´inserta en el reticle endoplasmàtic a través del translocó Sec61 per un mecanisme posttraducional independent de SRP i dependent del complex Sec62/Sec63.; ROT1 is an essential gene whose inactivation causes defects in cell cycle progression and morphogenesis. Rot1 affects actin cytoskeleton during the cell cycle at two levels. Firstly, it is required for the maintenance of apical growth during bud growth. Secondly, Rot1 is necessary to polarize actin cytoskeleton to the neck region at the end of mitosis; as a consequence of this defect, rot1 cells do not properly form a septum to complete cell division. The inability to polarize actin cytoskeleton at the end of mitosis is not due to a defect in the recruitment of the polarisome scaffold protein Spa2 or the actin cytoskeleton regulators Cdc42 and Cdc24 in the neck region. The previous results point to a connection between Rot1 and the Clb2 cyclin. In fact, an overexpression of CLB2 is toxic when ROT1 is partially inactivated and, reciprocally, a deletion of clb2 suppresses the lethality of the rot1 mutation, which indicates a functional antagonism between Clb2 and Rot1. Several genetic interactions suggest a link between Rot1 and the ubiquitin-proteasome system and in fact, we showed that the Clb2 cyclin is not properly degraded in rot1 mutant cells.<br/>Rot1 is primarily located at the endoplasmic reticulum-nuclear membrane facing the lumen. Rot1 migrates more slowly than expected which might suggest post-translational modification. Our results indicate that Rot1 is a protein that is neither GPI-anchored nor O-glycosylated. In contrast, it is N-glycosylated. By a directed mutagenesis of several Asn residues, we identified that the protein is simultaneously glycosylated at N103, N107 and N139. Sequence analysis predicts a transmembrane domain at the C-terminus. This fragment neither affects the targeting of the Rot1 protein to the ER nor its N-glycosylation, although it is important for the anchoring of the protein to the membrane and for its functionality. The existence of a signal sequence at the N-terminus has been suggested. However, deletion of this fragment neither impedes translocation to the ER nor N-glycosylation, but it is required for cell viability. Finally, we found that Rot1 is translocated to the ER by an SRP-independent post-translational mechanism which depends on Sec62. Tue, 12 Apr 2011 19:00:33 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9552 2011-04-12T19:00:33Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9550 Metabolismo de los hidratos de carbono en los enterocitos de sujetos con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Estada Gimeno, Úrsula Introducción: Los pacientes con enfermedad inflamatoria crónica intestinal (EII), enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa presentan lesiones en el epitelio intestinal de carácter inflamatorio. Estas lesiones afectan al intestino grueso en la colitis ulcerosa y a cualquier parte del tracto digestivo en la enfermedad de Crohn. En este tipo de enfermos se ha visto que existe una menor absorción de nutrientes, sobre todo en la enfermedad de Crohn, entre ellos la lactosa (el azúcar de la leche). Hipótesis de trabajo: los pacientes con enfermead inflamatoria tienen mayor prevalencia de malabsorción de lactosa y de fructosa. Pacientes y métodos: se valoró la gravedad de la enfermedad inflamatoria mediante los índices de Truelove-Witts y el CDAI, la extensión de la enfermedad, el patrón fenotípico y la existencia o no de válvula ileocecal en la enfermedad de Crohn. Se realizaron pruebas de absorción a 156 pacientes con enfermedad inflamatoria (71 colitis ulcerosa y 86 con enfermedad de Crohn) y a 41 voluntarios sanos mediante test del aliento de hidrógeno, se recogió mediante un cuestionario la presencia de síntomas durante la prueba y en las 24h posteriores y se realizó una analítica completa con maracadores para enfermedad celíaca con valoración de parámetros nutritivos y de parámetros inflamatorios. Resultados y conclusiones: la prevalencia de malabsorción de lactosa en los enfermos de EII es similar a la de la población general sana y no está influenciada por la localización, actividad inflamatoria, fenotipo ni por la ausencia de válvula ileocecal. La intolerancia a la lactosa es más frecuente en pacientes con colitis ulcerosa que en los sujetos sanos tanto durante el test como en las 24h posteriores, también en los pacientes con afectación izquierda extensa y pancolitis. En la enfermedad de Crohn la intolerancia a lactosa es superior a la población sana sólo en las 24h posteriores al test, y es más prevalente en las localizaciones del íleon terminal y la ileo-colónica, y en los patrones inflamatorio y estenosante. La prevalencia de malabsorción de fructosa es similar a la de la población sana en los pacientes con colitis ulcerosa y mayor en los de enfermedad de Crohn tanto respecto a los sujetos sanos como a colitis ulcerosa, también en las localizaciones: tracto digestivo superior ielo-colon y colon. La intolerancia a fructosa en los enfermos durante el test es similar a la de la población general sana, pero es superior en las 24h posteriores, en la colitis ulcerosa esta prevalencia aparece en las localizaciones distal e izquierda-extensa y en los pacientes sin activiad inflamatoria y en la enfermedad de Crohn en el tracto GI alto, íleon terminal e íleo-colon, en los tres fenotipos, y en pacientes con y sin actividad inflamatoria. Los pacientes con EII refieren síntomas sin existir malabsorción con mayor frecuencia. La prevalencia de sobrecrecimiento bacteriano en los pacientes con colitis ulcerosa es similar a la población sana, excepto en la pancolitis y cuando existe actividad, en la enfermedad de Crohn es superior para el grupo completo y para las localizaciones Tracto GI alto, íleon terminal e ileocolon, patrones estenosante y penetrante, en fase de remisión y en ausencia de válvula ileocecal. El tiempo de tránsito orocecal es similar a la población sana en los pacientes con enfermedad de Crohn, mientras que está enlentecido en los pacientes con colitis ulcerosa, en la localización izquierda extensa y tanto si hay como no actividad inflamatoria.; Introduction: There are specific foods or groups of foods that can be linked to the aggravation of inflammatory bowel disease (IBD). Foods commonly identified by IBD patients (Ulcerative colitis and Crohn's disease) as causing symptoms on reintroduction, rechallenge, and double-blind challenge, include milk, peanuts, citrus fruits, wheat, eggs, fish, etc. IBD is controversially discussed as an independent risk factor for lactose malabsorption. Some data show lactose intolerance in 40% to 70% of patients with Crohn's disease (CD), whereas a prevalence of lactose intolerance seems not to be increased in patients with ulcerative colitis (UC). Lactose maldigestion may be influenced by bacterial overgrowth and increased small bowel transit time. Hypothesis: Patients with IBD show lactose and/or fructose malabsorption frequently than healthy people. Patients and methods: 156 patients with IBD (86 with CD and 71 with UC) and 41 controls were included prospectively in the study. The diagnosis of IBD was based on findings of characteristic radiologic, endoscopic, and microscopic features. Disease activity was determined using the CDAI and the Truelove index for CD and UC, respectively. Blood was drawn to determine concentrations of inflammatory markers, hemoglobin and Celiac disease markers. Lactose, fructose and lactulose hydrogen breath test were carried out to all subjects. All individuals completed a symptom score where were asked about their subjective experience with diarrhea, bloating, flatulence and abdominal distension after ingestion of each sugar. Results and conclusions: The prevalence of lactose malabsorption in patients with IBD was similar to that of healthy group and was not influenced by location, inflammatory activity, Viena's phenotype or previous ileocolic resection. Lactose intolerance occurred more often among patients than among controls both during the test and in the next 24h. Fructose malabsorption was similar in UC patients and controls, but was increased in CD patients with respect to both groups. Patients show fructose intolerance 24h after the test more often than controls while patients and controls intolerance during the test was similar. The prevalence of bacterial overgrowth in patients with UC and controls was similar while was increased in CD patients. Orocecal transit time was slower in UC patients. Tue, 12 Apr 2011 19:00:32 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9550 2011-04-12T19:00:32Z http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9551 Caracterización de transportadores de cobre de Arabidopsis thaliana: efectos de la alteración de su expresión en plantas transgénicas. Andrés Colás, Nuria Con la finalidad de diseñar nuevas estrategias biotecnológicas relacionadas con la contaminación por cobre (Cu), los esfuerzos de esta Tesis se centraron en tres objetivos:<br/><br/>1. Identificación de la respuesta molecular a diferentes niveles de Cu en el medio en Arabidopsis thaliana mediante análisis global de los cambios de expresión génica entre exceso y déficit de Cu. <br/>Determinamos que el medio estándar de crecimiento en placa ½ MS es deficitario en Cu para las plántulas (~ 4 &#61549;g/g P.S.), mientras que el mismo medio suplementado con Cu 10 &#61549;M provoca una elevada concentración endógena del metal próxima al exceso (~ 30 &#61549;g/g P.S.). <br/>Las respuestas moleculares observadas mediante micromatrices a estos niveles de Cu en el medio se dividen en tres categorías:<br/>- Respuesta al estrés y alteración del metabolismo, incluyendo la respuesta al estrés hídrico y salino, la división celular y la modificación de DNA en exceso de Cu, así como la respuesta al estrés por patógenos, expansión celular y metabolismo del azufre en déficit del metal. El ritmo circadiano también se encuentra alterado por los niveles de Cu. En estas respuestas están implicados factores de regulación por déficit de Cu como las SPLs y los miRNAs.<br/>- Prioridad en el uso del Cu para proteínas esenciales, como la plastocianina, y sustitución de proteínas con función equivalente que utilizan otros metales en sus centros activos, como la Cu/ZnSOD y la FeSOD cloroplásticas. En este sentido, CSD2 y FSD1 son buenos indicadores de niveles elevados y deficitarios de Cu, respectivamente, dentro de la célula. <br/>- Regulación de los niveles intracelulares de Cu mediante alteración de los mecanismos de incorporación del metal en la célula, como los transportadores de Cu de alta afinidad COPT, y de destoxificación del metal, como la familia de ATPasas tipo P transportadoras de Cu.<br/><br/>2. Caracterización de transportadores de Cu de familias génicas que responden a los diferentes niveles de Cu en Arabidopsis thaliana. <br/>- HMA5, ATPasa tipo P transportadora de Cu.<br/>HMA5 se expresa principalmente en raíces y su expresión se induce en plántula entera específicamente por Cu. Mutantes por pérdida de función hma5 son hipersensibles específicamente al Cu y acumulan más Cu en las raíces que las plantas silvestres en exceso de Cu. <br/>- COPT3, transportador de Cu de alta afinidad.<br/>COPT3 se expresa principalmente en flores y semillas. COPT3 se localiza intracelularmente, probablemente en algún compartimento de la ruta de secreción. La sobrexpresión de COPT3 en plantas transgénicas provoca retraso en el desarrollo de la planta, cotiledones en "forma caída" y estambres más cortos que los de plantas silvestres. Estas plantas sobrexpresoras muestran hipersensibilidad al Cu, acumulan más Cu en las semillas y, en exceso de Cu, acumulan más Cu que las plantas silvestres en plántula entera. <br/><br/>3. Obtención de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana con posibles aplicaciones biotecnológicas en procesos de fitorremediación, mediante el estudio del transportador de Cu de alta afinidad COPT1. <br/>La expresión de COPT1 en plántula entera se reprime específicamente por Cu. COPT1 se localiza en la membrana plasmática. La sobrexpresión de COPT1 en plantas transgénicas provoca reducción del tamaño global de la planta, cotiledones en "forma de remo", curvatura cóncava de las hojas, pétalos y estambres protegidos por los sépalos y escasa fertilidad. Estas plantas sobrexpresoras son hipersensibles específicamente al Cu y acumulan más Cu respecto a las plantas silvestres. La sobrexpresión simultánea de COPT1 y TcMT3 podría ser una estrategia candidata en procesos de fitorremediación de suelos contaminados por Cu. Estas plantas reúnen dos características fundamentales para este tipo de aplicaciones biotecnológicas: acumulación y tolerancia al Cu.; With the aim of designing new biotechnological strategies related to copper (Cu), the objectives of this Thesis were:<br/> <br/>1. Identification of the Arabidopsis molecular responses to Cu status in the medium by microarray global analysis of gene expression. <br/>The internal Cu content in seedlings grown in the ½ MS medium is below the sufficiency levels, whereas the same medium supplemented with Cu 10 &#61549;M provoke a high endogenous metal concentration close to excess. <br/>The responses observed are divided in three categories:<br/>- Metabolic changes and stress responses. Circadian rythm is also alterated. Transcription factors and miRNAs are implicated. <br/>- Prioritizing the use of Cu for essential proteins and substitution of counterpart proteins with different metals at their active sites. CSD2 and FSD1 expression is a good marker of Cu levels in Arabidopsis. <br/>- Regulation of intracellular Cu levels by modification of expression of metal homeostasis components, such as the COPT and HMA families of transporters. <br/><br/>2. Characterization of Cu transporters from gene families that respond to Cu in Arabidopsis. <br/>- HMA5, Cu transporting P-type ATPase.<br/>HMA5 is mainly expressed in roots and specifically induced by Cu. The hma5 knockout mutants are specifically Cu hypersensitive and accumulate Cu in roots under Cu excess. <br/>- COPT3, high affinity Cu transporter.<br/>COPT3 is mainly expressed in flowers and seeds. COPT3 is intracellulary located, probably at some secretory pathway compartment. COPT3 overexpression provokes a delay in plant development, phenotypically characteristic cotyledons and short stamens. These overexpressing plants are Cu hypersensitive, accumulate Cu in seeds and, under Cu excess, accumulate Cu in the whole seedling.<br/><br/>3. Obtaining Arabidopsis transgenic plants with possible biotechnological applications, by overexpressing the high affinity Cu transporter COPT1.<br/>COPT1 expression is specifically repressed by Cu. COPT1 is located at the plasma membrane. COPT1 overexpression provokes biomass reduction, phenotypically characteristic cotyledons, concave leaves, petals and stamens protected by sepals and low fertility. These overexpressing plants are specifically Cu hypersensitive and accumulate Cu. Simultaneous overexpression of COPT1 and TcMT3 could be a candidate strategy for phytoremediation of Cu contaminated soils. These plants possess two fundamental characteristics for this biotechological application: Cu accumulation and tolerance. Tue, 12 Apr 2011 19:00:32 GMT http://www.tdx.cat:80/handle/10803/9551 2011-04-12T19:00:32Z