TDX/TDR - Departament d'Anatomia i Embriologia Humana

Análisis comparativo de la expresión de miRNAs en el desarrollo embrionario del colon, el cáncer colorectal y el linfoma de Hodgkin

Tue, 12 Apr 2011 13:17:23 GMT

Análisis comparativo de la expresión de miRNAs en el desarrollo embrionario del colon, el cáncer colorectal y el linfoma de Hodgkin Navarro Ponz, Alfons Los microRNAs (miRNAs) son unas pequeñas moléculas de RNA (20-25nt) que no codifican para proteína, sin embargo actúan inhibiendo la traducción a proteína de RNAs mensajeros mediante la unión a su región UTR 3'. Se ha visto que estos miRNAs juegan un papel esencial en la regulación de la diferenciación celular y en el mantenimiento del estado pluripotente en las células madre. De la misma manera se los ha visto desregulados en múltiples tumores, llegando a ser considerados en algunos casos oncogenes o genes supresores de tumores.
En la presente tesis se realizado un análisis de la expresión de miRNAs maduros en dos modelos tumorales diferentes: por un lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en tejido tumoral y normal de pacientes afectos de cáncer colorectal y en muestras de colon embrionario humano de embriones de 7-12 semanas de desarrollo. Por otro lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en ganglios de pacientes afectos de linfoma de Hodgkin clásico y en ganglios normales.
Para ello se han analizado un total de 156 miRNAs maduros mediante stem-loop RT-PCR y PCR a tiempo real(TaqMan). La validación de los resultados se ha realizado mediante el uso de líneas celulares (DLD1 de cáncer colorectal, y L-428, HD-MY-Z y L-1236 de linfoma de Hodgkin) y mediante hibridación in situ de miRNAs con sondas de tipo LNA(Exiqon) en la plataforma automática Bond Max (Vision Biosystems).
En el análisis del cáncer colorectal y la embriogénesis del colon se ha detectado una expresión solapada de miRNAs entre la mucosa colónica embrionaria y el cáncer colorectal. Se ha determinado una firma de miRNAs que caracteriza al cáncer colorectal de estadio I y II. Se ha definido también el patrón de expresión de miRNAs durante la embriogénesis del colon. Además hemos demostrado que el cluster de miRNAs miR-17-92 y su proteína diana E2F1 comparten un patrón de expresión común entre la embriogénesis del colon humano y la carcinogénesis colorectal, actuando en la regulación del proceso de proliferación celular. En este sentido, la hibridación in situ confirmó la sobreexpresión de miR-17-5p en la base de las criptas colónicas, en el compartimiento proliferativo.
Por otro lado, en el estudio del patrón de expresión de miRNAs en el linfoma de Hodgkin clásico (LHc), se ha encontrado una firma de 25 miRNAs que caracterizan a este LHc. Entre estos miR-21, miR-134 y miR-138 mediante hibridación in situ se los ha detectado en el citoplasma de las células de Hodgkin/Reed Sternberg (H/RS). La validación de los 25 miRNAs en las líneas celulares ha demostrado que 20 son expresados por las líneas celulares y únicamente 5 son de expresión exclusiva del microambiente reactivo. Por otro lado se han definido 32 miRNAs que permiten discriminar entre el subtipo histológico esclerosis nodular, del subtipo celularidad mixta, de los cuales 11 mostraban diferencias que caracterizaban a las células tumorales de un tipo u otro.
Además se analizó si la presencia del virus de Epstein Barr (EBV) estaba alterando el patrón de miRNAs en los pacientes de LHc EBV+ respecto a los EBV-, y se encontraron un conjunto de 10 miRNAs diferencialmente expresados entre los dos grupos de pacientes. Finalmente se vio que miR-138 estaba sobreexpresado en estadios iniciales (I-II) y se infraexpresaba en estadios avanzados (III-IV).
Los miRNAs se deben considerar como moléculas claves tanto en la embriogénesis del colon, como en la transformación neoplásica del epitelio colónico, así como en el LHc, pudiendo ser utilizadas en un futuro como herramienta terapéutica.; MicroRNAs (miRNAs) are negative regulators of gene expression that play an important role in hematopoiesis and tumorigenesis and have been shown to be essential to regulate cell differentiation and maintenance of the pluripotent cell state.To date, no evidence has linked miRNA expression in embryonic and tumor tissue. We assessed the expression of mature miRNAs in human embryonic colon tissue and in colorectal cancer and paired normal colon tissue. Overlapping miRNA expression was detected between embryonic colonic mucosa and colorectal cancer. We demonstrated that miR-17-92 cluster and expression of its target E2F1 share a common pattern between human colon embryogenesis and colonic carcinogenesis, regulating the proliferation process. In this sense, in situ hybridization assay confirmed the overexpression of miR-17-5p in the crypt progenitor compartment. miRNAs pathways must be considered to be included as major players contributing to both embryonic development and neoplastic transformation of colonic epithelium. In other hand, we analyzed miRNA expression in classic Hodgkin lymphoma (cHL) and the influence of Epstein-Barr virus (EBV) infection on the miRNA expression profiles. The expression of 157 miRNAs in lymph nodes from 49 cHL patients and 10 reactive lymph nodes (RLNs) was analyzed by real-time polymerase chain reaction (PCR). Hierarchic clustering revealed 3 well-defined groups: nodular sclerosis cHL, mixed cellularity cHL, and RLNs. A distinctive signature of 25 miRNAs differentiated cHL from RLNs, and 36 miRNAs were differentially expressed in the nodular sclerosis and mixed cellularity subtypes. These results were validated in a set of 30 cHLs and 5 RLNs, and in 3 cHL cell lines. miR-96, miR-128a, and miR-128b were selectively down-regulated in cHL with EBV. Our findings suggest that miRNAs play an important role in the biology of cHL and may be useful in developing therapies targeting miRNAs.

Polimorfismos en el gen dihidropirimidina dehidrogenasa (DPYD) y citidina deaminasa (CDA) como factores pronóstico en pacientes con cáncer gástrico resecados tratados con quimioterapia adyuvante con fluoropirimidinas.

Tue, 12 Apr 2011 13:17:22 GMT

Polimorfismos en el gen dihidropirimidina dehidrogenasa (DPYD) y citidina deaminasa (CDA) como factores pronóstico en pacientes con cáncer gástrico resecados tratados con quimioterapia adyuvante con fluoropirimidinas. Muñoz García, Carmen ESTUDIO: Se sabe que DPYD interviene en procesos catabólicos ó de degradación del 5-fluorouracilo, así como el enzima CDA participa en procesos anabólicos, al proveer de sustrato a la timidilato sintetasa para la síntesis de DNA, y por analogía, en la síntesis de RNA. Por lo tanto, la incorporación de la molécula de 5-FU por semejanza a la molécula de uracilo en procesos anabólicos significa el freno en la síntesis de DNA y de RNA tumoral, al "engañar" el fármaco a los enzimas de estas vías.

OBJETIVOS: 1. Analizar polimorfismos en los genes dihidropirimidina dehidrogenasa (DPYD) y citidina deaminasa (CDA); 2. Determinar si estos polimorfismos aumentan o disminuyen la actividad del enzima; y 3. Comprobar si estos polimorfismos están implicados en la supervivencia de pacientes tratados con quimioterapia adyuvante con Tegafur.

MÉTODOS: Análisis de polimorfismos por discriminación alélica de muestras parafinadas de 53 pacientes con cáncer gástrico con seguimiento por el Servicio de Oncologia del Hospital Clinic de Barcelona entre mayo de 1995 y noviembre de 2003 que recibieron quimioterapia adyuvante con Tegafur, un profármaco del 5-fluorouracilo y para DPYD Ile543Val (A/G), DPYD Arg29Cys (C/T) y CDA Lys27Gln (A/C).

CONCLUSIONES: Polimorfismos en DPYD Ile543Val, DPYD Arg29Cys y CDA Lys27Gln pueden predecir el pronóstico, supervivencia y toxicidad de pacientes con cáncer gástrico tratados con quimioterapia adyuvante con 5-FU. Polimorfismos en DPYD inducen deficiencia en este gen, dando lugar a una actividad aumentada de los derivados de 5-fluorouracil con posible toxicidad, y en concreto se ha observado una mayor supervivencia y significancia estadística para pacientes con DPYD Ile543Val A/G ó G/G. También se observó significancia estadística en pacientes homocigotos para la combinación de DPYD Arg29Cys más CDA Lys27Gln frente a heterocigotos. La asociación de un tercer polimorfismo (DPYD Ile543Val) no tuvo correlación clinica. Las frecuencias alélicas para DPYD Arg29Cys diferían de los valores de las bases de datos obtenidas por Internet para el resto de la población mundial.; "Dihydropyrimidine dehydrogenases (DPYD) and cytidine deaminase (CDA) gene polymorphisms as genomic predictors of clinical outcome in resected gastric cancer patients (GCP) treated with fluoropyrimidine based chemotherapy".

BACKGROUND: Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of DPYD gene induces deficiency in this gene resulting in a increased activity of 5-fluorouracil derivates in treatment of colorectal cancer patients. In GCP has not been previously analysed.

OBJECTIVES: 1. To analyse polymorphisms in the genes dihydropyrimidine dehydrogenase (DPYD) and cytidine deaminase (CDA); 2. To prove if these polymorphisms increase or decrease the activity of the enzyme; and 3. To observe if these polymorphisms are involved in the survival of patients treated with adjuvant chemotherapy with Tegafur.

METHODS: Analysis of polymorphisms by allelic discrimination of paraffin-embedded biopsies from 53 consecutive GCP of the Department of Oncology in the Hospital Clinic of Barcelona in the period of time between May 1985 and November 2003, who received adjuvant chemotherapy with Tegafur, one prodrug of 5-fluorouracil, for DPYD Ile543Val (A/G), DPYD Arg29Cys (C/T) and CDA Lys27Gln (A/C).

CONCLUSIONS: Polymorphisms of DPYD Ile543Val, DPYD Arg29Cys and CDA Lys27Gln predict outcome, survival and toxicity of GCP treated with 5-FU based adjuvant chemotherapy, with major survival with statistic significance for patients DPYD Ile543Val A/G ó G/G and for homozygous patients for the combination of DPYD Arg29Cys plus CDA Lys27Gln front heterozygous. The association of one third polymorphism (DPYD Ile543Val) hadn't clinic correlation.

Estudi del gen sonic HEDGEHOG (Shh) i dels gens de la família CEACAM durant l'embriogènesi del còlon humà i la seva implicació en el desenvolupament del càncer colorectal

Tue, 12 Apr 2011 13:17:21 GMT

Estudi del gen sonic HEDGEHOG (Shh) i dels gens de la família CEACAM durant l'embriogènesi del còlon humà i la seva implicació en el desenvolupament del càncer colorectal Artells i Prats, Rosa En aquest treball hem estudiat marcadors relacionats amb el desenvolupament embrionari del colon humà com són "Sonic hedgehog" i els membres de la família CEACAM comparant els seus nivells d'expressió en mostres de colon humà embrionari, teixit tumoral i teixit normal del propi pacient de pacients diagnosticats de càncer colorectal.

"Sonic hedgehog" (Shh) és un morfogen que s'expressa durant les etapes inicials de l'embriogènesi. Te un paper important en les primeres fases de l'organogènesi de cervell, pulmó, pàncrees i de l'aparell gastrointestinal. Shh també presenta expressió en molts tumors d'origen endodèrmic, però el seu paper en el desenvolupament del càncer colorectal no estava encara estudiat.

En el present treball hem realitzat un anàlisi morfològic de colons embrionaris , detecció per inmunohistoquímica i RT-qPCR per examinar l'expressió de Shh en colons d'entre 7 i 11 setmanes de desenvolupament així com també en teixit tumoral i normal del mateix pacient, de 63 pacients diagnosticats de càncer colorectal.

Els nostres resultats ens indiquen que l'expressió de Shh comença durant la setmana 7 de desenvolupament embrionari i es detecta a la zona de l'endoderma intestinal adjacent al mesènquima. Els nivells més elevats d'expressió de mRNA Shh es detecten a la setmana 9 de desenvolupament i mitjançant inmunohistoquímica, localitzem aquesta expressió tant a epiteli intestinal com a la zona del mesènquima.

Nivells baixos es detecten durant la setmana 11 de desenvolupament i, mitjançant inmunohistoquímica, aquesta expressió es detecta de manera lleu a la base de les criptes i en teixit muscular.

En colon humà embrionari, l'expressió de Shh és elevada en el moment de l'organització de l'endoderma embrionari (setmana 9) i l'expressió de Shh és baixa en el moment de la diferenciació del teixit del colon (setmana 11).

Mitjançant RT-qPCR veiem que els nivells de mRNA Shh en teixit tumoral són molt més elevats que els obtinguts en el cas del teixit normal (p=0.00001). Elevats nivells d'expressió s'associen amb estadis inicials (I-II) del desenvolupament d'un càncer colorectal (p=0.02).

Shh pot tenir un paper important tant en l'organització embrionària del colon humà com en les primeres etapes del desenvolupament d'un càncer colorectal.

Els membres de la família CEACAM (CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM67 i CEACAM8) són proteïnes de membrana que participen en processos d'immunitat i adhesió.

Mitjançant RT-qPCR detectem expressió de CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6 i CEACAM7 en embrions d'entre 7 i 11 setmanes de desenvolupament. Els nivells de CEACAM6 van augmentant progressivament a mida que augmenta l'edat de l'embrió; és a dir, els seus nivells augmenten a mida que va augmentant el grau de diferenciació cel·lular de les cèl·lules que formen el colon humà embrionari.

En el cas de l'anàlisi d'expressió de CEACAM5 observem que existeixen diferencies significatives entre els nivells d'expressió en teixit tumoral respecte al teixit normal (p=0.00008) i valors significatius respecte al temps a la progressió (p=0.001) i supervivència (p=0.006).; We have studied some markers related with colon development in human embryos, Shh and CEA family members, to compare their mRNA expression levels in human embryonary colon samples with adult tumor and matched normal tissue from patients affected by colorectal cancer.
Sonic hedgehog (Shh) is a morphogene expressed during the early phases of embryogenesis and in the foregut development. It plays an important role in the organogenesis of the brain, lung, pancreas and gastrointestinal system. Shh is also expressed in several tumors of endodermic origin. In the present study, we used morphological analysis, real-time quantitative PCR, and immunohistochemical staining to examine Shh expression in the colon of human embryos of 7 to 11 weeks. Our results show that Shh begins to be expressed in the human colon at 7 weeks, when it is found only in the cells of the endodermal epithelium. The highest levels of Shh expression are observed at 9 weeks, in the endodermal epithelium and in the mesenchyme. At 11 weeks, the colon is morphologically differentiated, and only low levels of Shh expression are detected at the base of the colon crypts. We conclude that in the human embryonic colon, Shh is upregulated at the time of the greatest structural organization and downregulated when the colon has acquired greater morphological differentiation.
We used real-time quantitative PCR to assess Shh mRNA expression levels in tumor and matched normal tissue from 57 colorectal cancer patients and correlated the results with patient clinicopathological characteristics. Shh expression levels were higher in tumor tissue than in normal tissue from the same patient (P=0.00001). Higher levels of Shh expression were associated with early stage disease (P=0.02). Shh overexpression may influence the development of colorectal cancer.
CEA family members are membrane proteins involved in immunity and adhesion. Using RT-qPCR we have detected expression of CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7 in colon of human embryos between 7-11 weeks of development. mRNA CEACAM6 level increases progressively with embryonic age. CEACAM5 analysis show that high mRNA levels in tumor tissues compared with levels in normal tissues of the same patient are related with a low progression of the tumor and a higher survival.

Estudio celular y molecular en cultivos de fibroblastos tratados con fármacos inductores de agrandamiento gingival

Tue, 12 Apr 2011 13:17:20 GMT

Estudio celular y molecular en cultivos de fibroblastos tratados con fármacos inductores de agrandamiento gingival Ramírez Rámiz, Albert El Agrandamiento gingival farmacológico -AGIF- es un dismorfismo gingival provocado por la inducción de fármacos antiepilépticos -Fenitoína-, antagonistas del calcio -Nifedipina- e inmunosupresores -Ciclosporina-.

En los primeros casos de AGIF, se creía que la alteración histopatológica residía en un aumento de la población celular de los fibroblastos -Hipótesis nula-. Este estudio quiere demostrar que esta alteración se produce en la matriz extracelular -fibras colágenas y glicosaminoglicanos de la sustancia fundamental:

Los fármacos inductores del Agrandamiento gingival no provocan una hiperplasia gingival secundaria a la proliferación celular de fibroblastos -Hipótesis alternativa-.

Para ello se proponen unos objetivos:

1-Determinar si cultivos de fibroblastos de encía humana son sensibles a la acción de fármacos inductores de Agrandamiento gingival.

2-Observar el efecto de estos fármacos en cultivos primarios de fibroblastos procedentes de las muestras examinadas -estudio de la viabilidad celular-.

3-Cuantificar si hay efecto farmacológico en la transcripción génica del Factor de Crecimiento Transformador ß (TGFß), del colágeno y de la colagenasa.

4-Observar si hay efecto farmacológico en la síntesis del colágeno y del TGFß.

Se tomaron muestras gingivales de pacientes, una de ellas sin relación con la administración de fármacos inductores conocidos de Agrandamiento gingival. Otra muestra se tomó de un paciente transplantado renal sometido desde hacía 2 años a ciclosporina -125 mg/12h-. Se observaronn las muestras a microscopía óptica para ver las características histopatológicas y una porción se fragmentó en explantes y se cultivó en medio esencial para conseguir un número determinado de fibroblastos. Se aplicaron los tres fármacos inductores a unas dosis preestablecidas -según estudios in Vitro consultados- y se observó la Viabilidad de los fibroblastos para el análisis de la proliferación celular. En una segunda fase, se estudió la expresión del mRNA de tres proteínas implicadas en la patogenia del AGIF -colágeno, colagenasa y TGFβ-. Finalmente se observó la traducción proteica del colágeno y del TGFβ.

Los resultados permitieron comprobar que no se produjeron cambios en la proliferación fibroblástica para la inducción con nifedipina y ciclosporina. Fenitoína produjo una reducción de esta proliferación como si hubiera un efecto tóxico del fármaco. En la transcripción génica de las proteínas consideradas se observaron aumentos para los tres fármacos inductores. En la expresión proteica del colágeno tampoco se apreciaron cambios.

En base a las muestras analizadas se puede considerar que hay una afectación en la matriz extracelular por la inducción farmacológica al comprobar aumentos significativos en mRNA de colágeno, TGFβ y colagenasa. Aunque hay factores que pueden actuar en la post-transcripción que alteren la expresión de estas proteínas y la actividad de la colagenasa.

Las conclusiones del estudio han sido:

1. Los fibroblastos gingivales de cultivos primarios son sensibles a fármacos inductores de Agrandamiento gingival -fenitoína, nifedipina y ciclosporina-.

2. Los fármacos inductores de Agrandamiento gingival no provocan hiperplasia gingival secundaria a la proliferación celular de fibroblastos.

3. Los fármacos inductores provocan un incremento significativo de la transcripción del TGFß, colágeno y colagenasa.

4. Los fármacos inductores no producen un incremento de la traducción del colágeno, con repercusión en la matriz extracelular.

Prevalencia de "Pneumocystis jirovecii" con mutaciones asociadas a resistencia a las sulfamidas en pacientes con infección por VIH-1. Estudio de los factores de riesgo y valor pronóstico en la neumonía por "Pneumocystis jirovecii" (PCP)

Tue, 12 Apr 2011 13:17:19 GMT

Prevalencia de "Pneumocystis jirovecii" con mutaciones asociadas a resistencia a las sulfamidas en pacientes con infección por VIH-1. Estudio de los factores de riesgo y valor pronóstico en la neumonía por "Pneumocystis jirovecii" (PCP) Alvarez Martínez, Miriam-José OBJETIVO GENERAL:

Desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular de Pneumocystis jirovecii, y conocimiento de la prevalencia de la resistencia a sulfamidas.

OBJETIVOS DETALLADOS:

1. Desarrollar técnicas de diagnóstico molecular de P. jirovecii y de tipado del gen de la Dihidropteroato Sintetasa (DHPS) de P. jirovecii, sitio activo de las sulfamidas.

2. Determinar la prevalencia de P. jirovecii con mutaciones en el gen de la DHPS, en pacientes VIH-positivos con neumonía por Pneumocystis (PcP) en España, en el periodo de la terapia antirretroviral combinada (c-ART).

2.1. Estudiar la asociación entre las mutaciones y la exposición previa a sulfamidas y sulfonas.
2.2. Estudiar los factores pronóstico de mortalidad en la PcP, y el impacto clínico de presencia de mutaciones en la DHPS.

3. Determinar la prevalencia de P. jirovecii con mutaciones en el gen de la DHPS, en pacientes VIH- positivos con neumonía por Pneumocystis (PcP) en Hospital Clínic de Barcelona, en el periodo previo a la terapia antirretroviral combinada (pre c-ART), 1989-1995, y compararla con la del periodo c-ART, 2001-2004, en el mismo centro.

4. Conocer la epidemiología de la PcP, y la prevalencia de las mutaciones en el gen de la DHPS de P. jirovecii, en África (Sudáfrica y Malawi) y Sudamérica (Brasil).

CONCLUSIONES:

1. Se desarrollaron dos técnicas de PCR, una nested-PCR y una PCR cuantitativa a tiempo real, para el diagnóstico de Pneumocystis jirovecii, mediante la detección del gen de la DHPS. Dichas técnicas presentaron una sensibilidad que osciló entre el 62.5% y el 100%, dependiendo del tipo de muestra clínica, y su método de conservación.

2. En un subgrupo de 71 muestras positivas para P. jirovecii, confirmadas microscópicamente, y 70 muestras negativas, los valores de sensibilidad y especificidad fueron de 94% y 81% para la nested-PCR, y de 94% y 96% para la rT-PCR.

3. La rT-PCR cuantitativa, con un límite de detección de 1 copia de DHPS / µl de muestra, presentó una especificidad significativa- mente mejor, que la nested-PCR. Por lo tanto, podría considerarse la técnica recomendada para el diagnóstico de P. jirovecii.

4. La prevalencia de mutaciones en el gen de la DHPS de P.jirovecii en España, en la era c-ART, fue del 3.7%, siendo la prevalencia más baja descrita hasta el momento en EUA y Europa.

5. Aproximadamente el 50% de los pacientes de nuestra serie de la era c-ART presentó una PcP, como debut de la infección por VIH. Por lo tanto, no habían estado previamente expuestos a profilaxis con sulfamidas. Este hecho explicaría la baja prevalencia de mutaciones en el periodo c-ART en nuestro país.

6. La mortalidad global de la serie de pacientes en la era c-ART fue de15%, elevándose a 80% en los pacientes que requirieron ventilación mecánica.

7. Ninguno de los pacientes que presentó mutaciones en el gen de DHPS requirió ingreso en UCI, ni murió. Por lo tanto, podemos concluir que su presencia no se asocia a un peor pronóstico en la PcP.

8. Las mutaciones en el gen de DHPS sólo confieren un bajo nivel de resistencia a las dosis de sulfamidas administradas como profilaxis, pero a mayores dosis de sulfamidas, administradas con fines terapéuticos, el tratamiento con TMP-SMX fue efectivo en la mayoría de los casos.

9. Presentar una Pao2 < 60 mmHg al ingreso se identificó como un factor de riesgo de ingreso en UCI, mientras que haber tomado c-ART previamente, se mostró como un factor protector.

10. Presentar una Pao2 < 60 mmHg al ingreso, o la necesidad de ingreso en UCI durante la 1º semana de hospitalización, se asociaron a una mayor mortalidad. La severidad de la insuficiencia respiratoria al ingreso determinó el pronóstico de la PcP.

11. Las mutaciones en el gen de la DHPS fueron más frecuentes en el periodo pre-cART (1989-1995), que en el periodo c-ART (2001-2004), siendo del 33% vs 5.5%, respectivamente. La exposición previa a las sulfamidas en los pacientes en el periodo pre-cART fue del 51% frente al 20% en el periodo c-ART, lo que explicaría la mayor prevalencia de mutaciones. Sin embargo, su presencia tampoco empeoró el pronóstico dela PcP.

12. Las mutaciones en DHPS de P. jirovecii fueron infrecuentes en niños sudafricanos infectados por VIH (prevalencia de 13.3%), siendo probablemente debido a una transmisión madre-hijo de cepas mutantes, más que a una sobre-exposición a sulfamidas. Aunque la mortalidad por PcP fue elevada en Sudáfrica (66.7%), no se incrementó por la presencia de mutaciones.

13. La incidencia de PcP en adultos infectados por VIH en Malawi fue de 1.0/100 personas/a, siendo menor que la incidencia de la tuberculosis pulmonar y de la neumonía bacteriana.14.No se detectaron mutaciones en la serie de 70 pacientes infectados con VIH y PcP en Brasil, por una menor exposición a sulfamidas.; MAIN OBJECTIVE:

Development of diagnostic molecular techniques of Pneumocystis jirovecii, and determine the prevalence of resistance to sulfa-drugs in Spain, and study of the PcP epidemiology in South Africa, Malawi and Brazil.

RESULTS AND CONCLUSIONS:

1. Two PCR techniques were designed, a nested PCR and a quantitative real-time PCR (rT-PCR) to detect DHPS of P. jirovecii. Sensibility of both ranges between 62.5% and 100%, depend on type of sample.
2. Nested-PCR and rT-PCR showed a sensibility of 94%, and specificity of 96% and 81%, respectively. rT-PCR could be considered as molecular standard diagnostic technique of P. jirovecii.
3. Prevalence of sulfa-drugs resistance in Spain in the combined antiretroviral therapy (c-ART) era was 3.7%. The lowest described in US and Europe, maybe due to PcP was the debut of HIV infection in almost 50% of patients, so they were not exposed previously to sulfa-drugs.
4. Global mortality of patients in the c-ART era was 15%, going to 80% in patients who required mechanical ventilation. Patients harbouring DHPS mutations did not require mechanical ventilation, neither ICU admissions. None of them died. Treatment with cotrimoxazole was effective in almost every patient.
5. To show a Pao2 < 60 mmHg at admission was identified as a risk factor of ICU admission, and to have c-ART previously a protector factor.
To show a Pao2 < 60 mmHg at admission and need ICU admission at first week were identified as a risk factor of mortality.
6. Prevalence of DHPS mutations in pre c-ART period was 33%, when previous sulfa-exposure was higher, although, their presence did not worse the outcome.
7. The prevalence of DHPS mutations in HIV South African children was 13.3%, probably due to a mother-to -child transmission of mutant strains; their presence did not increase the mortality.
8. The incidence of PcP in HIV-infected adults in Malawi was 1.0/100 persons/year, lower than tuberculosis and bacterial pneumonia.
9. DHPS mutations were not detected in the HIV-infected Brazilian patients with PcP, maybe due to a lowest sulfa-drug exposure.

Estudio de los cambios morfológicos del epitelio corneal en un modelo animal de ojo seco

Tue, 12 Apr 2011 13:17:19 GMT

Estudio de los cambios morfológicos del epitelio corneal en un modelo animal de ojo seco Julio Morán, Gemma En esta tesis doctoral se ha analizado morfológica y morfométricamente el deterioro que sufre el epitelio corneal de conejo cuando se impide el parpadeo del animal mediante la inserción de un blefarostado.
Para ello, se han procesado digitalmente las imágenes de 33 córneas, obtenidas bajo técnicas de microscopía electrónica. Dicho procesado, realizado con el programa de software libre Image J, ha permitido obtener una serie de variables que cuantifican las características celulares, tanto en el epitelio control como en los sometidos al modelo de ojo seco. Posteriormente, se ha realizado un análisis estadístico de los datos.
Los resultados obtenidos muestran que el epitelio control aparece como un mosaico celular continuo con diferentes tonos de gris, formas y tamaños. Asociando las variables área y forma celular se pueden discriminar tres tipos celulares. De este modo, las células del epitelio control son en su mayoría células pequeñas, de forma poligonal, tono de gris intermedio-claro y con una elevada densidad de microproyecciones. También aparecen células grandes de forma más circular, tonos más oscuros y densidad de microproyecciones algo menor. La gama de células catalogadas como de tamaño mediano presentan una caracterización más difícil puesto que sus rasgos morfológicos son semejantes tanto a las células grandes como a las pequeñas. A pesar de ello la forma de estas células medianas muestra una marcada tendencia a la pseudopoligonalidad.
Cabe señalar también que las células del epitelio sano muestran una clara uniformidad en las uniones intercelulares que aparecen, en su inmensa mayoría, intactas y en la densidad de las microproyecciones que es alta o muy alta en todas las células. Estas dos características son indispensables para una correcta funcionalidad del tejido.
Por su parte, los resultados del análisis de las córneas sometidas a diferentes periodos de falta de parpadeo muestran como el deterioro epitelial se inicia entre una y dos horas después de insertar los blefarostatos. Este deterioro se caracteriza, principalmente, por dos alteraciones. Una de ellas es la pérdida progresiva de las uniones intercelulares y la otra es la disminución de la densidad de las microproyecciones. En concreto, las células grandes son las que pierden más precozmente las microproyecciones pero, por el contrario, son las que mantienen mejor la adherencia con sus vecinas. Además, las células presentan, en general, un ligero aumento de tamaño, tendencia hacia la circularidad y uniformidad de los tonos celulares.
Gracias a los modelos estadísticos predictivos se han podido establecer, también, las características típicas de cada periodo de privación de parpadeo y el nivel de deterioro en el que se encuentra una córnea determinada.
En consecuencia, con esta tesis doctoral se ha desarrollado un criterio cuantitativo que, de forma global, analiza el estado del epitelio corneal. Esta es una herramienta básica para el análisis comparativo de la acción de las lágrimas artificiales de la que, hasta ahora, no se disponía.; To evaluate the changes on the corneal epithelium asociated with a evaporative dry eye model.

METHODS. Thirty-tree eyes of 17 New Zealand white rabbits were held open with an eye specula for differents periods of time (12 minutes - 3 hours and 15 minutes). Corneal damage was evaluated by scanning electron microscopy and the digital images were processed for morphometric information with free software program Image J. Finally the data were analyzed statistically with SPSS for Windows.

RESULTS. There was significantly changes on epithelium from more than 1 hour without blinking compared with the undessicated eyes. The main features of damage were loss of microvilli density (mean ± sd on the control corneal surface was 48.35 ± 7.25 opposite 34.12 ± 16.74 after more than 1 hour) (p<0.01) and break of intercellular junctions (mean ± sd on the control corneal surface was 0.94 ± 0.11 opposite 0.78 ± 0.3 after more than 1 hour) (p<0.01). Moreover the cells underwent a small but significant (p<0.01) increase in their area and circularity and the cells electron reflex showed a slight but significant (p<0.01) tendency to get darker.
By means of logistic regression we were able to predict the degrees of the corneal damage process and we found that the loss of microvilli was earlier than break of intercellular junctions.

CONCLUSIONS. The morphometric and statistical analysis of the gradual damage that this dry eye model cause in the corneal epithelium has allowed us to establish an objective and useful method for comparing commercially available artifical tear preparations.

Anti-Microtube Agents: Mechanismes of Action and Resistance / Agents anti-microtubulars: mecanismes d'acció i resistència

Tue, 12 Apr 2011 13:17:18 GMT

Anti-Microtube Agents: Mechanismes of Action and Resistance / Agents anti-microtubulars: mecanismes d'acció i resistència O'Brate Grupp, Aurora Marie The focus of this thesis has been four-fold. On one hand it has been to decipher, understand and manipulate the role of microtubule-trafficking in the cell. Secondly we have concentrated on the mechanism of action of agents that target the microtubules, and thirdly we have developed a model to explain acquired drug resistance to these microtubule-targeting agents. Lastly, we tested new microtubule-targeting agents that overcome acquired and intrinsic drug resistance to microtubule-targeting agents.
Microtubules (microtubules) are major dynamic structural components in cells that are essential for the development and maintenance of cell shape, cell signaling, movement, and division. We sought to understand the role microtubules play within the cellular context. Microtubules act as "active highways" within the cells and are essential for the correct operation of the cell by controlling the delivery, location, and function of a plethora of proteins. We have focused on the p53 and the HIF1-α proteins. Both these proteins are crucial players in tumor progression and angiogenesis. p53 is a tumor suppressor gene commonly referred to as the guardian of the genome and HIF1-α is a transcriptional factor that plays a key role in adaptation to hypoxia. Upon DNA damage or hypoxia, p53 or HIF1-α respectively are induced and quickly localize to the cell nucleus; whereas upon DNA repair or normoxia they must quickly concentrate in the cytoplasm for degradation. Their fast movement rate is not random and is directed by a microtubule-driven motor. Furthermore, we have shown that HIF1-α mRNA also uses the microtubule network to travel from the nucleus to the site of translation.
Drugs that bind to either tubulin or microtubules form one of the most effective classes of anticancer agents. The so-called anti-mitotic drugs usually arrest cells in mitosis leading to apoptosis. We analyzed the differential effects of taxol treatment on parental and taxol-resistant cells. Survivin is a protein that senses mitotic arrest and leading to apoptotic cell death. Despite the clinical success of microtubule-targeting agents, the emergence of acquired resistance to the drug is a limiting factor for curing cancer. Acquired drug resistance is the most common reason for the failure of drug treatment in cancer patients with initially sensitive tumors, and as such, is presently responsible for the majority of deaths from cancer. We sought to understand the timeline of events that takes place during the development of drug resistance to microtubule-targeting agents. While it has been widely published that a major mechanism of resistance to anti-mitotic drugs is due to acquired β-tubulin mutations, we have shown loss of heterozygosity of the wild type allele of β-tubulin must occur to confer higher levels of resistance. To overcome drug resistance to microtubule-targeting agents we have focused on alternate drug regimens that are active in anti-mitotic drug-resistant cells. The synergistic interaction of farnesyltransferase inhibitors (FTI) and taxol has recently been introduced in the clinic and surprisingly overcomes taxol resistance. We have shown that FTIs increase the binding of taxol to β-tubulin tubulin, even in taxol-resistant cells. In an effort to dissect the molecular mechanism underlying the synergistic interaction of FTIs with taxanes, we have recently discovered that FTIs affect microtubule acetylation and stability, partly due to inhibition of the tubulin deacetylase HDAC6. The inhibition of HDAC6 by the FTI lonafarnib leads to increased tubulin acetylation and that this is the molecular basis for the synergy of FTIs with Taxol.; La tesis titulada "Anti-microtubule drugs: Mechanisms of Action and Resistance.
Agents anti-microtubulars: Mecanismes d'Acció i Resistència" tiene cuatro objetivos principales. El primer objetivo ha sido descifrar, entender y manipular el papel del tráfico microtubular. El segundo objetivo se ha centrado en el mecanismo de acción de los agentes que tienen como diana los microtúbulos. En el tercer objetivo se ha desarrollado un modelo para explicar la quimioresistencia adquirida a estos agentes anti-microtubulares. En el cuarto y ultimo objetivo se han probado nuevos agentes anti-microtubulares que son activos en casos de quimioresistencia adquirida o endógena a agentes anti-microtubulares.
Los microtúbulos, componentes dinámicos y estructurales de las células, son esenciales para el desarrollo y mantenimiento de la forma celular, el movimiento y división celulares. Se ha intentado entender el papel que juegan los microtúbulos en el contexto celular. Los microtúbulos actúan como "autopistas activas" dentro de las células y son esenciales para la correcta operación celular ya que controlan la entrega, localización y función de una multitud de proteínas. El primer objetivo de la tesis se ha centrado en las proteínas p53 y HIF1-α. Estas dos proteínas son principales protagonistas en la progresión tumoral y la angiogenesis. La p53 es un gen supresor de tumor comúnmente llamado el guardián del genoma y el HIF1-α es un factor de trascripción que tiene un papel crucial en la adaptación celular a la hipoxia (la baja concentración de oxigeno). En los casos de el daño al ADN o hipoxia, la p53 o el HIF1-α, respectivamente, son inducidos y se translocan rápidamente al núcleo celular, mientras que cuando el ADN ha sido reparado o el regreso al estado de normoxia, las proteínas se deben concentrar en el citoplasma para su degradación por el proteosoma. El rápido movimiento de estas proteínas no es aleatorio y esta dirigido por un motor microtubular. Además, se ha demostrado que el ARN mensajero del HIF1-α también usa la red de microtúbulos para llegar del núcleo al sitio de translación a proteína.
Las drogas que se unen a la tubulina forman parte de una de las clases más efectivas de agentes anticáncer. Estas drogas comúnmente referidas como antimitóticas arrestan las células en mitosis conllevando a la apoptosis celular. Se han analizados los diferentes efectos del tratamiento del taxol en líneas celulares sensibles al taxol y en líneas celulares resistentes al taxol derivadas de las líneas sensibles. La survivina es una proteína clave en el pase del arresto mitótico en la célula a la muerte por apoptosis. A pesar del éxito clínico de las drogas antimicrotubulares, un factor que limita su aplicación universal es la apariencia de focos resistentes. La quimioresistencia adquirida es la razón más común del fracaso de la quimioterapia en pacientes con cáncer que inicialmente responden al tratamiento. En el tercer objetivo de la tesis se ha descrito un modelo temporal para explicar el desarrollo de la quimioresistencia en líneas celulares tratadas continuamente con drogas antimicrotubulares. Aunque se ha publicado extensamente que el principal mecanismo de quimioresistencia a los agentes antimicrotubulares es debido a la apariencia de mutaciones en el gen de la beta-tubulina, en este objetivo se ha demostrado que es necesario que también haya perdida de heterocigosidad en el alelo wt para que las células tengan unos altos niveles de resistencia. En el cuarto objetivo se han estudiado nuevos regimenes de quimioterapia que son activos en las células resistentes. La interacción sinergística entre los inhibidores de la farnesiltransferasa (FTI) y los taxanos se introdujo recientemente en la clínica y es muy activa contra la resistencia al taxol. Se ha demostrado que los FTIs intensifican la unión del taxol a la beta-tubulina, incluso en células resistentes al taxol. Los FTIs afectan la acetilación microtubular, a través de la inhibición de la HDAC6, la tubulina deacetilasa. La mayor acetilación de la tubulina, conlleva a una tubulina más estable y más propensa a la unión del taxol.

Distribución de fibronectina y laminina en el corpúsculo renal de diversas especies de roedores

Tue, 12 Apr 2011 13:17:17 GMT

Distribución de fibronectina y laminina en el corpúsculo renal de diversas especies de roedores Götzens Garcia, Guadalupe Objetivos: El objeto de estudio es la membrana basal glomerular (M.B.G.) y la distribución de dos de las moléculas estructurales de las matrices extracelulares del corpúsculo renal, la fibronectina y la laminina. el estudio se ha realizado con cuatro especies aparentemente próximas de un mismo grupo zoológico (Rodentia) dado que experimentalmente, se incorporan nuevas especies como animales de laboratorio, comparando un animal estándar de laboratorio, con especies silvestres, con distintas estrategias tróficas.
Material y métodos: Se han utilizado individuos adultos de Mus musculus (cepa isogénica BALB/c), y Mus spretus, Apodemus sylvaticus y Clethrionomys glareolus precedentes de capturas "in vivo" realizadas en el medio natural. El material histológico ha sido procesado mediante M.O. (tinción del PAS-Azul de Alcián/He. y dos técnicas de localización inmunohistoquímica, inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia para anticuerpos anti-fibronectina y anti-laminina) y mediante M.E.T. (estándar y de inmunolocalización de anticuerpos anti-fibronectina y anti-laminina mediante oro coloidal).
Resultados: La M.E.T. no muestra diferencias morfológicas entre los glomérulos de las diferentes especies utilizadas, excepto para la M.B.G. ya que en todas las especies silvestres utilizadas, el material que conforma toda la M.B.G. aparece con densidad uniforme.
Con la inmunolocalización mediante oro coloidal los resultados para la distribución de fibronectina en M. musculus muestran marcaje positivo en la matriz mesangial, y negativo en la M.B.G. y en la membrana basal peritubular. Los resultados para M. spretus y C. glareolus son semejantes a los obtenidos para M. musculus; si bien con un valor de reacción menor al observado para M. musculus.
Con la inmunolocalización mediante oro coloidal los resultados para la distribución de laminina, en M. musculus muestran marcaje positivo en la matriz mesangial, en la membrana basal tubular y en la M.B.G., en ésta última con tendencia a localizarse en las dos láminas raras. Los resultados para M. spretus y C. glareolus son semejantes a los obtenidos para M. musculus aunque con un valor de reacción menor al observado para el ratón de laboratorio.
Las muestras procedentes de A. sylvaticus, no mostraron reactividad positiva frente a ninguno de los dos anticuerpos, anti-fibronectina y anti-laminina, utilizados.
Conclusiones: La ultraestructura trilaminar de la M.B.G. presente en M. musculus no se observa en las otras especies utilizadas; en éstas existe densidad prácticamente uniforme en todo su espesor: Tampoco existe diferencia en el límite entre la M.B.G. pericapilar, la M.B.G. perimesangial y la matriz mesangial.
En las especies M. musculus, M. spretus y C. glareolus la fibronectina se localiza única y exclusivamente en la matriz mesangial y en ningún caso en las M.B.G. mientras que la laminina se localiza tanto en las M.B.G. como en la cápsula de Bowman, la membrana basal tubular y la matriz mesangial. Mostrando en la M.B.G. pericapilar una ligera tendencia a localizarse en las láminas raras externa e interna.
El marcaje menos intenso en M. spretus y C. glareolus y su ausencia en A. sylvaticus para la fibronectina y la laminina en la M.B.G. y la matriz mesangial puede indicar un carácter de divergencia filogenética.

ENGLISH; DISTRIBUTION OF FIBRONECTIN AND LAMININ IN RENAL CORPUSCLE OF DIVERSE SPECIES OF RODENTS

Propose: The aim of this study is the glomerular basement membrane (GBM) and the distribution of two of structural molecules of the extracellular matrices of the renal corpuscle: fibronectin and laminin. The study has been performed with four apparently closed species of a same zoological group (Rodentia) since experimentally, new species like laboratory animals are starting being breeded, comparing a standard laboratory animal with wild species with different trophic strategies.
Material and methods: Adults exemplars of Mus musculus (isogenic strain BALB/c), Mus spretus, Apodemus sylvaticus and Clethrionomys glareolus proceeding of captures "in vivo" made in natural fields have been used. The histological material has been processed by means of OM (stain PAS-Alcian Blue/H) and two immunohistochemical techniques, immunoperoxidase and immunofluorescence for antibodies anti-fibronectin and anti-laminin and by TEM (standard and immunolocalization of antibodies anti-fibronectin and anti-laminin by colloidal gold).
Results: TEM does not show morphological differences between the glomeruli of the different species used, except for the GBM , showing the material that conforms all the GBM a uniform density in all the wild species.
With the immunolocalization by colloidal gold, the results for the distribution of fibronectin in M. musculus is positive in the mesangial matrix, and negative in the GBM and the peritubular basement membrane. The results for M. spretus and C. Glareolus are similar to obtained for M. musculus; although with a smaller reaction to that observed for M. musculus.
With the immunolocalization by colloidal gold the results for the distribution of laminin, in M. musculus is positive in the mesangial matrix, the tubular basement membrane and the GBM; the latter with tendency to be located in two laminae rara. The results for M. spretus and C. glareolus are similar to obtained for M. musculus although with a smaller reaction to the observed for the laboratory mouse.
The samples from A. sylvaticus, did not show positive reactivity again the anti-fibronectin and anti-laminin antibodies used.
Conclusions: The trilaminar ultrastructure of the GBM presents in M. musculus is not observed in the other species used; in those a uniform density in all its thickness exists. Differences in the limit among the pericapillary GBM, the perimesangial GBM and the mesangial matrix does not exist either.
In M. musculus, M. spretus and C. glareolus species fibronectin are exclusively located in the mesangial matrix and never in the GBM, whereas laminin is located mainly in the GBM and also in the Bowman's capsule, the tubular basement membrane and the mesangial matrix; showing in the pericapillary GBM a slight tendency to be located in external and internal laminae rara. The less intense labelling in M. spretus and C. glareolus and its absence in A. sylvaticus for fibronectin and laminin in the GBM and the mesangial matrix may suggest a philogenetic divergence.

Estudi de la vascularització cutània escrotal. Aplicació en cirurgia de reconstrucció uretral.

Tue, 12 Apr 2011 13:17:16 GMT

Estudi de la vascularització cutània escrotal. Aplicació en cirurgia de reconstrucció uretral. Carrera Burgaya, Ana L'any 1997, Gil-Vernet va descriure la tècnica del penjall escrotal biaxial depilat ("BAES-Flap") per la reconstrucció de les estenosis de la uretra masculina. El disseny d'aquest penjall, que s'eleva en la cara posterior de l'escrot, centrat en la línia mitja i mesurant 5 cm d'amplada i longitud variable en funció del segment uretral a reconstruir, es va fonamentar en les descripcions de vascularització cutània de Salmon (1936), segons les quals s'irriga a través de les dues artèries perineals superficials que es ramifiquen en múltiples branques escrotals posteriors. Però malgrat aquesta base anatòmica, existeixen algunes incògnites sobre la distribució concreta dels vasos en la pell escrotal per a poder procedir a modificacions en l'amplada i longitud del penjall sense posar en compromís la seva viabilitat vascular. Aquestes incògnites no troben resposta en els textos d'anatomia clàssica que no aporten informació suficientment rellevant des del punt de vista quirúrgic. Pel que fa a altres estudis específics sobre la vascularització d'aquesta regió, a banda dels treballs de Salmon, només existeixen les descripcions de Quartey (1997) que es refereixen a la distribució microscòpica dels vasos en els plexes subdèrmic i subcutani de les cobertes escrotals.
S'ha realitzat un estudi anatòmic en 13 pelvis d'homes adults, amb prèvia injecció arterial de làtex negre, aplicant com a mètodes la dissecció dels troncs d'origen de la vascularització escrotal, la microdissecció del territori cutani, la transparentació escrotal (mètode d'Spalteholtz) i l'elevació i transparentació del penjall escrotal de Gil-Vernet.
També, en un grup de 95 pacients tractats d'estenosi uretral mitjançant aquest penjall, hem valorat els resultats obtinguts després de la intervenció, als 6 mesos i a llarg plaç, establint una relació entre aquests i les longituds i amplades dels segments cutanis utilitzats.
Hem determinat que la pell escrotal està vascularitzada per les artèries pudendes externes inferiors i per les artèries perineals. Cada artèria pudenda externa inferior s'introdueix a la pell de l'escrot en el punt lateral de l'arrel escrotal i es ramifica cobrint la vascularització de la totalitat de la bossa corresponent. Cada artèria perineal s'introdueix a l'escrot aplicada al costat homolateral del tabic, just sota del cos esponjós de la uretra, i realitza un recorregut cap a la base de l'arrel del penis durant el qual va desprenent branques descendents, també aplicades al tabic, que arriben a la pell de tota la lína mitja de l'escrot, des de la cara posterior i fins la cara anterior, arribant al límit de la cara ventral de l'arrel del penis. D'aquesta manera, des del punt de vista de la vascularització cutània, la pell de l'escrot es divideix en tres regions: la pell de les dues regions corresponents a les dues hemibosses escrotals i la pell de la línia mitja. Aquests territoris vasculars estan interconnectats ja que existeixen anastomosis entre les artèries cutànies escrotals de les diferents procedències.
Segons aquesta distribució vascular i comprovats els resultats clínics de l'aplicació del penjall escrotal biaxial de Gil-Vernet podem afirmar que aquest penjall, pediculat bilateralment a l'artèria perineal, no té restriccions pel que fa a la seva longitud i pot ser elevat des de la cara posterior de l'escrot fins al límit de la seva cara anterior amb la base de l'arrel del penis, sempre que el tabic escrotal, per on accedeix la seva vascularització, quedi inclòs en la seva cara profunda. Pel que fa a l' amplada, la seva reducció no en compromet la viabilitat, ja que les principals artèries que el vascularitzen procedeixen de la línia mitja. A més, les anastomosis existents entre els diferents territoris vasculars de l'escrot, permeten una gran versatilitat en el seu disseny.