TDX/TDR - Departament de Ciències Fisiològiques I

Physical forces and mechanical waves during tissue growth

Tue, 21 May 2013 10:59:27 GMT

Physical forces and mechanical waves during tissue growth Serra Picamal, Xavier Fundamental biological processes such as morphogenesis, tissue regeneration, and cancer invasion, depend on the collective migration of cell groups. The mechanisms that result in collective migration are not well understood, partially because the physical forces that initiate and maintain collective cell migration remain largely unknown. These forces include the traction forces, exerted by the cells on the extracellular matrix, and the cell-cell forces, transmitted between adjacent cells through cell-cell junctions. While the former have been studied, the latter have never been measured in the context of collective cell migration. The objective of this thesis has been to study these forces and integrate them in order to define the biomechanical mechanisms involved in the expansion of an epithelial monolayer. The thesis is presented as a compilation of two articles. In the first article, a new method for measuring intra-and intercellular forces in a cell monolayer was reported. It was shown that cells tend to align and migrate in the direction of maximal principal stress, demonstrating that intercellular forces act as a guidance mechanism during collective cell migration. In the second article, the expansion of an epithelial monolayer was studied. A new experimental model based on a barrier migration assay using polydimethylsiloxane membranes was implemented, allowing the study of epithelial expansion in a controlled and systematic manner. Structural and morphological changes at the cell level were observed during the expansion of the cellular monolayer. Furthermore, a mechanical wave propagates slowly spanning the entire monolayer, traversing intercellular junctions in a cooperative manner and building up differentials of mechanical stress. A minimal model based on sequential fronts of cytoskeletal reinforcement and fluidization captured essential features of this wave generation and propagation. These findings established a mechanism of long-range cell guidance, symmetry breaking and pattern formation during monolayer expansion.

Hepatic remodeling, serum biomarkers and prevention of fibrosis progression in liver disease.

Wed, 27 Feb 2013 11:00:05 GMT

Hepatic remodeling, serum biomarkers and prevention of fibrosis progression in liver disease. Reichenbach Marinkovic, Vedrana Hepatic fibrosis is characterized by intense tissue remodeling. In this study, we assessed whether CO3-610, a new identified neoepitope, could be used as a surrogate biomarker of liver fibrosis and portal hypertension in CCl4-induced experimental fibrosis. Serum CO3-610 was measured by ELISA. Liver fibrosis was quantified by Sirius red staining. Serum hyaluronic acid (HA) was measured with a binding-protein assay. Gene expression of collagens I and III, MMP2 and MMP9, and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1 and 2 was quantified by PCR. Hemodynamic measurements were taken in a subgroup of animals. A close direct relationship was found between serum CO3-610 and hepatic collagen content (r= 0.78; P<0.001), superior to that found for serum HA (r= 0.49; P<0.05). CO3-610 levels in rats with severe fibrosis (43.5±3.3 ng/mL, P<0.001) and cirrhosis (60.6±4.3 ng/mL, P<0.001) were significantly higher than those in control animals (26.6±1.3 ng/mL). Importantly, a highly significant relationship was found between serum CO3-610 and portal hypertension (r= 0.84; P<0.001). Liver MMP9 expression increased significantly in fibrotic animals but decreased to control levels in cirrhotic ones. Circulating CO3-610 behaves as a reliable indicator of hepatic remodeling and portal hypertension in experimental fibrosis. Therefore, this peptide could ultimately be a useful marker for the management of liver disease in patients. Endocannabinoids behave as antifibrogenic agents by interacting with cannabinoid CB2 receptors, whereas the apelin (AP) system acts as a proangiogenic and profibrogenic mediator in the liver. This study assessed the effect of long-term stimulation of CB2 receptors or AP receptor (APJ) blockade on fibrosis progression in rats under a non-discontinued fibrosis induction program. The study was performed in control and CCl4-treated rats for 13 weeks. Fibrosis-induced rats received a CB2 receptor agonist (AM1241) (1 mg/kg), an APJ antagonist (F13A) (75 μg/kg), or vehicle daily during the last 5 weeks of the CCl4 inhalation program. Mean arterial pressure (MAP), portal pressure (PP), hepatic collagen content, angiogenesis, cell infiltrate, and mRNA expression of a panel of fibrosis-related genes were measured in all animals. Fibrosis-induced rats showed increased hepatic collagen content, reduced MAP, PP, and increased expression of the assessed messengers in comparison with control rats. However, fibrotic rats treated with either AM1241 or F13A had reduced hepatic collagen content, improved MAP and PP, ameliorated cell viability, and reduced angiogenesis and cell infiltrate compared with untreated fibrotic rats. These results were associated with attenuated induction of PDGFRβ, α-SMA, MMPs, and TIMPs. CB2 receptor stimulation or APJ blockade prevents fibrosis progression in CCl4-treated rats. The mechanisms underlying these phenomena are coincident despite the marked dissimilarities between the CB2 and APJ signaling pathways, thus opening new avenues for preventing fibrosis progression in liver diseases. PDGF is the most potent stimulus for proliferation and migration of stellate cells. PDGF receptor β expression is an important phenotypic change in myofibroblastic cells that mediates proliferation and chemotaxis. Here we analyzed the relationship between PDGFRβ expression, hemodynamic deterioration, and fibrosis. Thereafter, we investigated the effects produced by an adenovirus encoding a dominant-negative soluble PDGFRβ (sPDGFRβ) on hemodynamic parameters, PDGFRβ signaling pathway, and fibrosis. Hemodynamics, PDGFRβ mRNA expression, and hepatic collagen were assessed in controls and fibrosic/cirrhotic rats. Next, 30 fibrotic rats were randomized into three groups receiving iv saline and an adenovirus encoding for sPDGFRβ or β-galactosidase. After 7days, hemodynamics, serum sPDGFRβ, and hepatic collagen were measured. CCl4-treated animals for 18weeks showed a significantly higher increase in PDGFRβ mRNA compared to those treated for 13weeks and control rats. In CCl4-treated rats, the fibrous tissue area ranged from moderate to severe fibrosis. A direct relationship between the degree of fibrosis, hemodynamic changes, and PDGFRβ expression was observed. Fibrotic rats transduced with the adenovirus encoding sPDGFRβ showed increased MAP, decreased PP, lower activation of the PDGFRβ signaling pathway, and reduced hepatic collagen than fibrotic rats receiving β-gal or saline. PDGFRβ activation closely correlates with hemodynamic disorders and increased fibrosis in CCl4-treated rats. Adenoviral dominant negative soluble PDGFRβ improved fibrosis. As a result, the hemodynamic abnormalities were ameliorated. Cirrhotic patients have altered host-defense response mechanisms. Here we assessed whether impaired expression of CB2 receptor in monocytic cells of cirrhotic patients could be involved in the pathogenesis of this phenomenon. CB2 mRNA and protein expression was assessed in a differentiated human monocytic cell line (U937) stimulated with endotoxin (LPS). A PCR array of 86 different genes was assessed in U937 cells treated with LPS. A migration assay towards endocannabinoids or the CB2 antagonist, SR144528, was performed in U937 cells exposed to LPS. Finally, CB1 and CB2 mRNA expression were measured in monocytes and macrophages of cirrhotic patients with or without spontaneous bacterial peritonitis. LPS reduced CB2 expression in human monocytes. Endocannabinoids increased the migratory activity of U937 cells, which was reverted when the experiments were performed in the presence of LPS. Transcriptional profiling showed marked upregulation of 9 genes related to proinflammatory signaling. However, only two genes encoding for CB1 and CB2 were reduced in LPS-treated cells. Circulating monocytes of cirrhotic patients showed a significantly diminished mRNA expression of CB1 and CB2. Markedly low CB1 and CB2 mRNA levels were found in peritoneal macrophages of cirrhotic patients with ascites, being almost suppressed when analyzed in patients with peritonitis. LPS reduces CB2 expression in human monocytes resulting in depressed chemotactic activity and therefore impaired host defense response of these cells.; La característica más destacable de la fibrosis es la desregulación de la ME. El equilibrio que existe entre la síntesis y la degradación de la ME en un hígado normal se pierde, y como consecuencia se favorece la síntesis y acumulación de fibras de colágeno, el cual provoca la distorsión de la arquitectura del parénquima y de la red vascular hepática. El CO3-610 es un producto de degradación del colágeno III que ha mostrado estar correlacionado significativamente con el aumento de la cantidad de colágeno y progresión de la fibrosis. Los valores máximos de CO3-610 se han encontrado ratas cirróticas. El resultado más importante es que el CO3-610 ha mostrado tener una estrecha correlación con los valores de presión portal. Existe un gran interés en investigar y desarrollar terapias dirigidas a la prevención de la progresión de la fibrosis. Los endocannabinoides son moléculas lipídicas que participan en un amplio rango de procesos fisiológicos. Los efectos son mediados por dos tipos de receptores, el CB1 y el CB2. El sistema de la apelina es otro sistema endógeno que ha despertado mucho interés en los últimos años. La apelina es el único ligando conocido para el receptor APJ. El tratamiento con AM1241, un agonista selectivo de CB2 y F13A, un antagonista de APJ mejoró la función hepática, la hemodinámica sistémica y portal, y provocó una reducción significativa del grado de fibrosis hepática. Ambos tratamientos produjeron una disminución del infiltrado inflamatorio, angiogénesis y del grado de apoptosis en el parénquima hepático. El análisis de la expresión del mRNA de varios genes importantes implicados en el proceso fibrogénico, reveló que el tratamiento tanto con AM1241 como con F13A, producían una disminución de la expresión del PDGFRβ, del αSMA y de genes de remodelado tisular. La inhibición parcial de la vía de PDGF mediante la administración de un dominante negativo para la fracción soluble del receptor β de PDGF, ha demostrado que mejora la hemodinámica sistémica y la presión portal además de mejorar el grado de fibrosis. Por último, los pacientes cirróticos con ascitis tienen una mayor probabilidad de sufrir infecciones (peritonitis bacteriana espontánea, PBE). Se ha observado que estos pacientes tienen una menor expresión de CB2. In vitro se han realizado experimentos con células monocíticas (U937) y se ha observado que el LPS disminuye drásticamente la expresión de CB2 al igual que afecta a la capacidad de migración de estas células. En conjunto, se puede concluir que la evaluación de la fibrosis hepática es una herramienta muy importante para el diagnostico de la enfermedad hepática y que éste puede mejorarse a través del uso de biomarcadores no invasivos que correlacionen con la hemodinámica y el grado de fibrosis hepática. La prevención de la progresión de la fibrosis a través de fármacos o bien actuando sobre genes clave involucrados en la fibrogénesis son posibles dianas terapéuticas. Finalmente, es posible mejorar la calidad de vida de los pacientes cirróticos con ascitis con infección por PBE mediante terapias que involucren los receptores de cannabinoides CB2.

TGF-ß-regulated genes implicated in invasion that might participate in the control of apoptosis in liver tumor cells

Tue, 30 Oct 2012 09:07:08 GMT

TGF-ß-regulated genes implicated in invasion that might participate in the control of apoptosis in liver tumor cells Mainez Villoro, Jessica In the last years our research has been focused on analyzing the signaling pathways induced by TGF-β in liver tumor cells, to understand the molecular mechanisms that confer resistance to its suppressor effects. TGF-β induces apoptosis in fetal and neonatal murine hepatocytes, as well as in liver tumor cells, and chronic exposure of these cells to TGF-β iinduces a process of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT). In the present work we wanted to identify TGF-β-regulated genes that being involved in EMT and cell invasion could also participate in the control of growth, apoptosis and/or differentiation. Firstly we analyzed the role of genes regulated by TGF-β and implicated in EMT that might participate in apoptosis control in hepatocytes, focusing on Snail and SPARC. Inhibition of Snail, through targeting knock-down with specific siRNA, impairs TGF-β-induced EMT in murine hepatocytes and significantly enhances their apoptotic response, which indicates that Snail plays a relevant role in conferring resistance to TGF-β-induced cell death. TGF-β also induces anti-apoptotic signals, mediated by the activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). Snail downregulation impairs the TGF-β-induced EGFR ligands expression and inhibits the phosphorylation of Akt, Erks and c-Src family, which is coincident with activation of mitochondrial-dependent apoptotic events and an earlier Smad3 phosphorylation in TGF-β-treated cells. We also demonstrate a role for Snail in sensitizing murine hepatocytes to cell death by anoikis, which is a relevant phenomenon in metastatic processes. Snail1 downregulation in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells, which are partially or fully resistant to TGF-β suppressor effects, restores the apoptotic response to TGF-β. TGF-β induces SPARC expression in FaO rat liver tumor cells but not in neonatal murine untransformed hepatocytes. SPARC inhibition, through targeting knock-down with specific siRNA, reveals a role for SPARC in mediating TGF-β-induced EMT in liver tumor cells. Furthermore, SPARC knock-down significantly enhances the TGF-β-induced apoptotic response. Interestingly, SPARC effects might be mediated by Snail, since SPARC silencing impairs Snai1 up-regulation by TGF-β in FaO cells. We next wanted to study the tumorigenesis of FaO cells after in vitro chronic treatment with TGF-β for 4 weeks (TβT-FaO). For this, we injected these cells through both subcutaneous and intrasplenic procedures. Liver tumor formation derived from intrasplenic injection of FaO cells induced a multifocal highly proliferative hepatocarcinoma in all mice, whereas parallel inoculation of TβT-FaO cells promoted low proliferative unifocal and heterogeneous hepatic lesions which showed higher staining for phospho-Smad2. Detailed analysis of tumors revealed lesions with bile duct characteristics and lesions with a dedifferentiated (hepatoblast) phenotype. Primary culture of tumor cells from both FaO- and TβT-FaO-induced intrasplenic lesions indicated that only cells obtained from FaO-induced tumors undergo apoptosis in response to TGF-β, whereas TβT-FaO-derived tumors contain cells that are fully resistant. Analysis of the phenotype of tumors and their derived cells showed that intrasplenic injection of TβT-FaO cells may produce cholangiocarcinoma-like and hepatoblastoma-like tumors. In summary, chronic in vitro TGF- β treatment of FaO cells changed their tumorigenic potential. Tumor growth was slower but cells are resistant to apoptosis. Futhermore, phenotype of lesions reflected a stem-like phenotype which provokes the appearance of less differentiated tumors (hepatoblastomas) or transdifferentiation to a different liver tumor lineage (cholangiocarcinomas).; En el trabajo actual hemos querido identificar genes regulados por TGF-β que estando implicados en EMT e invasión celular puedan también participar en el control del crecimiento, apoptosis y/o diferenciación, centrándonos en Snail y SPARC. La inhibición de la expresión de Snail impide la EMT inducida por TGF-β en hepatocitos murinos y aumenta su respuesta apoptótica, indicando un papel importante de Snail confiriendo resistencia a la muerte inducida por TGF-β. El TGF-β también induce señales anti-apoptóticas, mediadas por la activación del EGFR. La cancelación de Snail impide la inducción mediada por TGF-β de los ligandos del EGFR e inhibe la fosforilación de Akt, ERKs y familia c-Src, hecho coincidente con la activación de eventos apoptóticos dependientes de la mitocondria y con una fosforilación temprana de Smad3 en las células tratadas con TGF-β. También demostramos el papel de Snail en la sensibilización de los hepatocitos a la muerte celular por anoikis. La disminución de los niveles de Snail1 en células de carcinoma hepatocelular humano (HCC), restaura la respuesta apoptótica al TGF-β. El TGF-β induce la expresión de SPARC en las células tumorales FaO de hepatoma de rata pero no en los hepatocitos neonatales murinos no transformados. La inhibición de la expresión de SPARC revela un papel de SPARC en la inducción de EMT y en la respuesta apoptótica mediada por TGF-β en células tumorales hepáticas. A continuación quisimos estudiar el potencial tumorogénico de las células FaO después de un tratamiento in vitro crónico con TGF-β durante 4 semanas (TβT-FaO). Inyectamos estas células en ratones inmunodeprimidos para provocar la formación de tumores tanto subcutáneos como ortotópicos (inyección intraesplénica). La inoculación intraesplénica de células FaO indujo un carcinoma hepatocelular multifocal altamente proliferativo en todos los ratones, mientras que la inoculación paralela de células TβT-FaO promovió la formación de lesiones unifocales, heterogéneas y con baja proliferación que mostraron un fuerte marcaje para Smad2 fosforilado. Un análisis detallado de los tumores mostró lesiones con características de ducto biliar y lesiones con un fenotipo desdiferenciado (hepatoblastos). El cultivo primario de las células provenientes de estos tumores indicó que sólo las células obtenidas de los tumores FaO sufren apoptosis en respuesta al TGF-β, mientras que los tumores derivados de los TβT-faO contienen células que son completamente resistentes. En resumen, el tratamiento crónico in vitro con TGF-β de las células FaO cambió su potencial tumorogénico. El crecimiento tumoral fue más lento pero las células son resistentes a la apoptosis. Además, el fenotipo de las lesiones refleja un fenotipo tipo célula progenitora que provoca la aparición de tumores menos diferenciados o la transdiferenciación a una línea tumoral hepática distinta.

Modulació de l’activació microglial com a estratègia neuroreparadora

Tue, 09 Oct 2012 07:04:24 GMT

Modulació de l’activació microglial com a estratègia neuroreparadora Gresa Arribas, Núria L’activació microglial és un fenomen fisiològic que permet resoldre alteracions a l’homeostasi. Quan l’estímul desencadenant de l’activació microglial és proinflamatori, es desencadena una resposta inflamatòria en la que la micròglia produeix citocines i altres factors proinflamatoris que tenen potencial neurotòxic. Si aquesta activació es dóna de forma exacerbada o es cronifica, pot acabar tenint un efecte perniciós. De fet, diversos autors postulen que l’activació microglial pot agreujar el curs de patologies com l’Alzheimer o el Parkinson. És per això que en aquesta tesi ens vam plantejar la inhibició del fenotip proinflamatori de l’activació microglial com una diana terapèutica en les malalties neurodegeneratives. El primer objectiu va ser establir i caracteritzar un model in vitro de neuroinflamació, en el que estudiar el patró d’activació microglial a cultius tractats amb un estímul proinflamatori (LPS + interferó gamma). Així, vam determinar que la micròglia estimulada amb LPS/IFN-gamma s’activa amb un patró de resposta proinflamatori que es caracteritza per un increment en l’expressió dels enzims iNOS i COX-2 i en la producció de NO, TNF-alfa i IL-6. En una segona fase es va establir i caracteritzar un model de cocultiu de neurones i micròglia on estudiar la neurotoxicitat induïda per activació microglial en el que vam determinar que l’activació de la micròglia en resposta al LPS/IFN-gamma té un efecte neurotòxic principalment mediat per la producció de NO, mentre que el TNF-alfa la IL-6 i la COX-2 tenen un paper secundari. Una vegada establert el model experimental vam abordar la modulació de l’activació microglial inhibint els factors implicats en l’activació proinflamatòria, en concret els C/EBPs, ja que aquests factors regulen l’expressió de molts dels gens implicats en la resposta proinflamatòria microglial. La nostra hipòtesi era que la inhibició dels C/EBPs disminuiria aquesta resposta i tindria un efecte neuroprotector. La inhibició es va abordar des d’una aproximació farmacològica i una aproximació genètica. La inhibició farmacològica es va fer usant el flavonoide crisina que té efectes antiinflamatoris mediats per la inhibició dels C/EBPs en macròfags. Així, vam determinar que la crisina té un efecte antiinflamatori i neuroprotector i que aquest està mediat, si més no en part, per la inhibició de C/EBP-delta. Posteriorment, mitjançant la utilització de micròglia de ratolins deficients en C/EBP-beta o C/EBP-delta, vam determinar que l’absència de C/EBP-beta o C/EBP-delta inhibeix l’activació microglial i la neurotoxicitat associada. Els C/EBPs per tant són una possible diana terapèutica addicional per al tractament de patologies que cursen amb neuroinflamació. Per últim es va plantejar la inhibició de la sobreactivació microglial proinflamatòria potenciant els senyals inhibidors que mantenen a la micròglia en un estat quiescent, en concret la parella lligand-receptor CD200-CD200R. La nostra hipòtesi era que modulant l’activació de CD200R es podria inhibir la sobreactivació microglial i la neurotoxicitat associada. Així el tercer objectiu va ser estudiar, d’una banda quins estímuls poden modular l’expressió de CD200 a les neurones, i de l’altra quin és el paper de CD200 i CD200R en la modulació de l’activació microglial per part de les neurones. Per abordar aquest objectiu es va establir un model de mort neuronal apoptòtica i un model de mort neuronal necròtica per excitotoxicitat. En aquest model vam determinar que l’expressió de CD200 augmenta en neurones que estan morint, ja sigui per apoptosi com per necrosi, el que podria constituir un mecanisme de control de l’activació microglial en presència de mort neuronal (no es pot descartar que l’efecte observat sigui degut a una major estabilitat CD200 en front a altres proteïnes neuronals). Per últim ens vam plantejar estudiar l’efecte de la modulació de la senyalització CD200-CD200R sobre l’activació microglial i la neurotoxicitat associada, demostrant quel’expressió proteica de CD200 a neurones no es modula per estímuls antiinflamatoris com la IL-4 i la IL-10 ni proinflamatoris com el LPS i l’IFN-gamma. En resum, els resultats d’aquesta tesi mostren la utilitat dels models experimentals in vitro per estudiar la resposta inflamatòria de la micròglia i la neurotoxicitat resultant. Amb aquests models hem pogut establir la importància de la família de factors de transcripció C/EBPs en la regulació de la resposta inflamatòria microglial i suggerir la rellevància de CD200 en la comunicació entre la micròglia i les neurones que han entrat en un procés de mort cel•lular.; Microglial activation is a physiologic phenomenon that occurs in response to alterations of homeostasis. When microglia are activated by an pro-inflammatory stimulus there is an inflammatory response where cytokines and other pro-inflammatory factors with neurotoxic potential are released. A chronic or exacerbated response can have harmful effects; in fact many authors connect microglial pro-inflammatory overactivation with degenerative diseases such as Alzheimer’s or Parkinson’s disease. Given that, the main goal of this thesis was develope strategies to inhibit pro-inflammatory microglial activation that could serve as therapeutic target in neurodegenerative diseases. To do so we set up and characterized an in-vitro model of neuroinflammation using LPS + interferon-gamma as a proinflammatory stimulus. Treated microglial cells undergo a proinflammatory response pattern characterized by the release of NO, TNF-alpha and IL-6 and the increase of iNOS and COX-2 expression. When microglial cells are co-cultured with cortical neurons, the pro-inflammatory response results in neurotoxicity, an effect mediated mainly by NO release, whereas TNF-alpha, la IL-6 and COX-2 may have a secondary role in the process. Using this model we tested whether we could modulate microglial activation by inhibiting C/EBPs, a family of transcription factors involved in the regulation of pro-inflammatory genes. We first used a pharmacologic approach treating microglial cells with an anti-inflammatory compound named crisin. We determinated that crisin has anti-inflammatory and neuroprotective effects and that these effects are mediated,at least in part, by C/EBP-delta inhibition. We then used a genetic approach to inhibit C/EBPs, by using microglial cells from KO mice. We showed that the lack of C/EBP-beta or C/EBP-delta inhibits microglial activation and the associated neurotoxicity. Therefore, we suggest that C/EBPs are a potential therapeutic target in the treatment of diseases where neuroinflammation is present. We also modulated microglial activation by potentiating the inhibitory signals that keep microglia in a resting state, such as the neuronal ligand CD200 and its microglial receptor CD200R. We showed that CD200 expression appears to increase in response to neuronal death but not in response to pro-inflammatory stimuli such as IL-4, IL-10 or anti-inflammatory stimuli such as LPS and IFN-gamma. In summary we demonstrated that in-vitro models can be used to study the pro-inflammatory and neurotoxic effect of the microglial response. Using this approach we determinated the relevance of C/EBPs in regulating microglial activation and our studies support an important role of CD200 in the crosstalk between microglia and neurons that undergoing cell death.

Desenvolupament d’una teràpia anti-amiloide per a la malaltia d’Alzheimer en el gos amb disfunció cognitiva

Fri, 07 Sep 2012 07:32:23 GMT

Desenvolupament d’una teràpia anti-amiloide per a la malaltia d’Alzheimer en el gos amb disfunció cognitiva Bosch Pont, Mª Neus Introducció: La Malaltia d’Alzheimer (AD), és la malaltia neurodegenerativa amb més incidència actualment. La hipòtesi més acceptada sobre l’origen de la malaltia és la “hipòtesi amiloide”, en la que el cúmul de pèptid beta amiloide (Aβ) a l’espai extracel•lular a cervell du a la formació d’oligòmers solubles, fibril•les i plaques provocant una disfunció sinàptica i neuronal i, conseqüentment, dèficits cognitius. Tots aquests esdeveniments van acompanyats de neuroinflamació i de la formació de cabdells neurofibril•lars. Diversos són els models animals utilitzats per a l’estudi l’AD, dintre dels quals hi trobem els gossos de companyia envellits s’ha descrit la Síndrome de Disfunció Cognitiva (CDS). Els gossos amb la CDS es caracteritzen per presentar per alteracions a nivell cognitiu, anatòmic i histopatològic similars les descrites anteriorment i comparables a les observades en els estadis inicials de l’AD. Totes aquestes convergències, fan que el gos amb la CDS sigui considerat un bon model natural d’envelliment humà i dels estadis més inicials de l’AD i que pugui ser de gran utilitat en estudis de tractaments dirigits l’AD. Dintre dels tractaments dirigits a la prevenció de la formació i/o eliminació d’amiloide hi trobem les immunoteràpies anti-amiloide actives. Aquestes, mitjançant l’administració d’un fragment d’Aβ sintètic combinat amb diversos adjuvants i proteïnes transportadores, indueix l’eliminació d’amiloide de Sistema Nerviós Central cap a la perifèria mitjançant diversos mecanismes. Des de l’estudi fet l’any 2000 amb la immunoteràpia (AN1792), dissenyada a partir de l’Aβ42 i QS21 com a adjuvant, que va provocar un 6% de casos de meningoencefalitis en els pacients inclosos a l’estudi, diversos han estat els esforços per dissenyar vacunes eficaces i que evitin els efectes secundaris no desitjats. Objectiu general: En aquest treball es planteja si l’administració d’una immunoteràpia dissenyada a partir d’un adjuvant que indueix respostes de tipus Th2 o anti-inflamatòria juntament amb un fragment C-terminal del pèptid Aβ fibril•lar indueix una millora cognitiva en gossos amb CDS, evitant els efectes nocius observats en immunoteràpies ja testades en humans.; Development of an anti-amyloid therapy for Alzheimer Disease in dogs with Cognitive Dysfunction Introduction: Alzheimer’s Disease (AD) is a neurodegenerative disease where the cognitive deficits are due to the accumulation of the different forms of amyloid beta peptide (Aβ) (oligomers, fibrils and plaques). They also induce neuroinflamation and the formation of the neurofibrillary tangles. Aged dogs with Cognitive Dysfunction Syndrome (CDS) also present cognitive deficits associated to the accumulation of the different forms of Aβ into the brain. Because of the similarities with AD, dogs with CDS are considered a good model for the study of aging human and the first stages of AD. Active anti-amyloid immunotherapy is one of the strategies proposed with the aim to ameliorate the cognitive deficits through the clearance of the amyloid burden from the central nervous system to the periphery. After the harmful side effects due to the administration of the immunotherapy AN1792 in the 21st century, studies with different anti-amyloid immunotherapies have been performed with the aim to prevent and/or ameliorate AD and avoiding the side affects. Objective: This work considers the development of an immunotherapy designed with a Th2 adjuvant and C-terminal fragments of the fibrillar Aβ to induce a cognitive improvement in CDS dogs avoiding the side effects of the immunotherapies tested in humans. Results: The immunization study was performed after the selection of the V5 vaccine designed using the mixture of the Aβ1-40 + KLH-Aβy-40 fragments and the Aluminium Hydroxide (Alum®) as the adjuvant. V5 vaccine was administrated during a fifty days period to CDS dogs (n=12) and housed adult beagle dogs (n=9). Changes in cognitive deficits, in biochemistry and haematologist biomarkers were observed during the follow-up period. With the aim to observe the changes in neuroinflamation responses, a comparative study between brain samples form unimmunized and immunized dogs was performed as well. Increases in the Aβplasma/ AβLCR ratio associated to the reduction of the neuroinflamation responses could diminish the neuronal damage leading to a cognitive improvement without side effects in CDS dogs.

K(ATP) Channel blockade instructs microglia to foster brain repair and neurogenesis after stroke

Thu, 10 May 2012 06:58:45 GMT

K(ATP) Channel blockade instructs microglia to foster brain repair and neurogenesis after stroke Ortega González, Fco. Javier Stroke causes CNS injury associated with strong fast microglial activation as part of the inflammatory response. Fast activation of microglia in response to neuronal damage requires the rapid availability of a large amount of energy to trigger diverse cytotoxic or neuroprotective signals. ATP-dependent potassium (K(ATP)) channels play important roles in many cellular functions by coupling cell metabolism to electrical activity. K(ATP) channels were first detected in cardiac myocytes and later found in beta-cells of the pancreas, skeletal muscle, neurons, smooth muscle, heart, pituitary, and tubular cells of the kidney. Our group and others have also demonstrated its expression in reactive microglia after brain injury. In rat models of stroke, blockade of the sulfonylurea receptor (SUR), with glibenclamide (Gbc) reduced cerebral edema and infarct volume. Furthermore, clinical data suggest the effectiveness of Gbc to treat stroke. Gbc close the K(ATP) channel by interaction with two drug-binding sites on SUR subunits, as well as, the astroglial NC(Ca-ATP) channel, which mediates the Gbc-induced prevention of edema after cerebral ischemia. In these studies however, the function of the K(ATP) channel remained unclear. Therefore, as Gbc may bind to constitute functional K(ATP) channels after ischemic stroke, other possible effects of Gbc might explain the effectiveness of this drug in the treatment of stroke. Giving the fact that, SUR1-regulated channels are exquisitely sensitive to changes in the metabolic state of the cell, and that microglia are sensing the environment, the expression of K(ATP) channels in activated microglia, will couple cell energy to membrane potential. We herein postulate, that the effectiveness of Gbc to treat stoke, at least in part, is caused by the KATP channel closure expressed by activated microglia, which may then be critical in determining, their participation in the pathogenic process. Given the analogy with beta-cells, K(ATP) channel blockade in microglia would response faster and more efficiently to the external signals released after brain injury. If true, blockade of microglial K(ATP) channel with low doses of Gbc during the early stages of stroke might foster neuroprotective microglial activity, could enhance ischemia-induced neurogenesis in the SVZ, and consequently will lead to an improved functional outcome. The work presented in this thesis demonstrates that, Gbc improves functional neurological outcome in stroke, accompanied by neuron preservation in the core of the ischemic brain. In this region, reactive microglia from tMCAO rats upregulate the K(ATP) channel, which makes microglia a target to Gbc actions in the early stages of stroke. Furthermore, Gbc also strengthens the neuroprotective role of microglia in the acute phase after focal cerebral ischemia, enhance long-term neurogenesis and brain repair processes. As such, identify microglial K(ATP) channels as a key target for stroke treatment. Overall, these results provide new therapeutic avenues for the treatment of other neurological disorders that involve microglia.

Contractile response of alveolar epithelial cells to biochemical or mechanical stimulation probed by traction microscopy

Tue, 12 Apr 2011 13:25:36 GMT

Contractile response of alveolar epithelial cells to biochemical or mechanical stimulation probed by traction microscopy Gavara i Casas, Núria THESIS SUMMARY:

GENERAL AIM

The general aim of this thesis was to study the generation of contractile force by human alveolar epithelial cells in culture in response to biochemical or mechanical stimuli using traction microscopy.

SPECIFIC AIMS

1. To implement a traction microscopy setup to measure the contractile force generated by human alveolar epithelial cells in culture.
1.1. To implement and validate a software to determine the deformation field induced by adhered cells on the elastic substrate, following previously described algorithms.
1.2. To implement and validate a software to determine the traction field induced by adhered cells and other contractility parameters, following previously described algorithms.
1.3. To implement a software to determine the contour of an adhered cell from a brightfield or phase contrast image of the cell.

2. To study the contractile response of human alveolar epithelial cells in response to thrombin.
2.1. To determine the gel substrate conditions and gel fabrication procedure which enable suitable cell culture and optimal detection of traction forces exerted by human alveolar epithelial cells. These gel conditions include: concentration of polyacrilamide gel components to provide optimal gels stiffness; concentration of fluorescent beads to optimally compute gel deformation; and suitable gel coating to enable cell attachment.
2.2. To determine the gel elastic properties (Young's modulus) by atomic force microscopy.
2.3. To measure the time-course of the contractile response to thrombin challenge.
2.4. To study the distribution of contractile forces exerted by adhered cells before and after thrombin stimulation.
2.5. To measure actin polymerization and reorganization induced by thrombin challenge.
2.6. To study the role of the actin cytoskeleton in the contractile response to thrombin by pre-treatments with cytochalasin D.
2.7. To study the role of pathways signalling MLC phosphorilation in the contractile response to thrombin by pre-treatments with ML7 and Y-27632.

3. To study the contractile response of human alveolar epithelial cells subjected to stretch.
3.1. To determine a suitable gel substrate that firmly attaches to a flexible membrane, allowing biaxial stretch application (max ~15%) and cell culture.
3.2. To determine the gel elastic properties (Young's modulus) of the gel at different strain levels by atomic force microscopy.
3.3. To implement and validate a stretching device to apply controlled biaxial and uniform strains to cultured cells and simultaneously measure contractile forces by deforming the gel substrate to which they are adhered.
3.4. To adapt the existing traction microscopy algorithms and software to allow computation of large bead displacements (~20 μm) and corresponding stretch fields.
3.5. To measure contractile forces exerted by human alveolar epithelial cells before, during and after being subjected to a stepwise deformation of up to 11.5% linear strain.
3.6. To assess the role of actin polymerization in the contractile response to stretch.
3.7. To assess the role of actomyosin crossbridges attachment or detachment in the contractile response to stretch.
3.8. To assess temporal changes in cell contractility after stretch release.; "Estudi de la contracció de cèl·lules epitelials alveolars en resposta a estímuls inflamatoris i de deformació mitjançant microscopia de tracció"

TEXT:

L'epiteli alveolar forma una barrera cel·lular semipermeable entre l'espai alveolar i l'interstici del pulmó, permetent l'intercanvi gasós a la vegada que restringeix el pas de líquid, macromolècules i cèl·lules cap a l'alvèol. El trencament de la monocapa, degut a la formació de forats entre cèl·lules adjacents, pot donar lloc a l'augment de la permeabilitat i l'entrada de líquid a l'alvèol, característics del dany pulmonar agut. La integritat de la monocapa epitelial es regeix per un equilibri dinàmic de forces als punts d'unió cèl·lula-cèl·lula, i cèl·lula-matriu. Les forces en joc es divideixen en una component de tensió centrípeta i una component d'adhesió centrífuga. La component centrípeta es deguda a les forces de contracció generades activament per la maquinària contràctil cel·lular i el retrocés passiu degut a la deformació cíclica a la que es troben sotmeses les cèl·lules alveolars durant la respiració. Per tal de garantir la integritat de la monocapa, les forces d'adhesió han de ser capaces de contrarestar la tensió centrípeta. L'equilibri de forces als punts d'unió pot veure's compromès degut a estímuls inflamatoris o bé mecànics.

El projecte de tesi es centra en el paper de les forces actives de contracció sobre la integritat de la monocapa alveolar en resposta a estímuls característics del dany pulmonar agut. Per tal d'estudiar aquesta component contràctil, el present projecte ha utilitzat la microscopia de tracció. Aquesta tècnica permet mesurar la força que cèl·lules adherents aïllades realitzen sobre el seu substrat, així com la seva distribució espaial i evolución temporal. La tècnica consisteix en cultivar cèl·lules adherents sobre substrats elàstics que contenen microesferes fluorescents. Comparant la posició de les microesferes quan la cèl·lula es troba adherida al substrat i un cop aquesta ha estat desenganxada amb tripsina, podem calcular la força que la cèl·lulaadherent realitzava sobre el substrat.

El projecte de tesi inclou dos estudis concrets, dedicats a dos estímuls característics de dany pulmonar agut als qual poden trobar-se sotmeses les cèl·lules epitelials alveolars. El primer estudi (secció 3) es centra en l'efecte que el mediador inflamatori trombina provoca sobre la realització de forces contràctils per part de cèl·lules alveolars epitelials. El segon estudi (secció 4) es centra en la resposta contràctil de cèl·lules alveolars epitelials a l'aplicar deformacions externes, simulant les condicions de respiració mecànica que requereixen molts pacients amb dany pulmonar agut.

Fisiopatología del edema y de la formación de ascitis en la cirrosis hepática experimental

Tue, 12 Apr 2011 13:25:35 GMT

Fisiopatología del edema y de la formación de ascitis en la cirrosis hepática experimental Melgar Lesmes, Pedro DE LA TESIS:

INTRODUCCIÓN: La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos. Dicho proceso constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se ha implicado a diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua, o la reactividad vascular. Actualmente, se considera que la disfunción renal y el desarrollo de ascitis es el resultado de la vasodilatación arterial en el territorio esplácnico, promovida por la hipertensión portal. Esto da lugar a dos secuencias de acontecimientos bien diferenciados. En primer lugar, la vasodilatación esplácnica aumenta el aflujo sanguíneo en este territorio produciendo un incremento de la presión capilar y de la permeabilidad vascular, así como una mayor formación de linfa. En segundo lugar, la disminución de la presión arterial, como respuesta homeostática compensatoria, activa los sistemas vasoconstrictores endógenos. Estos sistemas, sin embargo, tienen propiedades antidiuréticas y antinatriuréticas, por lo que la activación de los mismos también produce retención renal de sodio y agua. La concurrencia simultánea de estas dos perturbaciones estimula el acumulo de líquido intraperitoneal. Sin embargo, todavía se desconocen los territorios vasculares implicados en la formación de ascitis ni los mecanismos moleculares que regulan la fisiopatología de ese desorden. OBJETIVOS: La presente tesis doctoral tuvo como objetivos investigar cuáles son las áreas vasculares que presentan una permeabilidad vascular alterada en las ratas cirróticas con ascitis y, por otra parte, analizar el impacto de vías de señalización proangiogéncias en los procesos que conducen al aumento de la permeabilidad vascular que origina la ascitis en la cirrosis experimental. RESULTADOS: El hígado y el mesenterio son los tejidos que presentan una permeabilidad vascular aumentada en las ratas cirróticas con ascitis. Los factores vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) y la angiopoyetina-2 se encuentran sobreexpresados en el hígado y el mesenterio de las ratas cirróticas con ascitis. El bloqueo agudo del receptor 2 de VEGF reduce drásticamente la permeabilidad vascular en el hígado y el mesenterio de las ratas cirróticas con ascitis. Por otra parte, la apelina, un péptido proangiogénico de reciente descubrimiento, se encuentra aumentada en el suero de los pacientes y las ratas con cirrosis. La expresión de dicho péptido y de su receptor se encuentra hiperactivada específicamente en el hígado de las ratas cirróticas con ascitis. Más concretamente, la apelina se sobreexpresa en las células estrelladas hepáticas (CEH), y su receptor, en dichas células y en el parénquima del hígado cirrótico. El bloqueo crónico del receptor de la apelina reduce la angiogénesis y la fibrosis hepática, mejora la hemodinámica sistémica y la función renal en las ratas cirróticas con ascitis. Esos efectos beneficiosos en la hemodinámica y la angiogénesis hepática se vieron asociados con la disminución drástica de la producción de ascitis o incluso la desaparación total de la misma. Para averiguar los agentes que regulan la expresión hepática de este péptido se utilizó una línea de CEH (LX-2). La angiotensina-II y la endotelina-1 (dos factores profibrogénicos) son los principales agentes que estimulan la expresión de apelina en las células LX-2. Precisamente, la apelina actúa de mediador en la estimulación de colágeno-I y de receptor beta de PDGF que realizan angiotensina-II y endotelina-1 en las CEHs. CONCLUSIÓN: El intenso proceso de angiogénesis hepática y mesentérica contribuye de manera significativa al desarrollo de la ascitis en la cirrosis hepática. Por tanto, estos datos apoyan la hipótesis de que el bloqueo de dianas terapéuticas implicadas en angiogénesis puede constituir un avance en el tratamiento de las alteraciones de la permeabilidad vascular que dan lugar a la formación de ascitis en esta enfermedad.

Estudio de la transición nucleohistona-nucleoprotamina "in vivo" e "in vitro". Clonación, secuenciación y expresión del gen de la protamina galina.

Tue, 12 Apr 2011 13:25:35 GMT

Estudio de la transición nucleohistona-nucleoprotamina "in vivo" e "in vitro". Clonación, secuenciación y expresión del gen de la protamina galina. Oliva Virgili, Rafael Para investigar los cambios de composición y estructura de la cromativa en las distintas fases de la espermatogénesis, se han puesto a punto para el testículo de gallo las técnicas de obtención de suspensiones celulares por disociación tríptica del tejido y separación de las células a gravedad unidad. Los resultados obtenidos indican que a medida que progresa la espermiogénesis se detectan cantidades crecientes de protamina y decrecientes de histonas. Coincidiendo con esta transición nucleohistona-nucleoprotamina, las histonas resultan hieracetiladas y se da un incremento en la biosíntesis y niveles de poliaminas. Experimentos "in vitro" indican que la protamina galina es capaz de desensamblar totalmente a las histonas de nucleosomas a una relación arg./ nucleótido dentro del rango fisiológico. A través de clonar y secuencias parte del gen de la protamina galina, se ha determinado la secuencia de la región 3' del gen y parte de la secuencia de la región C-terminal codificante. Existen 2 poblaciones de ARN mensajero codificante para la galina (460 y 480 bases aproximadamente) siendo la población de 460 bases mayoritaria en las espermátidas alargadas.

Progresividad de los efectos del glutamato en el sistema nervioso central: Aspectos experimentales y clínicos

Tue, 12 Apr 2011 13:25:32 GMT

Progresividad de los efectos del glutamato en el sistema nervioso central: Aspectos experimentales y clínicos Rodríguez Allué, Manuel José DE LA TESIS:

Una de las consecuencias de los avances científicos y tecnológicos del ultimo siglo es el aumento de esperanza de vida en las sociedades modernas lo que, en términos demográficos, se traduce en un incremento en la media de edad de la población. Sin embargo, este envejecimiento progresivo comporta una mayor incidencia en la sociedad de enfermedades que se manifiestan a edades avanzadas, destacando las que afectan al sistema nervioso central como la enfermedad de Alzheimer o la de Parkinson. El dramático incremento en la incidencia de este tipo de enfermedades se ha traducido en una sensibilización social frente a ellas, así como en un creciente interés en el estudio de los procesos neurodegenerativos asociados a la edad y en su posible tratamiento.

La etiología de la muerte neuronal en los procesos de neurodegeneración continúa siendo un enigma por descifrar pero cada vez se sabe más acerca de las causas y trastornos que la envuelven. Un factor que parece estar implicado directamente en estos procesos es el glutamato, el neurotransmisor excitador mayoritario del sistema nervioso central. La paradoja de ésta molécula estriba en que a pesar de estar implicada en procesos fisiológicos normales como el aprendizaje, la memoria o la construcción de conexiones sinápticas durante el desarrollo, también puede ser tóxica para las neuronas. El glutamato juega un papel central en muchos procesos neurodegenerativos y está implicado en patologías tan diversas como la corea de Huntington, la epilepsia, el daño cerebral isquémico o la enfermedad de Alzheimer. El modo mediante el que el glutamato ejerce su función tóxica consiste en la sobreactivación de sus receptores sinápticos, provocando una serie de fenómenos patológicos que llevan a la muerte de la neurona y que son conocidos con el nombre de excitotoxicidad. El mecanismo por el que todo esto sucede es todavía objeto de estudio.

Dentro de este marco, los objetivosprincipales sobre los que se fundamenta el trabajo aquí expuesto eran:

- Caracterizar en términos histológicos, bioquímicos y funcionales la lesión excitotóxica de la rata creada en la vía septohipocampal por la microinyección en el septo medio de un agonista de los receptores del glutamato (el ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilsoxazol-4-propiónico, o AMPA) y comparar los efectos provocados en función de la dosis administrada con los que aparecen en función del tiempo postlesión transcurrido.

- Bajo las condiciones de neurodegeneración seleccionadas, estudiar in vivo las respuestas adaptativas de los sistemas de activación e inhibición hipocampales controlados por los núcleos de la región septal para así establecer la relevancia de cada sistema en este modelo animal.

- De forma paralela y en otro modelo animal de aprendizaje y memoria en el que previamente se habían caracterizado variaciones de los receptores hipocampales del glutamato, nos propusimos estudiar el origen celular del aumento de receptores AMPA asociados al deterioro cognoscitivo provocado por el envejecimiento.

- Investigar la posible relación entre la vulnerabilidad humana a la hipoxiaisquemia durante el periodo perinatal, la calcificación cerebral en el mismo periodo y su evolución, con el fin de establecer posibles paralelismos con la lesión excitotóxica inducida en nuestro modelo en diferentes condiciones de dosis y tiempo.

- Analizar los mecanismos moleculares que puedan estar interrelacionados para dar lugar tanto a la formación de precipitados intracelulares de calcio como a la progresividad del proceso neurodegenerativo.

Mecanismos adrenérgicos en la evacuación del humor acuoso

Tue, 12 Apr 2011 13:25:32 GMT

Mecanismos adrenérgicos en la evacuación del humor acuoso Gasull Casanova, Xavier DE LA TESI

Uno de los fármacos que se sigue utilizando en el tratamiento del glaucoma es la EPI, debido a su acción hipotensora (I lOP). Los efectos de la EPI han sido estudiados en diferentes preparaciones tanto in vitro como in vivo y se ha descrito en detalle su mecanismo de acción a nivel de la formación del humor acuoso. Sin embargo, se desconoce su mecanismo de acción sobre la evacuación del humor acuoso. Es necesario, por tanto, estudiar los efectos de la EPI sobre la evacuación del humor acuoso y caracterizar los mecanismos celulares específicos activados por la EPI.

A pesar de que se han identificado diferentes tipos de receptores adrenérgicos en las células trabeculares no se conocen los subtipos farmacológicos implicados. Cabe suponer que cada subtipo de receptor adrenérgico (ai, ai, ßi, ß2, ßa, ß4) puede tener funciones diferentes en la regulación del la evacuación del humor acuoso. Por ello, deben establecerse los subtipos de receptores adrenérgicos presentes en las células trabeculares y cuáles de éstos están implicados en la evacuación del humor acuoso.

La activación de los receptores adrenérgicos de las células trabeculares debe, al igual que en otros tipos celulares, iniciar diferentes vias de señalización intracelular. Queda por estudiar en estas células, que vías intracelulares se activan por los adrenérgicos, que modificaciones producen sobre la facilidad de evacuación del humor acuoso, y cuáles son los segundos mensajeros implicados.

Se ha establecido que la estimulación adrenérgica modula, en las células trabeculares y en otros tipos celulares, los niveles de AMPc, aunque se desconocen los efectos de este segundo mensajero sobre evacuación del humor acuoso. En consecuencia, deben caracterizarse los efectos del AMPc sobre la facilidad de evacuación del humor acuoso.

Caracterització proteòmica i d'espermatozoides humans en pacients infèrtils i controls / Proteomic and molecular characterization of human spermatozoa in infertile patients and controls

Tue, 12 Apr 2011 13:25:30 GMT

Caracterització proteòmica i d'espermatozoides humans en pacients infèrtils i controls / Proteomic and molecular characterization of human spermatozoa in infertile patients and controls De Mateo López, Sara The knowledge of the proteins that are present in the spermatozoa is an essential step towards the comprehension of their normal function and their potential alterations associated to infertility. Although many studies have been performed in human male infertility, many of the causes still remain unknown, partly due to the fact that the proteins and the mechanisms involved in spermiogenesis and in sperm function are not known in detail. Therefore, the proteomic study of the human spermatozoa through mass spectrometry is relevant both, towards improving our fundamental knowledge and the mechanisms involved in the normal sperm physiology, as well as towards a better understanding of the male infertility. This doctoral thesis has contributed to the identification of the human sperm proteome through two-dimensional gels and mass spectrometry. Moreover, it has identified new correlations between the abundance of certain proteins and the seminal parameters related to male infertility such as the protamine content, DNA damage and sperm motility giving rise to the identification of potential diagnostic markers. In addition, the potential correlations between the protamine content and the presence of the protamine 2 precursors in the sperm cell from patients and the assisted reproductive outcomes have also been studied. Another point studied in the present thesis has been the determination, through immunofluorescent techniques, of the presence of nucleosomes and other proteins with a potential epigenetic function present in spermatozoon fractions selected through density gradients. Moreover, a protocol for the isolation of human sperm nuclei has been implemented to further identify, through mass spectrometry, minor nuclear proteins that may be important for normal sperm functioning or the embryo development.

KEYWORDS: Spermatozoon, Protamines, Proteome, Male infertility, Epigenetics; El coneixement de les proteïnes que formen part de l'espermatozoide és un aspecte clau per comprendre el seu funcionament normal i les seves possibles alteracions associades a la infertilitat. Tot i la gran quantitat d'estudis sobre la infertilitat humana masculina, moltes de les seves causes es troben encara desconegudes degut, en part, a que les proteïnes i els mecanismes implicats en l'espermatogènesi i la funció de la cèl·lula espermàtica no es coneixen en detall. Per tant, l'estudi proteòmic de l'espermatozoide humà a través de l'espectrometria de masses és rellevant tant pel coneixement d'aspectes fonamentals com pel millor enteniment de la infertilitat masculina. Aquesta tesi doctoral ha contribuït a la identificació del proteoma de l'espermatozoide humà a través de gels bidimensionals i espectrometria de masses. Addicionalment s'han identificat relacions entre la abundància de certes proteïnes i paràmetres seminals relacionats amb la infertilitat masculina tals com el contingut de protamines, el dany al DNA o la motilitat dels espermatozoides donant lloc a la identificació de potencials marcadors diagnòstics. A més, s'han buscat les possibles correlacions entre el contingut de protamines i la presència de precursor de protamina 2 als espermatozoides de pacients amb els resultats de reproducció assistida. Un altre aspecte tractat ha estat la determinació, mitjançant tècniques immunofluorescents, de la presència de nucleosomes i altres proteïnes presents a fraccions d'espermatozoides seleccionades a través de gradients de densitat amb una funció potencial epigenètica. A més, s'ha implementat un protocol per aïllar nuclis d'espermatozoides humans per tal de poder identificar a través d'espectrometria de masses proteïnes nuclears minoritàries possiblement importants pel desenvolupament embrionari i el funcionament de l'espermatozoide no patològic.; RESUMEN EN CASTELLANO:

El conocimiento de las proteínas que forman parte del espermatozoide es un aspecto clave para la comprensión de su funcionamiento normal i de sus posibles alteraciones asociadas a la infertilidad. A pesar de la gran cantidad de estudios sobre la infertilidad humana masculina, muchas de sus causas se encuentran aún desconocidas. Esto es debido, en parte, a que las proteínas y los mecanismos implicados en la espermatogénesis i la función de la célula espermática no se conocen en detalle. Por lo tanto, el estudio proteómico del espermatozoide humano a través de la espectrometría de masas es relevante tanto para el conocimiento de aspectos fundamentales como para el mejor entendimiento de la infertilidad masculina. Esta tesis doctoral ha contribuido en la identificación del proteoma del espermatozoide humano a través de geles bidimensionales i espectrometría de masas. Adicionalmente se han identificado relaciones entre la abundancia de ciertas proteínas i parámetros seminales relacionados con la infertilidad masculina tales como el contenido de protaminas, el daño en el DNA o la movilidad de los espermatozoides dando lugar a la identificación de potenciales marcadores diagnósticos. Además, se han buscado posibles correlaciones entre el contenido de protaminas i la presencia de precursor de protamina 2 en los espermatozoides de pacientes con los resultados de reproducción asistida. Otro aspecto tratado ha sido la determinación, mediante técnicas inmunofluorescentes, de la presencia de nucleosomas i otras proteínas presentes en fracciones de espermatozoides seleccionadas a través de gradientes de densidad con una función potencial epigenética. Además, se ha implementado un protocolo de aislamiento de núcleos de espermatozoides humanos con el objetivo de poder identificar a través de espectrometría de masas proteínas nucleares minoritarias posiblemente importantes para el desarrollo embrionario i el funcionamiento del espermatozoide no patológico.

PALABRAS CLAVE: Espermatozoide, Protaminas, Proteoma, Infertilidad masculina, Epigenética

Time course of biochemical, biomechanical, and histological changes for the assesment of inflammation and remodelling in a bleomycin-induced murine model of lung injury

Tue, 12 Apr 2011 13:25:29 GMT

Time course of biochemical, biomechanical, and histological changes for the assesment of inflammation and remodelling in a bleomycin-induced murine model of lung injury Pinart Gilberga, Mariona Las enfermedades pulmonares intersticiales difusas (EPID), constituyen un grupo variado de trastornos inflamatorios difusos de las vías aéreas inferiores causadas por inflamación, fibrosis (cicatritzación) de las paredes alveolares y grosor del espacio intersticial. Como muchas de estas EPID dan lugar a la formación de fibrosis, también se las llama fibrosis pulmonar (FP). Tanto la fisiopatología de la enfermedad como los mecanismos bioquímicos que se desencadenan son poco conocidos. La lesión pulmonar inducida por fármacos como la bleomicina, es heterogénea y rápida en su inicio, con una fase de alveolitis inicial caracterizada por la presencia de edema intersticial y de infiltración de células inflamatorias como los neutrófilos, macrófagos y limfocitos, que a su vez conducirán a una proliferación de los fibroblastos. Después hay una segunda fase, más fibrótica, que se caracteriza por la deposición de colágeno y de otros componentes de la matriz extracelular que resultarán en una distorsión de la arquitectura pulmonar.

Como creemos que los parámetros biomecánicos pueden ser de gran utilidad en el seguimiento de las estrategias terapéuticas así como también del conocimiento general de la historia natural de las EPID, queremos saber cuál es la influencia de la respuesta inflamatoria en las diferentes fases evolutivas de la FP sobre la biomecánica del parénquima. Por eso utilizamos un modelo murino de lesión pulmonar de dos semanas o de un mes de durada, inducida por dosis única o dosis repetidas de bleomicina respectivamente.

En el primer trabajo, utilizamos tiras de paánquima pulmonar para el estudio biomecánico (elastancia, resistencia (R0) e histeresividad (mi(0)) los días 3, 7 y 15 después de una instilación única sub-letal de bleomicina. Se analizaron también el impacto de la inflamación pulmonar (mieloperoxidasa (MPOL), índice de inflamación pulmonar (LI) y el contenido de agua pulmonar (WL)) y de la remodelación pulmonar (hidroxiprolina (HPL) y fibras elásticas) en los mismos días en los que se hizo el estudio mecánico. Los hallazgos más significativos sugieren que este modelo proporciona nuevas evidencias para la comprensión de la fisiopatología de la lesión pulmonar inducida por bleomicina y la relación entre los cambios inflamatorios y la mecánica del tejido pulmonar. Los parámetros disipativos del tejido pulmonar se vieron modificados después de la lesión: tanto R0 como mi(0) estuvieron correlacionadas con la MPOL, WL y LI. No encontramos correlaciones significativas entre HPL y los parámetros mecánicos, pero si de la elastina con mi(0) i el grosor de la paret alveolar.

En el segundo trabajo, usamos tiras de parénquima pulmonar para hacer el estudio mecánico el día 28 después de una instilación única sub-letal o después de tres dosis de bleomicina cada dos semanas. Se analizó el impacto de la inflamación pulmonar (MPOL y LI) y de la remodelación pulmonar (fibras de colágeno) en los mismos días en que se hizo el estudio mecánico. En el modelo de tres dosis repetidas por bleomicina se halló una infiltración de células inflamatorias, un incremento de la MPO y de las fibras de colágeno, la presencia de focos fibroblásticos y un aumento tanto de la elastancia (H) como de la amortiguación tisular (G), 28 dáas después de la última dosis. Sin embargo, en el modelo de dosis única, el colágeno aumentó sin que hubiesen cambios significativos en la mecánica pulmonar.

Caracterización de la entrada de Ca2+ "capacitativa" en células trabeculares

Tue, 12 Apr 2011 13:25:29 GMT

Caracterización de la entrada de Ca2+ "capacitativa" en células trabeculares Abad Adán, Elena El glaucoma es una de las principales causas de ceguera parcial o total e irreversible en el mundo. Los avances en su estudio revelan la compleja naturaleza multifactorial de la enfermedad que consiste finalmente en un daño del nervio óptico (neuropatía).

El incremento de la presión intraocular (PIO) prolongado en el tiempo es uno de los factores de riesgo más significativo y reconocido para el desarrollo de esta enfermedad. Este incremento puede causar lesiones en el nervio óptico por deformación mecánica y/o cambios fisiopatológicos en una zona de la retina dónde se sitúan las células ganglionares del nervio. La PIO es resultado del balance entre la producción y drenaje del humor acuoso. El humor acuoso es un fluído derivado de plasma sanguíneo, producido en los procesos ciliares, que baña la cámara anterior del ojo para alimentar sus estructuras avasculares y mantener la tensión mecánica adecuada del globo ocular, y es drenado, principalmente, a través de la malla trabecular o trabéculo. Se sabe que el incremento de la contracción de este tejido implica una disminución en la facilidad de drenaje del humor acuoso y un aumento de la PIO.

La presencia incrementada de endotelina-1 (ET-1), potente vasoconstrictor, en humor acuoso de pacientes glaucomatosos plantea algunas cuestiones que abordamos en este trabajo de tesis doctoral. Estas sustancias (endotelina-1, bradiquinina) son agonistas de receptores acoplados a proteína Gq que activan la vía de la fosfolipasa C (vía PLC- inositol trifosfato y diacilglicerol) y podrían tener un efecto contráctil, también, sobre la malla trabecular dado que activan la depleción de Ca2+ intracelular.

El objetivo principal de este trabajo de tesis doctoral ha sido identificar y caracterizar un tipo de corriente de entrada de calcio extracelular (vía principal de entrada de calcio en células no excitables), llamada corriente 'capacitativa' de Ca2+ o dependiente del vaciado de Ca2+ de los depósitos intracelulares (ICCE o ISOC) y su posible implicación en la función de contracción/relajación de las células trabeculares y en consecuencia del tejido.

Identificamos distintos tipos de corrientes capacitativas de Ca2+ en cultivos primarios de células trabeculares en modelo bovino y humano, tras el estímulo con sustancias vasoconstrictoras y tapsigargina. Para la caracterización farmacológica usamos bloqueadores típicos de la ICCE (2-APB, lantánidos, SKF96365) y registramos la evolución de la activación de ICCE mediante registros electrofisiológicos, testeando nuevamente bloqueadores conocidos de este tipo de corrientes. Observamos cómo en algunos casos las corrientes capacitativas son selectivas para el Ca2+ y en otros (vía PLC), en cambio, aparecían formas de corrientes catiónicas no selectivas.

Detectamos mediante western blot la presencia de proteínas de canal tipo TRPC (TRPC1 y TRPC4) que forman canales catiónicos en membrana y pueden ser activados vía PLC, posibles mediadores de la ICCE en células trabeculares.

La técnica de microscopía de tracción permitió estudiar la evolución de la contracción de la célula por estímulo con sustancias vasoconstrictoras. Obtuvimos medidas cuantitativas y la distribución de fuerzas en la célula durante la contracción. Estos resultados revelaron que la contracción inducida por estas sustancias depende primeramente de la depleción de Ca2+ intracelular y curiosamente, el Ca2+ extracelular regula, disminuyendo, la intensidad de esa contracción.

Mostramos en este trabajo, la existencia de la ICCE en células trabeculares y sugerimos el papel de esta vía de entrada de Ca2+ como señal autoreguladora del proceso de contracción celular y su posible efecto en la función evacuadora del tejido.; High concentrations of endothelin-1 (ET-1), one of the most potent vasoconstrictor peptide, has been found in the aqueous humor of glaucomatous eyes. It is said that vasoconstrictor substances as ET-1 or bradykinin could induce contraction of trabecular meshwork tissue (TM) and decreases the aqueous humour outflow facility increasing the intraocular pessure (IOP) and the risk of glaucoma. The aim of this study is the calcium signalling, mainly, the characterization of the calcium influx/entry in these cells, the identification of capacitative calcium entry (ICCE) or, also called, store-operated calcium entry (ISOC) in trabecular cells and their role on cell contraction.

We found these currents in cell culture of bovine and human trabecular cells and in a human cell line, too, using fluorescence techniques and electrophysiology recordings. They are stimulated by the intracellular Ca2+ depletion from stores via IP3 (bradykinin, endothelin) and blocking the Ca2+-pump of endoplasmic reticulum (thapsigargin). These currents are blocked or inhibited by certain lanthanids ions, 2-APB or SKF96365.

Western blots showed the presence of certain members of the Transient Receptor Potential (TRP) channels subfamily C (TRPC1 and TRPC4). The pharmacology of inhibition of the Ca2+ influx suggests the TRPC channels and store-operated calcium channels as mediators.

The measurements of cell traction evolution by traction microscopy maps stimulating with vasoconstrictor substances were useful to determine store-operated Ca2+ entry may not be necessary for cell contraction in TM cells but may contribute to modulate cell contractility and so, the aqueous humour outflow facility.

Caracterització proteòmica de l'espermatozoide humà. Proteïnes diferencials trobades en pacients astenozoospèrmics

Tue, 12 Apr 2011 13:25:28 GMT

Caracterització proteòmica de l'espermatozoide humà. Proteïnes diferencials trobades en pacients astenozoospèrmics Martínez Heredia, Juan La infertilitat és una malaltia que afecta a un 15% de les parelles en edat reproductiva. En la meitat dels casos, el problema té un origen masculí. Però, tot i els avenços existents en la fisiologia de la reproducció, encara hi han un 10% de parelles amb una infertilitat d'origen desconegut.
Així, aprofitant les noves tecnologies existents tal com la proteòmica (gels 2D, anàlisis per MS/MS, etc.) es va decidir realitzar un estudi de l'espermatozoide humà per tal d'aprofundir en el coneixement de les proteïnes implicades en la fertilització.
Primer, es va realitzar un estudi per descriure part del proteoma de l'espermatozoide humà. Es van descriure 98 proteïnes, localitzant-les en un mapa 2D. Un 22% d'aquestes proteïnes es van descriure per primera vegada com a presents en l'espermatozoide humà. D'un 11% no se'n coneix la funció, mentre que un 23% tenen una funció relacionada amb la transcripció, la síntesi proteica o l'intercanvi proteic. Aquesta dada és sorprenent ja que, fins fa poc, es creia que l'únic objectiu de l'espermatozoide era portar el material genètic masculí fins l'oòcit femení. La resta de proteïnes tenen una funció que s'engloba dintre d'aquestes categories: 23% relacionades amb la producció d'energia; 11% relacionades amb el cicle cel·lular, l'apoptosis i l'estrès oxidatiu; 10% relacionades amb el citoesquelet, el flagel i el moviment cel·lular; 9% relacionades amb la transducció de senyal; 7% relacionades amb el reconeixement cel·lular; i, per últim, un 6% té una funció relacionada amb el metabolisme.
D'aquestes 98 proteïnes (amb 3 proteïnes noves d'un altre estudi realitzat al laboratori), es va fer un estudi comparant la seva abundància relativa entre pacients astenozoospèrmics i controls (donants de semen). D'aquesta comparació, es van trobar 17 proteïnes amb una abundància relativa diferent entre pacients i donants. Aquestes proteïnes són ACTB, ANXA5, COX6B, H2A, PIP i el seu precursor,i dos punts corresponents a S100A9; totes aquestes es troben disminuïdes en els pacients. La resta de proteïnes son la forma precursora de CLU, DLD, FH, SEMG1, a més d'HSPA2, IMPA1, PSMB3, TEX12 i un punt que conté dos proteïnes: MPST i la forma precursora d'ECH1. Totes aquestes proteïnes es troben augmentades en pacients.
La majoria d'aquestes proteïnes es poden agrupar en tres grans grups: proteïnes relacionades amb la producció d'energia (COX6B, DLDpre, FHpre i ECH1pre), amb l'estructura i el moviment (ACTB, PIP i PIPpre, H2A i SEMG1), i senyalització cel·lular i regulació ( ANXA5, S100A9 i IMPA1).
A més, es va realitzar un estudi paral·lel estudiant les mateixes 101 proteïnes, però amb pacients normozoospèrmics (sense cap causa aparent d'infertilitat) i donants de semen de fertilitat probada. Donat el caràcter tan exclusiu de les mostres, nomès es van poder comparar sis pacients versus 5 donants. Tot i això, es van trobar dos proteïnes amb diferències a la seva abundància relativa. Aquestes proteïnes són la PDIA3 i la TEX12. Aquestes dades, però, no es poden considerar com a definitives, ja que el valor obtingut per a aquestes mostres de p (p<0.001) ens indica que un de cada 100 resultats pot ser degut a l'atzar. Així, una d'aquestes proteïnes pot ser un fals possitiu.
Amb aquests valors quantitatius, es va realitzar una agrupació no dirigida per tal de veure si aquestes proteïnes ens agrupaven les mostres segons el seu fenotip. Per a la comparació "astenozoospèrmics vs donants", l'agrupació va ser possitiva; en una branca de l'arbre resultant, teníem tots els pacients i, a l'altra, tots els donants.
Per últim, es va posar a punt la metodologia DIGE en mostres d'espermatozoides humans. Tot i que es necessitaran més dades per a acabar d'ajustar el procediment, els primers resultats són encoratjadors.; Infertility is a disease that affects 15% of couples at reproductive age. In about a half, the problem has a male origin. Conventional 1-DE has in the past provided a wealth of information concerning the major sperm proteins. However, so far there are relatively few reports exploiting the potential of the present proteomic tools to identify and to study additional yet-unidentified important proteins present in human spermatozoa. In this work, 2-DE of proteins from spermatozoa led to the identification of 98 different proteins. The function of these proteins turned out to be energy production (23%), transcription, protein synthesis, transport, folding and turnover (23%), cell cycle, apoptosis and oxidative stress (10%), signal transduction (8%), cytoskeleton, flagella and cell movement (10%), cell recognition (7%), metabolism (6%) and unknown function (11%). As many as 23% of the proteins identified have not been previously described as being expressed in human spermatozoa.
Also, asthenozoospermia is one of the most common findings present in infertile males, but its aetiology remains unknown in most cases. Present proteomic tools now offer the opportunity to identify proteins which are differentially expressed in asthenozoospermic semen samples and potentially involved in infertility. In this work, we compared the expression of 101 sperm protein spots in 20 asthenozoospermic samples to that of 10 semen donor controls using two-dimensional proteomic analysis. This results in seventeen protein spots, that have been identified at different amounts in the asthenozoospermic samples compared with controls. These are cytoskeletal actin-B, annexin-A5, cytochrome C oxidase-6B, histone H2A, prolactin-inducible protein and precursor, calcium binding protein-S100A9 (2 spots), clusterin precursor, dihydrolipoamide dehydrogenase precursor, fumarate hydratase precursor, heat shock protein-HSPA2, inositol-1 monophosphatase, 3-mercapto-pyruvate sulfurtransferase/dienoyl-CoA isomerase precursor, proteasome subunit-PSMB3, semenogelin 1 precursor and testis expressed sequence 12. The detected amount of these proteins enabled the grouping of asthenozoospermic sperm samples in an unsupervised clustering analysis. So, in conclusion, we have identified several proteins present at different amount in asthenozoospermic sperm samples. These proteins could be candidates towards the development of diagnostic markers, and open up the opportunity to gain further insight into the pathogenic mechanisms involved in asthenozoospermia.

Estudio molecular y citogenético del carcinoma urotelial: Detección temprana de la enfermedad y de su diseminación

Tue, 12 Apr 2011 13:25:27 GMT

Estudio molecular y citogenético del carcinoma urotelial: Detección temprana de la enfermedad y de su diseminación Marín Aguilera, Mercedes En España se diagnostican cada año unos 12.000 nuevos casos de carcinoma urotelial (CU). Más concretamente, en Cataluña este tumor representa entre un 9,9 y un 11,7% del total de tumores malignos, dando lugar a una mortalidad cáncer específica del 5,2% en el sexo masculino. Aunque en la mayoría de casos la enfermedad se acaba detectando en su fase más inicial, la alta frecuencia de recidivas y la posibilidad de progresión y diseminación debido a la agresividad de algunas formas limitarán la supervivencia del paciente.

El método estándar para la detección y seguimiento del CU se basa en la combinación de la citología urinaria y la cistoscopia. Sin embargo, la primera de estas técnicas presenta baja sensibilidad en la detección de tumores de estadio inical y bajo grado, mientras que la segunda es una técnica invasiva que además no es lo suficientemente sensible para detectar todas las lesiones de crecimiento plano.

Por otro lado, las técnicas histológicas convencionales para el diagnóstico de la diseminación linfática del CU no son lo suficientemente sensibles ya que alrededor del 50% de pacientes sometidos a cirugía radical con linfadenectomía N0, fallecen antes de los 5 años post-cirugía. Estos datos sugieren que existe una diseminación tumoral antes de la cirugía que no es detectada mediante estas técnicas histológicas.

Debido a la elevada prevalencia y gravedad de la enfermedad, a la invasividad de las pautas utilizadas en su diagnóstico y a la falta de métodos de estadiaje refinados, el desarrollo de nuevos sistemas diagnósticos que permitan una detección temprana tanto del CU inicial como de sus recidivas y de su diseminación es esencial para mejorar la calidad de vida y el pronóstico de los pacientes con esta enfermedad.

En el presente trabajo se ha evaluado la utilidad de la técnica "fluorescence in situ hibridization" (FISH) en el diagnóstico no invasivo del Cu de bajo estadio, en el diagnóstico no invasivo del CU localizado en el tracto urnario superior (TUS) y en el pronóstico de pacientes con CU de alto riesgo de recurrencia y progresión, tratados mediante inmunoterapia con el bacilo de Calmette Guérin (BCG). Por otro lado se ha intentado detectar la presencia de micrometástasis linfáticas así como de diseminación sanguínea del CU, mediante marcadores moleculares en pacientes sometidos a cistectomía y linfadenectomía radical.

Los resultados obtenidos indican que la técnica FISH basada en los cromosomas 3, 7, 9 y 17 presenta mayor sensibilidad que la citología urinaria, y una similar especificidad equivalente en la detección del CU no músculo-infiltrante, así como en la detección del CU localizado en el TUS. La naturaleza no invasiva de este ensayo así como su elevada sensibilidad y especificidad podrían contribuir a mejorar el actual diagnóstico/seguimiento del CU en estas localizaciones. Otro resultado interesante fue que los pacientes con un resultado positivo de FISH tras la terapia BCG tienen mayor probabilidad de presentar una recurrencia del tumor. Así, la técnica FISH parece ser útil en el seguimiento de los pacientes con un tumor no músculo-infiltrante de alto riesgo de recurrencia y progresión sometidos a terapia BCG. Finalmente, se observó que la utilización de marcadores moleculares permite mejorar la sensibilidad del análisis histopatológico en la detección de la diseminación linfática tumoral y que la linfadenectomía juega un importante papel curativo eliminando la enfermedad microdiseminada. Sin embargo, el análisis de la expresión génica en muestras de sangre periférica no es adecuado para seleccionar a aquellos pacientes que desarrollarán metástasis detectables clínicamente, aunque sí permite distinguir entre pacientes con CU de controles sanos.; Cystoscopy and cytology are the standard methods to detect and monitor urothelial carcinoma (UC). Cystoscopy is an invasive technique (especially to visualize the upper urinary tract or UUT) that has a high sensitivity, except in flat malignancies. Cytology has the advantage of being non-invasive with a high specificity, but it lacks sensitivity and produces high rates of suspicious cases, especially for low-stage and low-grade tumors. Another weak point in the clinical management of UC is the fact that current methodologies to detect disseminated UC lack sensitivity.

The aims of this study were: (1) to evaluate the performance of a multiprobe FISH (fluorescence in situ hybridization) assay for non-invasive detection of superficial UC in the bladder, in comparison to urinary cytology, (2) to assess the clinical utility of FISH as a non-invasive method for diagnosing and monitoring UC in UUT, (3) to evaluate the use of FISH for determining the response of patients with high-risk superficial bladder tumour (HRSBT) to bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy, (4) to identify and test potential mRNA markers of UC dissemination in lymph nodes, and to compare the performance of selected markers with patients' clinical outcome, and (5) to test the efficiency of such mRNA markers in detecting and monitoring UC haematogenous dissemination.

According to our results, FISH assay for chromosomes 3, 7, 9, and 17 has higher sensitivity than cytology and a similar specificity in the detection of superficial UC and UC at UUT, which could be useful for reducing some cystoscopies in the follow-up of these patients. Moreover, a high percentage of positive pre-BCG FISH results were obtained, suggesting the need for adjuvant therapy in patients with HRSBT after the transurethral resection. In addition, patients with a positive post-BCG FISH result were more likely to relapse after therapy. Thus, FISH appears to be useful for the surveillance of patients with HRSBT following BCG therapy.

Finally, using molecular markers it was possible to improve the sensitivity of LN histologic analysis. Also this methodology allowed distinguishing between UC patients and controls. However, despite its high sensitivity, it was not possible to monitor UC haematogenous dissemination.

Role of substrate attachment in cell mechanics: Implications in neutrophils and microvascular endothelial cells.

Tue, 12 Apr 2011 13:25:26 GMT

Role of substrate attachment in cell mechanics: Implications in neutrophils and microvascular endothelial cells. Roca-Cusachs Soulere, Pere EN CATALÀ DE LA TESI DOCTORAL

"Importància de l'adhesió al substrat en la mecànica cel·lular: Implicacions en neutròfils i cèl·lules endotelials microvasculars".

En organismes multicel·lulars complexos com els humans, el comportament de cèl·lules individuals ve dictat en gran mesura per les interaccions amb la matriu extracel·lular (ECM). La ECM és una xarxa de proteïnes filamentoses (com ara col·lagen, fibronectina o laminina) que proporciona un substrat físic per l'adhesió cel·lular. L'adhesió a la ECM està mitjançada bàsicament per les integrines, que són un tipus de proteïnes responsable de la transmissió a l'interior de la cèl·lula tant de senyals bioquímiques com de forces. El grau d'adhesió entre cèl·lules i el seu substrat, i la forma cel·lular que en resulta, han estat reconeguts com un factor determinant en l'expressió gènica i proteica i en funcions cel·lulars com la diferenciació o la proliferació. Remarcablement, s'ha determinat que aquesta regulació de la funció cel·lular depèn de la forma cel·lular independentment del grau d'enllaç entre integrines i ECM, suggerint que algun factor apart de la senyalització bioquímica és el responsable de llegir la informació associada amb l'adhesió cèl·lulasubstrat i de provocar una certa resposta en la funció cel·lular.

Un factor que podria ser responsable de detectar l'adhesió cèl·lula-substrat és la mecànica cel·lular. Certament, s'ha vist que un increment en l'extensió cel·lular (àrea que ocupa una cèl·lula sobre un substrat) està associat amb un increment de la polimerització d'actina, de la fosforil·lació de la cadena lleugera de la miosina (MLC), de la duresa cel·lular i de la contractilitat. Les cèl·lules podrien doncs respondre a canvis en la forma cel·lular incrementant la tensió mecànica del citoesquelet i activant vies de mecanotransducció, probablement involucrant la familia de GTPases Rho. Tanmateix, aquesta hipòtesi no ha estat directament verificada, i altres paràmetres (com ara la forma del nucli) podrien estar involucrats. Addicionalment, encara no existeix un estudi global que analitzi com l'adhesió al substrat (i la forma cel·lular resultant) afecta la mecànica de les cèl·lules, i quines implicacions té això en la funció cel·lular.

L'objectiu d'aquesta tesi ha estat l'estudi del paper de l'adhesió al substrat en la mecànica cel·lular per dos tipus cel·lulars relacionats amb el sistema respiratori, que constitueix l'àrea d'interès del nostre grup de recerca. El primer d'aquests tipus cel·lulars ha estat els neutròfils, un tipus de cèl·lules generalment no adherents però que s'activen i s'endureixen en contacte amb cèl·lules endotelials o amb un substrat com el vidre. La mecànica de neutròfils en els seus estats passiu i activat juga un paper clau a l'hora de determinar la funció dels neutròfils en resposta a estímuls inflamatoris. Tanmateix, actualment no està clar si la mecànica de neutròfils es correspon a la d'una gota líquida o si exhibeix esmorteïment estructural. Els canvis induïts per l'activació en la mecànica de neutròfils tampoc estan clars. Per clarificar aquestes qüestions, es va mesurar la reologia de neutròfils en funció de l'adhesió al substrat, posant èmfasi en les seves implicacions en la funció d'aquestes cèl·lules en els capil·lars de la microvasculatura dels pulmons. El segon tipus cel·lular estudiat va ser el de les cèl·lules endotelials, també provinents de capil·lars de la microvasculatura dels pulmons. En aquest cas, el treball es va orientar a entendre com la forma cel·lular (controlada a través de la tecnologia coneguda com a microestructuració o "micropatterning") afecta la mecànica i la proliferació cel·lular. La comprensió de com la forma cel·lular controla la proliferació es crucial per entendre el procés de l'aniogènesi o formació de nous vasos sanguinis, el qual es dóna essencialment durant la formació embrionària i en processos patològics com la formació de tumors. Aquest estudi ens va permetre avaluar el paper de la mecànica cel·lular en la proliferació de cèl·lules endotelials i determinar la seva importància relativa. En ambdós estudis, la mecànica cel·lular va ser avaluada mitjançant la mesura del mòdul complex elàstic G* amb microscopia de forces atòmiques (AFM) seguint un procediment ja descrit. G* proporciona informació tant sobre l'elasticitat cel·lular (duresa) com sobre la viscositat, i pot ser mesurat amb AFM per un ampli rang de freqüències. Això permet una caracterització precisa de la reologia cel·lular i una avaluació de la tensió interna del citoesquelet a través de la mesura de duresa.

Procesamiento de imágenes en SPECT cerebral: Cuantificación de estudios de neurotransmisión en el sistema dopaminérgico y registro de estudios de flujo en la epilepsia farmacorresistente

Tue, 12 Apr 2011 13:25:26 GMT

Procesamiento de imágenes en SPECT cerebral: Cuantificación de estudios de neurotransmisión en el sistema dopaminérgico y registro de estudios de flujo en la epilepsia farmacorresistente Crespo Vázquez, Cristina En el contexto de la técnica de SPECT, la simulación Monte Carlo es una herramienta que permite profundizar en el fundamento físico de la formación de la imagen, evaluando diversos aspectos que serían muy difíciles de medir experimentalmente. Monte Carlo es un método estadístico que parte del seguimiento de partículas, generadas aleatoriamente, en una distribución tridimensional. Este seguimiento se hace incluyendo toda la física implicada, modelizada con unas funciones de probabilidad para las diferentes interacciones posibles. Este método se utiliza en diversas especialidades relacionadas con la interacción radiación ionizante-materia como son la medicina nuclear, radioterapia, dosimetría y protección radiológica.

Esta herramienta se empleará en dos aplicaciones: 1) Cuantificación de estudios de SPECT de neurotransmisión y 2) Localización del foco epileptógeno en el contexto de la epilepsia farmacorresistente.

A) Cuantificación de estudios de SPECT de neurotransmisión:

El estudio de los sistemas de neurotransmisión cerebral tiene una gran importancia en el diagnóstico de enfermedades neurológicas y psiquiátricas. En concreto, la disfunción del sistema dopaminérgico presináptico está relacionado con la Enfermedad de Parkinson. La valoración visual es a menudo suficiente para valorar las imágenes del transportador de dopamina (DAT), pero una cuantificación de las imágenes permitiría hacerla menos dependiente del observador. Los valores cuantitativos están afectados por la degradación de las imágenes debido a los efectos asociados a la interacción radiación-materia, a los efectos relacionados con la respuesta del sistema colimador/detector y al efecto de volumen parcial. Para alcanzar la cuantificación exacta de estas imágenes es necesario desarrollar algoritmos de reconstrucción y métodos de corrección de cada uno de los efectos degradantes que afectan a la técnica de SPECT.
Para evaluar la fiabilidad y la exactitud de los algoritmos de reconstrucción y de los métodos de cuantificación se puede hacer uso de las técnicas de simulación Monte Carlo. Por medio de la simulación de maniquíes numérico se puede evaluar la exactitud de un método de cuantificación comparando los valores teóricos (del maniquí) con los valores calculados (en la imagen reconstruida).

B) Localización del foco epileptógeno:

Las crisis epilépticas parciales se caracterizan por presentar un origen focal y porque tienen una elevada farmacorresistencia, por lo que se plantea la búsqueda de otras alternativas terapéuticas. Una posibilidad es el tratamiento quirúrgico extrayendo el foco sin que se produzcan déficits neurológicos significativos. Por este motivo la detección y correcta localización del foco es fundamental para valorara la posibilidad de cirugía en estos pacientes. El método SISCOM permite localizar el foco mediante el registro de dos estudios de SPECT (ictal e interictal) para detectar los cambios de perfusión y esta información funcional registrarla con la imagen de resonancia magnética, que aporta el detalle estructural y así permite localización del foco detectado. La evaluación cuantitativa de los algoritmos de registro empleados en la técnica requiere el conocimiento de una transformación geométrica de referencia. Para obtener esta transformación algunos estudios emplean marcadores externos, otros marcos estereotácticos o el cálculo de la transformación geométrica a partir de los resultados de registros intermedios. Una manera de conseguir este gold standard es por medio de la simulación realista de datos de SPECT.

Inflamación de la vía aérea superior inducida por estímulos mecánicos en la apnea obstructiva del sueño

Tue, 12 Apr 2011 13:25:26 GMT

Inflamación de la vía aérea superior inducida por estímulos mecánicos en la apnea obstructiva del sueño Almendros López, Isaac El síndrome de la apnea/hipopnea del sueño (SAHS) es una enfermedad caracterizada por el colapso repetitivo de forma parcial o total de la vía aérea superior (VAS). Numerosos autores han sugerido que los daños observados en la VAS de pacientes con SAHS podrían ser provocados por el estrés mecánico provocado por fenómenos como el ronquido y los eventos apneicos. Concretamente estos estímulos mecánicos asociados al SAHS son vibración (ronquido) y presión intraluminal negativa decreciente con colapso y reapertura (eventos apneicos). Por otro lado, durante el tratamiento con CPAP, la pared nasal está sometida a una compresión que podría explicar el agravamiento y aparición de los síntomas nasales experimentados por estos pacientes.

El objetivo del primer estudio es determinar si el estímulo mecánico vibratorio asociado al ronquido induce inflamación en la VAS en un modelo en rata in vivo. La VAS de 12 ratas se canuló a nivel traqueal y se sometió a vibración (60 Hz; ± 10 cmH2O) durante 3 h con un patrón temporal consistente en 1 s de vibración seguido de 3 s sin vibración. Una segunda canulación, dirigida hacia los pulmones, permitió al animal respirar espontáneamente durante todo el experimento. En un grupo control (n=12) los animales se instrumentaron del mismo modo con la única diferencia de que no se aplicó vibración a la VAS. Mediante PCR en tiempo real, se observó un incremento significativo en la expresión de ambos mediadores proinflamatorios tras la aplicación de vibración: TNF-alpha: 6.01 veces (p = 0.005) y MIP-2: 2.38 veces (p = 0.021) respecto al grupo control. La aplicación durante 3 h de un estímulo mecánico vibratorio con las características típicas del ronquido es capaz de inducir un proceso local proinflamatorio en la VAS.

Los objetivos del segundo estudio son, desarrollar un modelo en rata que permita la aplicación intratraqueal de presión negativa intermitente capaz de inducir el colapso y reapertura de la VAS y determinar si el estímulo mecánico induce inflamación local en la VAS. La VAS de 14 ratas fue sometida a un patrón temporal de 1 s de presión negativa inspiratoria seguida de 2 s de presión positiva espiratoria durante 5 h. En un grupo control de 14 ratas, los animales fueron instrumentados similarmente pero no se aplicó estímulo mecánico. El modelo desarrollado consiguió simular el estímulo de colapso y reapertura que ocurre en la VAS de pacientes con apnea obstructiva del sueño. Después de 5 h de estímulo, mediante PCR en tiempo real se observó un incremento de expresión génica de los marcadores inflamatorios MIP-2, TNF-alpha, IL-1 y P-selectina (~ 40, 24, 47 y 7 veces, respectivamente) respecto al grupo control. Incrementos similares se observaron en la expresión génica del tejido de paladar blando. Estos resultados podrían explicar la inflamación observada en la VAS de los pacientes con apnea obstructiva del sueño.

El objetivo del tercer estudio fue demostrar si la aplicación no invasiva de CPAP nasal es un estímulo mecánico suficiente para inducir una respuesta inflamatoria local. 32 ratas macho de la cepa Sprague-Dawley (250-300 g) distribuidas en 4 grupos fueron sometidas a CPAP nasal (10 cmH2O) y control durante 3 h y 5 h. Tras la aplicación de CPAP nasal durante 5 h se observó un incremento (p=0.006) en el porcentaje de neutrófilos presente en la mucosa nasal (3.51 %) respecto al grupo control (1.12 %). Por otro lado, mediante PCR en tiempo real se observó un incremento de los mediadores inflamatorios MIP-2 (2.28 veces; p=0.034) tras 3h de aplicación de CPAP nasal respecto al grupo control y 5.56 veces; p=0.002) tras 5h. La inflamación generada tras la aplicación de CPAP nasal podría explicar la aparición y/o agravamiento de los síntomas riníticos observados en los pacientes tratados con esta técnica terapéutica.

Study of viscoelasticity and adhesion of human alveolar epithelial cells by atomic force microscopy. The importance of probe geometry

Tue, 12 Apr 2011 13:25:25 GMT

Study of viscoelasticity and adhesion of human alveolar epithelial cells by atomic force microscopy. The importance of probe geometry Rico Camps, Félix During the last century, cellular biology has been mostly assessed from the biochemical point of view: studying how biochemical stimuli modify the biochemical composition of living cells. However, most of the cells that form our body constantly exert or are subjected to mechanical forces. Muscle cells exert forces during contraction, vascular endothelial cells are subjected to shear forces due to blood stream, and pulmonary cells resist cyclic deformations due to spontaneous breathing. Therefore, it appears reasonable that mechanical forces play an important role in determining cell structure, composition, and function. The continuous increase in works relating mechanical properties of cells with cellular function has shown that mechanics are as important as biochemistry at the cellular level. Even the high development of nanotechnology, techniques such as atomic force microscopy (AFM) still present important limitations when applied to biological systems. The general aim of this thesis was to improve and apply AFM methods to the measurement of mechanical properties of living cells, laying especial emphasis on the probe geometry.

The studies presented in this thesis are part of the work I carried out during the last four years in the Biophysics and Bioengineering Unit at the University of Barcelona School of Medicine. The thesis can be divided into four main sections: Introduction, Aims, Experimental studies, and Conclusions. The introduction (Chapter 1) attempts to make a brief review of cellular mechanics. The specific aims are presented in Chapter 2. The first work (Chapter 3) describes the design and set-up of an AFM based system to measure the mechanical properties (viscoelasticity and adhesion) of living cells under physiological conditions. The second work (Chapter 4) describes the development and validation of a blunted pyramidal elastic model used to determine the viscoelastic properties of soft gels and living cells. The third study (Chapter 5) validates the use of FIB modified flat-ended cylindrical tips to study the mechanical properties of biopolymer gels and living cells. The last work (Chapter 6) applies the modified cylindrical cantilevers and the developed AFM system to measure elastic and adhesive properties of living cells under inflammatory conditions.

Effects of mechanical stimuli of vibration and stretch on airway epithelial cells

Tue, 12 Apr 2011 13:25:25 GMT

Effects of mechanical stimuli of vibration and stretch on airway epithelial cells Puig i Cotado, Ferranda Les cèl·lules estan exposades a diferents estímuls mecànics al llarg de la seva vida. Actualment s'accepta que les forces mecàniques juguen un paper important en funcions crítiques cel·lulars com ara la proliferació, diferenciació, mobilitat cel·lular, apoptosi, síntesi de proteïnes i DNA i expressió gènica, entre d'altres. Les cèl·lules pulmonars estan exposades a forces mecàniques derivades de la respiració, flux sanguini i tensió superficial. En concret, les cèl·lules epitelials que envolten les vies aèries estan exposades a forces de tensió i compressió durant el cicle respiratori. Per altra banda, forces anormals exercides sobre teixits pulmonars contribueixen a moltes situacions patològiques. Així, per exemple, la deformació mecànica indueix la proliferació de cèl·lules epitelials alveolars, jugant un paper important en el manteniment de la integritat de l'epiteli especialment durant processos de reparació després de dany pulmonar. Durant l'aplicació de diferents estratègies de ventilació mecànica, tractament bàsic en els pacient amb dany pulmonar agut (ALI) i la seva forma més severa, el síndrome d'afecció respiratòria aguda (ARDS), s'ha observat un augment en la producció de mediadors inflamatoris com la trombina i el trencament de la barrera alveolocapil·lar que contribueix en el dany pulmonar induït pel ventilador i en la formació d'edema pulmonar. Un altre exemple de forces mecàniques exercides sobre el teixit respiratori, i en concret en la via aèria superior, és l'induït pel ronc, el qual té lloc quan el teixit de la via aèria superior es relaxa i comença a vibrar. Aquesta situació és experimentada típicament per pacients que pateixen apnea/hipoapnea o la síndrome de resistència en la via aèria superior. Actualment hi ha evidències fisiològiques i histològiques, i estudis moleculars que exhibeixen inflamació en pacients amb trastorns respiratoris de la son.

En aquesta tesi s'ha estudiat el paper de diferents estímuls mecànics en dues condicions patològiques. En un cas s'ha estudiat com la vibració pot induir una resposta inflamatòria en cèl·lules epitelials bronquials a través de la sobreexpressió de la citoquina IL-8. Més concretament, s'ha dissenyat un novedós model experimental que ens permet tastejar si l'aplicació d'un estímul mecànic vibratori amb una freqüència i amplitud similars a les sofertes pels teixits de la via aèria superior quan es ronca és capaç d'induir una desposta inflamatòria a nivell cel·lular. L'estudi s'ha focalitzat en avaluar si la vibració dispara una resposta inflamatòria caracteritzada per la sobreexpressió d'interluquina 8 (IL-8) a través de les vies de senyalització de la proteïna kinasa activada per mitògen (MAPK), tal com suggereix quan les cèl·lules estan subjectes a una deformació del substrat. L'altre estudi s'ha centrat en estudiar com un estímul mecànic de deformació o estirament juntament amb un mediador inflamatori, en aquest cas la trombina, poden alterar les propietats mecàniques de les cèl·lules epitelials i contribuir al trencament de la barrera alveolocapil·lar agreujant la formació d'edema pulmonar

Estudi del paper de la fructosa-2,6-Bifosfat i l'enzim fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bifosfatasa en múscul

Tue, 12 Apr 2011 13:25:24 GMT

Estudi del paper de la fructosa-2,6-Bifosfat i l'enzim fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bifosfatasa en múscul Rovira Juárez, Jordi La Fru-2,6-P2 es l'activador al·lostèric més potent de l'enzim PFK-1, enzim clau en el control i regulació de la via glucolítica. El paper d'aquest metabòlit en el múscul esquelètic encara no queda molt clar. En el present estudi es presenten dos objectius; el primer és caracteritzar la concentració de Fru-2,6-P2 i el patró d'expressió de les diferents isoformes de l'enzim 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa durant el desenvolupament del teixit muscular cardíac i esquelètic, tant a nivell proteic (western blot) com a nivell de mRNA (PCR a temps real). Així com, en músculs esquelètics de contracció lenta i ràpida en l'individu adult. El segon objectiu es centra en determinar la importància de la Fru-2,6-P2 en el control de la glucòlisi muscular.

El primer objectiu es realitza mitjançant un model experimental que inclou diferents etapes del desenvolupament del cor i del múscul esquelètic de rata (Fetus de 19 dies post-concepció, 2, 5 i 10 dies post-naixement i d'estadi adult). D'aquest estudi es conclou que en l'estadi fetal la concentració de Fru-2,6-P2 en ambdós teixits està controlada per la isoforma ubiqua de l'enzim PFK-2/FBPasa-2, enzim que controla la síntesi i degradació del metabòlit. També s'ha observat com durant el desenvolupament es produeix la substitució de la isoforma ubiqua de l'enzim PFK-2/FBPasa-2 per la pròpia de cada teixit, és a dir, per la cardíaca en cor i la muscular en múscul.

Per tal de resoldre el segon objectiu s'ha dissenyat un model experimental d'electroestimulació crònica a baixa freqüència (10 Hz) en conill. El protocol provoca la contracció del múscul tibialis anterior durant 24 hores, a continuació es concedeix un període de desncas de 48 hores. Sobre aquests músculs i per tal d'analitzar la glucòlisi muscular en ells es realitza un test d'exercici emprant el mateix sistema d'electroestimulació a baixa freqüència, durant 1, 3 i 10 segons. Els músculs estimulats i descansats presenten el mateix comportament fisiològic dels músculs en estat de repòs, quan s'aplica un protocol de força i/o de fatiga.
La concentració de Fru-2,6-P2 augmenta fruit de l'electroestimulació durant 24 hores, aquest augment es manté fins i tot quan es deixa descansar al múscul fins a 48 hores. L'anàlisi de les concentracions dels metabòlits intermediaris de la glucòlisi després de 48 hores de descans reflexa una recuperació total davant del procés d'electroestimulació. Quan es determina l'estat de la via glucolítica en aquests músculs s'ha observat un augment en la utilització de la mateixa en els primers instants del test d'exercici, coincidint amb un augment significatiu de l'activitat de l'enzim PFK-1, mesurat a través del quocient Fru-1,6-P2/Fru-6-P, principal regulador de la via. Per primera vegada es demostra com un augment persistent de Fru-2,6-P2 pot jugar un paper important en la regulació de la glucòlisi muscular en els primers instants de l'exercici.

La impossibilitat d'explicar els increments persistents de Fru-2,6-P2 a través de la isoforma muscular de l'enzim PFK-2/FBPasa-2, fa plantejar l'estudi del patró d'expressió de les diferents isoformes de l'enzim per determinar si es produeix alguna substitució isoenzimàtica que permeti explicar l'increment de la concentració de Fru-2,6-P2. L'anàlisi d'expressió de les isoformes a través de PCR a temps real i western blot permet concloure que l'augment de l'expressió de la isoforma cardíaca juntament amb la disminució de l'expressió de la resta d'isoformes de l'enzim permetrien l'increment de Fru-2,6-P2 observat en el estudi.

Estudio de la fatiga muscular mediante estimulación de baja frecuencia

Tue, 12 Apr 2011 13:25:23 GMT

Estudio de la fatiga muscular mediante estimulación de baja frecuencia Maulén Arroyo, José Humberto OBJETIVO.-Caracterizar la respuesta del TA sometido a EBF por tiempo breve para estudiar la instauración de fatiga muscular y su recuperación, determinar si la fatiga es de corta o larga duración y observar qué parámetros se modifican a fin de encontrar una causa para esta fatiga y su recuperación.
MATERIALES Y MÉTODOS.-El TA de conejos hembra, New Zealand, se estimuló con electrodos implantados a ambos lados del nervio peroneo en pata izquierda, la contralateral quedó como control. El modelo contempló músculos sin estimular (control), estimulados por 20 s, 1-5-15 y 30 min, con descansos de 30 min y 3 h y, un test final de 20 s de estimulación. Se calculó IF con test de Burke, se registró amplitud de onda M, se realizó gradiente de sacarosa de RS, se valoró MDA en RS y se valoró metabolitos de vía glucogenolítica y glucolítica, además de ATP, PCr y creatina. Se calculó promedio  DE, se usó ANOVA y se fijó un P<0,05.
RESULTADOS.-Según el test de Burke los TA más fatigados fueron del grupo 15'30' (P<0,001) y no se recuperó con 3 h de descanso; la onda M tuvo una disminución de amplitud en todos los tiempos (P<0,001) y no se recuperó con 3h de descanso; según el gradiente de sacarosa el RS no experimentó daño estructural; según valores de MDA no hubo daño oxidativo en membranas de RS; la estimulación disminuyó la concentración de ATP y no se recuperó con el descanso (P<0,001); el glucógeno disminuyó (P<0,001)y sólo se recuperó con 3h de descanso; la glucosa aumenta con la estimulación y descanso (P<0,001) pero retorna a valor control con 3h de descanso; el lactato inicialmente aumenta (P<0,001) pero disminuye a nivel control con 30 min de estimulación, con el descanso retorna a valor control; el pH disminuye (P<0001) pero a los 30 min está igual que control, con el descanso recupera el valor control; la utilización del ATP iniciamente aumenta pero luego disminuye; el flujo por las vías glucogenolítica y glucolítica en principio aumenta pero luego se enlentece; los nucleótidos totales están bajos en todos los casos.
CONCLUSIONES.-La fatiga muscular provocada por la EBF se asocia fundamentalmente a la disminución de ATP provocada por una disminución de las reservas de glucógeno, bloqueo de la glucogenólisis y glucólisis y aumento de la concentración de H+. La pérdida de nucleótidos podría deberse a una transformación a IMP y degradación de este. La disminución de ATP es estímulo modulador sobre canales de K+ y Cl- (ClC-1) que se abren y permiten la salida de K+ y el ingreso de Cl- lo que provoca, en el primer caso una depolarización y en el segundo caso una hiperpolarización del sarcolema, dando origen a una disminución de la excitabilidad del sarcolema. Si el sarcolema se torna inexcitable no se abren canales de Ca2+ (DHP) de túbulo T dependientes de voltaje y canales de Ca2+ (RyR) de vesículas laterales de RS, lo cual conduce a que el Ca2+ no se libere para desencadenar la contracción muscular, por su unión a troponina C. Proponemos que el estrés metabólico provocado por la EBF tiene por consecuencia un bloqueo de la actividad bioeléctrica del sarcolema, dando tiempo a la recuperación metabólica de las fibras musculares e impidiendo un daño irreversible. La bomba Ca2+ - ATPasa es la que utiliza la mayor parte de la energía almacenada en el ATP, de manera que una disminución de ATP provoca un aumento de Ca2+ en el sarcoplasma que puede conducir a la aparición de rigor y daño celular. Con nuestro modelo las fibras musculares que están en este peligro son fundamentalmente las tipo IIB y posiblemente algunas del tipo IIA. La fatiga lograda en nuestro modelo es de corta duración, dadas las recuperaciones observadas en algunas mediciones y porque no hubo daño estructural en RS.

Implicaciones funcionales de la señalización purinérgica en la red trabecular

Tue, 12 Apr 2011 13:25:23 GMT

Implicaciones funcionales de la señalización purinérgica en la red trabecular Soto del Cerro, David La red trabecular es una estructura situada en la cámara anterior del ojo cuya función es drenar el humor acuoso. Alteraciones en ella pueden producir aumentos de la presión intraocular (IOP) los cuales pueden provocar pérdidas en el campo visual y por lo tanto cegueras parciales o totales (glaucoma).

El objetivo de esta tesis doctoral se basa en el estudio de la fisiología de la red trabecular con el fin de tener un mayor conocimiento de sus funciones y así poder entender mejor su papel regulador dentro de la evacuación del humor acuoso. Dado que el ATP y otros derivados purinérgicos se encuentran presentes en el humor acuoso, en la realización de este proyecto se han estudiado los receptores purinérgicos en la red trabecular y el papel del ATP y derivados dinucleósidos polifosfato en la modulación de la evacuación del humor acuoso.

Se ha evaluado el efecto del ATP mediante el estudio de los incrementos de Ca2+ con el fluoróforo fura-2. Este nucleótido provoca incrementos rápidos del Ca2+ intracelular que disminuyen lentamente hasta los valores basales. El porcentaje de respuesta frente a éste y otros agonistas muestra un perfil de respuesta (ATP = UTP > ATP--S >> ADP = UDP) corresponde al receptor purinérgico P2Y2, el cual es sensible al antagonista suramina.

El Ca2+ movilizado tras la estimulación de los receptores P2Y procede de los depósitos citoplasmáticos y las vías de señalización intracelular involucran una proteína Gq/11 que estimula la fosfolipasa C- y produce IP3 con la subsiguiente estimulación de receptores de IP3.

Experimentos de inmunocitoquímica y western-blot confirman la existencia de un receptor P2Y2 además de la coexistencia con los subtipos P2Y1 y P2Y4.

Se ha estudiado como el ATP extracelular modula corrientes de K+ mediadas por el canal de alta conductancia dependiente de calcio BKCa. La estimulación con ATP extracelular provoca un aumento significativo de la corriente de salida de K+ mediante la participación del receptor P2Y2 en la corriente y los aumentos de corriente dependen del Ca2+ intracelular para activarse.

Por otro lado, Las células trabeculares poseen la capacidad de liberar ATP frente a estímulos hipotónicos y la cantidad de ATP liberado es proporcional a la hipotonicidad utilizada.

Finalmente, se ha estudiado el ATP en la regulación de la facilidad de evacuación de humor acuoso(C). Para ello se utilizó la técnica de perfusión de segmentos anteriores oculares en condiciones de cultivo de órgano obteniéndose valores de C (l/min/mmHg). El ATP no muestra ningún efecto sobre la C. El análogo no hidrolizable del ATP, el ATP--S, el cual es resistente a la acción de las ectonucleotidasas tampoco varia la C, indicando que quizá la el ATP estimula diferentes tipos de receptor.

En el segundo objetivo del trabajo de tesis se han estudiado los análogos estructurales del ATP dinucleósidos polifosfato ya que estos activan receptores purinérgicos y además se ha demostrado que varían la IOP.

Los efectos de los dinucleótidos polifosfato son similares a los mostrados por el ADP. El dinucleótido Up4U muestra una dinámica semejante a la observada por el ATP con incrementos más sostenidos en el [Ca2+]i. Las concentraciones a las que se producen estos incrementos de Ca2+ son grandes y a concentraciones fisiológicas sus efectos son muy bajos.

Los dinucleótidos Ap3A y Ap4A producen un aumento en la C y su efecto está mediado por la activación del receptor P2Y1. El aumento provocado por el Ap4A se previene al prefundir juntamente con el antagonista del receptor P2Y1. El agonista selectivo del P2Y1 aumenta la C y su efecto no se produce en presencia del antagonista del P2Y1.; SUBJECT: Functional involvement of purinergic activation in trabecular meshwork.

TEXT: The understanding of the physiology of the trabecular meshwork has advanced in the last few years, however purinergic receptors have not been characterized in this tissue and their role have not been determined.
In this work it is shown that trabecular meshwork express three diferent subtypes of purinergic receptors: P2Y1, P2Y2 and P2Y4. They are activated by different purinergic agonists and depending on the subtype their response on the intracellular calcium levels are diferent.
The activation of P2Y2 and P2Y4 leads Ca2+ mobilisations greater than the P2Y1 activation and their stimulation does not produce changes in outflow facility.
On the other hand, the stimulation of P2Y1 receptor by compounds selective for the receptor or some dinucleosides polyphosphate lead an increase in the outflow facility. The increments do not seem to involve calcium signalling and perhaps the intracellular mechanisms could involve second messengers like cAMP.

Caracterització electrofisiològica del canal de K+ d'alta conductància dependent de Ca2+ (BKCa) a la cèl·lula trabecular: modulació per l'stretch i la hipòxia

Tue, 12 Apr 2011 13:25:22 GMT

Caracterització electrofisiològica del canal de K+ d'alta conductància dependent de Ca2+ (BKCa) a la cèl·lula trabecular: modulació per l'stretch i la hipòxia Ferrer Mallol, Elisa Les malalties que causen ceguesa total o parcial afecten a milions de persones arreu del món. Una de les principals causas de ceguesa és el glaucoma, malaltia caracteritzada per un augment de la pressió intraocular (IOP) i una pèrdua de visió perifèrica.

La fisiopatologia del glaucoma està estretament relacionada amb la fisiologia de l'humor aquós, fluid contingut a les cambres oculars (anterior i posterior). Des de la cambra anterior, l'humor aquós s'eliminarà a través de: 1) la via uveoescleral, que és minoritària, i 2) la via convencional o trabecular, on la major part de l'humor aquós (aprox. 80%) s'elimina travessant la xarxa trabecular cap el canal d'Schlemm i les venes aquoses.

L'humor aquós té dues funcions: 1) nodrir les estructures avasculars (còrnia i cristal·lí) i 2) mantenir la IOP dins dels marges fisiològics (15-16 mmHg). Quan s'altera l'equilibri entre la producció i l'evacuació de l'humor aquós, l'humor aquós s'acumula i la IOP augmenta. La xarxa trabecular és un teixit d'estructura similar a una esponja organitzat en diferents regions i en contacte directe amb el canal d'Schlemm. La part més propera al canal d'Schlemm és la que presenta major resistència al pas de l'humor aquós. Alteracions en aquesta via suposaran un augment de la resistència i, en conseqüència, un augment de la IOP.

La contractilitat cel·lular i la regulació del volum de la cèl·lula trabecular, són dos mecanismes claus en la regulació de la permeabilitat de la xarxa trabecular. Aquests dos mecanismes induirien deformacions a la membrana que activarien canals mecanosensibles.

Un d'aquests canals mecanosensibles és el canal de K+ d'alta conductància dependent de Ca2+ (BKCa), que es caracteritza per la seva activació per voltatges despolaritzants i està modulat pel calci intracel·lula i del qual s'ha demostrat la seva mecanosensibilitat en diferents teixits.

Per aquesta raó, s'ha caracteritzat electrofisiològicament el canal BKCa a la cèl·lula trabecular i s'ha estudiat la seva modulació per diferents factors, entre ells l'stretch mecànic. El canal BKCa ha demostrat ésser mecanosensible augmentant la seva probabilitat d'obertura tant per canvis en la tensió de la membrana cel·lular com per increments del volum cel·lular (swelling).

En altres sistemes el canal està modulat per la pressió parcial d'oxigen (PO2), de manera que estímuls hipòxics disminueixen l'activitat del canal produïnt despolaritzacions com en les cèl·lules del cos carotidi. A l'ull, l'humor aquós aporta oxigen a les estructures avasculars i a la xarxa trabecular. Els valors de PO2 de l'humor aquós són més baixos (aprox. 55 mmHg) que en altres teixits més oxigenats (aprox. 95 mmHg). Per aquesta raó qualsevol procés que produeixi hipòxia a la cambra anterior tindrà un efecte més acusat.

Per aquests motius s'ha estudiat quins mecanismes poden existir a les cèl·lules trabeculars per respondre a estats hipòxics. Els resultats obtinguts mostren com els corrents mitjançats pel canal BKCa disminueixen quan les cèl·lules trabeculars es tracten amb una solució hipòxica. Aquesta disminució dels corrents totals també s'observa en cèl·lules incubades en condicions d'hipòxia (5% O2).

La hipòxia produeix alteracions a la mobilització del calci intracel·lular ([Ca2+]i) en diferents tipus cel·lulars. A les cèl·lules trabeculars s'ha estudiat l'efecte de la hipòxia sobre la [Ca2+]i i s'ha observat com la hipòxia modifica la resposta en relació al [Ca2+]i quan s'apliquen diferents substàncies vasoactives (bradikinina, endotel·lina-1) que influeixen sobre l'evacuació de l'humor aquós i que augmenten la [Ca2+]i a la cèl·lula trabecular. La hipòxia produeix entre d'altres efectes, un augment de la [Ca2+]i basal respecte les cèl·lules control (normòxiques) i disminueix l'increment de la [Ca2+]i produït per les substàncies agonistes.; SUBJECT: Electrophysiological characterization of a large conductance Ca2+-activated K+ channel (BKCa) in trabecular meshwork cells: modulation by membrane stretch and hypoxia

TEXT: The understanding of the physiology of the trabecular meshwork has advanced in the last few years, however few ionic channels have been characterized in this tissue. The large conductance Ca2+-activated K+ channel (BKCa) has been identified in the trabecular meshwork cells but its function is still unknown. BKCa channel is voltage dependent and its activity is modulated by intracellular calcium concentration ([Ca2+]i), with different functions depending on the cell type. In excitable cells it controls neuronal excitability, participates in neurotransmitter release and modulates contractile tone in vascular smooth muscle. In non-excitable cells it has been described its participation in cell volume regulation and its modulatory effect on different substances that mobilize [Ca2+]i.

Besides [Ca2+]I, other substances such as cGMP or nitric oxide modulate the activity of BKCa channel in the trabecular meshwork. In other tissues, BKCa channel has shown mechanosensitive properties and it has also been described how its activity is modified by low PO2 values (hypoxia). Since trabecular meshwork cells are subjected to intraocular pressure and that aqueous humor contained in the anterior chamber presents PO2 values lower than other tissues, it is important to study the effects of these modulators on BKCa channel activity which will have a direct effect on the physiology of the trabecular meshwork.

Canals de clorur a les cèl.lules trabeculars: implicacions en l'evacuació de l'humor aquós

Tue, 12 Apr 2011 13:25:22 GMT

Canals de clorur a les cèl.lules trabeculars: implicacions en l'evacuació de l'humor aquós Comes Beltran, Núria El glaucoma és una de les principals causes de ceguesa no traumàtica i afecta a milions de persones a tot el món. Aquesta patologia es caracteritza per una degeneració progresiva de les cèl·lules ganglionars de la retina i del nervi òptic i d'una pèrdua gradual del camp visual. Un dels principals factors de risc del glaucoma és l'augment de la pressió intraocular (IOP).

L'humor aquós contingut a les cambres anterior i posterior de l'ull i l'equilibri entre la seva síntesi i evacuació determina la IOP. Quan l'evacuació de l'humor aquós disminueix, aquest fluid s'acumula a les cambres oculars i provoca un excés de pressió. En humans l'humor aquós s'evacua a través de la xarxa trabecular i el canal d'Schlemm. La xarxa trabecular és una estructura en forma de malla que modula l'evacuació de l'humor aquós mitjançant diferents mecanismes. Alteracions en aquest teixit comporten un augment de la resistència al pas de l'humor aquós, produint un augment de la IOP. Entre d'altres factors, el volum de les cèl·lules trabeculars modula activament la resistència al pas de l'humor aquós. Les cèl·lules trabeculars presenten un mecanisme homeostàtic en resposta a un augment de volum que es coneix amb el nom de regulatory volume decrease (RVD) i els permet recuperar el seu volum inicial amb l'eflux d'ions de potassi (K+), clorur (Cl-) i la sortida pasiva d'aigua.

Ja que els canals de Cl- són claus en la regulació del volum cel·lular i que aquest mecanisme és un factor determinant en l'evacuació, és de gran interès estudiar els canals de Cl- a les cèl·lules trabeculars. Els resultats mostren que aquestes cel·lules expresen els canals de Cl- dependents de voltatge ClC-2, 3, 4,5,6 i 7. L'augment del volum cel·lular per hipotonicitat sobreexpressa el canal ClC-2 a les cel·lules trabeculars. L'elevada IOP durant una hora sobreexpressa el ClC-2 respecte el CIC-3. En canvi el canal ClC-3 se sobreexpressa en relació al ClC-2 després de 4 i 7 dies. Aquests resultats indiquen que ambdós canals podrien participar en el mecanisme homeostàtic que regula l'evacuació de l'humor aquós i estar relacionats amb la fisiopatologia del glaucoma.

A les cel·lules trabeculars i amb la tècnica de patch clamp hem identificat els corrents de Cl- mitjançats pel canal ClC-2 que es caracteritzen per una rectificació d'entrada. La magnitud del corrent augmenta amb l'acidificació extracel·lular, l'AMPc i l'augment del volum cel·lular mentre que es bloqueja amb cadmi. La seqüència de permeabilitats aniòniques del corrent és Cl->Br->I->F->. Les cel·lules trabeculars també presenten corrents activats en condicions hipotòniques amb rectificació de sortida, inactivació dependent del temps als potencials positius i una seqüència de permeabilitats aniòniques de I-> Br->Cl->F>glucomnat-. L'activació del corrent requereix la presència d'ATP intracel·lular i es bloqueja amb Tamoxifen, DIDS i ATP extracel·lular. Les propietats electrofisiològiques i farmacològiques del corrent indiquen que es tracta del corrent de Cl- conegut amb el nom d' IClswell.

Amb la tècnica fluorimètrica amb calceïna hem quantificat el mecanisme de RVD a les cel·lules trabeculars que els permet recuperar un 20% del seu volum después de 25 d'un augment del volum induït per hipotonicitat. L'aplicació de bloquejants específics dels diferents canals de Cl- indica que IClswell participa en el RVD de les cel·lules trabeculars mentre que el canal ClC-2 no col·labora en aquest mecanismo. Finalment, la hipotonicitat disminueix l'evacuació de l'humor aquós per l'augment del volum cel·lular i es recupera de manera progressiva per l'activació del RVD. Amb bloquejants específics hem determinat la implicació d' IClswell i del canal de K+ dependent de calci BKCa en la modulació de la facilitat d'evacuació mentre que el CIC-2 no hi té un paper rellevant. Per tant, les cèl·lules trabeculars poden modular de manera activa el seu volum i l'evacuació de l'humor aquós a travès dels canals Clswell i BKCa.; "Chrolide channels in the trabecular meshwork cells and their role in the aqueous humor outflow facility"

In the eye, the balance between aqueous humor (AH) inflow and outflow determines intraocular pressure (IOP). The major AH outflow pathway in humans, is through the trabecular meshwork (TM) and the Schlemm's canal (SC). Impairment of AH outflow leads to ocular hypertension, which is the main risk factor to develop glaucoma. It is accepted that both TM cells and SC cells have an active role in modulating the IOP. Changes in TM cells volume may determine the AH outflow rate. Because cell volume is essential to TM function, we investigate cell volume and outflow facility regulation.

The results showed that all members of the CLCN gene family but ClC-1 were detected in TM cells. After short periods of elevated pressure ClC-2 induction was significantly higher than that of ClC-3. In contrast, after long pressure insults ClC-3 mRNA was significantly increased. The expression of ClC-2 and ClC-3 were modified by cell swelling and dexamethasone, respectively.

CIC-2 currents activated in TM cells were modified by changes in extracellular pH, 8Br-cAMP and hypotonicity-induced cell swelling. The anionic permeability sequence was CI->Br->I->F-. The electrophysiological data presented correlates nicely what the CIC-2 mRNA expression found in TM cells, thus we can conclude that TM cells express functional ClC-2 channels. Hypotonic media also activated a swelling-activated CI- current (Clswell) in TM cells. The current are characterized by an outward rectification, a time dependent decay at depolarizing voltages and an anion permeability sequence I>Br->Cl->F->gluconate-. The currents were inhibited by Tamoxifen, DIDS and external ATP.

Cell swelling activates a regulatory volume decrease (RVD) mechanism that implies activation of K+ and Cl- currents. Our results obtained by blocking ClC-2 and Clswell currents showed that CIC-2 had no effect on RVD mechanism while the major contributor to CI- efflux is Clswell in TM cells. Hypotonic media decreased outflow facility in perfused anterior segments, which recovered to baseline levels. Clswell and BKCa channels are involved in a RVD because their selective blockade impair outflow facility recovery after cell swelling while CIC-2 block did not modify the outflow facility and are not involved in RVD mechanism.

Estudi genètic de la Síndrome de Williams-Beuren i de les patologies associades al gen de l'elastina

Tue, 12 Apr 2011 13:25:21 GMT

Estudi genètic de la Síndrome de Williams-Beuren i de les patologies associades al gen de l'elastina Rodríguez-Revenga Bodi, Laia La síndrome de Williams (SW) és un trastorn del desenvolupament caracteritzat per trets facials característics, retard mental, hipercalcèmia infantil i anormalitats en el teixit conjuntiu que inclouen arteriopaties, com l'estenosi supravalvular aòrtica (SVAS). És un desordre multisistèmic amb una incidència de 1/20.000 nascuts vius amb igual freqüència entre homes i dones. Tot i que la majoria de casos de SW són esporàdics, els casos presenten un patró d'herència autosòmic dominant.
L'alteració molecular implicada en la SW és una deleció hemizigota d'aproximadament 1'5 Mb en la regió 7q11.23. És per tant, una de les síndromes anomenades de gens contigus ja que la deleció afecta a varis gens.
El mecanisme causal en la SW sembla ser l'haploinsuficiència gènica d'alguns dels gens que es troben en la regió delecionada. Fins al moment, s'han descrit 20 gens amb locus en aquesta regió, un dels quals és el que codifica per la proteïna de l'elastina (ELN). Aquest és l'únic gen amb el què s'ha pogut establir una correlació genotip-fenotip, ja que alteracions en la seva seqüència donen les característiques manifestacions cardíaques i vasculars presents en la SW.
Mentre que la SW és el resultat de l'haploinsuficiència del gen ELN i d'altres gens situats al voltant, mutacions en aquest mateix gen donen lloc a dos desordres autosòmics dominants diferents: l'estenosi supravalvular aòrtica (SVAS) i la cutis laxa.
Els estudis genètics mitjançant hibridació in situ fluorescent (FISH) i anàlisi de pèrdues d'heterozigositat amb marcadors de la regió 7q11.23 evidencien la pèrdua de material genètic i possibiliten el diagnòstic de SW. Aquests estudis permeten acotar les delecions, establir una correlació genotip-fenotip i estudiar l'origen parental i la seva repercussió en el fenotip. El fet d'emprar conjuntament les tècniques moleculars i de FISH no només permet donar un diagnòstic a tots els casos amb sospita clínica de SW, sinó que també permet caracteritzar les diferents delecions que presenten els pacients.
El present treball intenta aprofundir en el coneixement de la SW a través de la caracterització dels pacients afectes que el Servei de Genètica de l'Hospital Clínica ha recollit en els últims set anys. De la mateixa manera també pretén realitzar un estudi mutacional del gen ELN en aquells pacients en els que no s'ha demostrat una deleció del mateix gen però que fenotípicament presenten alguna tipus d'afectació cardiovascular, i caracteritzar molecularment la síndrome de cutis laxa.
S'han analitzat 200 pacients amb sospita clínica de SW i mitjançant alguna de les dues tècniques utilitzades, s'ha posant de manifest una hemizigositat de la regió crítica en 70 casos. Això representa que només un 35% del casos rebuts amb sospita clínica de SW realment presenten la deleció. En 5 d'aquests, l'estudi molecular no ha estat informatiu mentre que en els 65 restants, s'ha pogut estudiar i determinar l'origen parental de la deleció.
S'ha realitzat l'estudi mutacional del gen ELN en un total de 28 individus que presentaven en el seu fenotip alguna afectació cardíaca o trets distintius de cutis laxa. Aquest estudi ha permès identificar un total d'onze canvis dels quals tres ja havien esta descrits anteriorment. Nou són polimorfismes i els altres dos són canvis missense en els exons 22 i 26. Entre els polimorfismes, sis són intrònics i tres s'expressen al ser exònics. Pel què fa a la cutis laxa, en la literatura només existien 3 casos descrits en els que la mutació causant estigués descrita. L'estudi també ha permès identificar una quarta mutació relacionada amb aquest desordre.
A part de les implicacions científiques, aquest treball de recerca posa de manifest una vegada més la utilitat de l'anàlisi genètic com a eina diagnòstica per a aquesta síndrome.

Processament d'estudis d'SPECT cerebral: reconstrucció, quantificació i estandarització.

Tue, 12 Apr 2011 13:25:20 GMT

Processament d'estudis d'SPECT cerebral: reconstrucció, quantificació i estandarització. Pareto Onghena, Deborah La tomografia per emissió de fotó únic (SPECT) és una tècnica de diagnòstic per la imatge que avalua la funcionalitat d'un òrgan, amb l'ajut d'un traçador intravenós. Les imatges obtingudes estan afectades per diverses degradacions físiques, destacant l'atenuació i dispersió de fotons i la resposta del sistema detector, format per la gamma càmera i el col·limador. Aquestes degradacions poden corregir-se mitjançant la utilització d'algoritmes iteratius de reconstrucció, incorporant un model que reprodueix l'efecte.
El principal objectiu de la tesi és l'avaluació i quantificació d'estudis de SPECT cerebral. Per assolir-lo, s'han plantejat els següents objectius específics: 1) modelització de la resposta d'un col·limador convergent fan-beam; 2) implementació d'un algoritme iteratiu, basat en subconjunts ordenats de projeccions, per a la reconstrucció d'estudis de SPECT cerebral adquirits amb col·limadors fan-beam; 3) valoració de l'efecte de corregir la resposta d'un col·limador fan-beam en la quantificació de la captació específica d'estudis de neurotransmissió i 4) valoració de l'efecte de corregir la resposta d'un col·limador fan-beam en la quantificació i valoració estadística d'estudis de perfusió.
Les principals conclusions del treball realitzat són les següents:
1) s'ha posat a punt un mètode per a determinar experimentalment la distància focal dels col·limadors fan-beam i avaluar la convergència dels seus forats a la línia focal. Els valors obtinguts de la focal difereixen dels nominals en un 1.5%. Els forats convergeixen a una zona focal amb desviacions estàndard "SIGMA sub x"=2.5mm "SIGMA sub zeta"=2.5mm. Els resultats permeten concloure que la qualitat dels col·limadors està dins els marges d'acceptació requerits per a la rutina clínica.
2) s'ha caracteritzat la resposta puntual d'un col·limador fan-beam en funció dels paràmetres intrínsecs i les coordenades de la font, a partir de mesures experimentals. S'han obtingut funcions analítiques que permeten calcular la resolució i l'eficiència del col·limador, donats els seus paràmetres intrínsecs i les coordenades de la font. Els alts valors del coeficient de correlació entre els valors predits pel model i els experimentals -0.994 resolución i 0.991 eficiència- indiquen que les funcions reprodueixen correctament la resposta.
3) s'ha desenvolupat un algoritme de simulació numèrica que permet determinar la resposta puntual geomètrica d'un col·limador a partir dels seus paràmetres i la distribució dels seus forats. Aquest algoritme permet avaluar el disseny d'un col·limador o aspectes concrets com la dependència angular de l'eficiència amb la distribució dels forats. Quan la distància entre els forats és constant, aquesta varia com cos(zeta), quan augmenta segons 1/cos(zeta), varia com cos-super2(zeta).
4) s'ha implementat un algoritme de reconstrucció iteratiu que inclou la correcció de la reposta dels col·limadors fan-beam. La matriu de pesos de l'algoritme inclou les funcions analítiques obtingudes per l'eficiència i la resolució.
5) s'ha validat la simulació de projeccions realistes de SPECT cerebral amb el codi simSET.
6) s'ha avaluat la importància de la correcció de les diferents degradacions en la reconstrucció d'estudis simulats de neurotransmissió dopaminèrgica, a partir del model d'Alderson i simSET. La comparació dels valors de captació recuperats respecte els teòrics indiquen que la correcció per atenuació, dispersió i resposta col·limador milloren el càlcul en un 30% en el putamen i un 43% en el caudat.
7) s'ha avaluat la importància de la correcció de les diferents degradacions en la reconstrucció d'estudis simulats de perfusió, a partir del model de Zubal i simSET. La correcció de les degradacions millora la determinació del factor d'activació en un 12, 10 i 3% per focus de volum 1.0, 2.1 i 3.7 cm3 respectivament. També s'ha validat el Statistical Parametric Mapping en la valoració d'estudis de perfusió, estudiant la sensibilitat de detecció de petits canvis en un disseny típic de comparació de grups. La correcció de les degradacions permet disminuir el nombre de subjectes en cada grup per obtenir significació estadística.

Estudio del metabolismo del hierro en lactantes de una alta y perenne transmisión de malaria.

Tue, 12 Apr 2011 13:25:20 GMT

Estudio del metabolismo del hierro en lactantes de una alta y perenne transmisión de malaria. Giménez Gómez, Nuria Pilar La malaria y la anemia se encuentran entre los principales problemas de la salud pública mundial. Los recién nacidos y los niños pequeños son uno de los grupos de la población más afectados por ambas patologías. En áreas endémicas de malaria, la frecuente coexistencia de ferropenia, procesos inflamatorios y malaria dificulta la interpretación de las magnitudes bioquímicas utilizadas para valorar el metabolismo del hierro. Otra dificultad añadida en la interpretación de los resultados es la falta de valores normales en estas poblaciones. En los últimos años se ha desarrollado otro test indicador del contenido corporal de hierro, el receptor soluble de transferrina, que aumenta en aquellos pacientes con anemia por deficiencia de hierro mientras que no se altera en la anemia asociada a procesos infecciosos o inflamatorios. Se han realizado pocos estudios sobre la utilidad de este marcador en niños que viven en áreas endémicas de malaria y con resultados contradictorios.
Los objetivos de esta investigación son: estudiar el metabolismo del hierro en un grupo de lactantes que viven en un área endémica de malaria, determinando el efecto de la inflamación y de la malaria, así como valorar la utilidad del receptor soluble de transferrina en el diagnóstico diferencial de la anemia en esta población. Se analizan, durante el primer año de vida, las magnitudes bioquímicas y hematológicas utilizadas habitualmente para valorar el metabolismo del hierro. Se ha observado que la edad influye sobre la prevalencia de las principales patologías que en esta zona afectan a este metabolismo y sobre las magnitudes bioquímicas y hematológicas estudiadas. Asimismo estas magnitudes se alteran en los niños con malaria y/o procesos inflamatorios. El receptor soluble de transferrina no contribuye al diagnóstico del tipo de anemia en los lactantes que viven en estas áreas, puesto que su concentración se eleva con la hemólisis asociada a la malaria además de con la ferropenia.
Se recomienda continuar las búsqueda de nuevos test no invasivos que permitan detectar la deficiencia de hierro en estas zonas.