UNIVERSITAT DE LLEIDA FACULTAT DE MEDICINA DEPARTAMENT DE CIÈNCIES MÈDIQUES BÀSIQUES GLUTATION TRANSFERASAS DE CLASE OMEGA EN Saccharomyces cerevisiae: ESTUDIO BIOQUÍMICO Y FUNCIONAL Memoria para optar al Grado de Doctor por la Universitat de Lleida presentada por LINA PATRICIA BARRETO PARRA Lleida, noviembre de 2006 El Director de la Tesis Dr. Enrique Herrero Perpiñan A Mi familia Adriana Esteves Catalina Y Toni Agradecimientos AGRADECIMIENTOS No sé si alguien podrá llegar a imaginarse la importancia sentimental que tiene esta memoria, no solo para mi, también para los míos, sobre todo para quienes me han apoyado tanto a lo largo de mis estudios y en esta etapa de mi vida en particular. Esta memoria existe gracias al Dr. Enric Herrero, quien me dio la oportunidad de trabajar en su laboratorio y ha tenido una organización ejemplar y admirable para llevar todo este trabajo a término. Tengo mucho que agradecerle…desde su paciencia hasta la respuesta inmediata a todos los correos electrónicos que recibió de mi parte antes de venir al laboratorio. También por ir a buscarme al aeropuerto el día que llegué por primera vez a Barcelona, por llevarme a ver por primera vez la nieve y a esquiar. También por aguantar mis risas escandalosas (cosa que ya he aprendido a moderar…) durante estos cuatro estupendos años. Son detalles para mí muy importantes que tendré presentes y le agradeceré toda mi vida. Esta aventura empezó con los libros de biología de mi madre, los que siempre me llenaron de curiosidad sobre la belleza de lo que llamamos “vida”, junto con las ganas de conocer más allá de lo que se puede ver. Siempre me he sentido enormemente afortunada por haber podido estudiar y he sido conciente toda mi vida del esfuerzo que eso representó para mis padres. Para mí también representó sumarle un tanto de voluntad, además que con mucho esfuerzo, mucha dedicación y determinación procuré no tener malas notas a pesar de no ser de los brillantes de la carrera. Todo porque siempre quise aprender cada día más, porque quería ser independiente y porque siempre quise corresponder a sus esfuerzos intentando llenar las expectativas que pusieron en mí. Esta es la demostración del amor y el agradecimiento infinitos que tengo hacia ellos dos. El aspecto más duro de cumplir los sueños es que de alguna manera se tiene que sacrificar algo para hacerlos realidad y en mi caso me separé de mi familia para realizar los míos. Felizmente todo se vio compensado con amigos y encontrando el amor incondicional. A ellos, mis padres, les agradezco ese esfuerzo que han hecho por darme una buena educación, no solo en conocimientos, también unas buenas bases morales y éticas, aspectos personales que me han abierto las puertas en muchos lugares y gracias a ello también he recibido el afecto, el amor y el respeto de muchas personas a lo largo de mi vida. A mi madre le debo el apoyo que siempre he tenido para lograr lo que me propongo y que cuando todo parecía empeñarse en impedirlo, ella siempre ha estado animándome para que luche y siga adelante sin rendirme. Por eso y Agradecimientos por muchas cosas más te doy gracias, Mami. Mi padre ha sido mi ejemplo de dedicación y esfuerzo. Cuando estaba físicamente cansada de trabajar recordaba los años que trabajó desde muy pronto en la mañana hasta muy tarde en la madrugada y de las noches que trabajábamos juntos con mi madre y mis hermanos para entregar algún pedido en la fábrica, porque la responsabilidad nos podía más que el sueño. A mis hermanos les doy gracias por las risas que siempre me han animado, sobre todo cuando más cansada estaba y no se imaginan lo mucho que las encuentro a faltar. Y Catalina siempre ha sido el motor de mis ilusiones porque de ella recibo la alegría que ilumina mis ojos. Aunque Adriana no está ya con nosotros, a ella le doy gracias por enseñarme la fuerza y la generosidad del amor y por tener siempre esperanza en que yo podría venir a España a estudiar lo que más me gustaba. A mis tías Blanca y Judith les agradezco las bufandas y los gorritos hechos con tanto cariño y que me pongo cada invierno…son un apoyo contínuo para superar lo que menos me gusta: el frio. Y que decir de mis amigos… Con Madelaine y Patricia siempre nos hemos apoyado en todo lo que hemos decidido durante la universidad y también en nuestra vida actual. Para ellas mi eterna gratitud por ser las mejores amigas del mundo y que a pesar de los 13.000 kilómetros que nos separan, sigo sintiéndolas tan cercanas como cuando estudiábamos en mi casa. A Inma también le agradezco muchísimo por ayudarme tanto en momentos tan difíciles y también por pasar conmigo momentos tan agradables en muchas ocaciones. Valoro enormemente la amistad incondicional que siempre me ha ofrecido y espero poder corresponderle enteramente a tanto aprecio. A mi Garceritas, mi Anita favorita le tengo un aprecio gigante porque también me ha ayudado mucho y ha tenido detalles que son muy importantes para mí, además de las risas, las cenas y los buenos ratos que hemos compartido. Me alegra tener como compeñera de laboratorio a una personita tan especial y con la que he trabajado muy a gusto. He tenido el honor de publicar con ella un par de artículos y me siento muy orgullosa de ello. Alicia, mi “champi” querida, ¡que buenos ratos hemos pasado! y es que las risas son la sal de la vida, ¿a que si? Es muy divertido trabajar contigo y gracias por tener un sentido del humor tan especial. De Lidia tengo los mejores consejos, su intuición, su manera estupenda de ver la vida y que cuando sea grande ¡quiero ser como tú! También tengo muy presente a SuperNeus Colomina y a Micalela, mi Miky, con quienes he tenido conversaciones fiolosóficas Agradecimientos interesantísimas que me han servido para reflexionar sobre algunas cosas que aparentemente eran triviales, charlas que echaré mucho en falta. Y al final de este camino tengo el apoyo de un hombre estupendo que ha decidido compartir su vida conmigo y empezar una vida nueva. Estos últimos meses tu apoyo ha sido fundamental para cerrar este capítulo de mi vida que tanto he esperado y me alegra que mi Toni esté a mi ladito para celebrar este momento tan especial. Amor mío, eres la razón para seguir luchando y ojalá pueda corresponderte con todo lo que tengo, con todo lo que te mereces. Tu amor ha sido siempre incondicional, estás dispuesto a ir y volver tan lejos como sea necesario con tal de seguir juntos y yo tengo el mismo sentimiento hacia ti. Tu paciencia y tu empeño hacen que me sienta afortunada y bendecida por tenerte…por eso le doy gracias a Dios cada día por haberme puesto en tu camino. Gracias amor mío por estar allí siempre para escucharme, animarme y apoyarme en todo lo que viene ahora… por ser el compañero incondicional del que me siento muy orgullosa, al que amo con locura y a quien quiero hacer inmensamente feliz. Resúmen RESÚMEN Saccharomyces cerevisiae posee dos glutatión transferasas (GST) denominadas Gtt1 y Gtt2 con capacidad de conjugar una molécula de glutatión con el sustrato estándar CDNB. Estas dos enzimas no son clasificables dentro de las clases convencionales descritas con base en la estructura de las GST de eucariotas superiores, aunque guardan cierta similitud estructural con las de clase Zeta. En esta memoria se describe la caracterización de tres GST de clase Omega en S. cerevisiae denominadas Gto1, Gto2 y Gto3, codificadas por las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w. Las enzimas de esta clase no tienen actividad sobre CDNB, pero son activas como tiol oxidoreductasa y poseen actividad dehidroascorbato reductasa y dimetilarsenato reductasa. La primera de ellas, Gto1, es peroxisomal y posee una señal de localización de tipo PTS1 en la región C-terminal. Dicha señal es reconocida por el transportador peroxisomal Pex5, que facilita su internalización en este organelo. Por otra parte, Gto2 y Gto3 tienen localización citoplásmica. Los genes GTO de S. cerevisiae se inducen por estrés oxidativo pero con patrones distintos para los tres genes. La dependencia de esta expresión de los factores de trascripción Yap1, Msn2 y Msn4 se relaciona con la presencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. El mutante ∆gto1 es sensible al agente oxidante diamida y tiene una concentración intracelular de glutatión menor que la cepa silvestre. Este fenotipo se relaciona con que el triple mutante ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto1 sea sensible al cadmio, indicando que las tres GST Gtt1, Gtt2 y Gto1 intervienen en la detoxificación de este metal. Otro fenotipo relevante es la dificultad del mutante ∆gto1 para crecer en medios con ácido oleico como única fuente de carbono, indicando que las funciones peroxisomales en dicho mutante están afectadas. La ausencia de GTO1 en S. cerevisiae causa así mismo el descenso en la expresión de varios genes involucrados en la vía de síntesis de cisteína y metionina. Como consecuencia, el mutante ∆gto1 crece con dificultad en ausencia de treonina, serina o lisina. La ausencia de Gto1 en S. cerevisiae impide que utilice eficientemente la cisteína o la cistationina como únicas fuentes de azufre, manifestando defectos en la transulfuración, proceso que permite la síntesis de metionina a partir de cisteína. Ello sugiere que Gto1 podría estar regulando la actividad cistationina β-liasa de Str3 mediante su actividad tiol oxidoreductasa, dado que Str3 también es peroxisomal. Dado que la cisteína 387 de Str3 es importante para su actividad biológica y está conservada en las cistationina β-liasas de otras especies de hongos, este residuo podría ser diana de Gto1 para la regulación del estado redox de la proteína Str3. Resúmen RESÚMEN Saccharomyces cerevisiae posseeix dues glutatió transferases (GST) anomenades Gtt1 i Gtt2, amb capacitat de conjugar una molècula de glutatió amb el substrat estàndar CDNB. Aquests dos enzims no són clasificables dins de les classes convencionals descrites en base a l'estructura de les GST d'eucariotes superiors, encara que guarden certa similitud estructural amb els membres de la classe Zeta. En aquesta memòria es descriu la caracterització de tres GST de classe Omega en S. cerevisiae anomenades Gto1, Gto2 i Gto3, codificades respectivament per les ORFs YGR154c, YKR076w i YMR251w. Els enzims d'aquesta classe no tenen activitat sobre CDNB, però són actives com tiol oxidoreductases i posseïxen activitat dehidroascorbat reductasa i dimetilarsenat reductasa. La primera d'elles, Gto1, és peroxisomal i posseïx un senyal de localització de tipus PTS1 en la regió C-terminal. Aquest senyal és reconeguda pel transportador peroxisomal Pex5, que facilita la seva internalizació en aquest organul. D´altre banda, Gto2 i Gto3 tenen localització citoplàsmica. Els gens GTO de S. cerevisiae s'induïxen per estrès oxidativu però amb patrons distints per als tres gens. La dependència d'aquesta expressió dels factors de trascripció Yap1, Msn2 i Msn4 es relaciona amb la presència de seqüències YRE i STRE en els promotors dels gens GTO. El mutant ∆gto1 és sensible a l'agent oxidant diamida i té una concentració intracel· lular de glutatió menor que la soca silvestre. Aquest fenotip es relaciona amb que el triple mutant ∆gtt2 ∆gtt1 ∆gto1 sigui sensible al cadmi, indicant que les tres GST Gtt1, Gtt2 i Gto1 intervenen en la detoxificació d'aquest metall. Altre fenotip rellevant és la dificultat del mutant ∆gto1 per a créixer en medis de cultiu amb àcid oleic com única font de carboni, indicant que les funcions peroxisomals en el mutant estan afectades. L'absència de GTO1 en S. cerevisiae causa així mateix el descens en l'expressió de gens involucrats en la via de síntesi de cisteïna i metionina. Com a conseqüència, el mutant ∆gto1 creix amb dificultat en absència de treonina, serina o lisina. La manca de GTO1 en S. cerevisiae impedeix que utilitzi eficientment la cisteïna o la cistationina com úniques fonts de sofre, manifestant defectes en la transulfuració, procés que permet la síntesi de metionina a partir de cisteïna. Això suggereix que Gto1 podria estar regulant l'activitat cistationina β-liasa de Str3 mitjançant la seva activitat tiol oxidoreductasa, atès que Str3 també és peroxisomal. Atès que la cisteína 387 de Str3 és important per a la seva activitat biològica i està conservada en les cistationina β-liasas d'altres espècies de fongs, aquest residu podria ser diana de Gto1 per a la regulació de l’estat redox de la proteïna Str3 Summary SUMMARY Saccharomyces cerevisiae contains two glutathion transferases (GST) named Gtt1 and Gtt2, which are enzymes with glutathione conjugating activity with the standard substrate CDNB. These two enzymes are not classified into the conventional classes that have been established based on the structure of mammalian GST, although they keep certain structural similarity with Zeta class members. In this report, we describe the characterization of three S. cerevisiae Omega class GST named Gto1, Gto2 and Gto3, coded by ORFs YGR154c, YKR076w and YMR251w, respectively. The enzymes of this class do not exhibit activity with CDNB but they are active as tiol oxidoreductases, dehydroascorbate reductases and dimetilarsonate reductases. The first of them, Gto1, is located at the peroxisome and is targeted to this organelle throught a C-terminal PTS1-type sequence. This sequence is recognized by the peroxisomal transporter Pex5 that facilitates peroxisomal import. On the other hand, Gto2 and Gto3 are at the cytosol. The GTO genes of S. cerevisiae are induced by oxidative stress, although the expression patterns are different for the three genes. The expression of GTO genes depends on Yap1, Msn2 and Msn4 transcription factors and correlates with the presence of YRE and STRE sequences in the promoters of these genes. The absence of GTO1 causes a hipersensitivity to the oxidant diamide in S. cerevisiae and reduces the intracelular concentration of glutathione, compared with the wild type stain. This phenotype is related to cadmium sensitivity of the ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto1 triple mutant, indicating that Gtt1, Gtt2 and Gto1 participate in the response to cadmium toxicity. Another rellevant phenotype of S. cerevisiae cells lacking GTO1 is the growth defect with oleic acid as the sole carbon source, indicating that the peroxisome funtions are affected in the mutant. This mutant also grows defficiently in the absence of threonine, serine or lysine in the growth medium. Lack of GTO1 function also affects negatively the expression of several genes involved in methionine and cisteine sinthesis. As a consecuence, the ∆gto1 mutant shows defective growth in a medium with cisteine or cistationine as the sole sulfur source as a consequence of defective trasulfuration, a process that allows methionine synthesis from cisteine. This suggests that Gto1 could regulate the cystathionine β-lyase activity of Str3 through its thiol oxidoreductase activity, since Str3 is also peroxisomal. As the cysteine 387 residue of Str3 is important for the biological activity of this protein and is conserved in fungal species, this residue could be a target of Gto1 for the regulation of the redox state of Str3. ÍNDICE Indice ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1 1.1. COMPUESTOS XENOBIÓTICOS Y SU CONVERISIÓN ENZIMÁTICA.............. 3 1.2. ESTRUCTURA Y EZIMOLOGÍA DE LAS GLUTATIÓN TRANSFERASAS (GST) ............................................................................................................................ 6 1.2.1. ESTRUCTURA BÁSICA............................................................................. 6 1.2.2. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA..................................................... 9 1.2.2.1. SUPERFAMILIAS DE GST .......................................................... 9 1.2.2.2. CLASES DE GST....................................................................... 10 1.2.3. MECANISMO CATALITICO DE LA REACCIÓN..................................... 19 1.2.3.1. ACTIVACIÓN DEL GSH ............................................................ 20 1.2.3.2. ESPECIFICIDAD SOBRE SUSTRATOS ELECTROFÍLICOS... 23 1.2.4. LAS GST COMO GLUTATIÓN PEROXIDASAS ..................................... 23 1.3. LOCALIZACIÓN CELULAR DE LAS GST ......................................................... 27 1.4. IMPORTANCIA BIOLÓGICA DE LAS GST........................................................ 27 1.5. GLUTATIÓN TRANSFERASAS A LO LARGO DE LA ESCALA EVOLUTIVA 32 1.5.1. GST BACTERIANAS................................................................................ 32 1.5.2. GST EN PLANTAS................................................................................... 34 1.5.4. GST EN INSECTOS ................................................................................. 35 1.5.5. GST EN PARÁSITOS............................................................................... 37 1.6. GST EN HONGOS............................................................................................... 40 1.6.1. DIVERSIDAD ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL ...................................... 40 1.6.2. LAS PROTEÍNAS Gtt EN S. cerevisiae ................................................. 42 1.7. RELACIÓN DE LAS GST CON LAS GLUTAREDOXINAS ............................... 44 1.7.1. RELACIONES ESTRUCTURALES.......................................................... 46 1.7.2. RELACIONES FUNCIONALES EN S.cerevisiae.................................... 48 1.8. LAS GST Y SU RELACIÓN CON LOS PEROXISOMAS ................................... 49 1.8.1. FUNCIONES DE LOS PEROXISOMAS................................................... 50 1.8.2. INTERNALIZACIÓN DE PROTEÍNAS PEROXISOMALES..................... 52 1.8.3. LAS SEÑALES TIPO PTS1 Y SU SISTEMA DE INTERNALIZACIÓN ... 52 1.9. LA SÍNTESIS DE CISTEÍNA Y METIONINA EN S. cerevisiae.......................... 55 1.9.1. ASIMILACIÓN DEL AZUFRE................................................................... 56 1.9.2. SÍNTESIS DE LA METIONINA................................................................. 59 1.9.3. LA TRANSULFURACIÓN Y LA SÍNTESIS DE CISTEÍNA...................... 61 Indice 1.9.4. REGULACIÓN DE LA RUTA ................................................................... 62 1.9.4.1. EL COMPLEJO Cbf1-Met4-Met28 ............................................... 63 1.9.4.2. LOS REGULADORES Met31 y Met32......................................... 68 2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 71 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 76 3.1. MICROORGANISMOS UTILIZADOS ................................................................. 77 3.1.1. Cepas de S. cerevisiae ........................................................................... 77 3.1.2. CEPAS DE E. coli .................................................................................... 78 3.2. PLÁSMIDOS........................................................................................................ 78 3.3. MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 80 3.4. MANIPULACIÓN DE MICROORGANISMOS ..................................................... 82 3.5. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR.......................................................... 82 3.5.1. EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO DE S. cerevisiae.......................... 82 3.5.2. TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE .................................................. 83 3.5.3. CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES NULOS SIMPLES Y MÚLTIPLES DE S. cerevisiae........................................................................................... 84 3.5.4. PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Gto RECOMBINANTES............ 85 3.5.5. ANÁLSIS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN S. cerevisiae POR DIG NORTHERN............................................................................................ 86 3.5.6. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA UTILIZANDO MICROORDENAMIENTOS DE DNA ....................................................... 91 3.5.7 AISLAMIENTO Y SUBFRACCIONAMIENTO DE MITOCONDRIAS A PARTIR DE CÉLULAS DE S. cerevisiae ................................................ 94 3.6. TÉCNICAS BIOQUÍMICAS ................................................................................. 94 3.6.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN INTRACELULAR DE GLUTATIÓN OXIDADO Y REDUCIDO.................................................. 94 3.6.2. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS ................................................................ 95 3.7. LOCALIZACIÓN MICROSCÓPICA DE PROTEÍNAS MARCADAS CON GFP. 96 3.8. ANÁLISIS In silico .............................................................................................. 96 4. RESULTADOS ........................................................................................................... 97 4.1. EL GENOMA DE S. cerevisiae CONTIENE TRES ORF QUE CODIFICAN PROTEÍNAS HOMÓLOGAS A LAS GST DE CLASE OMEGA........................ 99 4.2. HOMÓLOGOS DE LOS GENES GTO EN OTROS MICROORGANISMOS.. 100 4.3. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS In vitro E In vivo DE LAS PROTEÍNAS Gto103 4.3.1. PURIFICACIÓN Y ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS IN VITRO DE LAS PROTEÍNAS Gto1, Gto2, Gto3 Y Gtt1 ................................................ 103 4.3.2. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS IN VIVO DE Gto1, Gto2, Gto3 .......... 107 Indice 4.3.3. LA ACTIVIDAD GLUTAREDOXINA DE Gto2 REQUIERE DEL RESÍDUO CISTEÍNA EN POSICIÓN 46 .............................................. 108 4.4. Gto1 SE LOCALIZA EN EL PEROXISOMA, MIENTRAS QUE Gto2 Y Gto3 ESTÁN EN EL CITOPLASMA........................................................................ 109 4.5. EXPRESIÓN DE LOS GENES GTO EN CONDICIONES OXIDANTES........ 112 4.6. DEFECTOS FENOTÍPICOS DE LOS MUTANTES QUE CARECEN DE LOS GENES GTO Y GTT EN S. cerevisiae ......................................................... 116 4.7. LA FUNCIÓN DE Gto1 Y LAS Gtt TIENEN UN EFECTO ADITIVO EN LA PROTECCIÓN FRENTE A LA TOXICIDAD DEL CADMIO........................... 118 4.8. EL MUTANTE ∆gto1 NO CRECE NORMALMENTE EN MEDIO CON ÁCIDO OLÉICO .......................................................................................................... 119 4.9. LA MUTACIÓN DE GTO1 EN S. cerevisiae AFECTA EL METABOLISMO DE LOS AMINOÁCIDOS QUE CONTIENEN AZUFRE ....................................... 120 4.10. RELACIÓN ENTRE EL FUNCIONAMIENTO DE LOS PEROXISOMAS Y LA VÍA DE ASIMILACIÓN DEL AZUFRE EN S. cerevisiae............................... 125 5. DISCUSIÓN .............................................................................................................. 131 6. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 141 7. ABREVIATURAS ..................................................................................................... 145 8. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 149 9. APÉNDICE ARTÍCULO 1 ARTÍCULO 2 1. INTRODUCCIÓN 1 Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1.1. COMPUESTOS XENOBIÓTICOS Y SU CONVERISIÓN ENZIMÁTICA Los xenobióticos son compuestos de origen no biológico, producto de las actividades humanas y de descomposición lenta. Entre ellos encontramos los fungicidas, insecticidas, fármacos, carcinógenos, y agentes mutagénicos. Los seres vivos se exponen continuamente a compuestos xenobióticos que pueden interactuar de manera deletérea con el organismo, causando efectos tóxicos y, en algunos casos, carcinogénicos. Aunque la cantidad de estos xenobióticos ha aumentado en los dos últimos siglos, los compuestos tóxicos existen desde hace tanto tiempo como la vida misma. Así, existen compuestos tóxicos naturales como los fenoles y alcaloides que producen algunas plantas, las aflatoxinas de los hongos, las especies reactivas de oxígeno originadas por el propio metabolismo aerobio, y productos de la peroxidación lipídica como el 4-hidroxinonenal (4-HNE). Las habilidades que tienen los organismos para sobrevivir a estas amenazas químicas posiblemente representan una adaptación biológica fundamental para permanecer en la naturaleza. Las células poseen un gran conjunto de enzimas capaces de transformar una amplia variedad de compuestos con diferentes estructuras químicas y funciones, reduciendo o eliminando su toxicidad. Entre estas habilidades se encuentran una serie de procesos que permiten inactivar o expulsar dichos compuestos tóxicos, entre los cuales se pueden mencionar la unión con compuestos intracelulares y la detoxificación enzimática. La detoxificación enzimática de xenobióticos sucede en tres fases principales que funcionan de manera integrada (Sheehan et al., 2001). Las fases I y II involucran la conversión de los xenobióticos hidofóbicos o no polares en compuestos más solubles en agua y así menos tóxicos para el organismo. En la fase III el compuesto, que ahora es más soluble, puede ser eliminado fácilmente del citoplasma celular (Figura 1). La fase I es catalizada principalmente por el sistema del citocromo P450. Esta familia de proteínas microsomales es responsable de un gran conjunto de reacciones, que implican procesos de oxidación, reducción o hidrólisis. Estas reacciones tienen como fin la introducción de un grupo funcional, lo cual se conoce como activación. De las reacciones de activación, la oxidación aparece como una de las más importantes. 3 Introducción Figura 1. Descripción de los diferentes pasos en la detoxificación celular del benzo[a]pireno y algunos de los metabolitos formados durante el proceso. Tomado de Sheehan et al. (2001). Las enzimas de la fase II catalizan la conjugación de los xenobióticos activados con sustratos endógenos solubles como glutatión reducido (L-γ-glutamil-L-cystenil-glicina o GSH), ácido glucorónico-UDP, sulfato, glucosa o glicina. Dado que la concentración intracelular del glutatión es alta (hasta 10mM), muchos de los compuestos xenobióticos tienen el potencial de reaccionar espontáneamente con el grupo SH del GSH. Sin embargo, el proceso de formación de conjugados con GSH (GS-X) es mucho más eficiente cuando intervienen las glutatión transferasas o GST. Estas reacciones de conjugación incrementan el peso molecular y la solubilidad de los compuestos tóxicos y, además, dan carga negativa a la molécula. La conjugación con GSH tiene una importancia particular porque los sustratos de esta reacción frecuentemente son compuestos altamente electrofílicos y la unión de GSH evita que puedan unirse covalentemente a macromoléculas intracelulares. Este paso tiene como fin la neutralización de los sitios electrofílicos y que los compuestos tóxicos sean más solubles. Cuantitativamente, la conjugación con GSH, la cual es catalizada por las GST, es la principal reacción de la fase II en muchas especies. Aunque es difícil causar una reducción intracelular de GSH, cuando esta reducción ocurre, posteriormente se genera 4 Introducción un efecto tóxico dentro de la célula. Los compuestos glutationilados son metabolizados a través del corte de los residuos de glutamato y glicina, seguido de una acetilación del grupo amino del residuo cisteinil resultante para producir finalmente ácidos mercaptúricos, como los derivados S-alquilados de la N-acetilcisteína. Todos estos cambios causan que los productos de la fase II de la detoxificación tengan una permeabilidad muy baja a través de las membranas y que no puedan difundir pasivamente fuera de la célula. El siguiente paso en la detoxificación celular es la fase III, en la cual se expulsan del citoplasma dichos compuestos glutationilados generados en las dos fases anteriores. Para ello la célula cuenta con una serie de proteínas encargadas de enviar los compuestos glutationilados fuera del citosol. En el caso de las células animales, sus membranas contienen una serie de transportadores entre los cuales se han descrito los transportadores multiespecíficos de aniones inorgánicos o MOAT (de “Multiespecific Organic Anion Transporter”) (Heijn et al., 1992), la dinitrofenol S-GSH ATPasa (Dnp-SG ATPasa) (Saxena et al., 1992), la proteína de membrana MRP1(de “Multidrug Resistance-asociated Protein”) (Cole et al., 1992), la glicoproteína-P (Gottesman y Pastan, 1993) y la CFTR (de “Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulador protein”) (Welsh et al., 1992). En el caso de las levaduras, se han descrito dos bombas de expulsión: la bomba GS-X dependiente de ATP, Ycf1 (Ishikawa, 1992), y el transportador Bpt1 (Sharma et al., 2002). Ambas son homólogas a las proteínas transportadoras MRP1 (Cole et al., 1992) y CFTR (Szczypka et al., 1994) de humanos, y están localizadas en la membrana de la vacuola. En los humanos, el hígado es el principal órgano en el que se lleva a cabo el metabolismo de compuestos químicos externos como los fármacos, compuestos tóxicos y carcinógenos. En las células hepáticas suceden los procesos de detoxificación celular que culminan con la excreción de los compuestos glutationilados a través de la bilis o al torrente sanguíneo. Finalmente los compuestos metabolizados son expulsados del cuerpo por las heces o la orina en forma de ácidos mercaptúricos. Durante varias décadas hubo una gran especulación acerca del origen de la cisteína usada para la biosíntesis de los ácidos mercaptúricos y una serie de experimentos con extractos celulares de hígado de rata y conejo dieron pistas muy importantes acerca del origen de la cisteína asociada a estos metabolitos. 5 Introducción En 1.959 se determinó que extractos celulares de hígado de conejo eran capaces de transformar el p-(clorobencil)-cloruro en p-(clorobencil)-glutatión y la formación posterior del ácido mercaptúrico correspondiente se comprobó tanto in vivo como in vitro (Bray et al., 1959b; 1959a). En 1.961 se describió por primera vez la purificación parcial y algunas propiedades de ciertas enzimas hepáticas de rata que facilitaban la formación de derivados glutationilados de varios compuestos como el 3,4diclorobenceno y el sulfobromoftaleína sódica (Booth, 1961; Combes y Stakelum, 1961; Al-Kassab et al., 1963). En ambos casos se demostró la sustitución del ion cloruro y bromuro respectivamente por una molécula de GSH. Para ese momento, el nombre de las enzimas que catalizaban la reacción de sustitución del ión electrofílico en estos compuestos era glutationasas o glutatioquinasas. Posteriormente, en 1.963 se determinó que estas enzimas, además de sustituir iones halogenados de compuestos bencénicos, también eran capaces de desplazar el grupo nitrato del compuesto policloronitrobenceno sustituyéndolo por una molécula de GSH (Al-Kassab et al., 1963). Todos estos estudios incitaron el interés sobre las GST, como se les conoce actualmente, que culminaron con análisis genéticos y enzimológicos junto con la determinación de las estructuras tridimensionales de muchas de ellas. Actualmente, se considera a las GST como una superfamilia de proteínas que catalizan el ataque nucleofílico del átomo de azufre de la molécula de GSH sobre compuestos electrofílicos endógenos o exógenos participando en la fase II del proceso de detoxificación celular. Diversas revisiones (Pickett y Lu, 1989; Armstrong, 1997; Hayes et al., 2005; Oakley, 2005) amplían la visión actual de esta superfamilia de enzimas. 1.2. ESTRUCTURA Y EZIMOLOGÍA DE LAS GLUTATIÓN TRANSFERASAS (GST) 1.2.1. ESTRUCTURA BÁSICA La estructura básica de las GST consiste en dos dominios, N y C-terminal. El dominio N-terminal tiene un plegamiento característico de la superfamilia tioredoxina (Martin, 1995), la cual incluye también como miembros a las tioredoxinas, glutaredoxinas, disulfuro isomerasas y glutatión peroxidasas. El dominio N-terminal constituye alrededor de la tercera parte de la proteína y consiste en una estructura β−α−β−α−β−β−α. El centro del dominio está compuesto de tres láminas beta situadas entre hélices alfa (α/β/α) (Figura 2). El dominio C-terminal compone los otros dos tercios 6 Introducción de la proteína y está constituido por varias hélices alfa. El centro del dominio consiste en la agrupación de cuatro de estas hélices (Figuras 2 y 3). Figura 2. Estructura común de la superfamilia de GST. Las hélices están representadas como cilindros y las láminas beta están representadas como flechas. El dominio tioredoxina corresponde a las láminas beta rodeadas de varias hélices alfa. Tomado de Board et al. (2000). La principal función del dominio N-terminal es proporcionar el sitio de unión del GSH, el cual se localiza al final de una lámina beta, interaccionando la molécula de GSH con la proteína a través de uniones electrostáticas y puentes de hidrógeno. En el caso del sustrato, este se coloca dentro de una hendidura generada por los dos dominios N y C-terminal y realiza una serie de contactos con los residuos del dominio C-terminal, especialmente entre la hélice α4 y el extremo final. Por lo tanto, la función del dominio Cterminal es proporcionar los elementos estructurales para el reconocimiento del sustrato y ayudar a definir la selectividad de cada tipo de GST hacia el sustrato. Otro aspecto común entre las GST es el asa que conecta a la hélice α2 y la lámina β3; esta asa contiene una prolina en conformación cis y se la conoce como el asa cis-Pro. Aunque el 7 Introducción asa no juega un papel directo en la actividad catalítica, es importante para mantener la proteína con una estructura adecuada para su actividad. Extensión N-terminal Extensión N-terminal Figura 3. Estructuras tridimensionales de subunidades de GST. Los dominios N-terminal y C-terminal están representados en rojo y azul respectivamente. Los residuos esenciales para la actividad catalítica (tirosina en a, b y d; cisteína en c) están representados en color amarillo. Los ligandos con los que fueron cristalizadas están representados en verde. Las hebras de unión que conectan los dos dominios están representadas en violeta. Las estructuras del diagrama corresponden a (a) GST clase Sigma del camarón, (b) GST Omega humana (la extensión C-terminal, que corresponde a los residuos 1 al 19 se representan en negro y es característica de esta clase), (c) GST clase Beta de Proteus mirabilis, (d) GST clase Mu de Fasciola hepatica. Tomado de Sheehan et al. (2001). Respecto de la estructura cuaternaria, las GST suelen formar dímeros en los que existe una simetría C2, y las principales interacciones entre las subunidades suceden entre el dominio N-terminal de una subunidad con la C-terminal de la otra. No se ha descrito actividad catalítica de los monómeros de GST de mamíferos y estudios de desnaturalización proteica sugieren que el proceso ocurre en dos etapas, lo que pone en evidencia que la conformación de la estructura catalíticamente activa es dimérica (Dirr y Reinemer, 1991; Erhardt y Dirr, 1995). Estas conformaciones diméricas estabilizan la estructura terciaria de cada una de las subunidades y posiblemente la estructura de cada uno de sus dominios. Por el contrario, se han descrito unidades monoméricas activas como GST en Arabidopsis thaliana, las cuales componen un grupo especial de GST. Esta superfamilia de GST vegetales utilizan el GSH como co-factor o co-sustrato en su actividad catalítica y tienen una serina o una cisteína en su sitio activo 8 Introducción (Edwards y Dixon, 2005). Por otro lado, se han descrito las proteínas CLIC (de “intracelular Chloride Ion Chanels”) que son una familia especial de proteínas solubles o integradas a las membranas citoplasmáticas o de organelos (Oakley, 2005). Estas proteínas tienen el plegamiento típico de las GST pero se encuentran como monómeros, lo que indica que el plegamiento de las GST puede ser estable como unidades independientes. Una secuencia similar al sitio activo de las glutaredoxinas monotiólicas está presente en el dominio N-terminal de las CLIC pero no se ha detectado actividad catalítica en CLIC1 humana. Sin embargo, CLIC2, que es muy similar a CLIC1, tiene una actividad GSH peroxidasa baja y es modulador de la actividad del receptor cardiaco de rianodina 2 (Oakley, 2005). 1.2.2. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA 1.2.2.1. SUPERFAMILIAS DE GST La gran variedad de proteínas con actividad GST y su presencia a lo largo de toda la escala evolutiva hace que su clasificación resulte compleja e, incluso, confusa. Existen cuatro superfamilias de GST: canónicas, mitocondriales, microsomales, y fosfomicina/glioxalasa (Oakley, 2005; Pearson, 2005). La superfamilia de las canónicas es la más extensa y a ella pertenecen las enzimas solubles o citosólicas, de estructura dimérica, que están involucradas principalmente, pero no exclusivamente, en la biotransformación de los tóxicos xenobióticos o endobióticos. Las GST citosólicas están divididas a su vez en clases designadas como Alpha, Mu, Pi, Sigma, Theta, Zeta y Omega. Esta distinción en clases se ha hecho con base en la clasificación de las GST citosólicas de mamíferos. Justo después de descubrir las GST de mamíferos, se describieron las GST vegetales, que se han considerado como una superfamilia compleja, diferenciada y que está compuesta también por un número discreto de clases. A la superfamilia de GST citosólicas se unieron nuevas clases descubiertas en plantas (Phi, Tau, Lambda DHAR y TCHQD) y también se caracterizaron otras isoenzimas que pertenecen a las clases ya descritas en mamíferos (Theta y Zeta). La caracterización y clasificación de esta superfamilia se ha hecho recientemente (Dixon et al., 2002). La superfamilia de las GST mitocondriales fueron originalmente denominadas como “clase Kappa” por una inferencia errónea en su homología con las citosólicas. Esta homología estaba basada en una similitud parcial entre secuencias de aminoácidos, longitud y estructuras diméricas. De hecho, las proteínas de la “clase 9 Introducción Kappa” de mamíferos no tienen una similitud de secuencia estadísticamente significativa con ninguna de las GST canónicas (Pearson, 2005). En general, las GST mitocondriales comparten una fuerte similitud con la familia de las ácido 2-hidroxicromeno-2-carboxílico isomerasas (HCCI), que son de origen procariota. Estas enzimas están implicadas en el catabolismo del naftaleno (Eaton, 1994) y de compuestos dibencílicos (Di Gregorio et al., 2004). Las diferencias existentes entre las GST citosólicas y las mitocondriales sugieren que ambas tienen un origen evolutivo diferente y que las mitocondriales son más antiguas que las canónicas (Pearson, 2005). La tercera superfamilia, las microsomales, está compuesta por enzimas de estructura probablemente trimérica que se hallan involucradas en el metabolismo del ácido araquidónico. A esta superfamilia también se le conoce como MAPEG (de “Membrane-Asociated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism”). Las MAPEG difieren considerablemente en tamaño y estructura de las GST citosólicas y las mitocondriales. Las GST microsomales son cortas comparadas con las citosólicas (150160 aminoácidos, comparadas con los 210-240 aminoácidos de las citosólicas), y en humanos se han descrito tres GST microsomales: MGST1, MGST2 y MGST3. MGST1 tiene una alta homología con la enzima prostaglandina E sintasa, mientras que MGST2 la tiene con la proteína activadora de la 5-lipoxigenasa y con la leucotrieno C4 sintasa (Bresell et al., 2005). El conjunto de las GST bacterianas se conoce como la superfamilia de las fosfomicina/glioxalasa e incluye las descritas en los géneros Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Burkholderia y Rhodococcus (Vuilleumier, 1997). Las enzimas de esta superfamilia participan en la resistencia a antibióticos realizando actividades de conjugación de GSH a los mismos, además de ser capaces de unirse a las moléculas de antibiótico directamente. 1.2.2.2. CLASES DE GST Aunque no existe un criterio claro respecto al grado de similitud en secuencia que permita clasificar a una GST en una clase en particular, en general se acepta que las enzimas de una misma clase comparten al menos un 60% de identidad, habiendo entre clases al menos un 30% de identidad. Para la clasificación se hace énfasis en la estructura primaria del extremo N-terminal ya que, entre clases, esta región tiende a estar relativamente conservada al ser parte del sitio activo. Esta región contiene un 10 Introducción residuo esencial, que puede ser una tirosina, serina o cisteína, que interacciona con el grupo tiol del GSH, reduciendo su pKa de 9.0 hasta 6-7 (véase apartado 1.2.3.). Dentro de una clase se agrupan uno o más polipéptidos, los cuales representan tipos únicos de subunidades (Mannervik et al., 2005). Cada clase puede incluir hasta cinco polipéptidos que comparten entre sí una homología muy alta (hasta de un 90%). Sin embargo se ha propuesto un límite de homología alternativo del 50% para los péptidos que pertenecen a las clases de GST de mamíferos (Mannervik et al., 1992). Por otra parte, también se han utilizado técnicas inmunológicas para identificar la expresión de las GST en diferentes tejidos y para determinar la relación inmunológica entre subunidades individuales. Un anticuerpo policlonal contra una clase de GST de una especie en particular puede tener una reacción cruzada con una GST de la misma clase pero de especies diferentes. Por el contrario, una reacción inmunológica cruzada no ocurre entre clases aunque se comparen GST de la misma especie (Hayes y Mantle, 1986). Las propiedades cinéticas, como especificidad de sustrato y sensibilidades a inhibidores, se pueden usar para distinguir diferentes isoenzimas. Sin embargo, algunos de estos valores se superponen o tienden a ser muy similares entre clases, lo cual no permite que este método se utilice para hacer una distinción definitiva entre las clases de GST. En cambio, esta distinción es posible hacerla tomando como base las secuencias o los análisis inmunológicos. Comparando las GST de mamíferos, las propiedades de actividad enzimática son útiles únicamente cuando la similitud entre las secuencias es baja y generan mejores resultados cuando se llevan a cabo análisis multivariados, es decir, utilizando varios sustratos dentro de un mismo análisis. A pesar de esto, las actividades enzimáticas son un método pobre de clasificación de las GST de mamíferos y no es útil extenderlo hacia la clasificación de GST de otros organismos diferentes como plantas, procariotas o insectos. El 1-cloro-2,4-dinitrobenceno o CDNB era considerado el sustrato universal de las GST pero varias de las clases descritas no son activas frente a este sustrato, como es el caso de la clase Omega. Por consiguiente, no es posible utilizarlo como referencia de clasificación respecto de la actividad enzimática, aunque pueda tenerse en cuenta como una característica particular. De acuerdo con los criterios descritos anteriormente, las GST de mamíferos se clasifican dentro de las clases Alpha, Kappa, Mu, Pi, Phi, Sigma, Theta, Zeta y Omega. Con base en ellas se ha hecho la clasificación de GST de otros organismos y además 11 Introducción se han descrito clases nuevas como es el caso de las Lambda, Tau y DHAR (de “Active glutathione-dependent DeHidroascorbate Reductases”) que actualmente son exclusivas de plantas. Además, existen otras clases caracterizadas en helmintos, insectos, hongos y bacterias. Así pues, la nomenclatura de estas enzimas se ha llevado a cabo atendiendo fundamentalmente a las GST humanas citosólicas (Mannervik et al., 1992), lo cual en principio es aplicable para todas las GST de vertebrados y extensible a las de otros organismos. Las GST humanas se han nombrado respecto de la clase en la que pueden estar contenidas (A, M, P, T y O para Alpha, Mu, Pi, Theta y Omega respectivamente), acompañado de la cantidad de subunidades que la componen o el tipo de isoenzima, que se designa con números arábigos. Por ejemplo, un homodímero de tipo Mu se denomina M1-1 y los heterodímeros de tipo Alpha se denominan A1-2. Además, la nomenclatura puede ir acompañada de la especificación de las variaciones alélicas: M1a-1b. Cuando es necesario distinguir GST de diferentes especies biológicas, se agregan prefijos. Por ejemplo mGST A1-1 y rGST A1-1 se refieren a enzimas de la clase Alpha de ratón (mouse GST) y de rata (rat GST) respectivamente. Esta distinción puede ser importante porque no existe una correspondencia estricta entre las subunidades de diferentes especies y permite identificar los ortólogos. Clase Alpha, Mu y Pi: Respecto de las características, la interfase entre las subunidades de las clases Alpha, Mu y Pi tienen una conformación hidrofóbica de “esfera-bolsillo”. Esta se establece entre la cadena lateral de la fenilalanina (F52, Alpha; F56, Mu; F47, Pi), que sobresale del asa formada entre la hélice α2 y la lámina β3 del dominio N-terminal de un monómero, con el “bolsillo” localizado entre las hélices α4 y α5 del dominio N-terminal del otro monómero (Figura 4) (Sheehan et al., 2001). Esta interacción tan particular no se observa en las clases Sigma y Theta, ya que los residuos fenilalanina del asa y el “bolsillo” en donde encajan no existen en ellas. La base estructural para el reconocimiento de las subunidades entre las clases más cercanas (Alpha, Mu, Sigma y Pi) parece estar relacionada con la rotación de ambos dominios en las subunidades que interaccionan. Los dos dominios tienen orientaciones bastante diferentes en estas tres clases, en las cuales la superficie de una clase no es completamente compatible con la otra, lo cual se evidenció comparando la estructura de la clase Alpha con las clases Mu y Pi (Sinning et al., 1993). Por otro lado, las tres clases poseen una tirosina en el 12 Introducción dominio N-terminal (localizada en la lámina β1) que es importante para su actividad catalítica. Las enzimas de la clase Mu tienen en su estructura un asa característica (Muloop) que se encuentra entre β2 y α2. El dominio C-terminal de la clase Alpha contiene una α-hélice extra (α9) que se incluye en la parte hidrofóbica del sitio de unión del sustrato, lo que resulta en un bolsillo mucho más hidrofóbico comparado con la misma región de las clases Mu y Pi. Esta hélice extra es importante para la estabilidad del dímero y para la unión de ligandos que son transportados por ellas. Además, afecta a la tasa de unión del GSH y el estado de ionización de la Tyr9, que es esencial para la actividad catalítica. Clase Theta: Las enzimas de la clase Theta en mamíferos se descubrieron de manera tardía, ya que no se unen por afinidad a matrices como GSH-agarosa o S-hexil-GSH-agarosa. Esta clase sólo guarda un 7% de identidad con las clases Alpha, Mu y Pi. Sus miembros tienen especificidad por un único sustrato y no todas las enzimas que pertenecen a esta clase son activas sobre el sustrato CDNB. A diferencia de las Alpha, Mu y Pi, la clase Theta tiene una serina en el sitio activo de la región N-terminal en lugar de una tirosina. Esta clase está ampliamente distribuida en la naturaleza y se encuentra en plantas, bacterias, insectos y en otros organismos. En humanos se han descrito dos homodímeros (hGST T1-1 y hGST T2-2), en los que las dos subunidades solo comparten un 50% de similitud (Pemble et al., 1994; Schroder et al., 1996). Clase Sigma: Respecto de las enzimas de la clase Sigma, éstas están relacionadas con la síntesis de prostaglandina y en parásitos estimulan la síntesis endógena de este compuesto. Los homólogos en vertebrados, que también pertenecen a esta clase, tienen una actividad muy alta como prostaglandina D sintasa y se han identificado en rata, ratón, pollo y humanos (Sheehan et al., 2001). Cuando se analiza su estructura, no todas las enzimas de esta clase tienen la interfase “bolsillo-esfera” de las clases Alpha, Mu, y Pi. El tipo de interfase que existe en los dímeros estabiliza las dos subunidades y las interacciones que se generan allí son importantes para el sitio activo. Por esta razón, ésta no es una característica definitiva para la distinción de las enzimas de la clase Sigma. Por ejemplo, la enzima purificada de calamar, la cual fue clasificada dentro de esta clase, no tiene este tipo de interfase en su sitio activo (Harris et al., 1991; Tomarev 13 Introducción et al., 1993). Por el contrario, la enzima hematopoyética humana, la prostaglandina D sintasa, que es una enzima de clase Sigma, tiene una interfase de tipo “esfera-bolsillo” similar a la de las clases Alpha, Mu y Pi (Kanaoka et al., 1997). hélice α-9 Asa Mu Figura 4. Estructuras de diferentes clases de GST diméricas. Las subunidades están identificadas en verde y azul, y los residuos serina o tirosina que interaccionan con el GSH están identificados en amarillo, mientras que el ligando con el que fue cristalizado está indicado en color rojo, localizando el sitio activo. Las estructuras características de de las clases Alpha y Mu se indican en color negro. (a) Alpha humana, (b) Pi humana, (c) Mu de rata, (d) Theta humana. Tomado de Sheehan et al. (2001). Clase Zeta: En referencia a la clase Zeta, es una de las clases filogenéticamente más conservadas, estando sus miembros ampliamente distribuidos en la naturaleza, desde plantas hasta humanos. Las enzimas de la clase Zeta tiene actividad maleilacetoacetato isomerasa. Esta enzima hace parte del catabolismo de la tirosina convirtiendo maleilacetoacetato en fumarilacetoacetato, y maleilacetona en fumarilacetona. Ambos sustratos son agentes alquilantes y se ha demostrado que estas enzimas son inactivadas por el ácido dicloroacético, lo cual resulta en la acumulación de maleilacetona. Al igual que para las clases Alpha, Mu y Pi, se han encontrado polimorfismos en la población humana, lo cual explica las diferencias individuales en el 14 Introducción metabolismo del dicloroacetato y del fluoroacetato (Fernandez-Canon y Penalva, 1998; Cornett et al., 1999; Tzeng et al., 2000). Clases Delta y Epsilon: Se han descrito además citosólicas en insectos que corresponden a las clases Delta y Epsilon. Ambas clases se han identificado en Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae y Aedes aegypti (Ranson y Hemingway, 2005; Tu y Akgul, 2005). Las enzimas de la clase Delta se expresan en niveles muy altos en insectos, sobre todo en los estados larvales iniciales, aunque se pueden obtener también a partir de extractos celulares de ejemplares adultos. La clase Epsilon está implicada en la detoxificación de insecticidas y, además, sus miembros tienen actividad peroxidasa, lo cual los hace importantes en la protección contra efectos secundarios del estrés oxidativo. Clase Omega: La clase Omega es una de las descritas más recientemente y fue hallada por análisis bioinformáticos de las bases de datos de secuencias humanas (Board et al., 2000). Se han descrito y caracterizado dos genes que se transcriben activamente en humanos y se les ha denominado hGSTO1 (Board et al., 2000) y hGSTO2 (Wang et al., 2005). Se ha identificado también un pseudogen humano al que se le ha denominado hGSTO3, estando localizado en el cromosoma 3 (Whitbread et al., 2003). Se han descrito ortólogos en cerdo (Rouimi et al., 2001), ratón (Ishikawa et al., 1998), rata (Ishikawa et al., 1998), Caenorhabditis elegans (Wilson et al., 1994), Schistosoma mansoni (Girardini et al., 2002), D. melanogaster (Tu y Akgul, 2005) y en el nematodo Onchocerca volvulus (Kampkotter et al., 2003) . Las principales características de esta clase de GST se determinaron a partir de la estructura cristalizada de hGSTO1-1 (Board et al., 2000). En esta estructura se observa el plegamiento típico de las GST canónicas y además comparten un 20 % de homología con los miembros de otras clases. Analizando el sitio de unión del sustrato en hGSTO1-1 se observa que es más abierto comparado con las GST de otras clases y expone de manera lineal una serie de residuos polares haciendo que el bolsillo de unión del sustrato sea menos hidrofóbico (Board et al., 2000). Este hecho, y que la apertura entre las dos subunidades sea mayor comparada con otras GST, sugiere que el sustrato 15 Introducción natural o de unión de la hGSTO1-1 no sea particularmente hidrofóbico y que la enzima activa pueda tratarse de una o varias subunidades (Board et al., 2000; Whitbread et al., 2005). Por otro lado, las enzimas de esta clase tienen una región rica en prolinas en posición N-terminal que es inusual en las demás clases. Respecto de la estructura primaria de GSTO2-2, una característica importante de las subunidades de esta enzima es su alto contenido de cisteínas. Existen 11 cisteínas en hGSTO2-2 y 15 en mGSTO2-2 en contraste con las 5 y 4 de hGSTO1-1 y mGSTO1-1 respectivamente (Whitbread et al., 2005). El alto contenido de cisteínas recuerda a proteínas estructurales como las queratinas, en donde sus propiedades estructurales están dadas por este contenido de cisteínas. Aunque el papel estructural de las subunidades de las GSTO2 no está determinado únicamente por esta característica, es importante anotar que otras GST juegan un papel estructural importante en los cristalinos de los cefalópodos (Tomarev et al., 1993). Otro aspecto importante en la secuencia de las subunidades de esta clase es la presencia en su sitio activo de una cisteína en vez de una tirosina o una serina (Board et al., 2000). Esta cisteína interactúa con el GSH formando un disulfuro mixto en su sitio activo. Esta característica puede relacionarse con la actividad tiol transferasa de la molécula, en la que se eliminan aductos S-tiolados formados entre las cisteínas de las proteínas y el GSH en respuesta a estrés oxidativo (Listowsky, 2005). Todo esto pone en evidencia la importancia que tienen este residuo cisteína y la formación del enlace disulfuro en la actividad catalítica de las GST de clase Omega (Board et al., 2000). Acerca de la estructura cuaternaria, se ha demostrado que la hGSTO1-1 forma homodímeros (Board et al., 2000), lo cual es consistente con la estructura cuaternaria de muchas GST citosólicas. Dada la presencia de la Cys32 en el sitio activo de las GSTO, las enzimas de esta clase tienen un amplio rango de actividades enzimáticas que son distintas a las presentes en otras GTS de mamíferos, mientras que algunas de las actividades típicas de las GST citosólicas no existen en esta clase. Por ejemplo, las GSTO no son activas frente al diclorometano y al ácido etacrínico. Además, la hGSTO1-1 y otras GST de esta clase tienen una actividad muy baja sobre el CDNB, excepto GSTO2-2 la cual tiene actividad alta sobre este sustrato (Wang et al., 2005). Sorprendentemente, la mutación de la Cys32 por alanina en hGSTO1-1 aumenta la actividad sobre CDNB (Board et al., 2000; Whitbread et al., 2005). 16 Introducción Dentro de las actividades enzimáticas descritas en la clase Omega están la tiol transferasa, dehidroascorbato reductasa (DHAR) y monometilarsenato reductasa. Todas estas reacciones son tiol dependientes de GSH o reacciones de reducción. En el caso de la actividad tiol transferasa, tanto hGSTO1-1 como hGSTO2-2 catalizan este tipo de reacciones (Board et al., 2000; Schmuck et al., 2005). Se han descrito varios métodos para medir la actividad tiol transferasa y uno de los sustratos usados es el 2hidroxietildisulfuro (HED). Este ensayo mide la tasa de formación de GSH oxidado (GSSG) acoplando la reacción a la actividad de la GSH reductasa y a la oxidación de NADPH (Holmgren y Aslund, 1995). Otra característica de la sustitución de la Cys32 por alanina en hGSTO1-1 es la pérdida de la actividad tiol transferasa de esta proteína (Whitbread et al., 2005). Otra de las actividades enzimáticas detectadas en las GST de clase Omega es la actividad DHAR. Esta actividad enzimática también depende de la presencia de la cisteína del centro activo y es característica de las glutaredoxinas (Washburn y Wells, 1999). Las GSTO catalizan la reducción dependiente de GSH del dehidroascorbato a ascorbato. A nivel biológico, este paso enzimático es vital para el reciclaje de la vitamina C (Whitbread et al., 2003). Aunque los estudios de Board et al (2000) demuestran que hGSTO1-1 tiene actividad DHAR, estudios recientes han demostrado que hGSTO2-2 tiene 70 a 100 veces más actividad a este nivel que hGSTO1-1 (Schmuck et al., 2005). Esta actividad enzimática también se ha detectado en la GSTO de cerdo (Rouimi et al., 2001) y de rata (Board et al., 2000). Estudios inmunohistoquímicos y funcionales de la enzima GSTO1-1 en ratas sugieren que tiene un papel importante en el mantenimiento de los niveles de ascorbato en el cerebro (Fornai et al., 2001). El papel más importante del ascorbato en este órgano parece ser el secuestro de los radicales libres y las ROS generadas en las células cerebrales (Rice, 2000). Esta actividad sugiere que las GSTO protegen de los procesos oxidativos que pueden estar implicados en las patologías de las enfermedades neurodegenerativas (Mattson, 2004). Se han realizado estudios en los que se pretendía determinar si existía una asociación entre los polimorfismos de las hGSTO y las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, pero los resultados son contradictorios (Li et al., 2003; Nishimura et al., 2004; Ozturk et al., 2005). Se ha examinado también la actividad DHAR de otras clases (Alpha, Mu, Pi, Theta, y Zeta) y con excepción de la GSTM2-2, la cual tiene una actividad muy baja sobre el dehidroascorbato, las demás se consideran esencialmente inactivas (Board et al., 2000). 17 Introducción Aparte de las actividades tiol transferasa y DHAR de hGSTO1-1 y hGSTO2-2, se ha reportado que además tienen actividad monometilarsenato reductasa (Zakharyan et al., 2001; Schmuck et al., 2005). Por otro lado, se considera a hGSTO1-1 como la enzima limitante de la vía de biometilación en el metabolismo del arsénico inorgánico (Zakharyan et al., 2001). La actividad monometilarsenato reductasa consiste en la reducción enzimática del metilarsenato o del ácido dimetilarsínico a costa de la oxidación de GSH a GSSG. La oxidación del GSH se sigue espectrofotométricamente ligando su reducción por la GSH reductasa y la oxidación de NADPH (Denton et al., 2004). El aspecto importante de esta actividad enzimática radica en la capacidad que tienen las células para metabolizar los compuestos inorgánicos del arsénico. Uno de ellos es el tióxido de arsénico, el cual es usado en el tratamiento de la leucemia promielocítica. En algunos pacientes se observan reacciones adversas al tratamiento con este óxido, lo cual sugiere que existe un componente genético que determina las diferencias en la capacidad para metabolizar el arsénico (Schmuck et al., 2005). Estudios recientes sugieren que el polimorfismo en hGSTO1-1 está asociado con un perfil inusual de excreción de arsénico por vía urinaria en pacientes expuestos a altas concentraciones de arsénico (Marnell et al., 2003). Sin embargo, no se ha determinado la actividad monometilarsenato reductasa en las diferentes variantes de hGSTO1-1 (Schmuck et al., 2005). Estas actividades enzimáticas descritas en las GSTO tienen relación con otras funciones biológicas. La hGSTO1-1 está relacionada con la modulación de los receptores de rianodina, los cuales son canales de calcio del retículo endoplásmico (RE). El mecanismo por el cual la hGSTO1-1 regula estos canales es desconocido, pero es importante anotar que la mutación de la Cys32 a alanina causa pérdida de este mecanismo de regulación (Dulhunty et al., 2001). Aunque no se conoce el papel fisiológico del mismo, se ha observado que hGSTO1-1 se sobreexpresa en líneas celulares de linfomas resistentes a la radiación terapéutica, lo que reduce la apoptosis y genera una movilización de calcio a través de los receptores de rianodina. Adicionalmente, hGSTO1-1 puede modular la respuesta inmune que depende de un incremento en la concentración de Ca2+ a través de los receptores de rianodina de los linfocitos B y T (Xu et al., 1996; Whitbread et al., 2005). Otra de las funciones adicionales que tiene la hGSTO1-1 es la interacción con fármacos inhibidores de la liberación de citoquinas. La interleucina-1 (IL-1) es un mediador proinflamatorio producido en los monocitos activados y en los macrófagos 18 Introducción (Dinarello, 1998). IL-1 no se libera constitutivamente y es necesario que ocurra un procesamiento postransduccional antes de ser liberada. Varias diarilsulfonilureas actúan como fármacos inhibidores de la liberación de citoquinas o CRIDs (de “Cytokine Release Inhibitory Drugs”) (Perregaux et al., 1992). Estas CRIDs inhiben el procesamiento post transcripcional de la IL-1β en los monocitos humanos activados. Estudios recientes describen que las CRIDs se unen a la hGSTO1-1 de los monocitos, y esta interacción puede determinar el mecanismo por el cual las CRIDs detienen el procesamiento postranscripcional de las IL-1β (Laliberte et al., 2003). La interacción entre CRIDs y hGSTO1-1 requiere la presencia de la Cys32 pero el papel exacto que la hGSTO1-1 tiene en este proceso no está determinado. Se especula que puede estar mediando la formación de canales de calcio ya que el procesamiento de la interleucina1β está asociado con cambios significativos de la homeostasis iónica celular (Laliberte et al., 2003). Otra posibilidad es que hGSTO1-1 esté mediando el procesamiento de la interleucina-1β a través de su actividad tiol transferasa, ya que la activación de los monocitos puede alterar el balance del estado redox y alterar el potencial de glutationilación de las proteínas. La glutationilación puede modular potencialmente la función de las proteínas a través del bloqueo de tioles funcionalmente importantes (Laliberte et al., 2003), y la actividad tiol transferasa, vía deglutationilación, podría regular el estado redox de estos grupos tiol. 1.2.3. MECANISMO CATALITICO DE LA REACCIÓN Las GST se pueden encontrar como monómeros, homodímeros o heterodímeros y las unidades que componen estas últimas siempre pertenecen a la misma clase. Hasta ahora no se ha descrito actividad catalítica de monómeros en mamíferos, pero en plantas se han descrito GST activas como monoméros en las clases Lambda y DHAR (Edwards y Dixon, 2005). Las GST catalizan la siguiente reacción general: GSH + R-X GSR +HX Respecto del funcionamiento de estas enzimas se deben abordar dos cuestiones importantes: ¿cuál es el mecanismo que le permite a la enzima reconocer y activar al GSH para el ataque nucleofílico? y ¿de qué manera las GST reconocen específicamente los sustratos electrofílicos? 19 Introducción 1.2.3.1. ACTIVACIÓN DEL GSH Uno de los aspectos fundamentales del mecanismos catalítico de las GST es la manera en que estas enzimas usan las interacciones con el GSH para activar el átomo de azufre de esta molécula y así iniciar el ataque nucleofílico. El tripéptido GSH está unido en una conformación extendida, donde el residuo γ-glutamil está dirigido hacia la interfase del dímero GST, mientras que el azufre del residuo cisteinil apunta hacia la subunidad a la cual está unido y se localiza cerca de la superficie de la proteína (Figura 5). OMEGA DELTA Figura 5. Disposición del GSH en el sitio activo de las GST. El GSH y los residuos que interactúan con el GSH a través de puentes de hidrógeno están indicados mediante un esquema de barras. Los diagramas corresponden a: (BETA) GST clase Beta bacteriana, (OMEGA) hGSTO1-1, (DELTA) GST clase delta de mosquito. Tomado de Oakley (2005). La región más conservada estructuralmente en todas las enzimas GST citosólicas es el motivo ββα del centro activo, el cual se encarga de reconocer la porción γ-glutamil del GSH. Este elemento estructural de las GST empieza con un residuo cisprolil que está justo antes de la lámina β3 y que continúa con la hélice α3. La función de este residuo es permitir que se mantenga el plegamiento total del dominio. Existen dos residuos localizados entre la lámina β4 y la hélice α3 que están directamente 20 Introducción relacionados con este reconocimiento: un residuo glutamato o glutamina seguido de un residuo serina, treonina o cisteína (Figura 6). Figura 6. Representación del motivo conservado ββα de las GST responsable del reconocimiento del residuo γ-glutamil del GSH. El GSH y las cadenas laterales en la lámina β4 y la hélice α3 están indicadas mediante esferas y barras. Estas cadenas están involucradas en las interacciones por puentes de hidrógeno con el residuo γ-glutamil del GSH. Tomado de Armstrong (1997). Las enzimas de la clase Theta, la cual es considerada el precursor de las clases Alpha, Mu, Pi y Sigma, utiliza el grupo hidroxilo del residuo serina localizado cerca del dominio N-terminal del polipéptido para activar el átomo de azufre del GSH. Por otro lado, las clases Alpha, Mu, Pi y Sigma hacen esta misma interacción pero con el grupo hidroxilo de una tirosina que está en una posición ligeramente diferente a la serina de la clase Theta. El aminoácido hidroxilado actúa como donador de hidrógeno para el azufre, lo cual baja el pKa del tiol en el complejo E· GSH. Esto genera la ionización del complejo, lo que ocurre predominantemente a pH fisiológico. En la clase Alpha existen dos residuos relacionados con el enlace E· GSH: el residuo Tyr19 y la Arg15 (Armstrong, 1997) (Figura 7). Figura 7. Interacciones entre los sitios activos de las clases Theta, Alpha, Mu y el azufre del GSH. Tomado de Armstrong (1997). 21 Introducción En resumen, la especie reactiva de los complejos binarios formados entre las GST de cualquier clase y el GSH es probablemente el ion tiolato (GS-), el cual forma un puente de hidrógeno con el hidroxilo de la serina o de la tirosina de las GST. En el caso de la familia Alpha, este enlace se estabiliza con la carga positiva de la Arg15. Otro aspecto importante en la actividad catalítica es el papel que pueden tener otros residuos en la estabilidad del ion tiolato. Estos residuos pueden generar interacciones que aumentan la estabilidad de los puentes de hidrógeno del sitio activo o contribuir a crear un ambiente electropositivo cerca del ion tiolato, permitiendo así que disminuya el pKa y que aumente la estabilidad del sustrato electrofílico dentro de la enzima. Por ejemplo, se ha descrito el microdipolo generado por el puente de hidrógeno entre el NH del GSH y el grupo hidroxilo de la Tyr6 en la clase Mu (Figura 8). Figura 8. Interacciones electrostáticas en el sitio activo de la clase Mu (rGSTM1-1). Las interacciones con el azufre del GSH incluyen: (a) el puente de hidrógeno con el grupo + hidroxilo de la tirosina, (b) con una molécula de solvente o NH4 , (c) interacción con el anillo aromático de la Tyr6. Otras interacciones en la subunidad de rGSTM1-1 son (d) puente de hidrógeno entre la Tyr6 y la Thr13 de la rGSTM1-1 y (e) puente de hidrógeno entre el grupo amida del residuo Leu12 y el grupo hidroxilo de la Tyr6. Tomado de Armstrong (1991). Este puente de hidrógeno disminuye la afinidad por protones del grupo hidroxilo y aumenta la estabilidad del puente de hidrógeno con el azufre del GSH (Armstrong, 1991). Otro ejemplo en la clase Mu es el puente de hidrógeno formado entre el grupo hidroxilo de la Tyr13 y la Tyr6. En principio, este puente de hidrógeno disminuye la afinidad por protones del grupo hidroxilo de la tirosina haciendo que sea mejor donador de protones para el tiolato y que disminuya el pKa del ácido conjugado (Armstrong, 1991). 22 Introducción 1.2.3.2. ESPECIFICIDAD SOBRE SUSTRATOS ELECTROFÍLICOS La especificidad del sustrato que tiene cualquier enzima es función de la eficiencia de ésta para disminuir las barreras de activación de un proceso particular. Para entender completamente la especificidad catalítica de las GST es necesario conocer la naturaleza de los intermediarios y los estados de transición que se coordinan en la reacción. Estos intermediarios pueden variar en función del sustrato. Los grupos funcionales más electronegativos (F- y Cl-) forman rápidamente los compuestos intermedios de la conjugación pero los procesos posteriores para descomponer el sustrato conjugado son más complejos (Armstrong, 1991). El dominio C-terminal es el encargado de alojar el sustrato electrofílico y está formado básicamente por hélices α. El número de estas hélices varía entre clases de GST y las hélices 4α y 5α proporcionan un ambiente hidrofóbico para la estabilidad del sustrato dentro del dominio. Respecto de la posición del sustrato electrofílico dentro de la subunidad, éste se coloca sobre la estructura formada por la lámina β1 y la hélice α1 del dominio C-terminal. Estas dos estructuras dan forma a la base de la cavidad del dominio y los laterales o paredes están formados por hélices α y por la extensión final del dominio C-terminal. La forma de esta cavidad varía de una clase a otra, lo cual determina la variabilidad de sustratos que pueden ser transformados por estas enzimas. En muchas clases de GST la presencia de hélices o de asas en el dominio C-terminal contribuye a que el dominio tenga una plasticidad estructural variada. Por ejemplo, la hélice α9, que es característica de la clase Alpha, forma una base-soporte para el sustrato electrofílico en el dominio C-terminal. La clase Sigma tiene esta región más corta y eso trae como consecuencia que su sitio activo sea más abierto y las enzimas de tipo Mu tienen el asa característica de esta clase (Figura 1) (Armstrong, 1991). 1.2.4. LAS GST COMO GLUTATIÓN PEROXIDASAS La producción de especies reactivas de oxígeno o ROS (de Reactive Oxigen Species) a partir de la reducción parcial del O2 es una consecuencia inevitable de la respiración aeróbica. Estas ROS son el anión superóxido O2-, el peróxido de hidrógeno H2O2, y el radical hidroxilo (OH· ). Dichas especies químicas se producen principalmente en la fosforilación oxidativa, así como en las reacciones catalizadas por la 5lipoxigenasa, ciclooxigenasa, las enzimas del sistema del citocromo P450 y la xanteno oxidasa, entre otras (Hayes y McLellan, 1999). Las ROS son metabolizadas por la 23 Introducción actividad catalítica de enzimas como la superóxido dismutasa (SOD), catalasa, GPx y, de manera no enzimática, por el α-tocoferol, ácido ascórbico, GSH y bilirrubina. A pesar de estas defensas antioxidantes, las ROS causan daños en las membranas lipídicas, en el DNA, en las proteínas y en los carbohidratos. La oxidación de estas macromoléculas genera productos de degradación citotóxicos y mutagénicos (Marnett et al., 2003). Así, aunque el radical superóxido puede dañar directamente el DNA, también lo puede hacer de manera indirecta a través de la producción de metabolitos secundarios reactivos, lo cual hace parte de la amplificación del daño celular que causan los radicales libres. Un problema particular que generan los radicales libres es la peroxidación lipídica de los ácidos grasos polinsaturados, los cuales hacen parte de las membranas de los organelos y las membranas celulares. Esta peroxidación lipídica resulta de una reacción en cadena que a su vez amplifica el daño celular. El proceso produce peróxidos lipídicos que son autocatalíticos y se transforman en compuestos electrofílicos secundarios como los epoxialdehídos, 2-alquenales, 4-hidroxi-2-alquenales y ketoaldehídos, algunos de los cuales son genotóxicos (Marnett et al., 2003). El 4-hidroxinonenal (HNE) es uno de los 4-hidroxi-2-alquenales más importantes y su producción celular aumenta bajo estrés oxidativo (Awasthi et al., 2004). La acción y descontrol de la peroxidación lipídica causa daños celulares irreversibles que inducen la apoptosis (Yang et al., 2001). Algunos de los sistemas que protegen contra los productos generados a partir del estrés oxidativo son la aldehído deshidrogenasa, la alcohol deshidrogenasa, la aldo-ceto reductasa, las GPx dependientes de selenio y las GST (Hayes et al., 2005). Algunas clases de GST, además de su actividad transferasa dependiente de GSH, también tienen actividad GPx independiente de Se y pueden catalizar la reducción dependiente de GSH de hidroperóxidos de ácidos grasos (FA-OOH, de “Fatty Acid hydroperoxides”), hidroperóxidos de fosfolípidos (PL-OOH, de “PhosphoLipid hydroxyperoxides”) y de hidroperóxidos orgánicos no fisiológicos como el hidroperóxido de cumeno (CU-OOH) (Zhao et al., 1999; Yang et al., 2001). Sin embargo, a diferencia de las GPx dependientes de Se, las GST no usan el peróxido de hidrógeno como sustrato para su actividad GPx (Yang et al., 2001). Se han descrito una serie de actividades enzimáticas que indican la relación entre la actividad de las GST, la reducción de los hidroperóxidos lipídicos (actividad GPx independiente de Se) y la protección que estas enzimas proporcionan a través de su actividad GST contra un rango de compuestos electrofílicos, los cuales se generan durante el daño oxidativo de 24 Introducción las membranas celulares (Armstrong, 1997; Hurst et al., 1998; Prabhu et al., 2004). En humanos, rata y ratones la actividad GPx de las GST está asociada principalmente a la clase Alpha. También se ha purificado una GST de esta clase a partir de extractos de hígado de oveja y tiene actividad tanto GST como GPx independiente de Se (Prabhu et al., 2001). Se ha descrito que las clases Mu y Theta también tienen actividad GPx sobre PL-OOH (Hurst et al., 1998). Se ha demostrado que las enzimas hGSTA1-1 y hGSTA2-2 tienen una actividad alta como GPx sobre hidroperóxidos lipídicos, específicamente sobre FA-OOH y PL-OOH (Yang et al., 2001), y que la sobreexpresión de hGSTA2-2 en la línea celular K562 protege a las células contra la apoptosis inducida por peróxidos lipídicos e inhibe tanto a JNK como la activación de las caspasas (Yang et al., 2001). Además, la clase Alpha tiene una expresión alta en órganos con tasas metabólicas elevadas como es el caso del hígado, que está continuamente expuesto a ROS. El significado fisiológico de esta actividad GPx de la clase Alpha puede estar asociado con la localización celular, ya que del 3 al 5% del total de las proteínas solubles del hígado son GST y muchas de ellas pertenecen a la clase Alpha (Awasthi et al., 2004). En las reacciones que catalizan las hGSTA1-1/2-2, los peróxidos lipídicos son reducidos a los alcoholes correspondientes a costa de la oxidación del GSH (GSSG) y la formación de agua: PL-OOH + 2GSH FA-OOH + 2GSH CU-OOH + 2GSH PL-OH + GSSG + H2O FA-OH + GSSG + H2O CU-OH + GSSG + H2O Los hidroperóxidos lipídicos son el principal producto de la peroxidacón lipídica y son los que inician la propagación de una cadena autocatalítica. Esta cadena consiste en la autocatálisis del peróxido lipídico que genera compuestos electrofílicos como 4hidroxialquenos y más radicales libres. Estos radicales libres oxidarán otros ácidos grasos potenciando así la cadena de propagación de la reacción. Como se ha mencionado antes, la formación de HNE se incrementa durante el estrés oxidativo celular y se ha demostrado que las células que sobreexpresan hGSTA1-1 o hGSTA2-2 no incrementan la formación de HNE bajo estrés oxidativo (Yang et al., 2001; Yang et al., 2002). Aunque estos estudios se han llevado a cabo in vitro, también se ha demostrado que los procesos de regulación y control del estrés oxidativo también 25 Introducción ocurren in vivo en el hígado de ratones, ratas y humanos (Yang et al., 2001). Considerando que las GST aumentan su expresión bajo exposición a compuestos electrofílicos, estas enzimas pueden proteger a las células bajo condiciones fisiológicas normales o bajo estrés oxidativo, siempre y cuando la disponibilidad de GSH y de NADP (necesario para el reciclaje del GSSG a GSH) no sea un factor limitante. PUFA presente en membranas o en estado libre L-OH ROS L-OOH GSTA1-1 / GSTA2-2 GSH ATP GSSG NADPH GR NADP+ 4-HNE y otros 4-hidroxialquenales hGSTA4-4, hGST5.8 GS- HNE ADP GSH RLIP 76 Figura 9. Papel de las GST en la peroxidación lipídica. La peroxidación de los ácidos poliinsaturados (PUFA) se inicia por la acción de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y los radicales libres para generar peróxidos lipídicos (L-OOH), los cuales por autocatálisis propagan la peroxidación lipídica por una producción contínua de radicales libres. GSTA11 y GSTA2-2 reducen los L-OOH al alcohol correspondiente, rompiendo la cadena de peroxidación lipídica y limitando la producción de 4-hidroxinonenal (HNE). hGSTA4-4 y hGST5,8 conjugan el HNE con GSH formando GS-HNE, el cual es transportado fuera de la célula a través de los transportadores de membrana RLIP-76 o RALBP1. Tomado de Awasthi et al. (2004). Las GST también pueden regular la concentración del HNE por conjugación con GSH. Aunque el HNE es lo suficientemente electrofílico como para reaccionar espontáneamente con el GSH, las GST potencian la tasa de reacción (Alin et al., 1985). En humanos, ratones y ratas, se ha caracterizado la preferencia de las diferentes isoenzimas de la clase Alpha por los siguientes sustratos: PL-OOH, FA-OOH y el HNE (Awasthi et al., 2004). Esta caracterización permite especificar el papel de cada una de las isoenzimas de la clase Alpha durante el proceso que atenúa los efectos de la peroxidación lipídica (Figura 9). En resumen, los ácidos polinsaturados de las membranas celulares son oxidados por las ROS formando los peróxidos lipídicos. Estos 26 Introducción compuestos se autocatalizan generando más ROS y propagando así la peroxidación lipídica. GSTA1-1/2-2 reducen los peróxidos lipídicos al alcohol correspondiente, rompiendo la cadena de peroxidación lipídica y limitando la producción de HNE. hGSTA4-4 y hGST5,8 conjugan el HNE con GSH formando GSH-HNE, el cual es transportado fuera de la célula por las bombas RLIP76 o RALBP1 (Barrera et al., 1991). 1.3. LOCALIZACIÓN CELULAR DE LAS GST La localización celular de las GST puede variar a pesar que la mayoría de ellas son solubles. Las mayoría se han descrito en el citoplasma pero algunas están presentes en el núcleo (Soboll et al., 1995), los peroxisomas (Morel et al., 2004) y la mitocondria (Raza et al., 2002), donde pueden tener funciones peculiares para la integridad de estos organelos. Por ejemplo, GSTP1-1 en el núcleo puede estar asociada con la protección del DNA frente al daño inducido por la doxorubicina, causando la adquisición de resistencia a medicamentos usados en el tratamiento contra células tumorales (Goto et al., 2001). Se sabe también que las GST presentes en la mitocondria (GSTA1-1, GSTA4-4 y GSTM1-1) pueden tener un papel importante en la defensa frente al estrés químico y oxidativo (Raza et al., 2002). En el caso de la GST peroxisomal, hGSTK1-1, se ha clasificado dentro de la clase Kappa ya que comparte similitud de secuencia con este grupo de GST (69% con mGSTK1-1 y 71% con rGSTK11) así como por su localización exclusivamente peroxisomal y mitocondrial (Morel et al., 2004). Es importante anotar que algunas proteínas localizadas en RE y en mitocondria también se han detectado abundantemente en los peroxisomas de los fibroblastos de ratón (Islinger et al., 2006). Esta observación resulta importante, ya que estaría indicando una relación física entre estos tres organelos y una relación funcional entre las proteínas allí localizadas (Islinger et al., 2006). 1.4. IMPORTANCIA BIOLÓGICA DE LAS GST Una de las características más importantes de la superfamilia de las GST es la diversidad en la actividad enzimática, lo cual les permite participar en procesos metabólicos y enzimáticos diversos, como ya se indicó anteriormente. Esta diversidad enzimática las hace especialmente interesantes desde el punto de vista terapéutico y farmacológico, ya que algunas de sus actividades pueden relacionarse con aspectos puntuales del tratamiento de algunas enfermedades. Aunque el papel farmacológico de las GST en el metabolismo y detoxificación de xenobióticos está ampliamente descrito, 27 Introducción el significado de la conjugación catalizada por las GST de compuestos endógenos no se entiende por completo. Se ha descrito que los compuestos endógenos que tienen carbonos α, β-insaturados son sustratos potenciales de las GST. Algunos de los compuestos endógenos, particularmente aquellos que se han formado durante los procesos de degradación oxidativa de componentes celulares, son objeto de especial atención por su capacidad de atacar moléculas nucleofílicas, que pueden convertirse posteriormente en compuestos tóxicos (Awasthi et al., 2005). Las GST pueden catalizar la conjugación con GSH de compuestos endógenos alquenil α,β-insaturados como HNE, malonaldialdehído, acroleína, y bases propenales como citosina propenal, timina propenal y uracil propenal. Este proceso de conjugación con GSH protege contra la actividad de estos tóxicos potenciales (Alin et al., 1985; Berhane et al., 1994). Dada su naturaleza electrofílica, estos compuestos pueden reaccionar espontáneamente con el GSH pero la reacción es de 500 a 600 veces más rápida en presencia de las GST (Awasthi et al., 2005). También se considera la relación existente entre la patogénesis de algunas enfermedades y la actividad de las GST en el metabolismo de los productos de la peroxidación lipídica. Una de las hipótesis sobre la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer o AD es la relación que existe entre los niveles elevados de marcadores para estrés oxidativo y la degeneración neuronal (Markesbery, 1997). Este nivel elevado de estrés oxidativo en el cerebro de los pacientes con AD se caracteriza por un aumento en la peroxidación lipídica, proteínas oxidadas y DNA oxidado. Además, se ha detectado una reducción en la cantidad de ácidos grasos poli-insaturados en los cerebros de pacientes con AD (Smith et al., 1991; Mecocci et al., 1994; Hensley et al., 1995; Lovell et al., 1995). Teniendo en cuenta todos estos aspectos, posiblemente el HNE tiene un papel importante en la patogénesis de AD como producto de la peroxidación lipídica, ya que los niveles de este compuesto están también elevados en el cerebro de pacientes con AD (Markesbery y Lovell, 1998). Las GST pueden estar cumpliendo un papel protector frente al HNE, ya que el pretratamiento de cultivos primarios de células de hipocampo de ratón con GST y la posterior exposición a concentraciones tóxicas de HNE aumenta la superviviencia celular comparado con células no pretratadas (Xie et al., 1998). La actividad peroxidasa de las GST de clase Alpha también está relacionada con la protección frente a estrés oxidativo, ya que actúan sobre los hidroperóxidos de fosfolípidos. Se ha demostrado que la sobreexpresión de hGSTA1-1 en la línea celular K562 atenúa la peroxidación lipídica en condiciones normales y bajo estrés oxidativo generado por exposición a peróxido de hidrógeno (Yang et al., 2001). 28 Introducción El HNE, además de ser un producto de la peroxidación lipídica, también se considera como una molécula de señalización intracelular (Awasthi et al., 2003; Echtay et al., 2003; Uchida, 2003) y su conjugación con GSH catalizada por las GST puede influir en algunas vías metabólicas. El HNE está involucrado en una serie de enfermedades degenerativas como AD (Montine et al., 1997; Sayre et al., 1997), arteriosclerosis (Yang et al., 2004), cataratas (Awasthi et al., 1996) y también en cáncer (Zarkovic et al., 1995). Algunos estudios sugieren que el HNE puede afectar el ciclo celular, inducir apoptosis y diferenciación celular, modular el crecimiento celular y afectar varias vías de transducción de señal (Awasthi et al., 2005). Otro aspecto importante de los efectos del estrés oxidativo en las células cerebrales es el nivel de ascorbato intracelular y su relación con enfermedades neurodegenerativas como AD o Parkinson. Como se ha mencionado en el apartado 1.2.2.2., el ascorbato es considerado como un antioxidante importante en las células cerebrales y se ha implicado en la patogénesis de ambas enfermedades. Sumado a esto, la actividad DHAR, presente tanto en GSTO1-1 como en GSTO2-2, está relacionada con el reciclaje de la vitamina C, lo cual hace pensar que la variación de la expresión de las GSTO en determinado tipo de células cerebrales puede ser un factor importante en estos desórdenes neurológicos. Por otro lado, se ha observado que la expresión de rGSTO1-1 es abundante en tejidos cerebrales como el cerebelo e hipocampo y particularmente en las células afectadas en la enfermedad de Parkinson (Fornai et al., 2001), y se ha propuesto que su actividad DHAR representa el 65% de la actividad total en el cerebro (Fornai et al., 1999). Es especialmente relevante la posibilidad de considerar a las GST como dianas terapéuticas dada su relación con algunas enfermedades como el asma o la resistencia a tratamientos quimioterapéuticos del cáncer. Como se ha mencionado anteriormente, hGSTM2-2 es homóloga de la enzima leucotrieno C4 sintasa, la cual se considera también una GST (Piper, 1984; Ford-Hutchinson, 1990). Los leucotrienos y peptidoleucotrienos, como el LTD4, son importantes en la patogénesis de enfermedades como el asma por lo que la inhibición de la síntesis de LTD4 o de sus receptores representa una aproximación terapéutica importante en el tratamiento de esta enfermedad (Rushmore y Pickett, 1993). Los leucotrienos son derivados del ácido araquidónico, que son liberados de la célula como araquidonatos y luego convertidos en un epóxido inestable, el leucotrieno A4 o LTA4. Este compuesto es metabolizado de dos maneras diferentes, una por hidratación, generando LTB4 y otra por conjugación con 29 Introducción GSH, que es catalizada por la leucotrieno C4 sintasa. De hecho, los antagonistas de LTD4 y los inhibidores de la síntesis de leucotrieno han sido eficaces en el tratamiento del asma bronquial, y los datos sugieren que la leucotrieno C4 sintasa es la única GST necesaria para la producción de peptidoleucotrienos, lo cual la convierte en una diana terapéutica importante en la inhibición de la síntesis de estos compuestos (Rushmore y Pickett, 1993). Otro producto del metabolismo del ácido araquidónico es la prostaglandina H2 (PGH2). Las GST de la familia MAPEG catalizan la isomerización del PGH2 a prostaglandina E2 (PGE2) y prostaglandina D2 (PGD2), o la reducción a PFG2α (Hayes et al., 2005). Las GST citosólicas que se expresan en el cerebro humano tienen actividad PGE2 sintasa (Beuckmann et al., 2000) y las enzimas que pertenecen a la familia de las MAPEG contribuyen mayoritariamente a la producción de PGE2 (Nakashima et al., 2003). La actividad de las GST en el metabolismo de este tipo de mediadores lipídicos endógenos como las prostaglandinas clásicas (PGD2, PGE2 y PGF2α), influye en vías de señalización celular y esto tiene consecuencias a nivel biológico. El efecto más estudiado es el generado por el 15d-PGJ2. Este compuesto se produce a partir del metabolismo del PGD2, y su principal propiedad es funcionar como ligando activador del factor de trascripción PPARγ (de “Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ). Este factor de trascripción es un regulador crítico en la diferenciación de los adipocitos y también representa una diana molecular para medicamentos relacionados con la sensibilización a insulina. La sobreexpresión de las GST puede disminuir la transactivación de la expresión génica mediada por PPARγ a través de la conjugación del la prostaglandina con GSH, la cual es catalizada por las GST (Paumi et al., 2004). La habilidad de las GST para afectar la síntesis o la eliminación del PGD2, las coloca en el punto central de la regulación de este compuesto. En el caso de la resistencia a tratamientos quimioterapéuticos del cáncer, uno de los mecanismos que se ha propuesto para explicar este efecto es el incremento y/o expresión diferencial de una o más GST en las células tumorales resistentes. Un ejemplo de ello es la expresión diferencial en las células tumorales de pulmón, colon, hígado, ovario, esófago, y estómago (Procopio et al., 2005). Otro ejemplo es el aumento de la actividad GST en las líneas celulares provenientes de cáncer de mama, las cuales son resistentes a la adriamicina, atribuyéndose el 90% de esta actividad a GST de clase Pi (Batist et al., 1986). Los cambios en el sistema GSH/GST también se relacionan con la resistencia a los fármacos alquilantes utilizados en el tratamiento del cáncer, presumiblemente porque aceleran la detoxificación de estos compuestos antineoplásicos. Los compuestos alquilantes alteran la replicación del DNA causando 30 Introducción roturas en el DNA de cadena sencilla o doble, o generando entrecruzamientos. A pesar del éxito que tienen en el tratamiento contra el cáncer, uno de los problemas que presentan es la resistencia de algunos tipos celulares. La resistencia es de dos tipos, intrínseca o adquirida. Esta última aparece por alteraciones celulares que resultan de la exposición continua al fármaco, proporcionando a las células ventajas selectivas de superviviencia (Procopio et al., 2005). La resistencia se ha atribuido a múltiples factores, entre los cuales se incluyen la prevención de la entrada del fármaco en la célula, la alteración de los niveles de GSH y alteraciones en la expresión de algunas GST. En efecto, algunas GST catalizan la conjugación con GSH de agentes antineoplásicos específicos como el melfalán, clorambucil, ciclofosfamida, BCNU y mecloretamina, en entre otros (Procopio et al., 2005). Un estudio sobre dos líneas celulares de adenocarcinoma de ovario, provenientes de una paciente antes y después de la aparición de resistencia a la quimioterapia, mostró que la actividad GST de las dos líneas era diferente. La línea obtenida después de la aparición de la resistencia tiene una actividad GST tres veces mayor que la línea obtenida al inicio del tratamiento quimioterapéutico (Lewis et al., 1988). Por lo tanto, conocer la estructura cristalina de las GST y su sitio de unión del GSH, junto con el desarrollo de análogos del GSH, proporciona las bases para el desarrollo de competidores e inhibidores intracelulares que permitan evitar la acción de estas enzimas en los tejidos tumorales y mejorar la acción de los compuestos alquilantes en el tratamiento del cáncer (Procopio et al., 2005). En otros casos, la sobreexpresión de algunas GST protege las células de la acción de metabolitos tóxicos. Un ejemplo de ello es la sobreexpresión de hGSTP1-1 en una línea celular sensible a adriamicina. Esta línea celular tiene una actividad GST baja y no expresa isoenzimas de la clase Pi. Las células transfectadas son resistentes al benzo(a)pireno y al metabolito tóxico benzo(a)pireno-anti-7,8-dihidrodiol-9,10-epóxido comparadas con las células normales. Por otro lado, esta sobreexpresión también puede proteger de la acción de compuestos endógenos potencialmente tóxicos (Rushmore y Pickett, 1993). Otro de los procesos celulares en los que intervienen las GST es la degradación de compuestos aromáticos. En mamíferos la fenilalanina es degradada a acetoacetato y ácido fumárico. Entre los intermediarios de esta degradación están la tirosina, el maleilacetoacetato y fumarilacetoacetato. Como se mencionó en el apartado 1.2.2.2., las GST de clase Zeta son maleilacetoacetato isomerasas, por lo cual catalizan 31 Introducción el penúltimo paso del catabolismo de la fenilalalina y la tirosina (Fernandez-Canon y Penalva, 1998; Hayes et al., 2005). En la síntesis de hormonas esteroides, las GST también cumplen un papel activo. La progesterona y la testosterona se sintetizan a partir del metabolito del colesterol 3β-hidroxi-5-pregnen-20-ona. Dentro de los pasos de síntesis de ambas hormonas, las isoenzimas de GSTA catalizan la isomerización de uno de los intermediarios, comportándose como 3-keto-∆4-esteroide isomerasas (Pettersson y Mannervik, 2001). 1.5. GLUTATIÓN TRANSFERASAS A LO LARGO DE LA ESCALA EVOLUTIVA 1.5.1. GST BACTERIANAS Las cianobacterias, proteobacterias, bacterias fotosintéticas y algunas bacterias grampositivas son los únicos procariotas conocidos que sintetizan GSH (Fahey y Sundquist, 1991; Newton et al., 1996). Sin embargo, no se ha podido determinar la presencia de este tripéptido en muchos géneros bacterianos y, además, existen variaciones significativas en el contenido de GSH entre especies del mismo género (Fahey y Sundquist, 1991). El hecho que en las cianobacterias, productoras de oxígeno en la fotosíntesis, y en las bacterias purpúreas, que usan el oxígeno como último aceptor de electrones, se hayan detectado altos niveles de GSH apunta a que el metabolismo del glutatión apareció paralelamente a las condiciones aeróbicas iniciales en la tierra. En Escherichia coli y otras proteobacterias el GSH y las enzimas dependientes de este, como las GST, están involucradas en varios procesos metabólicos centrados en la protección frente a estrés oxidativo y también aseguran el funcionamiento correcto de procesos como plegamiento, síntesis, regulación y degradación de enzimas y de complejos multienzimáticos (Penninckx y Elskens, 1993; Koonin et al., 1994). Una característica importante de la estructura primaria de las GST bacterianas es que los residuos altamente conservados en las GST citosólicas de mamíferos no se encuentran en aquellas, lo cual indica la tolerancia del conjunto de las GST a la variación en la secuencia proteica que conlleva a la diversidad en actividades enzimáticas (Vuilleumier, 1997). Inicialmente el estudio de la actividad de las GST bacterianas se realizó usando el CDNB como sustrato, pero esta actividad es rara en 32 Introducción bacterias y donde fue posible detectarla los niveles fueron muy bajos (Fahey y Sundquist, 1991; Penninckx y Elskens, 1993). A pesar de ello fue posible purificar varias GST bacterianas, e incluso varias de ellas presentan actividad sobre sustratos como ácido etacrínico, hidroperóxido de cumeno, 1,2-dicloro-4-nitrobenceno, 1,2-epoxi-3-pnitrofenil fosfato, nitrobencil cloruro, tetracloro-p-hidroquinona y tricloro-p-hidroquinona (Vuilleumier, 1997). El papel fisiológico de las GST bacterianas activas frente a CDNB no está claro, ya que no son enzimas abundantes en la célula (Iizuka et al., 1989; Piccolomini et al., 1989); sin embargo se les asocia con resistencia a antibióticos (Perito et al., 1996) y con respuestas a estrés oxidativo dado que algunas tienen actividad alquil peroxidasa (Piccolomini et al., 1989). Por otro lado está la familia de las fosfomicina/glioxalasa, las cuales generan resistencia a la fosfomicina, un antibiótico de amplio espectro producido por cepas de Streptomyces, que inactiva a una de las enzimas encargada de catalizar el primer paso de la biosíntesis del peptidoglicano (Kahan et al., 1974). En Proteus mirabilis se han descrito tres GST y una de ellas, la isoforma PmGST B1-1, es activa frente a hidroperóxido de cumeno, ácido etacrínico y 1,2-epoxi3-p-nitrofenoxipropano, los cuales son sustratos de algunas GST de eucariotas (Di Ilio et al., 1988). La expresión del gen que codifica para esta proteína aumenta cuando la bacteria se somete a estreses por CDNB, H2O2, fosfomicina o tetraciclina. La viabilidad del mutante para este gen se reduce cuando se expone a estrés oxidativo causado por H2O2 (Allocati et al., 2003). Esto sugiere que PmGSTB1-1 está involucrada en la protección frente a estrés oxidativo y en la detoxificación de agentes antimicrobianos. Otras secuencias de posibles GST se han detectado en otros géneros bacterianos pero su función aún es desconocida. Algunas se relacionan con la degradación de compuestos halogenados, como el producto del gen Bphk de Pseudomonas sp. que hace parte del operón relacionado con la degradación de bifeniles (Hofer et al., 1994) o sus homólogos en Cycloclasticus oligotrophus. Dicho gen está relacionado con el metabolismo de hidrocarburos aromáticos (Wang et al., 1996). Otro ejemplo es el gen orf3 de Burkholderia cepacia, que codifica para otra GST putativa pero de función desconocida, aunque podría estar relacionada con la mineralización del ácido 2,4,5-triclorofenoxiacetico. Sin embargo, no se detectó actividad de esta proteína sobre CDNB cuando se expresó en E. coli (Daubaras et al., 1995). Está claro que las GST de estos operones no son esenciales para la supervivencia de 33 Introducción las bacterias en condiciones de crecimiento con base en los correspondientes compuestos aromáticos, y posiblemente tienen algún papel en rutas metabólicas específicas. Como se mencionó anteriormente, las fosfomicin/glioxilasas están relacionadas con la degradación de la fosfomicina [ácido-(1R,2S)-epoxipropilfosfónico]. La resistencia a este antibiótico en la familia Enterobacteriaceae está mediada por un plásmido que codifica una proteína conocida como FosA la cual cataliza la adición de GSH a la molécula de antibiótico convirtiéndolo en un compuesto inactivo (Arca et al., 1990b). Esta GST es una metaloproteína dependiente de Mn(II) que requiere K+ para su óptima actividad catalítica (Arca et al., 1988; Arca et al., 1990a; Arca et al., 1990b) y por homología de secuencia se han encontrado y caracterizado genes de este mismo tipo en especies como Pseudomonas aeruginosa los cuales confieren resistencia a la fosfomicina cuando se expresan en E. coli (Rife et al., 2002; Rigsby et al., 2004; Beharry y Palzkill, 2005). En los genomas de Staphylococcus aureus y Bacillus cereus se ha detectado la secuencia de una proteína similar a FosA pero con una homología menor (FosB). Estas proteínas se encargan de agregar L-cisteína en vez de GSH a la molécula de fosfomicina, aunque no necesita de K+ o de otro catión monovalente para su actividad óptima (Cao et al., 2001). Está claro además que la ramificación en la evolución de esta enzima está dada por la incapacidad de estas especies bacterianas grampositivas para sintetizar GSH, aunque la concentración de L-cisteína en ellos se considera baja (Rigsby et al., 2005). También se ha descrito una tercera clase de proteínas, la FosX, que tiene actividad fosfomicina hidrolasa. Esta enzima es sintetizada en cepas de Mesorhizobium loti y Listeria monocitogenes y ha sido descrita con detalle en cuanto a su estructura y mecanismo bioquímico, el cual es muy parecido al de FosA y FosB (Fillgrove et al., 2003). 1.5.2. GST EN PLANTAS Las GST vegetales se clasifican en ocho clases diferentes (Edwards y Dixon, 2005). Las clases Phi y Tau son específicas de plantas; representan las dos clases dominantes de la superfamilia y comparten similitudes funcionales con las GST que metabolizan fármacos en animales. Las enzimas que pertenecen a estas clases son diméricas y catalizan la conjugación de un rango amplio de xenobióticos dentro de los cuales se encuentran los herbicidas. Las enzimas de las clases Zeta y Theta encontradas en plantas también son diméricas y tienen homólogos en animales y 34 Introducción hongos. La clase Theta de plantas tiene actividad limitada sobre xenobióticos pero es muy activa como GPx catalizando la reducción de hidroperóxidos lipídicos a los monohidroalcoholes respectivos. Esta es una actividad antioxidante importante en plantas, habiéndose comparado las GST de la clase Theta de plantas con las GPx de mamíferos que participan en la tolerancia al estrés (Edwards y Dixon, 2005). Recientemente se han descrito las clases Lambda y DHAR, que también son específicas de plantas y difieren de las demás GST vegetales en que son diméricas y actúan como tiol-oxidoreductasas dependientes de GSH, además de ser enzimas conjugantes. Finalmente, las plantas también contienen genes que codifican para GST microsomales y, aunque no están relacionadas estructuralmente con la superfamilia de GST del mismo nombre, comparten su actividad GST. En A. thaliana se ha descrito sólo un gen para GST microsomal, pero otras especies de plantas pueden tener más genes. Sin embargo, no se ha descrito ningún trabajo sobre la caracterización de estas enzimas microsomales en plantas (Edwards y Dixon, 2005). 1.5.4. GST EN INSECTOS Dentro del reino animal, las especies que pertenecen a la clase Insecta han evolucionado de manera independiente y con una alta diversidad. Algunos insectos resultan ser un problema considerable para el desarrollo de la agricultura, ya sea por dañar directamente los cultivos o por ser vectores de diversos fitopatógenos. Hace más de cincuenta años se introdujeron rápidamente en la naturaleza compuestos sintéticos para el control de los insectos en las cosechas y esta introducción rápida hizo que ellos desarrollaran mecanismos de defensa bastante eficientes frente a estos compuestos químicos. La rapidez con la que los insectos ganan resistencia resulta ser un campo de interés en la industria agroalimentaria con el fin de desarrollar estrategias que permitan combatir a las especies fitopatógenas emergentes. Por otra parte, el control de los insectos también tiene una importancia biomédica y veterinaria, ya que algunas especies son vectores de parásitos o bacterias que afectan considerablemente la salud de los mamíferos. La resistencia causada por la metabolización de los insecticidas puede involucrar una o la combinación de varias enzimas, como pueden ser el sistema del citocromo P450, las GST, las carboxiesterasas y otras enzimas de las fases I o II de la detoxificación (Ketterman et al., 1991). Se han purificado GST en más de 24 especies diferentes de insectos; estas proteínas se expresan en niveles altos y en diferentes 35 Introducción etapas del desarrollo (Zhou y Syvanen, 1997). Otro aspecto importante es que la expresión de estas enzimas es alta en especies resistentes a insecticidas como el DTT (Fournier et al., 1992; Tang y Tu, 1994; Ranson et al., 1997b; Brogdon y McAllister, 1998; Hemingway, 2000; Hemingway y Ranson, 2000) y la conjugación con GSH es un mecanismo secundario en la resistencia a los insecticidas del grupo de los organofosfatos (Hemingway, 2000). Las GST de insectos se han clasificado en dos grupos inmunológicamente diferenciados (I y II), teniendo algunas homología con las clases Omega, Zeta, Sigma y Theta (Ranson y Hemingway, 2005). Las clases Delta y Epsilon están compuestas por enzimas que se encuentran exclusivamente en insectos. En contraste, no se han encontrado enzimas de las clases Alpha, Mu y Pi en las especies de insectos analizadas. Las GST de clase I o Delta, antes clasificadas en la clase Theta, se han identificado en especies como Musca domestica, D. melanogaster, Anopheles gambiae (Ranson et al., 1997a), Anopheles dirus y Lucilia cuprina (Wilce et al., 1995). La clase II se ha identificado en Manduca sexta y D. melanogaster y son similares a las enzimas de la clase Sigma (Beall et al., 1992; Snyder y Maddison, 1997). Las enzimas de la clase Epsilon tienen actividad baja sobre CDNB y se han relacionado con la detoxificación de insecticidas (Huang et al., 1998; Wei et al., 2001; Ortelli et al., 2003). En las clases Delta, Epsilon y Sigma se detectó actividad peroxidasa sobre el sustrato hidroperóxido de cumeno (Singh et al., 2001), lo cual puede ser importante en la protección frente a estrés oxidativo (Ortelli et al., 2003; Lumjuan et al., 2005). Las GST de diferentes especies de mosquitos también han sido estudiadas, sobre todo las del vector de la malaria A. gambiae (Ranson et al., 1997a). Varias GST se identificaron también en el genoma de Aedes aegypti, algunas de las cuales ya han sido caracterizadas (Lumjuan et al., 2005). Se conoce muy poco acerca de los sustratos endógenos de este conjunto de enzimas en el metabolismo de los insectos. Se especula que participan en el transporte intracelular, vías de señalización, vías de biosíntesis o en el metabolismo de algunos componentes de su dieta como los compuestos aleloquímicos (Ranson y Hemingway, 2005), que son sustancias naturales encargadas de transmitir información entre individuos de especies distintas determinando una respuesta de comportamiento o fisiológica (Pickett et al., 1999). Se ha identificado una GST expresada específicamente en las antenas de M. sexta, la cual participa en la detección de feromonas sexuales. 36 Introducción Estas moléculas de olor o señales olfativas deben ser degradadas para iniciar la respuesta sensorial o de comportamiento de los insectos (Rogers et al., 1999). Por otra parte, los mosquitos que se alimentan de sangre humana tienen que enfrentarse a estrés oxidativo durante la digestión de la hemoglobina, ya que durante este proceso se generan cantidades considerables de ROS y esto indicaría la importancia de la actividad peroxidasa de las GST en dichos insectos (Ranson y Hemingway, 2005). También es importante el estado redox de las células del mosquito para la supervivencia del parásito que puedan transportar. Es el caso del Plasmodium, causante de la malaria, el cual utiliza las glándulas salivales del mosquito para llevar a cabo una parte de su reproducción sexual. La respuesta inmune del mosquito involucra una respuesta oxidativa y las especies que están bajo un estrés oxidativo crónico son incapaces de permitir el desarrollo del parásito (Kumar et al., 2003). Este mecanismo de defensa del insecto contra el parásito requiere el balance de las enzimas antioxidantes para prevenir el daño tisular de las glándulas salivales y no queda claro si los mosquitos con alta actividad GST son mejores vectores de la malaria (Ranson y Hemingway, 2005). 1.5.5. GST EN PARÁSITOS Parásitos como Fasciola hepatica, Schistosoma mansoni y Ascaris lumbricoides son helmintos que afectan la salud humana. Estos parásitos se caracterizan por tener sistemas de detoxificación limitados y carecer de las reacciones de detoxificación del sistema del citocromo P450 (Precious y Barrett, 1989), por lo que tienen una actividad GST alta en la fase II de detoxificación celular y además aumentan su expresión en respuesta al tratamiento con fármacos (Brophy y Barrett, 1990). Por otra parte, se ha propuesto que los sistemas antioxidantes son esenciales en los helmintos para defenderse de las ROS generadas por los macrófagos, neutrófilos y eosinófilos del huésped (Callahan et al., 1988), además de las funciones normales de un organismo aerobio. Por lo tanto, las GST son dianas interesantes para el desarrollo de nuevos quimioterapéuticos y de vacunas. A. lumbricoides es un gusano que infecta a más de mil millones de personas en el mundo. Aunque no es fatal a corto plazo, tiene efectos debilitantes sobre todo en niños, causando condiciones clínicas serias. Aunque no se ha descrito en esta especie, 37 Introducción a partir de Ascaris suum se clonó y secuenció una GST similar a la clase Pi aunque con una homología limitada (entre el 34 y 37%) (Liebau et al., 1997). El género Schistosoma está constituido por un grupo de helmintos causantes de la esquistosomiasis que afecta a más de 275 millones de personas en el mundo. Las GST de este género se han estudiado con cierto detalle, ya que se les atribuye la resistencia al praziquantel, el medicamento más usando en el tratamiento de esta parasitosis. El mecanismo de resistencia se debe principalmente a la unión directa de las GST con el compuesto químico, lo cual recuerda la unión de los esteroides con la rGSTA1-1 (Barycki y Colman, 1997). En S. mansoni se han descrito cinco GST (SmGST-1 hasta SmGST-5). SmGST-5 se caracteriza por su inestabilidad y por catalizar la conjugación de epóxidos y de diclorovos, la forma activa del metrifonato. (O'Leary y Tracy, 1991). Posteriormente se caracterizó con detalle una GST de la clase Omega con baja actividad sobre CDNB y con actividad tiol transferasa y DHAR. Esta última actividad pone en evidencia la existencia de una vía del ácido ascórbico en este parásito (Girardini et al., 2002). Las filarias son otra clase de nemátodos que causan la filariasis, que también afecta a unos mil millones de personas de cuatro continentes. La filariasis linfática es propagada por la picadura de mosquitos vectores hembras que transportan los nemátodos de una persona a otra y pueden permanecer en el cuerpo humano o de los mamíferos durante muchos años. Como consecuencia pueden dejar ceguera, atrofia de las extremidades inferiores por oclusión de las vías linfáticas o atrofia dérmica. La presencia de estos parásitos genera también una eosinofilia muy alta comparada con otras infecciones por helmintos (Gupta y Srivastava, 2006). Uno de los mecanismos importantes para la supervivencia de estos parásitos es el metabolismo del GSH y dado que en esta vía intervienen un número considerable de enzimas, entre ellas las GST, se le considera un punto de ataque para el diseño de nuevos fármacos para el tratamiento de la filariasis. A partir del cDNA de Onchocerca volvulus se han purificado y caracterizado tres GST (Liebau et al., 1994b; 1994a; Kampkotter et al., 2003). Las filarias adultas sobreviven a la respuesta inmune directa que genera el huésped; se ha propuesto que las GST pueden contribuir a esta persistencia en el organismo (Liebau et al., 1994b), teniendo en cuenta que Ov-GST3 se induce bajo estrés oxidativo (Kampkotter et al., 2003). La inhibición de ambas GST en el parásito le priva del mayor sistema de defensa contra el estrés oxidativo causado por el sistema inmunológico, lo 38 Introducción cual no le permite sobrevivir (Sharp et al., 1991; van Bladeren y van Ommen, 1991; Brophy y Pritchard, 1994; Liebau et al., 1994b). También se han identificado cuatro GST en Fasciola hepatica (Fh-1, -7, -47 y 51), otro helminto que obstruye las vías biliares y que afecta en mayor proporción a animales herbívoros y en menor proporción al hombre. Se conoce la estructura de Fh47, la cual es similar a la estructura de Schistosoma japonicum (Rossjohn et al., 1997). Las cuatro proteínas Fh tienen diferencias en sus estructuras, lo cual se manifiesta en diferencias inmunológicas y de unión al sustrato (Salvatore et al., 1995). El género Taenia pertenece al grupo de los céstodos, tratándose de parásitos obligados permanentes que pueden colonizar el intestino (teniasis intestinal) o causar cisticercosis. Se han purificado varias GST de diferentes especies de tenias (T. solium, T. saginata, T. taeniaeformis, y T. crassiceps) y los anticuerpos generados contra ellas no tienen reacción cruzada con las GST de mamíferos ni con la presente en S. japonicum (Vibanco-Perez et al., 1999). Otra especie de parásito en el que se ha aislado una GST es Tripanosoma cruzi, causante de la enfermedad de Chagas. A partir de cDNA de epimastigotes (una de las etapas de desarrollo del parásito) se identificó la secuencia TcAc2 homóloga a la GST27 de D. melanogaster (Schoneck et al., 1994). Dada esta similitud, se presume que este gen es importante para la adaptación de T. cruzi al microambiente sanguíneo. Otro parásito de gran interés es Plasmodium falciparum, agente causal de la malaria y de 2 millones de muertes humanas al año. Esta enfermedad emergente está aumentando su distribución geográfica y el parásito ha desarrollado mecanismos de resistencia contra los fármacos actualmente disponibles. El genoma completo de esta especie está secuenciado y a partir de esta información se identificó y caracterizó una única GST, denominada PfGST (Schoneck et al., 1994; Burmeister et al., 2003; Hiller et al., 2006). Esta enzima resulta de gran interés por dos razones: i) ciertos fármacos antimaláricos como la cloroquina y el azul de metileno posiblemente influyen en el metabolismo del GSH en el parásito donde la PfGST está involucrada; ii) PfGST posiblemente juega un papel importante en la resistencia a los fármacos antimaláricos ya que su expresión está elevada en cepas resistentes a la cloroquina (Srivastava et al., 1999). Esta enzima no tiene similitud estructural con ninguna de las clases de GST descritas y la mayor diferencia se observa en el dominio C-terminal de unión al sustrato. 39 Introducción Esta GST resulta ser una diana terapéutica interesante ya que la inhibición de la actividad de la enzima podría crear un desequilibrio en la detoxificación mediada por GHS, incrementar los niveles de peróxidos citotóxicos y finalmente incrementar la concentración de tóxicos intracelulares en el parásito (Deponte y Becker, 2005). PfGST tiene actividad sobre CDNB, DCNB, bromosulfoftaleína, ácido etacrínico, se une a la hemin/ferriprotoporfirina IX y tiene actividad peroxidasa sobre hidroperóxido de cumeno (Hiller et al., 2006). Esta última actividad resulta útil en el microambiente del eritrocito dado que el parásito consume cantidades importantes de hemoglobina y está expuesto continuamente a un ambiente oxidante dentro del eritrocito (Becker et al., 2004). 1.6. GST EN HONGOS 1.6.1. DIVERSIDAD ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL Se conoce relativamente poco acerca de la presencia y papel biológico de las GST en los hongos. Sin embargo se conocen isoformas y existen estudios sobre estas enzimas en S. cerevisiae (Choi et al., 1998), Schizosaccharomyces pombe (Kim et al., 2001; Shin et al., 2002; Veal et al., 2002) , Aspergillus nidulans (Fraser et al., 2002), Aspegillus fumigatus (Burns et al., 2005), Issatchenkia orientalis (Tamaki et al., 1999), Yarrowia lipolytica (Foley y Sheehan, 1998; McGoldrick et al., 2005a), Cuningamela elegans (Cha et al., 2001), Mucor circinelloides (Dowd y Sheehan, 1999), Mucor mucedo (Hamed et al., 2005) y Phanerochaete chysosporium (Dowd et al., 1997). Las GST de hongos tienen patrones de expresión diferentes y algunas isoformas se expresan en presencia de xenobióticos o bajo estrés oxidativo. Por ejemplo, en las dos GST de I. orientalis solo una se expresa constitutivamente y ambas se inducen en presencia de o-dinitrobenceno (o-DNB) (Tamaki et al., 1999). Por otra parte, A. fumigatus tiene tres genes que codifican para GST, gstA-C (Burns et al., 2005). Los genes gstA y gstC tienen una expresión basal baja pero se sobreexpresan en presencia de CDNB y peróxido de hidrógeno, mientras que gstB sólo se expresa en presencia de CDNB. Además, las proteínas que codifican estos genes tienen actividad GST sobre el sustrato CDNB y GPx sobre peróxido de hidrógeno. A. nidulans también expresa una GST denominada GstA. Esta GST también se sobreexpresa en presencia de CDNB o peróxido de hidrógeno y tiene un papel importante en la resistencia a metales pesados (Fraser et al., 2002). En S. pombe las tres GST se inducen bajo estrés oxidativo y son codificadas respectivamente por los genes gst1 y gst2 o gst3. Los 40 Introducción mutantes simples para estos tres genes son más sensibles al antifúngico fluconazol (Veal et al., 2002), indicando así el papel de las GST en la tolerancia a los fármacos. Muchas de estas GST no se pueden clasificar en ninguna de las clases caracterizadas por criterios inmunológicos, estructurales o catalíticos. Adicionalmente se han encontrado por análisis bioinformático otras 67 secuencias similares a GST en 21 especies diferentes de hongos (McGoldrick et al., 2005b). Estas secuencias fueron comparadas y clasificadas dentro de cinco grupos diferentes: 1, 2, EFIBγ, MAK16 y Ure2. En el grupo 1 se incluye Gst3 de Schizosaccharomyces pombe, Gtt1 de S. cerevisiae, una GST de Kluyveromyces lactis, dos GST de Debaromyces hansenii, y dos secuencias de Candida albicans. En el grupo 2 están las GST de Y. lipolitica, Gst1 de Botyrotinia fuckelinia, GstA de A. nidulans y una secuencia de D. hansenii. El grupo de EFIBγ consiste en enzimas que tienen similitud estructural con esta subunidad del factor de elongación eEF1 de S. cerevisiae. eEF1 es un complejo responsable de la elongación en la síntesis proteica y en él están incluidas EF-1A, que une los aminoaciltRNAs a la subunidad 80S del ribosoma, y EF-1B. A su vez, EF-1B está compuesta por dos subunidades: EF-1Bα y EF-1Bγ. Esta última tiene homología en su extremo Nterminal con las GST y está codificada en el gen TEF3 (Koonin et al., 1994). Aunque todas las EF-1Bγ de hongos tienen este dominio N-terminal, el dominio C-terminal es de tamaños variados en cada especie. Por ejemplo, A. nidulans sólo tiene el dominio Nterminal GST (Koonin et al., 1994). Esto indicaría que la funcionalidad de estas proteínas estaría en el dominio homólogo con las GST y una evidencia de ello es la actividad CDNB de EF-1Bγ de Oryza sativa expresada en E. coli (Kobayashi et al., 2001). Adicionalmente se ha determinado la estructura cristalina del dominio N-terminal de la proteína EF-1Bγ, codificada por el gen TEF3 en S.cerevisiae. Se ha observado que esta proteína tiene la estructura común de las GST y hace parte de un complejo que se une al promotor del gen MSRA en S. cerevisiae, el cual codifica para la metionin sulfóxido reductasa (Jeppesen et al., 2003). Esto sugiere que Tef3 puede tener un papel regulador en la expresión de la metionin sulfóxido reductasa y por ende, participar en la respuesta a estrés oxidativo (Hanbauer et al., 2003). Una explicación para esta relación posiblemente está en que Tef3 protege la síntesis proteica del estrés oxidativo (McGoldrick et al., 2005b). Mak16 es una proteína nuclear importante en la progresión del ciclo celular y en la biogénesis de las subunidades ribosomales 60S. Se ha relacionado esta proteína con las GST ya que los anticuerpos contra la GST de S. mansoni tienen una reacción 41 Introducción cruzada con la Mak16 de esta misma especie y además comparte un 43% de identidad y un 66% de similitud con su homóloga en S. cerevisiae (Wickner et al., 1987; Milhon et al., 2000). Todas las proteínas de este grupo tienen un domino MAK16 conservado pero muestran una identidad del 30% con las GST microsomales humanas, lo que puede estar indicando que componen un grupo distinto de GST en hongos y levaduras, y que pueden estar relacionadas con la superfamilia de las MAPEG y la clase Kappa (McGoldrick et al., 2005b). La proteína Ure2 es un factor de trascripción presente en S. cerevisiae involucrado en la represión dependiente de nitrógeno de la vía de utilización del ureidosuccinato y que tiene similitud estructural con las GST en su extremo C-terminal (Bousset et al., 2001). La relación entre Ure2 y las GST no se ha determinado, pero Ure2 tiene actividad peroxidasa, tanto en su forma nativa como en la forma fibrilar amiloide, a pesar de la ausencia de residuos activadores de GSH (Bai et al., 2004). El papel conocido de Ure2 es prevenir que el factor de trascripción Gln3 entre en el núcleo, pero la naturaleza de esta interacción es hasta ahora desconocida. Todos los estudios anteriores sugieren que las secuencias similares a las GST están ampliamente distribuidas en los hongos, y que posiblemente tienen funciones diversas (McGoldrick et al., 2005b). 1.6.2. LAS PROTEÍNAS Gtt EN S. cerevisiae Además de las secuencias homólogas a las GST mencionadas anteriormente, se han caracterizado dos genes denominados GTT1 y GTT2 en S. cerevisiae, los cuales codifican para dos GST funcionales (Choi et al., 1998). Estas proteínas sólo comparten aproximadamente un 50% de similitud con las GST de otros organismos y tienen actividad GST sobre el sustrato CDNB. Utilizando el sistema de doble híbrido se comprobó que ambas proteínas forman homodímeros y no heterodímeros (Choi et al., 1998). Por fraccionamiento celular se determinó que Gtt1 está asociada al RE, ya que Gtt1 y la proteína dolicol-fosfato sintasa, un marcador del retículo endoplásmico, se encontraban siempre en la misma fracción y que la distribución de los demás marcadores celulares era claramente diferente. La expresión de GTT1 y GTT2 se induce en el cambio diáuxico durante el crecimiento poblacional y se mantiene en niveles altos durante la fase estacionaria. Los 42 Introducción mutantes simples y el doble son viables, demostrando que no son genes indispensables para la supervivencia de la levadura. Sin embargo, los mutantes simples son sensibles al choque térmico durante la fase estacionaria, crecen de manera limitada a 39ºC y la doble mutación no tiene un efecto aditivo sobre el choque térmico o la exposición al CDNB (Choi et al., 1998). Esto indica que Gtt1 y Gtt2 tienen una función solapante durante la fase estacionaria. Aunque la homología de Gtt1 respecto a las GST de otros organismos es limitada, la actividad GST de Gtt1 y Gtt2 se manifiesta in vitro e in vivo, y esta última se detecta tanto en lisados de levaduras como de E. coli que sobreexpresan la forma recombinante. La Km sobre GSH y CDNB es de 0,6 y 3,3 mM respectivamente, con una Vmax de 500 nmol/min· mg. Por otro lado, la actividad de Gtt2 es menor comparada con Gtt1; los valores en este caso son: Km de 0,2 mM para CDNB y 5 mM para GSH con una Vmax de 340 nmol/mg· min (Choi et al., 1998). La región promotora de GTT1 contiene un elemento de respuesta a xenobióticos (XRE) el cual es común en los genes GST de mamíferos (Paulson et al., 1990). Otras secuencias que están repetidas varias veces en este promotor son el elemento de respuesta a estrés (STRE) (Rushmore et al., 1991; Schuller et al., 1994; Martinez-Pastor et al., 1996) y el elemento de cambio postdiáuxico (PDS) (Boorstein y Craig, 1990), que son reconocidos respectivamente por los factores de trascripción Msn2/4 y Yap1 (Hasan et al., 2002; Toledano, 2003). Dada la sobreexpresión de GTT1 durante el cambio diáuxico, las secuencias PDS del promotor son funcionales y regularían la sobreexpresión durante la fase estacionaria. La inducción de GTT1 y GTT2 durante el cambio diáuxico y la sensibilidad al choque térmico de las cepas que carecen de uno o ambos genes demuestra que la función de las proteínas correspondientes está relacionada con la respuesta a estrés oxidativo y que aquellas son importantes durante la fase estacionaria; posiblemente la actividad GST de ambas proteínas es importante en la eliminación de los metabolitos que se acumulan durante la fase estacionaria o durante el estrés oxidativo. Otra alternativa es que Gtt1 y Gtt2 aumenten la estabilidad de otras proteínas bajo condiciones de estrés, y que el daño de algunas proteínas sea la principal causa de toxicidad y letalidad durante el choque térmico y otras condiciones de estrés en el mutante carente de Gtt1 y Gtt2 (Choi et al., 1998). 43 Introducción 1.7. RELACIÓN DE LAS GST CON LAS GLUTAREDOXINAS Como se ha mencionado anteriormente, todos los organismos aerobios están expuestos a las ROS durante los procesos metabólicos normales o después de ser tratados con compuestos generadores de radicales libres. Para protegerse del daño oxidativo, las células cuentan con mecanismos de defensa efectivos que incluyen enzimas antioxidantes y secuestrantes de radicales libres (Yu, 1994). Dentro de los mecanismos de defensa de S. cerevisiae que se activan contra las ROS están los no enzimáticos como el glutatión y el ácido ascórbico, y los enzimáticos como las tioredoxinas (Trx), glutaredoxinas (Grx) y Gpx, entre otros (Wheeler y Grant, 2004). Oxidado Reducido Sustratos Acr2 Grx1 Grx1 Hidroperóxidos Grx2 Grx2 Xenobióticos GSSG Glr1 NADPH, H+ GSH Ribonucleótido reductasa Trx1 Trx1 PAPS reductasa Trx peroxidasas Yap1 Trx2 Trx2 Trr1 NADPH, H+ Figura 10. Los sistemas GSH/glutaredoxina y tioredoxina. S.cerevisiae tiene un par de genes que codifican para dos glutaredoxinas citosólicas clásicas (GRX1 y GRX2) y otro par para dos tioredoxinas (TRX1 y TRX2). Existe además un gen (TRX3) que codifica para una tioredoxina mitocondrial. La forma oxidada de las tioredoxinas se reduce directamente por la tioredoxina reductasa (Trr1) usando NADPH. En cambio, las glutaredoxinas son reducidas mediante el GSH; el GSSG generado se reduce nuevamente en una reacción dependiente de NADPH catalizada por la glutatión reductasa (Glr1). Las tioredoxinas son activas sobre la 3´-fosfoadenosin 5´-fosfosulfato reductasa (PAPS reductasa), tioredoxina peroxidasa y Yap1. Las glutaredoxinas son activas sobre la arsenato reductasa (Acr2) y pueden reducir directamente hidroperóxidos y xenobióticos. Ambos sistemas tienen como sustrato la ribonucleótido reductasa. Tomado de Wheeler y Grant (2004). Las Trx son tiol oxidoreductasas de pequeño tamaño que utilizan el NADPH para reducir las proteínas que han sido oxidadas por la acción de las ROS. Las Trx, el NADPH y la tioredoxina reductasa (Trr) forman el sistema tioredoxina. 44 Introducción Las Grx son oxidoreductasas que junto con NADPH, GSH y la glutatión reductasa (Glr) forman el sistema glutaredoxina. Estas oxidoreductasas transfieren electrones desde el NADPH a través del GSH. El GSH pasa a su forma oxidada (GSSG) y vuelve a su forma reducida por la acción de la glutatión reductasa (Glr) (Holmgren, 1989) (Figura 8). Las Grx catalizan la reducción de los puentes disulfuro formados entre los grupos tiol de una proteína (actividad proteín disulfuro reductasa) o los formados entre las proteínas y el GSH (actividad glutatión disulfuro oxidoreductasa) (Yang y Wells, 1991; Bushweller et al., 1992). Dependiendo de la presencia de una o dos cisteínas en su centro activo, las Grx se clasifican en monotiólicas (Cys-Gly-Phe-Ser en su centro activo) y ditiólicas (Cys-Pro-Tyr-Cys en su centro activo) (Luikenhuis et al., 1998; Fernandes y Holmgren, 2004). Las glutaredoxinas también catalizan la formación de disulfuros mixtos con GSH, un proceso llamado glutationilación, el cual juega un papel importante en la protección contra el estrés oxidativo o en la regulación funcional de las proteínas en la transducción de señal (Cotgreave y Gerdes, 1998). Adicionalmente, las Grx en mamíferos tienen una lista creciente de funciones dentro de las cuales están la reducción del ácido dehidroascórbico, proliferación celular o la regulación de la actividad de factores de trascripción (Bandyopadhyay et al., 1998; Nakamura et al., 1999; Fernandes y Holmgren, 2004). 1.7.1. RELACIONES ESTRUCTURALES Las GST comparten similitudes estructurales con las Trx y las Grx, lo cual se refleja en algunas actividades enzimáticas específicas. Con base en la similitud de la estructura terciaria del dominio N-terminal de las GST citosólicas, se deduce que el plegamiento presente en este dominio posiblemente ha evolucionado a partir de un progenitor común de las Trx y Grx (Armstrong, 1997). El dominio N-terminal de las GST adopta una topología similar al dominio tioredoxina, que consiste en cuatro láminas β rodeadas de hélices α. Este tipo de plegamiento está presente en varias familias de proteínas con una identidad de secuencia limitada, las cuales parecen haber evolucionado para permitir la unión de cisteína o GSH. Ejemplos de ello son la DsbA (enzima bacteriana equivalente a la disulfuro isomerasa), las Grx y las Gpx (Martin, 1995; Sheehan et al., 2001) (Figura 11). 45 Introducción Se ha propuesto que las GST canónicas habrían evolucionado por la adición del dominio helicoidal de unión al sustrato al dominio tioredoxina. Sin embargo, la estructura de las GST mitocondriales parece indicar que este grupo en particular tuvo una vía de evolución paralela ya que la inserción del dominio de unión al sustrato ocurrió en medio del dominio tioredoxina (Hayes et al., 2005) (Figura 11). A B cis-Pro Punto de conexión con C-terminal en las GST Figura 11. A. El dominio tipo tioredoxina. Las hélices α están representadas como cilindros y las láminas β están representadas como flechas color naranja. Las cuatro láminas β y la hélice α-2 (color rojo) son esencialmente coplanares y las otras dos hélices α (color azul) están en el plano posterior. El asa cis-Prolina (cis-Pro) une a α-2 con β-3 y está altamente conservada en las GST. El segundo dominio de las GST está conectado en posición C-terminal por un péptido corto. B. Esquema de la enzima tioredoxina. Las láminas β están representadas en color amarillo mientras que las hélices α están indicadas en rojo. El plegamiento tipo tioredoxina empieza en la estrella ( ) y las demás partes de la enzima están indicadas en gris. Tomado de Sheehan et al. (2004). Teniendo en cuenta estas similitudes, resultan interesantes las características estructurales y enzimáticas de Grx2 de E. coli (Xia et al., 2001). Esta enzima no reduce la ribonucleótido reductasa como generalmente lo hacen otras Grx o Trx, pero tiene una alta capacidad catalítica en la reducción de disulfuros mixtos de alto y bajo peso molecular. Un ejemplo de esto es la reducción de la arsenato reductasa, donde Grx2 es 100 veces más eficiente que Grx1 y Grx3 en E. coli (Shi et al., 1999). Estructuralmente Grx2 tiene dos dominios: el dominio N-terminal con un plegamiento típico de las tioredoxinas y el dominio C-terminal que está unido covalentemente con el dominio Nterminal a través de 11 residuos. El dominio C-terminal está compuesto por seis hélices α conectadas por asas y ambos dominios son necesarios para el plegamiento y la actividad de la proteína. Al comparar la estructura reducida de Grx2 con las GST Theta y Omega humanas resultan ser similares (Xia et al., 2001). Grx2 y las GST cuentan con una 46 Introducción prolina antes de la lámina β3, que está muy conservada tanto en Trx/Grx como en las GST. Como se mencionó en el apartado 1.2.3.1., esta prolina es la parte inicial del elemento estructural de las GST que reconoce la porción γ-glutamil del GSH y es importante para mantener el plegamiento total del dominio N-terminal. En las Trx/Grx, este residuo es especialmente importante en la dinámica de las formas oxidada y reducida (Kelley y Richards, 1987). α2 β 2 α1 β 1 β 3 β 4 α3 N TIOREDOXINA C C β 2 α1 β 1 β 3 β 4 α3 Inserción dominio helicoidal Inserción dominio helicoidal N β 2 α1 β 1 β 3 β 4 α3 N GST CANONICA GST MITOCONDRIAL C Figura 12. Esquema de la evolución de las GST. Las flechas indican las láminas β y los rectángulos indican las hélices α. Las regiones que se ilustran corresponden al dominio tioredoxina de las GST citosólicas y mitocondriales en las que ocurre la unión al GSH, así como las inserciones correspondientes que dieron origen al dominio de unión del segundo sustrato en las GST. Tomado de Hayes et al. (2005). La similitud estructural entre las GST y Grx2 sugiere que sus funciones están relacionadas: las GST clásicas participan en reacciones donde el GSH es covalentemente conjugado con compuestos carcinogénicos, quimioterapéuticos o productos de estrés oxidativo, mientras que Grx2 forma o elimina los disulfuros mixtos con GSH, protegiendo o interrumpiendo la actividad enzimática de las proteínas durante el estrés oxidativo. La similitud entre las GST y la familia de Trx/Grx se nota particularmente comparando la estructura de Grx2 y hGSTO1-1 (Xia et al., 2001) (Figura 13). 47 Introducción A B Figura 13. Comparación de las estructuras de (A) Grx2 de E. coli con (B) hGSTO1-1. Las hélices se han enumerado de acuerdo con su posición en la secuencia de aminoácidos. El dominio N-terminal de ambas proteínas es muy similar y se acercan a la estructura de otras glutaredoxinas. En particular, las hélices α1 y α3 son casi paralelas en las dos estructuras. La estructura del dominio C-terminal en ambas proteínas también es similar y las hélices paralelas se identifican en ambas estructuras con los mismos colores. Tomado de Xia et al. (2001). 1.7.2. RELACIONES FUNCIONALES EN S.cerevisiae En S. cerevisiae se han descrito dos glutaredoxinas ditiólicas (Grx1 y Grx2) (Luikenhuis et al., 1998), y tres monotiólicas (Grx3, Grx4 y Grx5) (RodriguezManzaneque et al., 1999). Esta clasificación se hace de acuerdo con la estructura de su centro activo, específicamente por la presencia de una o dos cisteínas en esta parte de la proteína. Las glutaredoxinas ditiólicas son enzimas multifuncionales que son necesarias para contrarrestar los efectos del estrés oxidativo. Grx1 y Grx2 reducen los disulfuros mixtos formados entre GSH y HED, tienen actividad Gpx, reducen directamente los hidroperóxidos y tienen actividad GST sobre los sustratos clorodinitrobenceno (CDNB) y DCNB, siendo estas dos últimas actividades muy similares entre sí (Collinson et al., 2002; Collinson y Grant, 2003). Por el contrario, Grx5 no tiene actividad glutaredoxina sobre el sustrato HED, y tampoco se detectó en ella actividad dehidroascorbato reductasa o Gpx (Tamarit et al., 2003). Estas características bioquímicas de Grx1 y Grx2 demuestran que tienen una actividad solapante con Gtt1 y Gtt2, lo que se manifiesta en el aumento de la sensibilidad del múltiple mutante a condiciones de estrés tales como exposición a xenobióticos o agentes oxidantes y choque térmico (Collinson y Grant, 2003). Curiosamente, el doble mutante gtt1 gtt2 no muestra mayor sensibilidad al CDNB, lo que 48 Introducción sugiere que existe un sistema de detoxificación alternativo a las Gtt en S. cerevisiae (Choi et al., 1998). El análisis de las secuencias de Grx1 y Grx2 de S. cerevisiae y su comparación con hGSTO1-1 y SmGSTO muestra que hay cierta similitud entre ellas (Collinson y Grant, 2003). En esta comparación se identificaron residuos conservados localizados principalmente en el dominio N-terminal incluyendo la secuencia cis-Pro común en todas las GST. Además, el sitio de unión del GSH en hGSTO1-1 incluye a los residuos Pro-33 y Phe-31 que rodean a la Cys-32 del sitio activo, los cuales son equivalentes a Pro-28 y Tyr-26 en Grx1 y Grx2. Cabe recordar que las GTS de clase Omega tienen actividades oxidoreductasa dependiente de glutatión y DHAR, las cuales son características de las Grx clásicas (Board et al., 2000; Whitbread et al., 2005). 1.8. LAS GST Y SU RELACIÓN CON LOS PEROXISOMAS Como se ha descrito en el apartado 1.3., las GST están localizadas en diferentes organelos celulares como núcleo, mitocondria y peroxisoma. En este último se han localizado GST de clase Kappa en humanos así como en ratón y rata (Morel et al., 2004; Islinger et al., 2006). La localización de estas proteínas en el peroxisoma lleva a la pregunta sobre su función y sus posibles sustratos. Muchas de las funciones del peroxisoma están relacionadas con el metabolismo de los lípidos, lo que incluye la α y βoxidación de ácidos grasos y la producción final de acetil-CoA y acil-CoA (Wanders et al., 2000). Se ha demostrado que las GST de clase Alpha son capaces de unirse al acilCoA y a las moléculas xenobiotico-CoA (Silva et al., 1999). Teniendo en cuenta esta observación, la hipótesis planteada es que las GST peroxisomales podrían estar involucradas en el sistema regulador del acil-CoA o xenobiótico-CoA (Morel et al., 2004). Un aspecto importante de los peroxisomas es la producción de peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo y otros radicales libres como consecuencia de las actividades metabólicas que allí se llevan a cabo (Moldovan y Moldovan, 2004). Aunque los peroxisomas contienen enzimas antioxidantes (como catalasa y superóxido dismutasa), los radicales libres representan la principal fuente de peroxidación lipídica que lleva a efectos deletéreos en la estabilidad de la membrana peroxisomal y a efectos directos en su función. Teniendo en cuenta esta característica y que hGSTK1-1 tiene actividad peroxidasa sobre los sustratos tert-butil hidroperóxido, hidroperóxido de cumeno y ácido 15-S-hidroxiperoxi-5,8,11,13-eicosatetraenóico, se podría establecer 49 Introducción una relación entre hGSTK1-1 y la detoxificación de los peróxidos lipídicos generados dentro del peroxisoma (Morel et al., 2004). Por otra parte, en células hepáticas de rata, se ha detectado la presencia de una misma GST en tres organelos diferentes: RE, mitocondria y peroxisoma, encontrándose en menor proporción en este último (Islinger et al., 2006). Una característica importante de esta GST microsomal es la señal de localización al RE. Se sabe que esta señal se encuentra en C-terminal, ya que al construir proteínas de fusión colocando secuencias peptídicas como myc o FLAG en este extremo, esta señal se enmascara y la proteína se dirige entonces al peroxisoma. Sin embargo se desconoce la naturaleza de ambas señales y la función de esta mGST (Islinger et al., 2006). La importancia del peroxisoma en la salud humana se relaciona con la descripción de más de veinte enfermedades por anomalías peroxisomales. Las alteraciones en la biogénesis peroxisomal son causadas por mutaciones autosómicas recesivas que provocan un grupo de enfermedades genéticamente heterogéneas, y que se caracterizan por la deficiencia en múltiples funciones peroxisomales; muchas de estas deficiencias están relacionadas con la imposibilidad de importar proteínas en dicho organelo (Schrader y Fahimi, 2004). Las deficiencias en la biogénesis de los peroxisomas se caracterizan clínicamente por un déficit en el funcionamiento de ciertas rutas metabólicas como la regulación de los ácidos grasos de cadena larga y la síntesis de sales biliares o plasmalógenos (Sacksteder y Gould, 2000). Las enfermedades de origen peroxisomal están relacionadas con al menos 12 genes y se agrupan en dos categorías clínicas. La primera categoría es el espectro Zellweger compuesto por el síndrome de Zellweger, la adrenoleucodristrofia neonatal y la enfermedad infantil de Refsum; en la segunda categoría está la condrodisplasia punctata rizomélica clásica (Sacksteder y Gould, 2000). Estas enfermedades se manifiestan por problemas en el desarrollo y en algunos casos los pacientes solo viven algunos años después de nacer. También hay problemas neurológicos severos, como retardo mental e hipotonía, y los afectados pueden sufrir aberraciones oculares (Wanders, 2006). 1.8.1. FUNCIONES DE LOS PEROXISOMAS Los peroxisomas son organelos comunes en muchas células eucarióticas, limitados por la típica bicapa lipídica y que alojan a más de 60 proteínas que catalizan diversas reacciones catabólicas o anabólicas (Reddy y Mannaerts, 1994). Dos de las 50 Introducción funciones de los peroxisomas conservadas a lo largo de la escala evolutiva son la βoxidación de ácidos grasos y el metabolismo de compuestos como el peróxido de hidrógeno y otras ROS, los cuales son generados por las oxidasas peroxisomales (Purdue y Lazarow, 2001). Las demás funciones de los peroxisomas varían de acuerdo con el organismo y el tipo celular. En los peroxisomas de mamíferos se llevan a cabo procesos como la biosíntesis de lípidos (plasmalógenos, ácidos biliares, colesterol, dolicol y elongación de ácidos grasos), α-oxidación de ácidos grasos (ácido fitánico) y compuestos xenobióticos, procesos catabólicos (catabolismo de aminoácidos, poliaminas y purinas), metabolismo de glioxilato y la vía de la hexosa monofosfato (Schrader y Fahimi, 2004). En los peroxisomas de plantas también se lleva a cabo el metabolismo del glioxilato y la fotorespiración, mientras que los tripanosomas llevan a cabo allí la glicólisis. En el caso de las levaduras, procesos como la oxidación del metanol y la asimilación y oxidación de las aminas tienen lugar en este organelo (Purdue y Lazarow, 2001). Por lo que respecta a la β-oxidación de los ácidos grasos, mientras que en levaduras y plantas este proceso ocurre exclusivamente en los peroxisomas, en mamíferos y otros eucariotas superiores sucede tanto en peroxisomas como en mitocondrias (Wanders y Waterham, 2006). Se ha demostrado también que una parte de la vía de síntesis de la lisina se lleva a cabo en el peroxisoma de S. cerevisiae (Breitling et al., 2002). La deficiencia de peroxisomas afecta la síntesis de lisina durante la fase de crecimiento exponencial de las levaduras en medio de cultivo completo, lo cual se relaciona con la sobreexpresión de varios genes implicados en esta ruta metabólica. En consonancia con ellos se han identificado señales de localización peroxisomal en varias de las proteínas que intervienen en la síntesis de la lisina, como son Lys1, Lys4 y Lys12 (Breitling et al., 2002). Las aproximaciones moleculares clásicas y bioinformáticas, junto con los análisis filogenéticos masivos de los proteómas peroxisomales de levadura y rata, han hecho posible desarrollar hipótesis sobre el origen y la evolución del proteóma de los peroxisomas (Gabaldón et al., 2006). Al igual que las mitocondrias y los cloroplastos, los peroxisomas tienen la capacidad de internalizar proteínas postranscripcionalmente y multiplicarse a partir de los preexistentes durante la división celular. Con estas características se afirmó en un principio que los peroxisomas tienen un origen endosimbiótico, pero las evidencias actuales no son suficientes para sostener esta teoría (Gabaldón et al., 2006). Además, se tienen evidencias claras sobre la formación de nuevos peroxisomas a partir del RE (Hoepfner et al., 2005). 51 Introducción 1.8.2. INTERNALIZACIÓN DE PROTEÍNAS PEROXISOMALES La identificación y caracterización de los mutantes de S. cerevisiae defectuosos en la biogénesis de peroxisomas ha resuelto la mayor parte de las dudas sobre los procesos necesarios para llevar a cabo este proceso, lo cual incluye la identificación de las señales de localización peroxisomal (Wanders y Waterham, 2006). La información sobre las señales de localización peroxisomal se ha usado para buscar otras proteínas similares y sus correspondientes ortólogos en mamíferos. Esta estrategia, junto con los estudios clásicos de clonación y purificación de proteínas, ha permitido la identificación de muchas proteínas peroxisomales y su relación con los procesos metabólicos que allí se llevan a cabo (Wanders y Waterham, 2006). Muchas de las proteínas peroxisomales de membrana y de matriz son sintetizadas en polisomas libres en el citoplasma y posteriormente son transportadas hasta este organelo (Lazarow y Fujiki, 1985). Muchas de las peroxinas o proteínas involucradas en la biogénesis de los peroxisomas (Pexp) están relacionadas con el importe de las proteínas de matriz y con la formación de la maquinaria que permite el paso del complejo de importe a través de la membrana peroxisomal (Purdue y Lazarow, 2001). Las proteínas de la matriz peroxisomal son internalizadas a través de dos receptores que reconocen dos señales de localización (PTS1 y PTS2). Las señales tipo PTS1 son tripéptidos localizados en el extremo C-terminal de la proteína y son reconocidas por Pex5, mientras que las señales tipo PTS2 están en la región N-terminal y son reconocidas por Pex7 (Subramani, 1996; Heiland y Erdmann, 2005). Por el contrario, las proteínas de membrana peroxisomal no tienen ninguna de estas dos señales y cuentan con una combinación de aminoácido básicos y uno o más dominios transmembranales que permiten la correcta inserción de estas proteínas en la membrana peroxisomal (Purdue y Lazarow, 2001). Al contrario que las proteínas importadas en el RE o en la mitocondria, se asume además que los receptores que acompañan a la proteína importada son reciclados y regresan al citosol (Gould y Collins, 2002). 1.8.3. LAS SEÑALES TIPO PTS1 Y SU SISTEMA DE INTERNALIZACIÓN El proceso de internalización y las proteínas que intervienen en el mismo se han descrito en S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolitica, Pichia pastoris 52 Introducción y en mamíferos (Sacksteder y Gould, 2000; Veenhuis et al., 2000; Gould y Collins, 2002; Agne et al., 2003). El mecanismo se describe en la Figura 12. La señal consenso de localización tipo PTS1 se ha descrito como (S/A)-(K/R)(L-M), pero no todas las variaciones son funcionales en todas las especies (Neuberger et al., 2003). Esta señal de localización es reconocida por la proteína receptora Pex5. Esta proteína contiene un dominio de siete repeticiones tetratricopeptídicas o TPR que interaccionan directamente con el tripéptido PTS1, siendo estas repeticiones necesarias para la internalización de la proteína diana (Klein et al., 2001). Cuando Pex5 se une a la proteína diana, se despolimeriza y este complejo proteína(PTS1)-Pex5 es transportado hasta la superficie del peroxisoma para interaccionar con Pex14 y Pex13, que a su vez están asociadas de manera independiente a Pex17 y Pex8 (Gould y Collins, 2002; Heiland y Erdmann, 2005). Posteriormente, este conjunto interacciona con el complejo Pex2-Pex10-Pex12 para internalizar Pex5 junto con la proteína diana. Una vez dentro del peroxisoma sucede la interacción con Pex8, que facilita la disociación de la proteína diana y Pex5. El regreso de Pex5 al citoplasma depende de Pex4, la cual está asociada a la membrana peroxisomal a través de Pex22. Aunque se ha demostrado que Pex5 se acumula en el interior de los peroxisomas de los mutantes para Pex4 de H. polymorpha, no se ha demostrado la relación directa entre el complejo Pex4-Pex22 y la salida de Pex5 del peroxisoma (Veenhuis et al., 2000). Actualmente se sabe poco acerca del mecanismo de internalización de las proteínas peroxisomales con señal tipo PTS2, pero se conoce la proteína con la que deben interaccionar para llegar al interior del organelo. Las señales de localización peroxisomal tipo PTS2 se encuentran en la región N-terminal de la proteína diana y corresponden a la secuencia consenso (R/K)-(L/V/I)-(XXXXX)-(H/Q)-(L/A/F). Esta es reconocida por Pex7, una proteína citosólica que se caracteriza por tener una región de seis repeticiones triptófano-ácido aspártico dentro de un dominio conservado, el cual alcanza una longitud de 40 aminoácidos (Heiland y Erdmann, 2005). Este dominio es común en las proteínas de la familia WD-40, las cuales interaccionan con los dominios TPR de algunas proteínas. Por otro lado, Pex7 interacciona con las proteínas Pex13/Pex14 (Albertini et al., 1997) y Pex18/Pex21 (Purdue et al., 1998). Estas dos últimas proteínas tienen una vida media de 10 minutos durante la biogénesis del peroxisoma y su interacción con Pex7 permite liberar la proteína diana en el interior del peroxisoma. (Purdue y Lazarow, 2001). La capacidad que tiene Pex7 para reconocer los dominios TPR de algunas proteínas hace pensar que ambas señales de localización 53 Introducción pueden utilizar la misma maquinaria de internalización peroxisomal (Sacksteder y Gould, 2000; Veenhuis et al., 2000; Heiland y Erdmann, 2005). PTS1 Pex5 Pex5 PTS1 Pex14 Pex4 Pex22 Pex13 PTS1 Pex5 Pex2 PTS1 Pex5 Pex17 Pex17 Pex8 PTS1 Pex5 Pex10 Pex12 PTS1 Pex5 PTS1 Pex5 PTS1 Pex5 Figura 14. Modelo de importación peroxisomal de las proteínas con señal tipo PTS1. Las proteínas peroxisomales sintetizadas en el citosol son reconocidas por Pex5. Ambas proteínas son transportadas hasta la superficie del peroxisoma donde son reconocidas por el complejo Pex13-Pex14-Pex17. Posteriormente Pex5 interacciona con el complejo Pex2Pex12-Pex10 y ambas proteínas son internalizadas en la matriz peroxisomal, pero el mecanismo exacto de internalización es desconocido. Posteriormente Pex8 media la separación de Pex5 y la proteína peroxisomal. El regreso de Pex5 al citoplasma es mediado por Pex4, que está asociado a la membrana a través de Pex22. Diagrama adaptado de Veenhuis et al. (2000) y de Heiland y Erdman (2005). Existen evidencias sobre otro tipo de señal de localización peroxisomal en S. cerevisiae y en Candida tropicalis. La enzima acil-CoA oxidasa de ambas especies carece de señales de localización tipo PTS1 o PTS2 y aún así entra en la matriz peroxisomal (Purdue y Lazarow, 2001). Otro ejemplo es la catalasa A de S. cerevisiae, que posee una señal interna de localización en el peroxisoma además de la señal PTS1 (Kragler et al., 1993). A este tipo de señal se le ha denominado PTS3 y también es reconocida por Pex5, aunque no hay evidencia de la misma situación en mamíferos o en P. pastoris (Purdue y Lazarow, 2001). Pex5 y la acil-CoA oxidasa de S. cerevisiae interaccionan en ensayos de doble híbrido e in vitro, específicamente a través de la región comprendida entre los residuos 136-292 de Pex5, la cual no incluye la región TPR. Esto indica que el sitio de interacción entre Pex5-PTS1 y Pex5-acil-coA oxidasa es completamente diferente uno del otro y que Pex5 es un receptor multifuncional aunque no se conozca el mecanismo de este tipo de interacción (Purdue y Lazarow, 2001) 54 Introducción 1.9. LA SÍNTESIS DE CISTEÍNA Y METIONINA EN S. cerevisiae Como se ha mencionado en el apartado anterior, el peroxisoma participa en diversas vías metabólicas que no sólo se relacionan con la transformación de ácidos grasos de cadena larga. Un ejemplo es la relación entre los peroxisomas de S. cerevisiae y la síntesis de la lisina (Breitling et al., 2002). Adicionalmente, otros estudios han descrito en los peroxisomas de S. cerevisiae la presencia de Str3, una proteína con actividad cistationina β-liasa implicada en el proceso de transulfuración, el cual se describirá más adelante (Schafer et al., 2001; Yi et al., 2002). Transportadores de sulfato SUL1 SUL2 SO4 MET3 2- SO4 2- ATP ATP sulfurilasa permeasa general de aminoácidos GAP1 pirofosfato 5’-adenylylsulfate (APS) ATP MET14 5´-adenililsulfato quinasa 3-fosfoglicerato NAD 3-fosfoglicerato deshidrogenasa SER33 SER3 NADH 3-fosfohidroxipiruvato L-glutamato fosfoserina transaminasa ADP 3’-fosfo-5´-adenililsulfato (PAPS) NADPH 3´-fosfo-5´-adenililsulfato MET16 reductasa 2SO3 aspartato PAP 3 NADPH homoserina MET2 homoserina transacetilasa SER1 MET5 MET10 H2S sulfito reductasa 2-oxoglutarato 3-fosfoserina H2 fosfoserina fosfatasa O fosfato H2O H2O + NH3 CHA1 piruvato Ser/Thr dehidratasa 3 NADP+ + 3H2O O-acetil-L-homoserina CoA acetylCoA treonina adenosina SAH1 S-adenosil-L-homocisteína hidrolasa SER2 MET17 homocisteína sintasa L-serina cistationina beta-sintasa acetato homocisteína pyruvato + NH3 cistationina beta-liasa 5-metiltetrahidropteroil-tri-L-glutamato homocisteína metiltransferasa H2O S-adenosilhomocisteína Biosíntesis de Ergosterol y Fosfolípidos OPI3 Fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa MET6 CYS4 H2O cystationina H2O CYS3 cistationina gamma-liasa STR3 tetrahidropteroiltri-L-glutamato L-methionina H2O + ATP H2O S-adenosil-L-metionina sintasa acetato cistationina gamma-sintasa NH3 + 2-oxobutanoato L-cisteína STR2 SAM1 SAM2 fosfato + pirofosfato CHO2 S-adenosilL-metionina O-acetil-L-homoserina Fosfatidil-N-metiletanolamina N-metiltransferasa SAM3 S-adenosil-L-metionina permeasa S-adenosilL-metionina Figura 14. Biosíntesis de aminoácidos que contienen azufre en S. cerevisiae. El nombre de las enzimas que intervienen en cada paso se indica en color azul y los genes que las codifican están en color turquesa. Basado en Thomas y Surdin-Kerjan (1997). S. cerevisiae posee varios sistemas enzimáticos que le permiten metabolizar los compuestos inorgánicos azufrados que se encuentran en la litosfera. Uno de los sistemas que mejor se ha caracterizado es el sistema reductor del sulfato, el cual le 55 Introducción permite utilizar los iones sulfato y sulfito como fuentes de azufre (Thomas y SurdinKerjan, 1997). Una característica de esta levadura es que puede crecer en presencia de cisteína o metionina como únicas fuentes de azufre, a diferencia de bacterias como E. coli y otros hongos como Neurospora crassa o A. nidulans que solo pueden usar cisteína. Esto se debe a que S. cerevisiae tiene dos sistemas que catalizan la interconversión de homocisteína (precursor de la cisteína y la metionina) a cisteína. Como consecuencia, muchos de los genes estructurales que codifican para componentes de la vía del azufre se identificaron inicialmente por la auxotrofía para metionina que poseen sus respectivos mutantes (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997). Las reacciones de la síntesis de metionina y de cisteína están descritas ampliamente y se han identificado los genes que intervienen en dicha vía metabólica en S. cerevisiae, la cual se muestra en la figura 14. 1.9.1. ASIMILACIÓN DEL AZUFRE Inicialmente S. cerevisiae toma del medio el azufre en forma de sulfato y en este mecanismo intervienen Sul1, Sul2 y Sul3 (Cherest et al., 1997). Los mutantes simples para los tres genes correspondientes tienen una tasa de transporte de sulfato similar a la cepa parental, lo que indica que pertenecen a sistemas de transporte independientes. Sul1 y Sul2 tienen 11 y 10 dominios transmembranales respectivamente y la tasa de trasporte de sulfato es prácticamente nula en los mutantes dobles sul1 sul2 y sul1 sul3. A partir de estudios de expresión se determinó que Sul3 está relacionada con la regulación de la expresión de SUL2 (Cherest et al., 1997). Una vez el sulfato ha entrado en la célula, todos los organismos se enfrentan con un problema aparentemente complicado en el momento de asimilar el azufre, el cual se relaciona con el estado de oxidación. El ion SO42- es bastante estable y su reducción directa a sulfito resulta ser una reacción endergónica. Para asimilar el azufre que se encuentra en este estado se recurre a la activación de los iones sulfato a través de la adenilación. En levaduras este paso se divide en dos etapas: en la primera, se transfiere el grupo adenosil fosforil del ATP al sulfato formando adenil-sulfato o APS; en la segunda etapa, el APS es fosforilado para formar fosfoadenil-sulfato o PAPS: ATP + SO42- APS + PPi Esta primera reacción es catalizada por la ATP sulfurilasa, la cual es codificada por el gen MET3 en S. cerevisiae (Cherest et al., 1987). El mutante respectivo no pude 56 Introducción crecer en sulfato como única fuente de azufre, pero si lo puede hacer cuando la fuente es sulfito, sulfuro, tiosulfato, así como compuestos orgánicos que contienen azufre. Es importante anotar que esta reacción tiene una constante de equilibrio desfavorable para la formación de APS complicando aún más la adquisición de sulfato activado. El mecanismo por el cual los microorganismos evaden este problema está aún por determinar. Sin embargo, la ausencia total de APS causa que las células de levadura no sobrevivan a un choque térmico, lo cual se relaciona con un efecto protector de este compuesto durante cambios térmicos fuertes (Jakubowski y Goldman, 1993). Posteriormente, en la segunda etapa de la activación, el APS es fosforilado nuevamente a costa de una molécula de ATP formando PAPS: APS + ATP PAPS + ADP Esta reacción es catalizada por la APS quinasa codificada por MET14 en S. cerevisiae; una característica de esta enzima es su activación in vitro por el sistema tioredoxina (Schriek y Schwenn, 1986). Existen evidencias sobre la alta toxicidad de PAPS, de modo que los organismos han desarrollado mecanismos para controlar la concentración intracelular de este compuesto. Posiblemente, formando parte de esta regulación se encuentre MET22. La ausencia de este gen causa auxotrofía para metionina, existiendo dos hipótesis acerca de su función (Figura 15). A 2SO4 B SO4 2- APS Met22 PAPS Sulfito APS Met14 PAPS PAP Sulfito Sulfuro Met22 AMP Sulfuro Figura 15. Funciones de Met22 en el control de la concentración de PAPS. A. Ciclo de producción de APS a partir de PAPS. B. Transformación de PAP, subproducto de PAPS, a AMP. Tomado de Thomas y Surdin-Kerjan (1997) 57 Introducción Después de la activación del sulfato, ocurre una reducción en dos pasos sucesivos que llevan finalmente a la formación de sulfuro (Figura 15). La síntesis de sulfito a partir de PAPS es catalizada por la PAPS reductasa codificada por MET16. Los productos de esta reacción son PAP (transformado posteriormente por Met22 en AMP), sulfito, NADP+ y H+. Para este paso es indispensable la presencia de las tioredoxinas ya que la reductasa se une primero a ellas y luego al sustrato, lo cual explica la auxotrofía para metionina que presenta el doble mutante trx1 trx2 (Schwenn et al., 1988). El sulfito es un metabolito tóxico para S. cerevisiae como lo es para otros microorganismos y una de las razones para ello es su alta capacidad reductora. La capacidad que tiene este compuesto para inhibir el crecimiento de los microorganismos no se conoce con claridad pero se relaciona con la producción de compuestos como los acetaldehídos. Además, es un compuesto deseado en la fabricación de cerveza y vino ya que estabiliza los sabores y los aromas formando aductos con los aldehídos, propiedad que no posee el sulfuro. Una vez se ha obtenido el sulfito, este se reduce a costa de la oxidación de tres moléculas de NADPH. La enzima sulfito reductasa, que cataliza esta reacción, contiene diferentes grupos prostéticos: flavin adenin dinucleótido (FAD), flavin mononucleótido (FMN), un centro hierro/azufre, y el sirohemo, el cual es sintetizado a partir de uroporfirinógeno III. La sulfito reductasa de S. cerevisiae tiene una estructura oligomérica α2β2 y contiene dos FAD, dos FMN y dos sirohemo por molécula. Las unidades α y β en S. cerevisiae son codificadas por MET10 y MET5 respectivamente, por lo que los mutantes simples respectivos tienen el mismo fenotipo (Thomas y SurdinKerjan, 1997). El paso final de la asimilación del azufre es su incorporación en una molécula orgánica. Met17, una homocisteína sintasa, es la enzima encargada de incorporar el sulfuro en una cadena carbonada, la O-acetil-L-homoserina (Figura 14). Para la síntesis de este compuesto es necesaria la proteína Met2, una homoserina transacetilasa que utiliza como sustrato la homoserina, un metabolito intermedio de la síntesis de treonina a partir de aspartato. La incorporación del sulfuro en la O-acetil-L-homoserina produce la homocisteína, precursor de la cisteína y la metionina. El mutante que carece de MET2 puede crecer con O-acetil-L-homoserina, homocisteína, metionina y S-adenosil-Lmetionina (AdoMet) como únicas fuentes de azufre, pero no lo hace con cisteína. 58 Introducción En levaduras el aspartato y los demás aminoácidos son transportados al interior de la célula a través de permeasas específicas y no específicas. La permeasa general de aminoácidos o Gap1 transporta todos los L-aminoácidos así como compuestos relacionados como ornitina, citrulina, algunos D-aminoácidos y análogos tóxicos de aminoácidos. Sin embargo, Gap1 no es activa en condiciones específicas; por ejemplo, no se detecta la actividad de Gap1 cuando la levadura crece en medios en los que se puede obtener eficientemente nitrógeno, como los que contienen amonio. Y en estas condiciones los aminoácidos se asimilan por transportadores específicos (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997). 1.9.2. SÍNTESIS DE LA METIONINA La síntesis de novo de la metionina a partir de homocisteína utiliza un grupo metilo, el cual se origina a partir del metabolismo de compuestos monocarbonados. En este metabolismo, durante la oxidación de compuestos como metanol, formaldehído y formato, se transfieren grupos con un único carbono a moléculas receptoras. Uno de los compuestos que se forman durante estos procesos es el tetrahidrofolato. Los derivados monocarbonados del tetrahidrofolato son necesarios para la síntesis no sólo de metionina, sino también de nucleótidos del tipo purinas, timidilato y para la síntesis de Nformilmetionina en la mitocondria (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997). S. cerevisiae tiene un conjunto de enzimas para la conversión del folato localizadas en la mitocondria y en el citosol. Sólo uno de los pasos de esta transformación es necesario para la síntesis de metionina, en concreto la reducción del 5,10-metilen tetrahidropteroil tri-L-glutamato (5,10-metilentetrahidrofolato) a 5-metiltetrahidropteroil tri-L-glutamato (5-metil tetrahidrofolato), el cual es catalizado por Met13, una metilentetrahidrofolato reductasa. Finalmente, la reacción entre el 5-metil tetrahidrofolato y la homocisteína, catalizada por la homocisteína metil transferasa o Met6, genera L-metionina y tetrahidrofolato (Figura 17). 59 Introducción CITOSOL Folato 7,8 dihidrofolato (DHF) 5,6,7,8 tetrahidrofolato (THF) serina glicina 5,6,7,8 tetrahidrofolato (THF) 5,10 metileno (THF) MITOCONDRIA Folato 7,8 dihidrofolato (DHF) 5,6,7,8 tetrahidrofolato (THF) serina glicina 5,6,7,8 tetrahidrofolato (THF) 5,10 metileno (THF) 5-metil THF homocisteína metenil (THF) metenil (THF) 10-formil (THF) 10-formil (THF) METIONINA PURINAS FORMIL METIONINA tRNA Figura 17. Metabolismo del folato y su relación con la síntesis de metionina. Tomado de Thomas y Surdin-Kerjan (1997). La metionina es metabolizada posteriormente para convertirse en AdoMet, gracias a la reacción con una molécula de ATP que es catalizada por Sam1 y Sam2, dos S-adenosil metiltransferasas que actúan independientemente. AdoMet es el segundo metabolito más importante después del ATP por su participación en diversas reacciones en las que sirve como cofactor. La síntesis de AdoMet es el único ejemplo de la utilización de la energía del enlace fosfato del ATP para generar un compuesto sulfurado altamente energético (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997). La reacción consiste en la transferencia nucleofílica del grupo 5´-deoxiadenosil del ATP a uno de los tres pares de electrones del sulfuro tioeter de la L-metionina. Los fosfatos α y β del ATP son los que dan origen al pirofosfato y el fosfato terminal se libera como fosfato inorgánico. La AdoMet se usa en reacciones que involucran diferentes modificaciones químicas debido al sulfuro trivalente deficiente en un electrón que tiene esta molécula. El mayor consumo de AdoMet se produce durante las reacciones de transmetilación en las que AdoMet es el donador del grupo metilo. Este compuesto también puede ser adquirido del medio por transporte activo a través de la proteína de membrana Sam3 (Rouillon et al., 1999). Todas las reacciones de transmetilación producen S-adenosil homocisteína junto con el receptor del grupo metilo. La S-adenosil homocisteína es reciclada por hidrólisis para 60 Introducción producir nuevamente homocisteína y adenosina. Esta reacción de hidrólisis es catalizada por Sha1 (Tehlivets et al., 2004). 1.9.3. LA TRANSULFURACIÓN Y LA SÍNTESIS DE CISTEÍNA Como se ha mencionado antes, la homocisteína es el precursor de la metionina y la cisteína. En el caso de la síntesis de la cisteína, existen una serie de reacciones que permiten la interconversión de homocisteína y cisteína a través de la formación intermedia de cistationina, lo que se conoce como transulfuración. En el caso de las bacterias entéricas solo se produce la transulfuración en el sentido de la formación de homocisteína a partir de cisteína, mientras que los mamíferos solo realizan el paso de homocisteína a cisteína. En el caso de S. cerevisiae la transulfuración puede darse en ambos sentidos, es decir, la formación de cisteína a partir de homocisteína y viceversa. La presencia de dos vías de transulfuración en el mismo organismo no es exclusiva de esta especie ya que también lo pueden llevar a cabo otros hongos así como algunas arqueas, bacterias y las plantas (Zhou y White, 1991; Ravanel et al., 1998; Breitinger et al., 2001) (Figura 18). homocisteína L-serina CYS4 (cistationina β-sintasa) H2O cistationina H2O CYS3 (cistationina γ-liasa) Amonio + 2-oxobutanoato cisteína acetato (cistationina γ-sintasa) STR2 O - acetil-homoserina piruvato + amonio (cistationina β-liasa) STR3 H2O Figura 18. Reacciones que componen la vía de transulfuración en S. cerevisiae. Los nombres de las enzimas se identifican en color rojo y los genes que las codifican en color azul. Basado en Thomas y Surdin-Kerjan (1997). La síntesis de la cisteína a partir de homocisteína se realiza a través de dos pasos. El primer paso es llevado a cabo por la enzima cistationina β-sintasa (Figura 18). Esta enzima utiliza la homocisteína y la serina para sintetizar cistationina y agua. En S. 61 Introducción cerevisiae la cistationina β-sintasa es codificada por CYS4 (STR4). Los mutantes para este gen son auxótrofos para cisteína pero son capaces de crecer con GSH como única fuente de azufre, ya que este tripéptido es fácilmente hidrolizable in vivo para obtener cisteína. Una vez se ha sintetizado la cistationina, ésta es usada por la enzima cistationina γ-liasa para formar finalmente cisteína, ácido α-quetobutírico y amonio. El proceso inverso, es decir, la síntesis de homocisteína a partir de cisteína, es llevado a cabo por dos enzimas, la cistationina γ-sintasa y la cistationina β-liasa, codificadas por los genes STR2 y STR3 respectivamente (Figura 18) (Hansen y Johannesen, 2000). La estructura tridimensional de la cistationina β-liasa de A. thaliana es muy similar a la de E. coli (Breitinger et al., 2001). Aunque hay similitudes en la secuencia, algunos aminoácidos del sitio de unión del sustrato son diferentes, haciendo que este dominio en A. thaliana sea más grande que en E. coli, lo que se traduce en diferencias en la afinidad por el sustrato. La cistationina β-liasa está compuesta por cuatro subunidades y cada una de ellas está asociada a una molécula de piridoxal 5´-fosfato, el cofactor necesario para la actividad enzimatica. Una característica de la proteína de A. thaliana es su sensibilidad a inhibidores del bloqueo de tioles como iodoacetamida y Netilmaleimida. Esto indica que al menos una de las cisteínas de esta proteína que está dentro o cerca del centro activo es importante para la actividad enzimática (Ravanel et al., 1996). 1.9.4. REGULACIÓN DE LA RUTA La vía de síntesis de los aminoácidos sulfurados en S. cerevisiae está regulada negativamente. En una cepa silvestre la síntesis de las enzimas necesarias para la asimilación de sulfato, así como para la síntesis de cisteína o metionina, es reprimida cuando se agrega metionina, AdoMet o cisteína al medio de cultivo (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997). Inicialmente se propuso que el efecto de represión era llevado a cabo por AdoMet; la hipótesis se basaba en que la adición de metionina al medio de cultivo del doble mutante sam1 sam2 (cepa que carece totalmente de actividad AdoMet sintasa) no reprime la expresión de los genes de la vía. Esto indicaba que en una cepa silvestre la metionina extra del medio se transforma rápidamente en AdoMet favoreciendo así la represión de los genes de la vía (Thomas et al., 1988). Pero la presencia de AdoMet no es suficiente para esta represión, ya que es necesario un aumento de la concentración intracelular de cisteína proveniente de la transformación de la AdoMet en cisteína por la transulfuración. El aumento de la concentración de 62 Introducción cisteína induce la degradación en el núcleo de Met4, un factor importante en la regulación de los genes de la vía del azufre (Menant et al., 2006). En el promotor de MET25 se identificaron dos secuencias reguladoras comunes para varios de los genes MET. Una de ellas se centra alrededor de la secuencia TCACGTG, la cual es necesaria para inducir la expresión de los genes MET cuando la concentración de AdoMet es baja y para la segregación de los cromosomas durante la división celular (Kuras et al., 1996). Esta secuencia es el sitio de unión para el complejo heterodimérico y activador transcripcional Cbf1-Met4-Met28. La segunda secuencia funcional consenso es AAANTGTG, que es el sitio de unión de dos factores, Met31 y Met32 (Blaiseau et al., 1997). 1.9.4.1. EL COMPLEJO Cbf1-Met4-Met28 La proteína Cbf1 tiene un dominio básico hélice-asa-hélice (bHLH) común en las enzimas de unión al DNA, el cual es necesario para la unión de esta proteína a la secuencia TCACGTG y para su dimerización (Mellor et al., 1991; Masison et al., 1993). Los mutantes para CBF1 requieren sulfuro inorgánico para crecer, tienen la expresión de MET16 disminuida respecto de una cepa silvestre y no se detecta en ellos actividad sulfato permeasa (Thomas et al., 1992). Estas evidencias apuntan a que la activación de los genes MET requiere la unión de Cbf1 a las regiones promotoras, aunque la expresión no depende estrictamente de la actividad de Cbf1 (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997). Por ejemplo, la expresión de los genes MET3 y MET17 en un mutante para CBF1 es aproximadamente la mitad comparada con la expresión en una cepa silvestre, mientras que la expresión de MET10, MET14 y MET16 depende estrictamente de la presencia de Cbf1, lo cual indica que existen otros mecanismos de regulación adicionales a Cbf1 (Kuras et al., 1996). Otra de las proteínas necesarias para una inducción completa de los genes MET es Met4. Análisis fisiológicos de los auxótrofos para metionina permitieron identificar mutaciones en el locus MET4, las cuales confieren resistencia al selenato e imposibilidad de crecer en fuentes inorgánicas de azufre y en cisteína. En los mutantes para MET4 no se detecta la actividad de las enzimas implicadas en el transporte y la asimilación del azufre, al mismo tiempo que no se manifiesta trascripción de los genes MET2, MET3, MET5, MET14, MET16, MET10 y MET17 (Mountain et al., 1993). MET4 codifica para una proteína de 666 aminoácidos que en 63 Introducción su extremo C-terminal contiene una región rica en aminoácidos básicos y cinco grupos de siete leucinas. Este extremo es similar a los dominios bZIP que se encuentran en muchas de las proteínas reguladoras de los eucariotas superiores y de hongos. Estas proteínas se caracterizan por dimerizar a través de las repeticiones de leucina y por unirse al DNA a través de la región de aminoácidos básicos. Se ha demostrado que Met4 es un activador de la trascripción fuerte y que su actividad disminuye cuando aumentan la concentración intracelular de AdoMet y cisteína (Menant et al., 2006) Otra proteína que es necesaria para la inducción de los genes MET es Met28. Esta proteína es un efector positivo de la trascripción de varios genes MET en condiciones no represivas. La mutación del gen correspondiente también confiere auxotrofía a metionina, resistencia a selenato y pérdida de la actividad de las enzimas necesarias para la asimilación del sulfato (Cherest et al., 1997). Respecto de la expresión de los genes MET, se ha determinado que los niveles máximos de MET3, MET10, MET14 y MET16 son menores en este mutante comparados con los de la cepa silvestre (Kuras et al., 1996). La proteína Met28 tiene también un dominio del tipo bZIP pero difiere de Met4 en que hay un segmento de 7 aminoácidos entre la cremallera de leucinas y la región de aminoácidos básicos. Estudios de doble híbrido determinaron que Met4 interacciona con Met28 a través del dominio bZIP, mientras que la interacción entre Met4 y Cbf1 es a través del dominio bZIP de Met4 y el dominio bHLH de Cbf1 (Figura 19). Por el contrario, estos estudios no detectaron interacción entre Cbf1 y Met28, aunque se determinó que Met28 favorece la unión de Cbf1 a la secuencia consenso del DNA (Kuras et al., 1996; Kuras et al., 1997). Estos estudios indican que Met28 tiene dos funciones dentro de la formación del complejo: la primera es aportar estabilidad a la arquitectura del grupo proteico, ya que su interacción con Met4 es indispensable para mantener el complejo estable, y la segunda es estimular la Met4 Figura Cbf1 bHLH bZIP bZIP Met28 19. Interacción entre los diferentes factores involucrados en la regulación de la expresión de los genes MET. El dominio bZIP de Met4 interacciona con el dominio bHLH de Cbf1 y con el dominio bZIP de Met28, aunque Met28 y Cbf1 no interaccionan entre sí. Adaptado de Tomas y Surdin-Kerjan (1997). 64 Introducción unión de Cbf1 al DNA y por ende la de todo el complejo (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997). La regulación de la actividad de Met4 está dada por la estructura de la región N-terminal en la que se encuentran tres dominios: activador, inhibidor y auxiliar. El dominio activador está comprendido entre los aminoácidos 92 y 144, hallándose enriquecido en asparragina y en aminoácidos ácidos. Posteriormente se encuentra otro dominio comprendido entre los aminoácidos 189 y 235 necesario para inhibir la actividad de Met4 en condiciones de represión; esta inactivación se lleva a cabo por la unión de la proteína Met30 con este dominio. Existe un último dominio entre los aminoácidos 312 y 375 llamado dominio auxiliar que es necesario para la actividad máxima de Met4 en condiciones de no represión. Este dominio no es un activador de la trascripción pero es necesario para atenuar la función del dominio inhibidor en condiciones de no represión y es aquí donde ayuda al dominio inhibidor a disociarse de Met30, promoviendo así el funcionamiento de la región activadora (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997) (Figura 20). A. Condición de represión Met30 Act Inhib Aux BD LZ B. Condición de no represión Met30 Act Inhib Aux BD LZ Figura 20. Interacción de Met30 con el dominio inhibidor de Met4. Bajo condiciones de represión, Met30 se une a la región inhibidora inpidiendo que Met4 se una a los promotores de los genes MET. Cuando la condición es de no represión, el dominio auxiliar ayuda a que Met30 se disocie del dominio inhibidor y permita que la región de activación esté funcional. Act, dominio de activación; Inhib, dominio de inhibición; Aux, dominio auxiliar; BD, dominio básico; LZ, cremallera de leucinas. Tomado de Thomas y SurdinKerjan (1997). Una característica importante de Met30 es su relación con el sistema de degradación por ubiquitinación, el cual juega un papel importante en la regulación de los procesos celulares. La función más estudiada de la ubiquitinación es su participación en la degradación de proteínas, en donde las proteínas poliubiquitinadas son reconocidas por el proteasoma 26S y son rápidamente degradadas. Este proceso 65 Introducción de ubiquitinación es catalizado por una cascada de reacciones enzimáticas que empiezan con la activación de la ubiquitina por parte de las enzimas E1, reacción que depende de ATP. La ubiquitina activada es transferida al residuo cisteína específico de las enzimas tipo E2. Estas enzimas conjugan directamente las proteínas diana con ubiquitina pero para ello necesitan factores que confieren especificidad de sustrato. La especificidad está dada por los complejos ubiquitina-proteína ligasas o E3, siendo los más estudiados los complejos SCF compuestos por tres unidades: Skp1, Cdc53 y una proteína de la familia F-box. Esta última es la responsable de la unión con la proteína diana proporcionando especificidad a todo el complejo de degradación, de modo que por cada proteína F-box existen diferentes complejos SCF. En S. cerevisiae se han estudiado tres complejos de este tipo que corresponden a SCFCdc34, SCFGrr1 y SCFMet30 (Deshaies, 1999; Kaiser et al., 2000). Met30 interacciona con la proteína Cdc53, un componente de la ubiquitinaproteína ligasa (Deshaies, 1999), lo cual relaciona la regulación de la actividad de Met4 con el sistema de ubiquitinación. En medio mínimo Met4 es ubiquitinada y degradada en respuesta a un exceso de metionina, mientras que en medio rico Met4 es ubiquitinada pero permanece estable (Kaiser et al., 2000). Al permanecer estable en esta última condición, Met4 no se dirige a los promotores de los genes MET pero sí puede activar los genes SAM1 y SAM2, los cuales son necesarios para la síntesis de AdoMet. Esto indica que la ubiquitinación es un mecanismo que regula la unión de Met4 a diferentes promotores (Menant et al., 2006). La hipótesis consiste en que Met4 estaría inactiva durante el crecimiento normal de las células de levadura, pero cuando se agrega metionina al medio de cultivo Met4 se activaría transitoriamente para expresar los genes MET y para restaurar las concentraciones adecuadas de los metabolitos importantes de la biosíntesis de la metionina, sobre todo de AdoMet. Por esto se ha propuesto que en condiciones donde las concentraciones de estos metabolitos no son lo suficientemente altas como para mantener la progresión del ciclo, se induce una parada para conservar la integridad celular. Esta parada estaría ligada a la concentración de metionina, junto con la expresión de un gen desconocido que dependería de la actividad de Met4. Este gen tendría una expresión constitutiva en un mutante para MET30, lo que conduciría a la parada permanente del ciclo celular (Kaiser et al., 2000). 66 Introducción + metionina - metionina Cdc53 Ub Skp1 Met30 Cdc54 Ub Ub Met4 Met4 Ubp Expresión del Gen X Expresión de los Genes MET Inhibición de la Expresión de los Genes MET Continuación del Ciclo Celular Figura 21. Modelo de regulación de Met4 según Kaiser et al (2000). Cdc34/SCFMet30 median la ubiquitinación de Met4, lo que conlleva a la represión de la expresión de los genes MET. La ubiquitina hidrolasa (Ubp) desubiquitina y activa a Met4, lo que resulta en la expresión de los genes MET y del gen X, un inhibidor de la progresión del ciclo celular. Met30 Según Menant et al (2006), la regulación del complejo Cdc34/SCF viene determinada por la concentración intracelular de cisteína. Recientemente se ha demostrado que la degradación de Met4 en medio mínimo está determinada por la concentración intracelular de cisteína (Menant et al., 2006). Analizando la degradación de las proteínas GFP-Met4 y Met4-HA expresadas bajo el promotor de MET4 en un mutante ∆cys4 (ausencia de la cistationina β-sintasa), se observa que ambas proteínas son degradas cuando se agrega al medio cisteína, mientras que el exceso de metionina o AdoMet no inducen esta degradación. Esto indica que una cepa silvestre que crece en medio mínimo transforma el exceso de metionina en cisteína por transulfuración, aumentando su concentración intracelular e induciendo la degradación de Met4 (Menant et al., 2006). Se ha propuesto que el papel de la cisteína en la degradación de Met4 podría consistir en el control directo de la actividad del complejo SCFMet30 sobre Met4 a través de un mecanismo tiólico que actuaría sobre Met4 y/o SCFMet30. Una de las hipótesis es que la unión de la cisteína con una subunidad de Met30 estabilizaría la interacción entre Met4 y SCFMet30 (Menant et al., 2006) (Figura 21) 67 Introducción 1.9.4.2. LOS REGULADORES Met31 y Met32 Como se ha mencionado antes, en el promotor de MET25 se identificó otra secuencia reguladora que también está presente en otros genes MET. Esta secuencia se encuentra alrededor de la posición -200, correspondiendo a la secuencia consenso AAANTGTG que es reconocida por Met4. La unión de este activador con la citada secuencia está mediada por Met31 o Met32 y el complejo es estabilizado por Met28 (Blaiseau y Thomas, 1998). Ambas proteínas se caracterizan por tener dos dominios dedo de zinc: CC/HH en C-terminal y CC/HC en N-terminal. El análisis por Northern de las células que no expresan Met31 y/o Met32 demostró que la función de las dos proteínas durante la transcripción de los genes de la vía del azufre varía de un gen a otro. Por ejemplo, la expresión de los genes MET3 y MET14 requiere de la presencia de Met31 y Met32 simultáneamente, mientras que la expresión de MET28 requiere al menos una de las dos proteínas y la expresión de MET25 es constitutiva en el doble mutante met31 met32 (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997; Blaiseau y Thomas, 1998). Por otra parte, en los promotores de MET28 y MET3 no se forma el complejo Cbf1-Met28Met4, lo que indica que existe un sistema activador de la transcripción diferente al formado por este complejo. Todas estas evidencias indican que existen diferentes combinaciones de los activadores de la trascripción para la expresión de los genes MET y que en todos es necesario el factor Met4. Análisis de doble híbrido indican que Met4 interacciona con Met31 y Met32 independientemente, pero estas dos proteínas no interaccionan con Met28. El papel de Met28 es mantener estable los complejos Met4-Met28-Met31 o Met32, siendo indispensable el dominio bZIp de Met4 para la formación de ambos complejos. Además se ha demostrado que la unión de Cbf1 a la secuencia TCACGTG aumenta la afinidad del complejo Met4-Met28-Met31(Met32) por la secuencia AAANTGT vecina (Blaiseau y Thomas, 1998). Todos estos hallazgos señalan que Met4 y Met28 son reclutados dentro de uno u otro complejo dependiendo del tipo de secuencia presente en el promotor, aunque estos complejos pueden actuar de manera sinérgica en la expresión de dichos genes, ya que pueden tener elementos comunes haciendo parte de los sistemas activadores (Blaiseau y Thomas, 1998). A partir de esta idea se han desarrollado dos hipótesis sobre la relación entre los dos sistemas de activación de la transcripción que se ilustran en la figura 22. 68 Introducción Met4 Met28 Cbf1 Cbf1 TCACGTG Met31/32 AAANTGTG Opción A ATG MET3, MET28 … Met4 Cbf1 Cbf1 ATG Met28 TCACGTG MET16, … + Met4 Met28 Cbf1 Cbf1 Met31/32 AAANTGTG Opción B ATG TCACGTG MET3, MET28 … Figura 22. Modelos de reclutamento de Met4 y Met28 dependiendo de la secuencia promotora del gen MET. Tomado de Blaiseau y Thomas (1998). 69 2. OBJETIVOS 71 Objetivos 2. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo ha sido caracterizar los genes de S. cerevisiae cuyos productos son homólogos a las GST de clase Omega caracterizadas previamente en humanos y otros eucariotas superiores y determinar su relación con estrés oxidativo y con la regulación del estado redox de proteínas. Este objetivo se ha desarrollado a través de los siguientes objetivos específicos: 1. Obtener los mutantes nulos simples y múltiples para los genes YGR154c (GTO1), YKR076w (GTO2) e YMR251w (GTO3) y analizar su fenotipo. 2. Determinar la localización subcelular de las tres proteínas Gto utilizando la proteína GFP fusionada a cada una de ellas. 3. Analizar la expresión de cada uno de los genes en diferentes condiciones ambientales tales como el tratamiento con diversos agentes oxidantes y otros agentes tóxicos. Además, verificar si esta expresión depende de los factores de transcripción relacionados con estrés oxidativo Yap1 y Msn2/Msn4. 4. Expresar y purificar las tres proteínas Gto a partir de cultivos de E. coli para posteriormente determinar su actividad enzimática frente a diferentes sustratos clásicos de las GST, así como las actividades específicas de las GST de clase Omega (actividad glutaredoxina, DHAR y DMARV). 5. Realizar una aproximación genómica para el análisis funcional de las proteínas Gto, y en especial de Gto1. 73 3. MATERIALES Y MÉTODOS 75 Materiales y Métodos 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. MICROORGANISMOS UTILIZADOS 3.1.1. Cepas de S. cerevisiae Las cepas de S. cerevisiae utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1, en la cual se incluyen su genotipo y los comentarios correspondientes. CEPA GENOTIPO RELEVANTE COMENTARIOS W303-1A MATa ura3-1 ade2-1 leu2-3-112 trp1-1 his3-11,15 Cepa silvestre W303-1B MATα ura3-1 ade2-1 leu2-3-112 trp1-1 his3-11,15 Cepa silvestre MML535 MML536 MML538 MML540 MML542 MML546 MML572 MATa gto1::natMx4 MATα gto1::natMx4 MATa gto2::kanMX4 MATα gto2::kanMX4 MATa gto3::natMx4 MATα gto1::kanMx4 MATa [pMM401(GTO2-3HA)]::URA3 Delección de GTO1 en W303 -1A Delección de GTO1 en W303 -1B Delección de GTO2 en W303-1A Delección de GTO2 en W303-1B Delección de GTO3 en W303 -1A Delección de GTO1 en W303 -1B Integración del plásmido pMM401 en W3031A MML587 MML590 MATa gto1::kan MX4 gto3::natMX4 MATα gto1::kanMX4 gto2::kanMX4 gto3::natMX4 Producto del cruce entre MML542 x MML546 Producto del cruce entre MML540 x MML587 MML628 MML629 MML630 MML634 MML636 MML661 MML666 MML686 MATa gtt1::CaURA3 MATa gtt2::kanMX4 MATα gtt2::natMX4 MATα gto1::natMX4 gtt1::CaURA3 MATα gto2::kanMX4 gtt1::CaURA3 MATa gtt1::CaURA3 gtt2::kanMX4 MATa gtt1::CaURA3 gtt2::natMX4 MATa gto1::kanMX4 gto2::kanMX4 gto3::natMX4 Delección de GTT1 en W303-1A Delección de GTT2 en W303-1A Delección de GTT2 en W303-1A Producto del cruce entre MML536 x MML628 Producto del cruce entre MML540 x MML628 Producto del cruce entre MML629 x MML634 Producto del cruce entre MML630 x MML636 Producto del cruce entre MML540 x MML587 MML687 MATa gto1::kanMX4 gto2::kanMX4 gtt1::CaURA3 gtt2::natMX4 Producto del cruce entre MML590 x MML666 MML716 MATa gto1::kanMX4 gto2::kanMX4 gto3::LEU2 gtt1::CaURA3 gtt2::natMX4 Disrupción de GTO3 en MML687, usando el plásmido pMM550 Disrupción de GRX2 en W303-1A MML736 MATa grx2::LEU2 77 Materiales y Métodos CEPA MML752 MML826 Wmsn2msn4 GENOTIPO RELEVANTE MATa grx1::kanMX4 grx2::LEU2 MATa str3::kanMX4 MATa msn2::HIS3 msn4::TRP1 COMENTARIOS Disrupción de GRX1 en MML736 Delección de STR3 en W303-1A Proveniente de F. Estruch; delección de MSN2 y MSN4 en W303-1A Wyap1 MATa yap1::kanMX4 Proveniente de F. Estruch; delección de YAP1 en W303-1A BY4741 Y03603 MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 MATa pex5::kanMX4 Cepa silvestre De EUROSCARF *; delección de PEX5 en BY4741 Y04076 MATa pex7::kanMX4 De EUROSCARF; delección de PEX7 en BY4741 Tabla 1. Lista de las cepas de S. cerevisiae utilizadas en este trabajo. *European Saccharomyces Archive for Funcional cerevisiae frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf. Analysis (Universidad de Frankfurt), http://web.uni- 3.1.2. CEPAS DE E. coli Para replicar y conservar los plásmidos construidos durante este trabajo se utilizó la cepa de E. coli DH5α [F- SupE44 DlacU169 (φ80lacZ∆M15) hsdR17recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1] (Hanahan, 1983). Para los procesos de expresión y purificación de proteínas de S. cerevisiae en E. coli se utilizaron células de la cepa BL21 [F- ompT hsdSr (rB- mB) gal dcm, Novagen] de esta última especie. 3.2. PLÁSMIDOS Los plásmidos utilizados en este trabajo y los comentarios respectivos se detallan en la Tabla 2. PLÁSMIDO DERIVADO VECTOR ORIGINAL pET-21a pMAL-c2X YEplac211 pUG35 Novagen New England Biolabs Gietz y Sugino, 1988 COMENTARIOS Proporcionado por W. H. Hegemann, Institute of Microbiology, Duesseldorf, Alemania 78 Materiales y Métodos PLÁSMIDO DERIVADO pMM399 VECTOR ORIGINAL pUG35 COMENTARIOS GTO2 clonado entre los sitios XbaI-EcoRI del vector y marcado con la secuencia de la proteína GFP en posición C-terminal. La expresión depende del promotor de MET25 pMM400 Plásmido integrativo que contiene GTO1 (con su propio promotor) marcado en posición C-terminal con la secuencia de 6 Histidinas y el epítopo HA pMM401 Plásmido integrativo que contiene GTO2 (con su propio promotor) entre los sitios PstI-EcoRI del vector, marcado en posición C-terminal con la secuencia de 6 Histidinas y el epítopo HA pMM402 Plásmido integrativo que contiene GTO3 (con su propio promotor) entre los sitios PstI-BamHI del vector, marcado en posición C-terminal con la secuencia de 6 Histidinas y el epítopo HA pMM440 Plásmido centromérico que contiene GTO1 entre los sitios BSiWI-PstI del vector, en fase con la secuencia de la proteína GFP en posición N-terminal. La expresión depende del promotor tetO7 (Gari et al., 1997) pMM446 pUG35 GTO3 clonado entre los sitios PstI-EcoRI del vector en fase con la secuencia de la proteína GFP en posición C-terminal. La expresión depende del promotor de MET25 pMM494 pMM496 pMM498 pMM543 pMM545 pMM563 pMM566 pMM578 pET-21a pET-21a pET-21a pET-21a pET-21a pET-21a pMAL-c2X YEplac211 GTO2 clonado entre los sitios NdeI-XhoI del vector GTO3 clonado entre los sitios NdeI-XhoI del vector GTT1 clonado entre los sitios NdeI- XhoI del vector Derivado de pMM494 con una sustitución C46G Derivado de pMM494 con una sustitución C67S Derivado de pMM494 con una sustitución C307G GTO1 clonado entre los sitios EcoRI- HindIII del vector GTO1 con su propio promotor clonado entre los sitios EcoRI-BamHI del vector pMM584 YEplac211 GTO2 con su propio promotor clonado entre los sitios EcoRI-HindIII del vector pMM611 pMM640 pMM644 pMM736 YEplac211 pET-21a pET-21a GTO3 con su propio promotor clonado entre los sitios BamHI-PstI del vector Derivado de pMM563 con las sustituciones C67S y C307G Derivado de pMM640 con las sustituciones C46G, C67S y C307G Plásmido centromérico que contiene GTO1 (con su propio promotor) marcado con la secuencia TAP en posición N-terminal pMM756 pCM188 Plásmido centromérico que contiene STR3 entre los sitios BamHI-NotI del vector. La expresión depende del promotor tetO2 (Gari et al., 1997) pMM758 pMM760 pMM762 Derivado de pMM756 con una sustitución C353S Derivado de pMM756 con una sustitución C362S Derivado de pMM756 con una sustitución C387S Tabla 3. Plásmidos utilizados en este estudio y una descripción breve de sus características más relevantes. 79 Materiales y Métodos 3.3. MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo utilizados para el crecimiento de S. cerevisiae se detallan a continuación. Cuando fue necesario se agregó agar al 2% para obtener medios de cultivo sólidos. • • • YPD: glucosa 2%, peptona 2%, extracto de levadura 1%. YPGly: glicerol 3% (p/v), peptona 2%, extracto de levadura 1%. YPOle: extracto de levadura 1%, peptona 2%, Tween 40 (Sigma) 0,02% (p/v), ácido oleico (Sigma) 0,2% (p/v). El extracto de levadura y la peptona se disolvían en agua, se ajustaba el pH a 6,8 y se autoclavaba (121ºC y 1 atm de presión durante 15 min). Aparte se mezclaban el ácido oleico y el Tween40, se esterilizaba la mezcla por filtración y se agregaba al medio de cultivo. • SC (Sherman, 2002): Base nitrogenada para levaduras sin aminoácidos (Difco) 0,67%, glucosa 2%, Drop out 0,2%. El Drop out es la combinación en seco de bases nitrogenadas, aminoácidos y vitaminas, excepto el suplemento adecuado en el caso de selección de plásmidos; se agregaba al medio antes de esterilizarlo por autoclave. Su composición se muestra en la Tabla 3. AMINOÁCIDO Adenina Alanina Arginina Asparragina Ácido aspártico Cisteína Glutamina Ácido glutámico gramos 0,5 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 AMINOÁCIDO Glicina Histidina Inositol Isoleucina Leucina Lisina Metionina Ácido para-aminobenzóico gramos 2,0 2,0 2,0 2,0 4,0 4,0 4,0 0,2 AMINOÁCIDO Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptófano Tirosina Uracilo Valina gramos 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Tabla 3. Compuestos que hacen parte del Drop out y la cantidad correspondiente dentro de la mezcla (Sherman, 2002). • • SC OLÉICO: Base nitrogenada para levaduras sin aminoácidos 0,67%, Drop out 0,67%, Tween 40 (Sigma) 0,02% (p/v), ácido oléico (Sigma) 0,2% (p/v). MEDIO DE ESPORULACIÓN: Acetato de potasio 1%, extracto de levadura 0,1%, glucosa 0,05%. 80 Materiales y Métodos • MEDIO B (Cherest y Surdin-Kerjan, 1992): Medio de cultivo utilizado para analizar la capacidad de crecimiento en diferentes fuentes de azufre. Todos los componentes azufrados de este medio son de Sigma. Para obtener el medio sólido se suplementó con 1% de agarosa. Los componentes de este medio y su concentración final son los siguientes: Sales minerales: NH4Cl 15 mM, K2HPO4 6,6 mM, KH2PO4 0,5 mM, NaCl 1,7 mM, CaCl2 0,7 mM, MgCl2 2 mM. Oligoelementos: Ácido bórico 0,5 µg /ml, CuCl2 0,04 µg/ml, KCI 0,1 µg/ml, ZnCl2 0,19 µg/ml, FeCl3 0,05 µg/ml. Vitaminas y factores de crecimiento: Pantotenato de calcio 2 µg/ml, tiamina 2 µg/ml, piridoxina 2 µg/ml, biotina 0,02 µg/ml, inositol 20 µg/ml. Fuentes de carbono: glucosa 2%. Fuentes de azufre: 0,2mM de NH4SO4, cisteína, metionina, glutatión o cistationina. Para el cultivo de E.coli se utilizó el siguiente medio: • LB: Triptona 1%, NaCl 1%, extracto de levadura 0,5%. pH ajustado a 7,5 con NaOH 1N. En determinadas circunstancias el medio fue suplementado con los siguientes componentes: Ampicilina a una concentración final de 50 mg/l. IPTG (isopropil-β–D–galactopiranosido), inductor no metabolizable de la síntesis de la enzima β–galactosidasa. Se agregaba al medio a una concentración final de 1 mM. Sorbitol 1 M y glicil betaína 2,5 mM. La adición de estos compuestos al medio LB favorece la solubilidad de proteínas recombinantes dentro de las células de E. coli (Blackwell y Horgan, 1991). Glucosa 0,2% para los cultivos de células transformantes que portan derivados del plásmido pMAL-c2X. 81 Materiales y Métodos 3.4. MANIPULACIÓN DE MICROORGANISMOS Para el cultivo de S. cerevisiae las células se incubaron a 30ºC y en el caso de E. coli las células se incubaron en un rango entre 25 y 37ºC, agitando los cultivos líquidos a 180 r.p.m. La medida del crecimiento de los cultivos se realizó mediante la lectura de la densidad óptica a 600 nm. 3.5. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 3.5.1. EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO DE S. cerevisiae Soluciones necesarias para la extracción: • TNST: Triton X-100 2%, SDS 1%, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM, Tris HCl 10 mM pH 8 • FC: fenol/cloroformo/alcohol isoamílico 25:24:1 con 0,1% 8-hidroxiquinolina y saturado con TE • TE: 0,5 ml de una solución Tris-HCl 2 M pH 8; 0,2 ml de una solución de EDTA 0,5 mM pH 8; agua hasta un volumen de 1 litro. • NaOAC: Acetato de sodio 0,3 M pH 8. Procedimiento: 1. Se inocularon 10 ml de medio YPD con una colonia fresca y se dejó crecer durante 16 horas. 2. El cultivo se centrifugó a 3.000 g durante 2 min y se pasaron las células a un tubo eppendorf para lavarlas con 1 ml de agua estéril. 3. Las células se resuspendieron con 200 µl de TNST y luego se les agregaron 200 µl de FC y 200 µl de perlas de vidrio (450-600 µm, Sigma). 4. La mezcla se agitó en vortex a máxima velocidad durante 4 min. 5. Posteriormente se agregaron 200 µl de TE mezclando por inversión. La mezcla se centrifugó a 13.200 g durante 5 min. 6. Se tomó el sobrenadante, para colocarlo en un tubo nuevo y se añadió 1 ml de etanol 100%. Después de mezclar por inversión, la mezcla se centrifugó a 13.200 g durante 5 min. 82 Materiales y Métodos 7. Al precipitado se le agregaron 400 µl de TE junto con 3 µl de RNAsa (10 mg/ml) y se incubó a 37ºC durante 5 min. 8. Después se agregaron 50 µl de NaOAC y 500 µl de FC. Esta mezcla se agitó con vortex a máxima velocidad durante 1 min. 9. Luego se centrifugó a 13.200 g durante 5 min y se desechó el sobrenadante. 10. El precipitado se lavó con 1 ml de etanol 70% y se centrifugó nuevamente a 13.200 g durante 1 min. 11. Se retiró completamente el sobrenadante y se centrifugó otra vez a la misma velocidad. El sobrenadante restante se retiró completamente y el precipitado se dejó secar a temperatura ambiente durante 10 min. 12. Se resuspendió el precipitado en 50 µl de agua MilliQ y se valoró de manera aproximada la calidad del DNA por electroforesis en gel de agarosa (Serva) al 0,8%, comparando la intensidad de las correspondientes bandas con la intensidad de las bandas patrón de cantidad conocida. 3.5.2. TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE Amplificación y clonación de los genes estudiados: Para la clonación de genes de S. cerevisiae, se amplificaron los genes mediante PCR a partir de DNA genómico de la cepa silvestre W303-1A de S. cerevisiae y se llevaron a cabo las digestiones, tanto del inserto como del vector, con las enzimas respectivas de acuerdo con los sitios de restricción seleccionados para tal fin. Las enzimas de restricción utilizadas eran de Roche o Takara y se utilizaron siguiendo las indicaciones del fabricante para cada una de las digestiones. Los fragmentos de DNA obtenidos después de las digestiones se purificaron utilizando el sistema “High Pure PCR Product Purification Kit” (Roche) y fueron valorados mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Para determinar el tamaño aproximado de los fragmentos de DNA se utilizó como estándar “1Kb DNA Ladder” (InvitrogenTM). En las ligaciones inserto-vector se utilizó la enzima T4 DNA ligasa (Takara), siguiendo las instrucciones del fabricante. 83 Materiales y Métodos Métodos de transformación para E. coli y S. cerevisiae: La obtención de células competentes y el protocolo de transformación de cultivos de E. coli mediante el método de cloruro de calcio se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos estándar de laboratorio (Ausubel, 1994-1998). En la transformación de S. cerevisiae con plásmidos de expresión o fragmentos lineales de DNA se siguió el método rápido con acetato de litio (Gietz et al., 1992), plaqueando las células en medio selectivo (según la auxotrofía o el marcador de selección correspondiente) e incubando las placas a 30ºC durante 48 horas. Purificación de plásmidos a partir de cultivos de E. coli Para la purificación de plásmidos replicados en E. coli se cultivaron las células en medio LB con ampicilina a 37ºC durante 16 horas, utilizándose el sistema “NucleoSpin® Plasmid QuickPure” (Macherey-Nagel) según las indicaciones del fabricante. Construcción de proteínas con cambios en aminoácidos específicos A partir de genes silvestres clonados en plásmidos de expresión en E. coli se construyeron plásmidos derivados de éstos con mutaciones introducidas en dichos genes (Tabla 2) mediante el método de ExSite (Weiner y Costa, 1995). Los oligonucleótidos para la amplificación por PCR e introducción de la mutación se diseñaron cerca del punto donde se deseaba hacer el cambio, el cual no debía alterar el marco de lectura para la correcta transcripción del gen. La mutación era detectada por la creación de un sito de restricción y confirmada por secuenciación (3100 Avant Genetic Analyser, Applied Biosystems). 3.5.3. CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES NULOS SIMPLES Y MÚLTIPLES DE S. cerevisiae Los mutantes nulos para un único gen se obtuvieron siguiendo el método de sustitución por homología de secuencias flanqueantes cortas (short-flanking homology approach) con el módulo kanMX4 (resistencia a geneticina) (Wach et al., 1994), natMX4 (resistencia a nourseotricina) (Goldstein y McCusker, 1999), o CaURA3MX (restauración 84 Materiales y Métodos de la prototrofía para uracilo) (Goldstein et al., 1999), los cuales eran amplificados previamente por PCR con oligonucleótidos específicos para cada gen. Las mutaciones se confirmaron a continuación mediante PCR, según la estrategia descrita en Wach et al. (1994). Los mutantes múltiples se obtuvieron cruzando las cepas parentales, induciendo la esporulación de la cepa diploide y analizando las tétradas obtenidas para seleccionar la combinación de mutaciones de interés (Sherman, 2002). 3.5.4. PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Gto RECOMBINANTES Para la purificación de las proteínas Gto1 y Gto3 se partió de 500 ml de cultivo mientras que para la purificación de Gto2 se partió de 50 ml de cultivo. Para facilitar la solubilización de Gto3 fue necesario suplementar el medio de cultivo LB con sorbitol 1 M y glicil betaína 2,5 mM e incubar el cultivo a 25ºC. En el caso de la expresión de Gto1 el medio de cultivo fue suplementado con glucosa al 0,2% con el fin de reprimir la expresión del gen que codifica para la amilasa, la cual puede degradar la amilosa contenida en la columna de afinidad. Inducción de las proteínas recombinantes: 1. Se inoculó una colonia del correspondiente transformante de E. coli BL21 en la cantidad correspondiente de medio LB con ampicilina (suplementado con los componentes necesarios de acuerdo con el sistema de expresión utilizado). 2. Se incubó el cultivo con agitación a 25 o 37ºC según fuese el caso hasta alcanzar una concentración de 2x107 células/ml. Se tomó una muestra de 1 ml que se etiquetó como “control no inducido”. 3. Para inducir la expresión de la proteína se agregó IPTG a una concentración final de 1 mM y se continuó la incubación con agitación. La inducción de Gto1 y Gto2 se llevó a cabo durante 4 horas mientras que la inducción de Gto3 se llevó a cabo durante toda la noche (16 horas aproximadamente). Se tomó una segunda muestra de 1 ml que se etiquetó como “control inducido”. 4. Una vez terminado el tiempo de inducción, el cultivo se colocó en hielo durante 5 min y luego se centrifugó a 4.000 g durante 20 min a 4ºC. 85 Materiales y Métodos 5. Después de retirar el sobrenadante, las células se congelaron a -20ºC durante 16 horas o se continuó con la purificación. La inducción de la proteína se evaluó con las muestras control por electroforesis en gel de SDS-acrilamida al 10% y tinción del gel en solución de azul de Comassie. Purificación de las proteínas expresadas con el sistema pET-21a: En este procedimiento se siguieron específicamente las indicaciones del sistema QUIAexpressionist TM (Quiagen) para la purificación por cromatografía de afinidad de las proteínas Gto2 y Gto3 utilizando columnas de Ni-NTA. Para la elución de la proteína Gto2 se utilizó una solución de imidazol 10 mM, mientras que para la elución de la proteína Gto3 se utilizó una concentración de imidazol 20 mM. Los eluídos correspondientes se analizaron por electroforesis en gel de SDS-acrilamida al 10% y tinción del gel con solución de azul de Comassie. Purificación de la proteína Gto1 expresada en el sistema pMAL-c2X: Esta purificación se llevó a cabo siguiendo específicamente las instrucciones del manual del sistema pMALTM (New England, Biolabs®INC). La digestión de la proteína eluída de la columna con el factor Xa (para separar la proteína Gto1 de la región MBP) se incubó a 20ºC durante 16 horas. La comprobación de la digestión se hizo por electroforesis en gel de SDS-acrilamida al 10% y tinción del gen con solución de azul de Comassie. La concentración final de las proteínas obtenidas mediante ambos sistemas de purificación se determinó utilizando el método de Bradford (reactivos de BioRad). 3.5.5. ANÁLSIS DE EXPRESIÓN GÉNICA EN S. cerevisiae POR DIG NORTHERN Obtención de muestras Inicialmente se precultivó la cepa de interés en 20 ml de medio de cultivo líquido (según se indicará en cada caso) y se incubó con agitación a 30ºC durante 16 86 Materiales y Métodos horas. Posteriormente se diluyó el cultivo hasta una concentración de 5x105 células/ml y se dejó crecer hasta una concentración de 2x107 células/ml. En este momento se agregó el compuesto a ensayar y se tomó una muestra correspondiente al tiempo inicial de tratamiento. Los cultivos se incubaron durante 90 min tomando muestras en intervalos de 30 min. El volumen de cada una de las muestras fue de 100 ml de cultivo. Las células se centrifugaron a 3.000 g durante 5 min y se lavaron con agua estéril a 4ºC. A continuación se congelaron con nitrógeno líquido y se conservaron a -70ºC o se continuó con la extracción del RNA inmediatamente. Para preparar los medios de cultivo y la transferencia del RNA a la membrana de Nylon se utilizó agua MilliQ libre de RNAsas. Todo el material de electroforesis y de transferencia se lavó con agua y abundante jabón; los materiales y las muestras se manipularon con guantes. Soluciones y materiales: • • • • • • • • Anti-Digoxigenin-AP, alcalina (Roche) Fab fragments, conjugados con fosfatasa B1: 25 ml de una solución Tris-HCl 2 M pH 8, agua hasta 500 ml. Esterilizado en autoclave. B2: 0,5 g de Blocking Reagent (Roche), 100 ml de B1, agua hasta 100 ml. Esterilizado en autoclave. B3: 0,5 ml de dietanolamina, 40 µl de HCl 37%, agua hasta 50 ml. CDP-StarTM (Roche): Sustrato de la fosfatasa alcalina cuya defosforilación da lugar a la formación de un compuesto quimioluminiscente. FC: Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico 25:24:1 con 0,1% 8-hidroxiquinolina y saturado con TE Fenol Ácido: Fenol:agua 3,75:1 (Invitrogen). MagicHyb: 25 ml de una solución de Na2HPO4 1 M pH 7,2, 1 ml de una solución EDTA 0,5 M pH 8, 20 g SDS, 0,5 g de Blocking Reagent (Roche), agua hasta 100 ml. Conservada a 4ºC. • • • Membrana de Nylon (Roche) NaOAc: Acetato de sodio 3 M pH 5,2. Esterilizado en autoclave. NaOH 0,1 M y Tris HCl 0,1 M: para transferir el RNA a la membrana de Nylon. 87 Materiales y Métodos • 10x NBC: Ácido bórico 0.5 M, citrato de sodio 10 mM, NaOH 50 mM, agua hasta 1 litro, pH 7,5. Después de preparar esta solución se agregó dietil pirocarbonato 1%, se mezcló por inversión y se autoclavó. • • • Tampón de carga 10x: Ficoll 15%, EDTA disódico 0.1 M pH 8 y azul de bromofenol 0.25%. TE: 0,5 ml de una solución de Tris-HCl 2 M pH 8, 0,2 ml de una solución de EDTA 0,5 mM pH 8, agua hasta 1 litro. Esterilizada en autoclave. TES: 0,5 ml de una solución de Tris-HCl 2 M pH 8,0, 2 ml de una solución de EDTA 0,5 mM pH 8,0, 5 ml de una solución de SDS 10%, agua hasta 100 ml. Esterilizada en autoclave. • WB: 10 ml de una solución de Na2HPO4 1 M pH 7,2, 1 ml de una solución de EDTA 0,5 M pH 8, 5 g de SDS, agua hasta 500ml. Extracción de RNA total: 1. Las células se resuspendieron en 25 µl de TE y luego se les agregaron 25 µl de fenol ácido 2. La mezcla se incubó a 65ºC durante 2 min y posteriormente se agregó un volumen igual de perlas de vidrio (450-600 µm, Sigma) 3. Las células se rompieron agitando la mezcla en vortex a máxima velocidad durante 4 min. 4. Se agregaron 600 µl de TES y 600 µl de fenol ácido, luego se agitó en vortex a máxima velocidad durante 30 seg. 5. Nuevamente se incubó la mezcla a 65ºC durante 15 min y se hizo una última agitación en vortex a máxima velocidad durante 30 seg. Luego la mezcla se incubó en hielo durante 5 min. 6. Se centrifugó la mezcla a 13.200 g durante 5 min a 4ºC, después se tomó todo el sobrenadante, se colocó en un tubo nuevo y se agregaron 500 µl de FC. 7. Se agitó en vortex a máxima velocidad durante 30 seg y luego se centrifugó a 13.200 g a 4ºC durante 5 min. 8. Tomando todo el sobrenadante, se colocó en un tubo nuevo y se agregaron 40 µl de NaOAc y 1 ml de etanol 100%. 9. Para la precipitación del RNA, se incubó a -20ºC durante 1 a 2 horas. Luego se centrifugó a 13.200 g durante 5 min a 4ºC. 88 Materiales y Métodos 10. El precipitado se lavó con etanol 70% (sin resuspender). Se retiró todo el sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente durante 10 min. 11. La resuspensión del RNA se hizo con 50 µl de agua MilliQ libre de RNAsas. 12. Para la valoración del RNA total extraído se hizo una dilución 1:100 en agua MilliQ libre de RNAsas y se midió la densidad óptica de dicha dilución a 260 nm. La concentración se calculó teniendo en cuenta que 1 unidad de densidad óptica (260 nm) corresponde aproximadamente a 40 µg/µl de RNA. La razón [densidad óptica (260 nm)/ densidad óptica (280nm)] no era mayor de 2 y la concentración final se ajustó aproximadamente a 5 µg/µl. 13. El RNA total extraído se conservó a -20ºC o se procesó directamente para la electroforesis en gel de agarosa. Síntesis de sondas de DNA marcadas con Dioxigenin-dUDP (DIG-dUDP): La síntesis de sondas para la detección de mRNA se llevó a cabo utilizando el producto “DIG DNA Labeling Mix, 10x concentration” (Roche), siguiendo las indicaciones del fabricante. Como molde para la síntesis de la sonda se utilizó un fragmento del gen de interés, amplificado por PCR a partir de DNA genómico, con un tamaño no superior a 500 pares de bases. La calidad de la sonda se verificó por electroforesis en agarosa al 0,8%. Electroforesis en gel de formaldehído-agarosa: 1. Se mezclaron 0,8 g de agarosa (Serva) en 80 ml de 1xNBC. La mezcla se calentó hasta que la agarosa se disolvió completamente. 2. La agarosa se dejó enfriar hasta 65ºC y se añadieron 2 ml de formaldehído al 37% mezclando bien. 3. La solución de agarosa se colocó en la cubeta de electroforesis con los peines y se dejó solidificar durante 45 min aproximadamente. Como tampón de electroforesis se utilizó 1xNBC. 4. Se tomaron de 5 a 10 µg de RNA total (5 µl aproximadamente) y se colocaron en un tubo nuevo. 5. Luego se agregaron 2 µl de 10xNBC, 3 µl de formaldehído al 37% y 10 µl de formamida. 89 Materiales y Métodos 6. Esta mezcla se incubó a 65ºC durante 15 min y luego se agregaron 2 µl de tampón de carga 10x junto con 0,5 µl de solución de bromuro de etidio (2 mg/ml). 7. Las muestras se cargaron en el gel y se corrió la electroforesis a 100 V durante 90 min. Transferencia a la membrana de Nylon y fijación con rayos UV: 1. La membrana de Nylon (dimensiones 5 x 15 cm) se sumergió en agua durante 5 min. 2. Se colocó la membrana y luego el gel sobre el equipo de vacío VacuBlot de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Equipo para tranferencia de RNA acoplado a bomba de vacío, LKB VacuGen X de Pharmacia). 3. Se acopló a la bomba de vacío y se colocó a una presión de 50 mBar. 4. El gel se cubrió con agua durante 15 min. 5. Se retiró el agua y se cubrió el gel con NaOH 0,1 M durante 15 min. Este paso se repitió una vez más. 6. Se retiró la solución anterior y se cubrió el gel con Tris-HCl 0,1 M pH 7,5 durante 15 min. 7. Esta última solución se retiró y luego se cubrió la cámara del VacuBlot con agua hasta cubrir completamente los geles para transferir el RNA durante 90 min. 8. Transcurrido este tiempo, la membrana se retiró del VacuBlot y se colocó sobre una bandeja con papel de filtro húmedo. 9. La membrana se colocó en el equipo Stratalinker 1.800 (Stratagen) y se aplicó luz ultravioleta (12.000 µJ/cm2) para fijar en ella el RNA. 10. Usando un transiluminador UV convencional se verificó la transferencia y la posición de los rRNA. 11. Para retirar el formaldehído y el tampón de carga, se lavó la membrana dos veces con 100 ml de WB a 65ºC durante 15 min. Hibridación y lavados: 1. La solución MagicHyb se precalentó en un baño a 65ºC hasta que estuvo completamente líquida. 90 Materiales y Métodos 2. Después de los lavados, la membrana se colocó en un tubo de hibridación junto con 5 ml de MagicHyb y se incubó durante 1 hora a 65ºC en rotación. 3. Para desnaturalizar la sonda (2,5 ng/ml) se disolvió en 200 µl de TE y se calentó a 90ºC durante 2 min; a continuación se colocó en hielo durante 5 min. 4. La sonda desnaturalizada se agregó al tubo de hibridación con la membrana y se incubó a 65ºC en rotación durante 16 horas. 5. Para retirar el exceso de sonda se lavó la membrana a 65ºC con 100 ml de WB, precalentado a la misma temperatura, durante 20 min. Este paso se repitió dos veces más para un total de tres lavados. Detección por quimioluminiscencia: Los pasos siguientes se llevaron a cabo a temperatura ambiente: 1. La membrana se lavó en 50 ml de B1 durante 5 min para un total de dos lavados. 2. Para bloquear la membrana se utilizaron 50 ml de B2 y se incubó con agitación suave durante 60 min. 3. El anticuerpo Anti-DIG se diluyó en proporción 1:15.000 en B2 y se incubó con agitación suave durante 30 min. 4. Para retirar el exceso de anticuerpo, la membrana se lavó con 50 ml de B1 durante 20 min, para un total de 4 lavados. 5. Posteriormente se incubó la membrana con 50 ml de B3 durante 5 min y luego con 1 ml de B3 con CDP-Star diluido 1:100 durante 5 min. 6. Para captar la quimioluminiscencia se utilizó el equipo “Lumi-ImagerTM” (Roche). 3.5.6. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA UTILIZANDO MICROORDENAMIENTOS DE DNA Obtención de las muestras Inicialmente se precultivaron la cepa silvestre de S. cerevisiae y la cepa de interés cada una en 20 ml de medio de cultivo líquido incubando con agitación a 30ºC durante 16 horas. Posteriormente los cultivos se diluyeron hasta una concentración de 91 Materiales y Métodos 5x105 células/ml para un volumen final de 30 ml de cultivo y se dejaron crecer hasta una concentración de 3x107 células/ml. Las células se centrifugaron a 13.200 g durante 2 min, se retiró el sobrenadante y finalmente se lavaron con agua estéril a 4ºC. A partir de este momento se inició la extracción del RNA. Extracción de RNA y síntesis de cDNA marcado con fluorocromos Para la extracción del RNA a partir de las células de cada cepa se utilizó el sistema “RiboPureTM-Yeast” (Ambion®) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para determinar la concentración del RNA se utilizó el equipo “NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer”. Para la síntesis y marcaje de cDNA a partir del RNA total se utilizó el sistema “CyScribe Post-Labelling Kit” (Amersham Biosciences) y para la purificación del cDNA marcado se utilizó el sistema “CyScribe GFX Purification Kit” (Amersham Biosciences), siguiendo específicamente las instrucciones del fabricante. La cantidad de RNA total utilizada para las síntesis de cDNA fue de 30 µg y la síntesis se llevó a cabo en presencia de Cy3-dUTP o Cy5dUTP. Una vez marcado el cDNA de cada una de las cepas se combinó para hibridar el microordenamiento genómico de levadura. La concentración del cDNA marcado y la cantidad de fluorocromo incorporado (expresado en pmol) se determinaron utilizando el equipo “NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer”. Hibridación y análisis del microordenamiento Las características del microordenamiento y las condiciones de prehibridación, hibridación y lavados se han descrito previamente (Viladevall et al., 2004). Para la prehibridación y la hibridación se utilizó el equipo Array BoosterTM (Advalytix) de acuerdo con las especificaciones de uso del equipo. Las soluciones para esta parte del procedimiento son las siguientes: SSC 20x: NaCl 3 M, Citrato de sodio dihidratado 0,3 M. Solución de prehibridación: 5x SSC, SDS 0,1%, BSA 1%. Solución de hibridación: Formamida 50%, 5x SSC, SDS 0,1%. Solución de lavado A: 1x SSC, SDS 0,2%. 92 Materiales y Métodos Solución de lavado B: 0,1x SSC, 0,2% SDS. Solución de lavado C: 0,1x SSC. Estas soluciones eran filtradas para evitar que el soporte que contiene el micrordenamiento se contaminase con artefactos que interfiriesen con la lectura en el escáner de fluorescencia. Se tomó el soporte que contiene el microordenamiento y se aplicó luz UV en el equipo Stratalinker (12.000 µJ/cm2). Para prehibridar, se precalentó la solución de prehibridación a una temperatura de 42ºC y se colocó el soporte junto con la solución de prehibridación en el Array BoosterTM incubando a 42ºC de 45 a 60 min. Luego se colocó el soporte en una cesta portaobjetos para lavarlo sumergiéndolo 5 veces en agua MilliQ. Para la hibridación se suspendieron los cDNA marcados de cada cepa en tampón de hibridación, colocando como mínimo entre 20 y 30 pmoles de cada una de las muestras, para un volumen total de 97 µl. El soporte se colocó en el Array BoosterTM y luego se agregó sobre él la mezcla de cDNA para hibridar durante 16 horas a 42ºC. Una vez transcurrido este tiempo, el soporte se colocó en una cesta portaobjetos y se sumergió en solución de lavado A precalentada a 42ºC con agitación durante 8 min, luego en solución de lavado B a temperatura ambiente con agitación durante 8 min y en solución de lavado C con agitación durante otros 8 min. Finalmente el soporte se sumergió 5 veces en agua MilliQ y se secó por centrifugación a 100 g durante 20 min. Para medir la fluorescencia del micrordenamiento hibridado se utilizó el escáner Axon 4100A (Axon Instruments, Inc.) y para el análisis de los datos se utilizó el programa GenePix Pro 5.0 (Axon Instruments, Inc.). En este programa se calculó para cada gen la razón entre la intensidad de la señal del cDNA de la cepa silvestre y la señal del cDNA del mutante. Se analizaron los datos de tres experimentos independientes y se obtuvo la media de esta razón para cada gen. Se consideró que un gen dado estaba expresado diferencialmente entre las dos cepas cuando el resultado del cálculo de la razón era mayor que 2 o menor que 0,5. Para cada experimento, el cDNA obtenido a partir de las cepas silvestre y mutante se 93 Materiales y Métodos marcó en paralelo y se intercambiaron los fluorocromos de las muestras entre experimentos independientes compensar así diferencias debidas al fluorocromo. 3.5.7 AISLAMIENTO Y SUBFRACCIONAMIENTO DE MITOCONDRIAS A PARTIR DE CÉLULAS DE S. cerevisiae Las mitocondrias se purificaron a partir de células creciendo exponencialmente en medio YPGly a una concentración de 2x107 células/ml para un volumen total de 1 litro y se fraccionaron posteriormente de acuerdo con el método descrito por Diekert et al. (2001). El análisis por Western de cada una de las fracciones se llevó a cabo según se describe por Rodriguez-Manzaneque et al. (1999), utilizando el anticuerpo mAB anti-HA (Roche) a una dilución 1: 5.000 y anticuerpo policlonal de conejo anti-lipóico a una dilución 1: 50.000 (Cabiscol et al., 2000). 3.6. TÉCNICAS BIOQUÍMICAS 3.6.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN INTRACELULAR DE GLUTATIÓN OXIDADO Y REDUCIDO La medición de la concentración de glutatión oxidado y reducido por espectrofotometría se ha descrito previamente (Jakubowski et al., 2000). El número de células y su volumen se determinó utilizando el analizador de partículas Coulter Z2. La obtención de los extractos celulares se describe brevemente a continuación. Obtención de los extractos celulares La cepas silvestre y mutante se cultivaron exponencialmente cada una en 50 ml de YPD hasta una concentración de 2x107 células/ml. Posteriormente se centrifugaron a 3.000 g durante 5 min y se retiró el sobrenadante. Las células se lavaron dos veces con agua destilada estéril a 4ºC y se resuspendieron en una solución de ácido sulfosalicílico 1% (Sigma) a 4ºC. Se agregó luego un volumen igual de perlas de vidrio (450-600 µm, Sigma) y se agitó durante 2 minutos dejando en hielo otros dos minutos más. Esta agitación e incubación en hielo se repitió 4 veces más para un total de 5 repeticiones. Posteriormente la mezcla se incubó en hielo durante 30 min y se centrifugó a 13.200 g a 4ºC durante 5 min. Se tomó el sobrenadante (200 µl aproximadamente) y se dividió en dos partes iguales. Una de las partes se dejó intacta para medir la concentración de 94 Materiales y Métodos glutatión total (GSH + GSSG) y la segunda fue tratada para medir únicamente glutatión oxidado (GSSG). El tratamiento consistió en bloquear las moléculas de GSH agregando 2,6 µl de vinilpiridina y luego rápidamente 8 µl de trietanolamina 1,5 M. Se mezcló bien y se incubó a temperatura ambiente en oscuridad durante 1 hora. Finalmente se determinó la concentración de GSH por espectrofotometría utilizando el reactivo de Ellman (Jakubowski et al., 2000). 3.6.2. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS Obtención de los extractos celulares Para determinar las actividades in vivo fueron necesarios 200 ml de cultivos de las correspondientes cepas de S. cerevisiae en fase exponencial a una concentración de 2x107 células/ml. Luego los cultivos se centrifugaron a 5.400 g durante 6 min y las células se lavaron con tampón de lisis (fosfato de sodio 0,11 M pH 6,5) a 4ºC. Las células se resuspendieron en 200 µl de tampón de lisis a 4ºC y se agregaron 7 µl de inhibidor de proteasas 200x PIB (fenilmetasulfonil fluoruro 200 mM, N-p-tosil-Lfenilalanina clorometil cetona 20 mM, pepstatina A 200 µM, preparado en etanol 100%). Después de mezclar bien se agregó un volumen igual de perlas de vidrio (450-600 µm, Sigma) y se agitó dos veces en el equipo “FastPrep FP120” (Thermo Savant) a máxima velocidad durante 45 seg con una incubación intermedia en hielo de 5 min. Toda la fase liquida se recuperó y se centrifugó a 4ºC y a 13.200 g durante 30 min. Se tomó el sobrenadante y se pasó a un tubo nuevo para posteriormente valorar la concentración de proteína según el método de Bradford (reactivos de BioRad) y utilizarlo para determinar las actividades enzimáticas específicas. Determinación de las actividades enzimáticas Las actividades enzimáticas de las GST se determinaron espectrofotométricamente sobre diferentes sustratos (Habig et al., 1974). Para la actividad glutaredoxina o tiol transferasa se utilizó como sustrato el HED, el cual forma un puente disulfuro mixto con el GSH que es resuelto por la enzima generando así GSSG. Esta reacción se acopla a la actividad de la glutatión reductasa y a la oxidación del NADPH, cuya concentración se mide espectrofotométricamente (Holmgren y Aslund, 1995). La actividad DHAR y DMAR se midieron también espectrofotométricamente según se describe en la literatura (Whitbread et al., 2005). 95 Materiales y Métodos 3.7. LOCALIZACIÓN MICROSCÓPICA DE PROTEÍNAS MARCADAS CON GFP Las proteínas marcadas con GFP se expresaron en células de S. cerevisiae y se observaron al microscopio de fluorescencia (Olympus BX51) según las técnicas estándar (Tatchell y Robinson, 2002). Para la localización de la proteína de fusión GFPGto1, el transformante respectivo se cultivó en medio SC Oleico durante 16 horas para inducir la formación de peroxisomas y verificar su localización en este organelo. Para la inducción de Gto2 y Gto3 se utilizó el medio SC con una concentración de metionina de 300 µM haciendo las observaciones en cultivos exponenciales. 3.8. ANÁLISIS IN SILICO La búsqueda de secuencias homólogas se llevó a cabo utilizando el programa BLAST con los parámetros propuestos por el sistema (NCBI; www.ncbi.nlm.nhi.gov/BLAST). Los alineamientos múltiples se realizaron aplicando el programa ClustalW (Thompson et al., 1994), disponible desde el servidor del Instituto Europeo de Bioinformática (www.ebi.ac.uk). Para la búsqueda de secuencias reguladoras en regiones promotoras se utilizaron las herramientas informáticas disponibles en http://rsat.scmbb.ulb.ac.be/rsat (van Helden, 2003). Para la predicción de la estructura secundaria se utilizó el análisis de combinación de regresión linear multivariada aplicando los programas SOPMA, GOR4 y SIMPA (Combet et al., 2000) (Network Protein Sequence Analysis, PBIL, http://npsa-pbil.ibcp.fr). El programa MITOPROT permitió predecir posibles secuencias mitocondriales y sitios de corte en proteínas (Claros y Vincens, 1996). La búsqueda de las denominaciones de diferentes genes bacterianos se realizó en la base de datos del TIGR (The Institute for Genomic Research, www.tigr.org). 96 4. RESULTADOS 97 Resultados 4. RESULTADOS 4.1. EL GENOMA DE S. cerevisiae CONTIENE TRES ORF QUE CODIFICAN PROTEÍNAS HOMÓLOGAS A LAS GST DE CLASE OMEGA El análisis del genoma de S. cerevisiae indica que este hongo tiene tres secuencias cuyos productos son homólogos a proteínas GST de clase Omega, entre ellas a hGSTO1-1. Las tres secuencias identificadas corresponden a las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w, y los tres genes fueron respectivamente denominados GTO1, GTO2 y GTO3 (por Glutathione Transferase Omega-like). Al gen GTO2 se le ha asignado previamente el nombre ECM4 (de Extra Celular Mutants) por su posible relación con la biogénesis de la pared celular, ya que el mutante correspondiente fue descrito como sensible a varios agentes químicos que evidencian defectos en esta estructura celular (Lussier et al., 1997). Sin embargo, en el fondo genético utilizado por nosotros no hemos sido capaces de reproducir tal sensibilidad (resultados no publicados). YGR154c ( GTO1) YKR076w ( GTO2) YMR251w ( GTO3) YGR154c ( GTO1) YKR076w ( GTO2) YMR251w ( GTO3) YGR154c ( GTO1) YKR076w ( GTO2) YMR251w ( GTO3) YGR154c ( GTO1) YKR076w ( GTO2) YMR251w ( GTO3) YGR154c ( GTO1) YKR076w ( GTO2) YMR251w ( GTO3) 1 1 1 65 80 80 141 158 154 220 236 232 298 315 311 --------------- MSVSYKGTISKTHSVF KPEKGRYYIYGSLGCPFTHRAILARSLKKLEPVLGLVLSHWQLDSKGA MSKQWASGTNGAFKRQVS SFRETISKQHPIY KPAKGRYWLYVSLACPWAHRTLITRALKGLTSVIGCSVVHWHLDEKGW MSEKSASNNKAEFKRQSSPFREI ISADHPIY KPAKGRYWLYVALPCPWAQRTLITRALKGLAPIIGCSVAHWHLDDKGW RFLPAPH---RPEKYKERFFTAT GGIASAKLDE SEELGDVN NDSARLFVDGAFDPVENISRLSELYYLNDPKYPGTKFT RFLDMEKQLEDSEDFLEHWHDVA GGIRTAKEDS SKSFAEIK NDSQRFMVDATNEPHYGYKRISDLYYKSDPQYSA-RFT RFL—-EEGDGKTNE —-RHWFDIAGGISSVNLNT STPVANIP NNAHRLLVDGTDEPHYGYKRLSDFYFKTKPDYKG-RFT VPVLWDSKTRKIVNNESGDIIRILNSGVFDEFIQSEETNVID LVPHDLIDE IDKNIKWVHPKINLGVYKVGLAENGKIY VPVLWDLETQTIVNNESSEIIRILNSSAFDEFVD-DDHKKTDLVPAQLKTQ IDDFNSWVYDSINNGVYKTGFAEKAEVY VPVLWDLETCTIVNNESSDIIGIMNSAAFDEFVG-EEYRQVRLVPRSLEAQ ITEFNSWVYDKINNGVYKAGFAECAEVY ETEVKTLFENLQKMECVLKENYKRLEEQFSGN-KQKILAKYFVLGQRLTEADIRLYPSIIRFDVVYVQHFKCN LKTIRD ESEVNNVFEHLDKVEKILSDKYSKLKAKYGEEDRQ KILGEFFTVGDQLTEADIRLYTTVIRFDPVYVQHFKCN FTSIRA EREVTSLFQYLDKLENLLDKKYTDLEAEYGKNNKD KILDRYFAIGDTLTEADVRLYPTIVRFDVVYHQHFKCN LATIRD GFPYLHLWLINLYWNYAEFRFTTDFNHIKLFYIRMEVSRNKINQFGIVPLGPKPDI SRL GYPFIHLWVRNLYWNYDAFRYTTDFDHIKLHYTR---SHTRINPLGITPLGPKPDI RPP DYSRIHTWLKNIYWRHEAFQRTTDFTHIKLGYTR---SQPRVNPIGITPLGPKPDI RPL Figura 23. Alineamiento de las proteínas codificadas por los genes YGR154c (GTO1), YKR076w (GTO2) e YMR251w (GTO3) de S. cerevisiae, homólogas a las GST de clase Omega. Los residuos idénticos en las tres secuencias se resaltan en negro. La homología entre las tres proteínas Gto se extiende a lo largo de toda la secuencia de aminoácidos. Gto1 tiene una homología del 50% con Gto2 y del 62% con Gto3. La homología entre Gto2 y Gto3 también es del 50% (Figura 23). Comparando el tamaño de las Gto de S. cerevisiae con hGSTO1-1, aquellas son más largas que ésta, debido a una serie de aminoácidos adicionales presentes en las Gto de levadura que no tienen homólogos en la secuencia de la proteína humana. Un ejemplo de ello es la 99 Resultados región comprendida entre los aminoácidos 179 y 227 de las tres proteínas, la cual no se encuentra en la secuencia de hGSTO1-1. Como se mencionó en el apartado 1.2.2.2., las GST de clase Omega tienen una cisteína conservada en el sitio activo, la cual es importante para las actividades enzimáticas dependientes de glutatión. Esta cisteína está presente en las tres Gto, localizada en la posición 31 de Gto1 y en la posición 46 de Gto2 y Gto3 (Figura 24). Otros aminoácidos importantes para la actividad de hGSTO1-1 como Pro33, Leu56 y Lys59 también están conservados en las tres Gto, aunque el residuo Phe34 se ha sustituido por triptófano en Gto2 y Gto3 (Figura 24). • TH SVFKPEKGRY YIYGALGCPF THRAILARSL KKLEPVLGLV LSHWQLDSKG ARFL Gto1 12 Gto2 27 QH PIYKPAKGRY WLYWSLACP W AHRTLITRAL KGLTSVIGCS VVHWHLDEK G WRFL Gto3 27 DH PIYKPAKGRY WLYVALPCP W AQRTLITRAL KGLAPIIGCS VAHWHLDDK G WRFL C.ele gans Omega 15 DA EP -PLSKGSF RVYNMRFCP W AERAMLYVAA KGIE--A--E VVNLNVTDK L EWYW Schis KP -LYDPNRL ga 7 DP tosoma Ome TLIGFRFCP Y VDRVKLILSY YKVD--Y--D LIDISLASK P EWFL Mouse Omega O1- RVYSMRFCP F AQR TLMVLKA KGIR--H--E VININLKNK P EWFF 13 SA PPGPVPEGQI 1 Pig O PPGPVPEGLI 13 SA mega O1-l RVYSMRFCP F AQR TLLVLNA KGIR--H--Q VININLKNK P EWFF Human Omega O1- 1 13 SA PPGPVPEGSI RIYSMRFCP F AERTRLVLKA KGIR--H--E VININLKNK P EWFF Human Omega O2- 2 13 SQ PPGPVPEGLI RIYSMRFCP Y SHRTRLVLKA KDIR-- H-- E VVNINLRNK P EWYY Figura 24. Comparación de la región que incluye el sitio activo de varias GST de clase Omega. Los residuos idénticos se indican en color negro, los residuos con cambios conservados se resaltan con color gris y la región conservada que corresponde al sitio activo está subrayada. Los puntos negros indican los residuos importantes para la actividad de hGSTO1-1 (Board et al., 2000). 4.2. HOMÓLOGOS DE LOS GENES GTO EN OTROS MICROORGANISMOS La búsqueda de secuencias homólogas a las Gto en otros organismos muestra que éstas existen en otros hongos, por ejemplo, en C. albicans, S. pombe y N. crassa, así como en bacterias, particularmente en cianobacterias y proteobacterias (Figura 25). En el alineamiento de estas proteínas hipotéticas se observa que las secuencias homólogas halladas en hongos, así como las bacterianas, forman un grupo claramente separado de las GST de otras clases. Gtt1 no se encuentra dentro de un grupo en particular aunque Gtt2 se acerca a las GST de clase Zeta (Figura 25). Este hecho confirma la divergencia ya descrita entre las proteínas Gtt de S. cerevisiae y las demás GST fúngicas o de mamíferos (McGoldrick et al., 2005b). La secuencia proteica de E. coli homóloga a las GST de clase Omega es codificada por el gen yqjG, siendo aquella altamente similar a secuencias presentes en otras enterobacterias como Salmonella enterica (serovar Typhi CT18), Shigella flexneri 100 Resultados (cepa 2a 2457T), Yersinia pestis (cepa KIM) y Pseudomonas aeruginosa (cepa PAO1) (Figura 25). De acuerdo con diversas bases de datos, se predice que estas proteínas son hipotéticas GST (Salgado et al., 2006). R. meliloti B. melitensis P. aeruginosa S. agalactiae X. campestris G. violaceus. E. coli Halobacterium A. thaliana_Omega N. crassa_NCU04368.1 C. albicans_ECM4 S. pombe_SPCC1281.07c S. cerevisiae_GTO3 S. cerevisiae_GTO2 S. cerevisiae_GTO1 S. mansonii_Omega H. sapiens_Theta1 C. elegans_Omega M. musculus_Omega1 H. sapiens_Omega1 H. sapiens_Omega2 O. sativa_Phi1 B. juncea_Phi2 A. thaliana_Phi1 H. sapiens_Alpha G. gallus_Alpha D. melanogaster_Theta M. musculus_Theta1 H. sapiens_Zeta1 C. elegans_Zeta S. cerevisiae_GTT2 S. cerevisiae_GTT1 H. sapiens_Sigma R. norvegicus_Sigma X. laevis_Sigma H. sapiens_Pi R. norvegicus_Pi H. sapiens_Mu1 G. gallus_Mu2 Figura 25. Dendrograma representativo del alineamiento mediante ClustalW de GST de diversas clases. Las secuencias provienen de hongos (S. cerevisiae, N. crassa, C. albicans, S. pombe), bacterias (E. coli, Xantomonas campestres, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Gloebacter violaceus, Halobacter sp.), plantas (A. thaliana, Brassica juncea, Oryza sativa), animales (H. sapiens, Gallus gallus, Rattus norvegicus, Mus musculus, Xenopus laevis, D. melanogaster, C. elegans, y S. mansoni). Analizando la posición de los genes adyacentes a esta GST hipotética de E. coli, se observa que algunos de ellos tienen el mismo sentido de transcripción. Esta misma disposición se observa en los genomas de otras enterobacterias como Salmonella enterica y Shigella flexneri, aunque no se conserva en especies evolutivamente más alejadas como son Yersinia pestis y Pseudomonas aeruginosa (Figura 26). Esto indica que posiblemente dichos genes se transcriben sobre una sola molécula de mRNA haciendo parte de un operón. Los genes que se co-transcriben de este modo frecuentemente tienen funciones relacionadas, por ejemplo haciendo parte de una misma ruta metabólica, y son co-regulados a nivel transcripcional (Ermolaeva et al., 2001). Como se ilustra en la figura 26, siete genes antes de yqjG se encuentra el 101 Resultados promotor ecfLp. Este promotor es reconocido por la enzima EσE RNA polimerasa, la cual controla uno de los dos regulones que responden al choque térmico en E. coli (Dartigalongue et al., 2001). E. coli S. flexneri S. enterica Y. pestis P. aeruginosa Gto1 S.c. E. coli S. flexneri S. enterica Y. pestis P. aeruginosa Gto1 S.c. E. coli S. flexneri S. enterica Y. pestis P. aeruginosa Gto1 S.c. E. coli S. flexneri S. enterica Y. pestis P. aeruginosa Gto1 S.c. E. coli S. flexneri S. enterica Y. pestis P. aeruginosa Gto1 S.c. E. coli S. flexneri S. enterica Y. pestis P. aeruginosa Gto1 S.c. E. coli S. flexneri S. enterica Y. pestis P. aeruginosa Gto1 S.c. MGQLIDGVWHDTWYDTKSTGGKFQRSASAFRNWLTADGAPGPTGKGGFAAEKDRYHLYVS MGQLIDGVWHDTWYDTKSTGGKFQRSASAFRNWLTADGAPGPTGTGGFIAEKDRYHLYVS MGQLIDGVWHDTWYDTKSSGGKFQRSASAFRNWLTADGAPGPSGEGGFAAEKDRYHLYVS MGR----WWRYKWITFHPS-------------LTTTDGQAGPQGKGGFNAEAHRYHLYVS MGQLIDGRWHDQWYDTQKDG----------RFQRENAQRRHWLGEPAFPAEGGRYHLYVS --------------------------------MSVSYKGTISKTHSVFKPEKGRYYIYGA LACPWAHRTLIMRKLKGLEPFISVSVVNPLMLENGWTFD----------DSFPGATG--LACPWAHRTLIMRKLKGLEPFISVSVVNPLMLENGWTFD----------DSFPGATG--LACPWAHRTLIFRKLKGLEPFIPVSVVNPLMLENGWTFD----------DTFPAATG--LACPWAHRALLMRTLKGLESLISVSVVHPLMQENGWTFS----------SDFPAATG--LACPWAHRTLIVRKLKGLESLVDVSVVSWLMRENGWTFD----------PAH-GSTG--LGCPFTHRAILARSLKKLEPVLGLVLSHWQLDSKGARFLPAPHRPEKYKERFFTATGGIA --------------------------DTLYQHEFLYQLYLHADPHYSG-RVTVPVLWDKK --------------------------DTLYQHEFLYQLYLHADPHYSG-RVTVPVLWDKK --------------------------DTLYQHEFLYQLYLHADPHYSG-RVTVPVLWDKK --------------------------DALYHLDYLYQLYLRAAPDYSG-RVTVPVLWDKQ --------------------------DRLDGLAFLHQRYTRDDPHYSG-RVTVPLLWDKQ SAKLDESEELGDVNNDSARLFVDGAFDPVENISRLSELYYLNDPKYPGTKFTVPVLWDSK NHTIVSNESAEIIRMFNT-AFDALG----AKAGDYYPPALQPKIDELNGWIYDTVNNGVY NHTIVSNESAEIIRMFNT-AFDALG----AKAGDYYPPALQTKIDELNGWIYDTVNNGVY NHTIVSNESAEIIRMFNS-AFDGLG----AKAGDYYPHALQSKIDELNGWIYDNVNNGVY QQTVVSNESADIIRMFNN-AFDDVG----AKAGDYYPTALRNDIDDINGWVYDQVNNGVY AQKIVNNESADIVRIFNS-AFDAIG----ANALDFYPEPLREEIERLNGRIYPAVNNGVY TRKIVNNESGDIIRILNSGVFDEFIQSEETNVIDLVPHDLIDEIDKNIKWVHPKINLGVY KAGFATSQQAYDEAVAKVFESLARLEQILGQ------------------HRYLTGNQLTE KAGFATSQQAYDEAVAKVFESLARLEQILGQ------------------HRYLTGNQLTE KAGFATSQQAYDEAVEKVFTALARLEQILGQ------------------HRYLTGNQLTE KAGFATTQEAYDEAVGTLFSALDRLEQILGQ------------------HRYLTGNQLTE RAGFATRQDAYEEAFVQLFEELDYLEGLLGE------------------RRYLAGEYLTE KVGLAENGKIYETEVKTLFENLQKMECVLKENYKRLEEQFSGNKQKILAKYFVLGQRLTE ADIRLWTTLVRFDPVYVTHFKCDKHRISD-YLNLYGFLRDIYQ-MPGIAETVNFDHIRNH ADIRLWTTLVRFDPVYVTHFKCDKHRISD-YLNLYGFLRDIYQ-MPGIAETVNFDHIRNH ADIRLWTTLVRFDPVYVTHFKCDKYRISD-YLNLYGFLRDIYQ-IPGIAETVNMDHIRHH ADLRLWTTLVRFDPVYVTHFKCDKRRISD-YPNLYGFLRDIYQ-MPGIAETVDFAHIRTH ADIRLFTTLVRFDAVYHGHFKCNLRRIED-YPNLSGWLRELYQ-RPGIGETVDFEHIKGH ADIRLYPSIIRFDVVYVQHFKCNLKTIRDGFPYLHLWLINLYWNYAEFRFTTDFNHIKLF YFRSHKT---INPTGIISIGPWQDLDEPHGRDVRFG------YFRSHKT---INPTGIISIGPWQDLDEPHGRDVRFG------YFRSHKT---INPTGIISVGPWQDLLEPHGRDVRFG------YYRSHGT---INPYGIISIGPQQNLLEPHDRANRFV------YYASHRT---INPTGIVPLGPRLDLARAPGRERLPGKGIWGEG YIRMEVSRNKINQFGIVPLGPKPDISRL--------------328 328 328 311 324 356 60 60 60 43 50 28 107 107 107 90 96 88 140 140 140 123 129 148 195 195 195 178 184 208 237 237 237 220 226 268 295 295 295 278 284 328 Figura 26. Alineamiento por ClustalW de las secuencias proteicas homólogas a Gto1 de S. cerevisiae presentes en las especies E. coli cepa K12-MG1655, Salmonella enterica serovar Typhi CT18, Shigella flexneri cepa 2a 2457T, Yersinia pestis cepa KIM y Pseudomonas aeruginosa cepa PAO1. En barras negras se resaltan los residuos idénticos y en barras grises se resaltan los cambios conservados entre proteínas. 102 Resultados Como no se conoce la función de ninguno de los genes que pueden pertenecer a este operón, no se les puede relacionar con alguna actividad biológica específica, aunque a algunos se les ha asignado una actividad enzimática hipotética por su homología con otras enzimas (Figura 27). En resumen, del análisis de la posición en el genoma de E. coli u otras bacterias del gen que codifica la hipotética GST de clase Omega no se puede extraer ninguna conclusión sobre su función más allá de su posible localización en un operón. Hipotética GST- Omega ecfL ecfM yqjC yqjD yqjE yqjK proteína de membrana conservada yqjF yqjG yhaH hipotética proteína de membrana ecfLp Escherichia coli K12-MG1655 exuR Regulador negativo del regulón exu proteína conservada con posible función extracitoplásmica hipotética subunidad de la quinol oxidasa Salmonella enterica serovar Typhi CT18 Shigella flexneri 2a 2457T Yersinia pestis KIM Pseudomonas aeruginosa PAO1 exuR ecfL ecfM yqjD yqjE yhaH Regulador negativo del regulon exu hipotético citocromo hipotética acetiltransferasa hipotética hipotética transposasa transposasa hipotético regulador transcripcion al tipo LYSR sirohemo sintasa Figura 27. Esquema de la disposición genómica de las ORF homólogas a los genes GTO y de los genes adyacentes en Escherichia coli K12-MG1655, Salmonella enterica serovar Typhi CT18, Shigella flexneri cepa 2a 2457T, Yersinia pestis cepa KIM y Pseudomonas aeruginosa cepa PAO1. Los genes homólogos entre especies están en el mismo color. En el caso de Y. pestis y P. aeruginosa no se ha asignado un nombre específico a cada uno de sus genes, ya que no aparecen tales denominaciones en la base de datos de TIGR (The Institute for Genomic Research, www.tigr.org). ecfLp, promotor ecfL. 4.3. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS IN VITRO E IN VIVO DE LAS PROTEÍNAS Gto 4.3.1. PURIFICACIÓN Y ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS IN VITRO DE LAS PROTEÍNAS Gto1, Gto2, Gto3 Y Gtt1 Para determinar la actividad enzimática de las tres proteínas Gto, cada una de ellas fue clonada en el vector de expresión pET-21 y expresada en E. coli. Gto2 se obtuvo en una forma soluble a partir de cultivos incubados a 37ºC en medio LB sin mayores modificaciones en las condiciones de cultivo de la cepa, mientras que Gto1 y Gto3 no eran solubles en estas mismas condiciones de cultivo. Se ha reportado que la 103 Resultados adición de sorbitol y glicil betaína al medio de cultivo LB permite la solubilización de proteínas recombinantes que son insolubles en el citoplasma de E. coli (Blackwell y Horgan, 1991). Para probar la expresión de Gto1 y Gto3 bajo estas condiciones, se ensayó la adición de estos compuestos al medio de cultivo incubando las bacterias entre 25 y 37ºC. Gto3 se solubilizó cuando el cultivo se incubó a 25ºC pero Gto1 continuó siendo insoluble bajo todas las condiciones probadas. En vista de ello, se determinó cambiar el vector de expresión y se clonó el gen GTO1 en el plásmido pMAL-c2X. Esta vector permite fusionar la secuencia de la proteína de unión a maltosa de E. coli (MBP) con la proteína de interés en el extremo N-terminal. La expresión de Gto1-MBP se llevó a cabo en medio LB, a 37ºC y sin ninguna otra modificación, lo que permitió obtener esta proteína de fusión en la fracción soluble. Todas las proteínas recombinantes se purificaron por cromatografía de afinidad utilizando columnas específicas para cada caso. Las construcciones basadas en los plásmidos pET-21 se purificaron utilizando columnas de níquel y la construcción basada en pMAL-c2X se purificó mediante columnas de resina-amilasa. En este último caso, la proteína Gto1 se separó del Mr (kDa) (A) 1 2 3 4 5 6 7 (B) 1 2 3 (C) 1 2 3 4 97.0 66.0 45.0 30.0 20.1 14.4 Gto1 Gto2 Gto3 Figura 28. Electroforesis en gel SDS-poliacrilamida de las proteínas Gto1, Gto2 y Gto3 purificadas a partir de cultivos de E. coli. GTO1 fue clonada en el plásmido pMAL-c2X y expresada en E. coli a 37ºC en medio LB. El extracto celular pasó a través de columnas de resina-amilasa para retener la proteína Gto1-MBP. La proteína retenida fue separada de la resina utilizando tampón de elución y la proteína obtenida fue digerida con el Factor X para separar a Gto1 de la MBP (ver Materiales y Métodos). En (A) los carriles 1 al 5 corresponden a las eluciones de la columna resina-amilasa y los carriles 6 y 7 corresponden a la digestión de los eluídos con el Factor X (carril 6 Gto1 y carril 7 Gto1MBP). Los genes GTO2 y GTO3 fueron clonados en el plásmido pET-21 y expresados también en E. coli. La proteína Gto2 se obtuvo en la fracción soluble del extracto celular de la cepa correspondiente cultivada en LB a 37ºC, mientras que para solubilizar a Gto3 fue necesario cultivar la cepa de E. coli correspondiente a 37ºC en medio LB con glicil betaína y sorbitol. Los extractos celulares de ambas cepas pasaron a través de columnas de niquel y se eluyeron con tampón de elución (ver Materiales y Métodos). Los carriles 1 al 3 en (B) y los carriles 1 al 4 en (C) muestran los eluidos que contienen a Gto2 y Gto3 respectivamente obtenidos a partir de la purificación con columnas de afinidad de niquel. 104 Resultados fragmento MBP mediante la digestión del producto de la purificación con el Factor X. Los productos de la purificación y de la digestión se valoraron por electroforesis en geles de SDS-acrilamida, tinción con azul de Coomassie y obtención de una imagen digital de los geles teñidos (Figura 28). Al final del proceso, la pureza de cada uno de los productos fue, como mínimo, del 95%. También se expresó Gtt1 a partir de la correspondiente construcción en el plásmido pET-21 para utilizarse como control positivo de la actividad enzimática GST sobre CDNB. No se detectó actividad en ninguna de las proteínas Gto sobre los sustratos CDNB, 1,2-dicloronitrobenzeno o 4-hidroxinonenal, aunque sí se detectó actividad sobre el ácido etacrínico (Tabla 4). Por otro lado, las tres Gto tienen actividad tiol transferasa sobre HED, sustrato común de las glutaredoxinas ditiólicas (Holmgren y Aslund, 1995). De manera opuesta, Gtt1 presenta actividad considerable sobre CDNB, como se había descrito anteriormente (Choi et al., 1998), pero no tiene actividad tiol transferasa. Además, las Gto tienen una actividad DHA reductasa y DMAv reductasa moderada (Tabla 4). Comparando la actividad de las Gto con las GSTO humanas, se observa que la actividad específica de las proteínas Gto sobre los diferentes sustratos ensayados es ACTIVIDAD Glutatión Transferasa a Gto1 Gto2 Gto3 Gtt1 1-Cloro, 2-4,dinitrobenceno 1,2-Dicloronitrobenceno Ácido etacrínico 4-hidroxinonenal Tiol transferasa b c d ND ND 252 ± 31 ND 1.93 ± 0.118 0.23 ± 0.031 0.17 ± 0.031 ND ND 94 ± 6 ND 3,27 ± 1.286 0.11 ± 0.009 0.14 ± 0.009 ND ND 104 ± 19 ND 1.18 ± 0.240 0.16 ± 0.004 0.15 ± 0.026 70±8 ND 1045 ± 11 ND ND ND ND Dehidroascorbato reductasa Dimetilarsenato (V) reductasa Tabla 4. Actividad de las GST recombinantes de S. cerevisiae sobre varios sustratos. Los resultados son la media ± desviación estandar de tres determinaciones, obtenidas a partir de purificaciones proteicas independientes. (a) Actividad específica expresada como nmoles de conjugado de glutatión formado por minuto por mg de proteína; (b) Actividad específica expresada como µmoles de NADPH oxidado por minuto por mg de proteína utilizando como sustrato el HED; (c) Actividad específica como µmoles de DHA reducido por minuto por mg de proteína; (d) Actividad específica expresada como µmoles de NADPH oxidado por minuto por mg de proteína. ND, No detectada. 105 Resultados similar a la descrita para hGSTO1-1, aunque la actividad DHA reductasa de hGST2-2 es considerablemente mayor (Board et al., 2000; Schmuck et al., 2005). También se determinó la actividad específica de las proteínas Gto en función de la concentración de GSH. La representación gráfica de los datos y los análisis de éstos con funciones de regresión no lineal mediante el programa Matemática 5.1 indican que las gráficas se ajustan a una curva sigmoidal (Figura 29). Se calcularon los coeficientes aparentes de Hill (napp) para cada una de las proteínas, que corresponden a 2,36 para Gto1, 2,43 para Gto2 y 4,29 para Gto3. Estos datos muestran que existe una cooperatividad positiva considerable, lo cual se asocia con proteínas multiméricas. La Kapp para GSH de las tres proteínas es similar (entre 1,13 y 1,42 mM), mientras que las Vmax son bastante diferentes (entre 3,27 y 9,23 µmoles/min/mg de proteína). Actividad específica (µmoles/min/mg proteína) Gto1 4 3 2 1 0 0 1 2 3 Km : 1.13 Vm: 4.88 napp: 2.36 4 5 Actividad Específica (µmoles/min/mg proteína) Gto2 8 6 4 2 0 0 1 2 3 [GSH] mM 4 5 Km : 1.42 Vm: 9.23 napp: 2.43 [GSH] mM 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 2 3 4 5 Km : 1.40 Vm: 3.27 napp: 4.29 Actividad Específica (µmoles/min/mg proteína) Gto3 [GSH] mM Figura 29. Actividad tiol transferasa de las proteínas Gto en función de la concentración de GSH. Los valores Kapp (mM), Vmax (µmoles/min/mg de proteína) y el coeficiente de Hill (napp) se indican en las gráficas de cada Gto. Los datos corresponden a un experimento representativo y la diferencia entre tres experiementos independientes no fue superior al 15%. 106 Resultados 4.3.2. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS IN VIVO DE Gto1, Gto2, Gto3 Para determinar si la actividad tiol transferasa de las Gto se manifiesta también in vivo, una cepa que carece de las dos glutaredoxinas Grx1 y Grx2 fue transformada con los plásmidos multicopia conteniendo los genes GTO1, GTO2 o GTO3, expresados bajo sus respectivos promotores propios (pMM578, pMM584 y pMM611 respectivamente). Se utilizó la cepa MML752 (∆grx1 ∆grx2) con el fin de reducir la actividad tiol transferasa mediada por Grx1 y Grx2 sobre el sustrato HED en los extractos celulares. Esta cepa tiene reducida su actividad tiol transferasa aproximadamente en un 70% comparada con la cepa silvestre, lo cual concuerda con observaciones previas hechas en fondos genéticos diferentes (Rodriguez-Manzaneque et al., 1999). 5.24 3.14 2.58 1.77 1 1.65 1.21 2.56 MML752 + vector Gto1 Gto2 Gto3 Figura 30. Expresión in vivo de la actividad glutaredoxina de las proteínas Gto de S. cerevisiae. La cepa MML752 transformada con el plásmido multicopia YEplac121 o con los plásmidos derivados de éste que contienen cada uno de los genes GTO fueron cultivadas en medio SC a 30ºC hasta una concentración de aproximadamente 2 x 7 10 celulas/ml. La mitad del cultivo fue tratada con diamida (2,5mM) durante tres horas. Las actividades de los extractos celulares obtenidos de cultivos sin tratamiento se indican en barras azul claro, mientras que las actividades de los extractos celulares obtenidos a partir de cultivos tratados con diamida se indican en barras azul oscuro. Los valores relativos se muestran sobre cada una de las barras y corresponden a la media de tres experimentos independientes. La unidad corresponde a la cepa MML752 transformada con el vector y sin tratamiento (actividad específica absoluta 3.65 ± 0.16 nmol/min/mg). Las barras de error indican la desviación estándar. La sobreexpresión de GTO1 y GTO2 en la cepa MML752 causa un aumento de la actividad tiol transferasa celular, incremento que está entre el 60 y 70% respecto de la 107 Resultados actividad de la misma cepa transformada con el plásmido vacío (Figura 30). Por otro lado, la sobreexpresión de GTO3 en la misma cepa genera un aumento de la actividad tiol-transferasa menor (cerca del 20%). Como una de las funciones de las GST es proteger las células de la acción de agentes oxidantes (Hayes et al., 2005; Oakley, 2005), se quiso comprobar si el tratamiento de estas células sobrexpresoras con un agente oxidante podría incrementar la actividad tiol transferasa medida en los extractos celulares. Para ello, los cultivos celulares de cada uno de los sobrexpresores se trataron con diamida, un agente oxidante de grupos sulfidrilo, durante tres horas. Como consecuencia de dicho tratamiento sólo se incrementó la actividad glutaredoxina mediada por Gto2 (Figura 30). En resumen, la actividad tiol transferasa (glutaredoxina) de las tres proteínas Gto, además de ser detectable in vitro en las proteínas purificadas, también se manifiesta in vivo, aunque en grado diferente para cada una de las proteínas. 4.3.3. LA ACTIVIDAD GLUTAREDOXINA DE Gto2 REQUIERE DEL RESÍDUO CISTEÍNA EN POSICIÓN 46 El siguiente paso consistió en determinar si alguna de las cisteínas presentes en la proteína Gto2 podría ser importante para la actividad glutaredoxina de esta molécula. Inicialmente se determinó el modelo teórico de la estructura secundaria de la proteína Gto2; la predicción indica que el dominio N-terminal posee hélices α que alternan con láminas β, mientras que el dominio C-terminal es una región rica en hélices α, lo cual concuerda con la estructura de otras GST de clase Omega (Armstrong, 1997; Oakley, 2005). La secuencia de Gto2 tiene tres residuos cisteína en las posiciones 46, 67 y 307 (Figura 31A). Cys46 está entre una lámina β y una hélice α en el modelo de la figura 29A y la prolina adyacente puede ser importante para cambiar la orientación de la siguiente hélice α. Dichos residuos Cys46 y Pro47 están conservados en hGSTO1-1, siendo Cys32 el residuo equivalente en hGSTO1-1, el cual está expuesto hacia la superficie de la molécula (Board et al., 2000). Las otras dos cisteínas de Gto2 no tienen equivalentes en hGTSO1-1 ni en las otras dos Gto de S. cerevisiae. A partir de esta observación, se construyeron las proteínas Gto2 mutantes que contenían una de las siguientes sustituciones: C46G, C67S o C307G, además de la proteína en la que se sustituyeron las tres cisteínas simultáneamente y otra que solo conservaba la Cys46. Con todas estas variantes de Gto2 se ensayó la actividad glutaredoxina. Las actividades de las proteínas con las sustituciones C67G y/o C307G son similares a la actividad de la 108 Resultados proteína silvestre, mientas que la mutación C46G reduce la actividad a valores indetectables, resultado que también se obtiene con la proteína que carece de las tres cisteínas (Figura 31B). Por otro lado, la molécula que sólo conserva la Cys46 posee una actividad equivalente a la forma intacta de Gto2. Estos resultados demuestran que de las tres cisteínas de Gto2, Cys46 es necesaria y suficiente para la actividad glutaredoxina de la molécula. A C46 C67 C307 B Silvestre C46G C67S C307G C67S C307G C46G C67S C307G 100 ND 108 103 102 ND Figura 31. Efecto de los cambios de las cisteínas presentes en Gto2 sobre la actividad glutaredoxina de la molécula. A) Predicción de la estructura secundaria de Gto2. En color gris se indican las hélices α y en azul las láminas β. La posición de las cisteínas que fueron mutadas se indica sobre la estructura. B) Porcentaje de la actividad específica de las formas mutadas de Gto2 en relación con la forma silvestre no mutada. Los valores a la derecha corresponden a la media de tres experimentos independientes y las barras de error indican la desviación estándar 4.4. Gto1 SE LOCALIZA EN EL PEROXISOMA, MIENTRAS QUE Gto2 Y Gto3 ESTÁN EN EL CITOPLASMA Gto1 tiene en su extremo C-terminal una secuencia compatible con una señal de localización peroxisomal de tipo PTS1 (Subramani, 1996; Purdue y Lazarow, 2001; Heiland y Erdmann, 2005), que está presente en otras proteínas peroxisomales de S. cerevisiae (Veenhuis et al., 2000). Para confirmar la localización peroxisomal de Gto1 por microscopía de fluorescencia, se construyó la proteína de fusión GFP-Gto1, añadiendo la proteína GFP al extremo N-terminal de Gto1 para evitar enmascarar la posible señal de localización peroxisomal. Esta proteína de fusión se expresó bajo el control del promotor tet regulado por doxiciclina y se transformó la cepa silvestre con esta construcción. La cepa transformada se cultivó en medio con ácido oleico como 109 Resultados única fuente de carbono para inducir la formación de peroxisomas. Se observó que Gto1 tiene una distribución punteada en medio con ácido oleico, la cual es propia de las proteínas peroxisomales (Erdmann y Gould, 2002). Esta distribución no se observa en la misma cepa cultivada en medio con glucosa como única fuente de carbono. Para confirmar que la señal de localización sigue la ruta de internalización a través de Pex5, se estudió microscópicamente la ubicación de GFP-Gto1 en un mutante ∆pex5 (incapaz de internalizar en el peroxisoma proteínas con señales tipo PTS1) y ∆pex7 (incapaz de internalizar proteínas con señales de localización peroxisomal tipo PTS2). Los mutantes se crecían en medio con ácido oleico. En el mutante ∆pex5 la localización de Gto1 es citoplásmica mientras que la localización punteada que se observa en la cepa silvestre se conserva en el mutante ∆pex7 (Figura 32). Esta observación demuestra que la localización de Gto1 es peroxisomal y que la proteína es internalizada a través de la vía mediada por Pex5-PTS1. Los resultados aquí descritos confirman estudios previos sobre la identificación in silico de proteínas peroxisomales en el genoma de S. cerevisiae (Geraghty et al., 1999) y la detección experimental de proteínas peroxisomales, los cuales ya sugerían la localización peroxisomal de la proteína que hemos denominado Gto1 (Yi et al., 2002). GFP- Gto1 Silvestre ∆pex5 ∆pex7 Ácido oléico Glucosa Figura 32. Localización celular de Gto1. La cepa silvestre BY4741 y los respectivos mutantes ∆pex5 (cepa Y03603) y ∆pex7 (cepa Y04076) fueron transformados con el plásmido pMM440 que expresa Gto1 fusionada con la proteína GFP en posición N-terminal y bajo el control del promotor tet. Las cepas transformadas fueron crecidas en medio SC con ácido oléico o con glucosa como fuentes de carbono, en condiciones exponenciales a 30ºC. También se analizó si los homólogos de las proteínas Gto en otros hongos podrían tener secuencias tipo PTS1 en su extremo C-terminal. De los homólogos en las especies Kluyveromyces lactis (número de acceso SwissProt Q6CKB2), Torulopsis glabrata (Q6FTJ1), Candida albicans (Q5A953), Yarrowia lipolytica (Q6CDX7), 110 Resultados Debaryomyces hansenii (Q6BTR1 y Q6BTR2), Cryptococcus neoformans (Q55K61 y Q55K65), Schizosaccharomyces pombe (O94524, Neurospora crassa (Q7RWR2) y Asperillus nidulans (Q5BBA6 y Q5B0U9), ninguna de las secuencias tiene una señal tipo PTS1. Solamente se encontró este tipo de señal en la ORF c287-8925 del hongo Saccharomyces paradoxus. El producto hipotético de esta ORF tiene una homología alta con Gto1 y posee una secuencia PKL en posición C-terminal que es compatible con una señal tipo PTS1 (Lametschwandtner et al., 1998). Las proteínas homólogas halladas en las demás especies tampoco tienen una señal igual o similar a las de tipo PTS2 en la región N-terminal. Aunque no se descarta totalmente que alguna de estas proteínas pudiese localizarse en el peroxisoma mediante señales distintas a las de tipo PTS1 y PTS2, los resultados de este análisis en diversas especies de hongos indican que la localización peroxisomal de Gto1 es probablemente exclusiva de S. cerevisiae y de especies estrechamente relacionadas. A Gto2-GFP Gto3-GFP Glucosa Vector B Gto2-HA α-KGDH PDH ET MIT EIM MTX PM Figura 33. Localización celular de Gto2 y Gto3. A. La cepa silvestre BY4741 fue transformada con el vector (pUG35) o con los plásmidos que sobreexpresan a Gto2 (pMM399) o Gto3 (pMM446) bajo el promotor de MET25. Los transformantes fueron crecidos en medio SC con glucosa en condiciones exponenciales a 30ºC. B. La cepa MML572, que lleva una versión integrada de GTO2-HA, se cultivó en YPGly a 30ºC hasta 7 una concentración de 2,5x10 celulas/ml para el fraccionamiento celular posterior (ver Materiales y Métodos). La figura corresponde al análisis por Western de cada una de las fracciones obtenidas utilizando anticuerpos anti-HA y anticuerpos anti-acido lipóico para detectar los marcadores mitocondriales piruvato dehidrogenasa (PDH) y α-ketoglutarato deshidrogenasa (α-KGDH). (ET) extracto total, (MIT) fracción mitocondrial, (EIM) espacio intermembranal, (MTX) matriz mitocondrial, (PM) sobrenadante post-mitocondrial. En el caso de las proteínas Gto2 y Gto3, la secuencia GFP se añadió en el extremo C-terminal y la construcción se expresó bajo el promotor de MET25 (ver Tabla 1). La observación microscópica determinó que ambas proteínas tienen localización 111 Resultados citoplásmica independientemente de la fuente de carbono presente en el medio (Figura 33A). El análisis in silico de la proteína Gto2 predijo una señal de localización mitocondrial en su secuencia proteica, lo cual entraba en contradicción con la localización celular determinada microscópicamente. Para aclarar esto, se expresó bajo su propio promotor la proteína Gto2 marcada con el epítopo HA en posición C-terminal, en una cepa silvestre de S. cerevisiae que posteriormente se utilizó para hacer estudios de subfraccionamiento celular. La cepa fue cultivada en medio rico con glicerol (YPGly) como única fuente de carbono para inducir la formación de mitocondrias. Los análisis de Western indican que gran parte de la proteína de Gto2 se encuentra en la fracción postmitocondrial (Figura 33B), lo cual confirma las observaciones al microscopio sobre la localización citosólica de esta misma proteína (Figura 33A). Sin embargo, hay una proporción aproximadamente del 3% de la proteína total que se encuentra asociada al espacio intermembranal de la mitocondria (Figura 33B). 4.5. EXPRESIÓN DE LOS GENES GTO EN CONDICIONES OXIDANTES S. cerevisiae responde al estrés oxidativo causado por agentes externos, manifestándose esta respuesta mediante la alteración de la expresión de un gran número de genes, dentro de los que se incluyen los que participan en la detoxificación de las ROS (Gasch, 2003). La inducción de los genes que responden al estrés puede tener un componente específico o general. Una respuesta específica que se activa frente al estrés oxidativo está mediada por el factor de transcripción Yap1, una proteína del tipo b-ZIP que reconoce y activa los promotores que contienen la secuencia consenso YRE (TT/GACTAA) (He y Fassler, 2005). Por otra parte, la respuesta general a diferentes estreses también incluye la inducción de genes por agentes oxidantes externos. Esta respuesta está mediada en parte por los factores de transcripción Msn2 y Msn4. Estas dos proteínas reconocen las secuencias conocidas como STRE (CCCCT) presentes en los promotores de los genes que regulan (Estruch, 2000). Para determinar si la expresión de los genes GTO aumenta por estrés oxidativo, se analizó inicialmente la secuencia de cada uno de los promotores en busca de sitios de reconocimiento para Yap1 o Msn2/Msn4. Adicionalmente se realizó el mismo análisis para los promotores de los genes GTT1 y GTT2. La localización de estas secuencias se ilustra en la Figura 34. 112 Resultados -241 -170 1 1071 -241 -211 -165 -98 GTO1 GTT1 1 705 -179 -144 -117 1 1113 -98 GTO2 GTT2 1 702 -701 -330 GTO3 1 YRE 1101 STRE Figura 34. Diagrama de los genes GTO y GTT de S. cerevisiae y posición de las secuencias reconocidas por Yap1 (YRE) y Msn2/Msn4 (STRE) respecto del ATG. Los genes están indicados como flechas de color verde y la región promotora se muestra como una línea negra contínua. La distancia de cada una de las secuencias YRE y STRE tomada desde el codón de iniciación se indica sobre la región promotora. El promotor de GTO1 tiene una secuencia YRE en la posición -170 mientras que en el promotor de GTO2 está en la posición -179. Por el contrario, el promotor de GTO3 no tiene esta secuencia canónica. En el caso de los genes GTT, la secuencia canónica está en la posición -165 del promotor de GTT1 y en -98 en el caso de GTT2. En el caso de la secuencia reconocida por los factores de transcripción Msn2/Msn4, el promotor de GTO1 tiene una en la posición -241, mientras que en el caso de GTO2 existen dos secuencias STRE en las posiciones -117 y -144. El promotor de GTO3 también tiene dos secuencias STRE en las posiciones -330 y -701. Por otro lado, en el promotor de GTT1 se localizaron tres secuencias STRE en -241, -211 y -98. En el promotor de GTT2 no se encontró ninguna secuencia STRE. Todo ello indicaría que la expresión de los genes GTO podría inducirse por estrés oxidativo, dado que estudios anteriores sobre la expresión del genoma de esta levadura también lo indican (Gasch, 2003). Teniendo en cuenta esta información, se estudió la expresión de los genes GTO y de su posible dependencia de los factores de transcripción Yap1 y Msn2/Msn4, bajo estrés oxidativo. Como oxidantes se utilizaron tert-butil hidroperóxido (t-BOOH) y diamida. Este último causa específicamente la oxidación de los grupos sulfidrilo. El estudio también incluyó la exposición al sustrato CDNB y al cloruro de cadmio. Se ha propuesto que el CDNB causa indirectamente un estrés oxidativo en las células de levadura, como consecuencia de la formación del complejo GSH-CDNB y la consiguiente disminución de la concentración de GSH intracelular (Collinson y Grant, 2003). El cadmio, por otra parte, causa un efecto citotóxico, que deriva en parte en estrés oxidativo y peroxidación lipídica (Avery, 2001). El cadmio forma un complejo con 113 Resultados el GSH, el cual es retirado del citosol a través de bombas del tipo ABC, específicamente el transportador Ycf1. Este se ubica en la membrana vacuolar y se encarga de llevar el complejo hacia el interior de este organelo (Li et al., 1997; Sharma et al., 2002). La expresión basal de todos los genes GTO y GTT en células crecidas en medio con glucosa no es detectable en el análisis por Northern, aunque las proteínas correspondientes marcadas con el epítopo HA y expresadas bajo su propio promotor generan una señal considerable en el análisis por Western (Figura 35). 1 2 3 4 Figura 35. Expresión de Gto1, Gto2 y Gto3 bajo su propio promotor. Cada uno de los genes con sus respectivos promotores fueron clonados en el plásmido integrativo pMM50 donde el gen de interés se expresa en fase con el epítopo HA en C-terminal (pMM400 contiene a GTO1, pMM401 a GTO2 y pMM402 a GTO3). La cepa silvestre W303-1A fue transformada de manera independiente con cada uno de los plásmidos y los trasnformantes 7 se cultivaron exponencialmente en medio SC a 30ºC hasta una concentración de 1,5x10 celulas/ml. La figura corresponde al análisis por Western de la expresión de cada una de las proteínas utilizando el anticuerpo anti-HA para su detección en 40ug de extracto total de proteínas. 1. Control (W303-1A), 2. Gto1-HA, 3. Gto2-HA, 4. Gto3-HA. La expresión de GTO1 solamente supera el nivel basal cuando las células son tratadas con CDNB o diamida (Figura 36). La expresión de GTO1 no se detecta en los mutantes ∆yap1 y ∆msn 2∆msn4 después de 60 minutos de tratamiento con diamida, lo que indica que el aumento de la expresión de GTO1 inducida por diamida depende de ambos factores de transcripción. Además, el aumento de la expresión de GTO1 inducida por CDNB depende parcialmente de los factores Msn2 y Msn4 y completamente de Yap1, ya que en el doble mutante ∆msn2 ∆msn4 tratado con este xenobiótico la expresión de GTO1 se evidencia después de los 60 minutos de exposición, mientras que en el mutante ∆yap1 no se observa inducción de GTO1 bajo las mismas condiciones de tratamiento (Figura 36). La expresión de GTO2 aumenta en la cepa silvestre después de tratar las células con cualquiera de los cuatro agentes usados en este estudio. La inducción de este gen no se produce en el mutante ∆yap1 cuando es tratado con diamida o CDNB, mientras que la inducción es menor cuando se trata el mismo mutante con cloruro de cadmio o t-BOOH. El papel de los factores Msn2 y Msn4 parece ser menos relevante en 114 Resultados la inducción de GTO2, ya que el tratamiento del doble mutante ∆msn2 ∆msn4 con los agentes oxidantes seleccionados únicamente causa una disminución de la inducción de GTO2. La inducción de la expresión de GTO2 no es eliminada por completo en los mutantes ∆yap1 y ∆msn2 ∆msn4 tratados con cloruro de cadmio y t-BOOH, lo que apunta a que otros factores de transcripción estén participando en la inducción de GTO2 durante el tratamiento con estos dos compuestos. Uno de ellos puede ser Skn7, otro factor involucrado en la expresión de genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo y del que no se conoce detalladamente su mecanismo de acción (Toledano, 2003). En la cepa silvestre la expresión de GTO3 aumenta cuando las células son tratadas con t-BOOH y esta inducción disminuye considerablemente cuando no están presentes los factores Msn2 y Msn4. La falta del factor Yap1 no ejerce ningún cambio en la expresión del GTO3 durante el tratamiento con este agente oxidante. Estos resultados se relacionan con la presencia de dos secuencias STRE y la ausencia de secuencias YRE en el promotor de GTO3. La inducción de GTT1 es moderada después del tratamiento con cada uno de los agentes, observándose que este gen no se expresa en el mutante ∆yap1 después del tratamiento con diamida. La expresión de GTT1 no varía en el mutante ∆msn2 ∆msn4 después de los tratamientos realizados, indicando que Msn2 y Msn4 no influyen en la expresión de esta GST y que otros factores de transcripción probablemente estén involucrados en la inducción de su expresión después del tratamiento con los agentes escogidos en este estudio. GTT2 también se induce después del tratamiento de la cepa silvestre con los cuatro agentes ensayados. Esta inducción no se produce en el mutante ∆yap1 después de ninguno de los tratamientos, lo que indica que para los cuatro casos es necesaria la presencia de Yap1 para la inducción de GTT2. Por el contrario, dicha expresión no depende de Msn2 ni de Msn4, ya que la expresión de GTT2 no cambia en la cepa que carece de estas dos proteínas. Los resultados concuerdan con la presencia de una secuencia YRE y la ausencia de secuencias STRE en el promotor de GTT2. En resumen, la inducción de los genes GTO y GTT y la dependencia de esta inducción de los factores de transcripción Yap1 y Msn2/Msn4 se correlaciona con la presencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. 115 Resultados CdCl2 5 µg/ml wt ∆msn2/4 ∆yap1 t-BOOH 1 mM wt ∆ msn2/4 ∆yap1 CDNB 0.2 mM wt ∆msn2/4 ∆yap1 Diamide 2.5 mM wt ∆msn2/4 ∆yap1 GTO1 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 min wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆ msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 GTO2 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 min wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆ msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 GTO3 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 min wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 GTT1 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 min wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 wt ∆msn2/4 ∆yap1 GTT2 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 0 30 60 min Figura 36. Análisis por Northern de la expresión de los genes GTO1, GTO2, GTO3, GTT1 Y GTT2 después de la adición de varios agentes. Células de la cepa silvestre W303-1A y los mutantes respectivos, ∆yap1 y ∆msn2 ∆msn4, se cultivaron exponencialmente a 30ºC en medio con glucosa (YPD para los tratamientos con CDNB, t-BOOH y diamida; SC para el 7 tratamiento con cloruro de cadmio) hasta alcanzar una concentración de 1-2x10 celulas/ml, momento en el que se añadieron los agentes correspondientes (tiempo=0). Posteriormente se tomaron muestras a los 30 y 60 minutos de tratamiento. 4.6. DEFECTOS FENOTÍPICOS DE LOS MUTANTES QUE CARECEN DE LOS GENES GTO Y GTT EN S. cerevisiae El hecho que los genes GTO y GTT aumenten su expresión durante la exposición a agentes oxidantes indicaría que asumen un papel importante en la respuesta al estrés oxidativo. Para determinar si los mutantes simples o múltiples de los genes GTO y GTT en S. cerevisiae tienen defectos de crecimiento durante la exposición a determinados agentes tóxicos, se llevó a cabo un análisis fenotípico cuantitativo de alta resolución en colaboración con el grupo del Dr. Per Sunnerhagen del Departamento de Biología Celular y Molecular de la Universidad de Göteborg, Suecia. Este estudio se basa en el microcultivo de las cepas en 350µl de medio líquido, donde el crecimiento es medido de manera automática por densidad óptica (600 nm), en intervalos de veinte minutos, durante un total de 2.500 minutos, lo cual permite obtener curvas de crecimiento detalladas de las cepas mutantes y la cepa de referencia. A partir de estos 116 Resultados datos se determina el índice fenotípico, el cual relaciona los cambios en la tasa de crecimiento de la cepa mutante respecto de la cepa de referencia bajo unas condiciones de crecimiento específicas (Warringer y Blomberg, 2003). En este caso, la condición de crecimiento se refiere al tratamiento de la cepa silvestre y las cepas mutantes con varios compuestos: cloruro de cadmio (5ug/ml), CDNB (0,05mM), dietilmaleato (2mM), diamida (0,75mM), t-BOOH (0,5mM), paraquato (2,5mg/ml), bromuro de etidio (55µg/ml) y 4nitroquinolona (NQO) (0,3 µg/ml). Las tasas de crecimiento relativas se resumen en la figura 37. 4-Nitroqui- ∆gtt2 ∆gto3 Paraquato ∆gto2 Bromuro Cloruro∆ CDNB Dietil∆gto1Diamida gto3growth rate ∆gto2 ∆gtt2 ∆gtt1 ∆gtt1 ∆gto3 ∆gto2 ∆gto1 0,8 1,6 0,6 1,4 0,4 1gto1 0,2 t-BOOH Relative de cadmio 2.5 mg/ml 0.75 ∆gtt2 de etidio maleato nolona ∆0.050.5 mM gtt1 mM 0.3µµg/ml 55 µg/ml 52 mM g/ml Velocidad Relativa de Crecimiento Figura 37. Efecto de diferentes agentes químicos sobre el crecimiento de la cepa silvestre (W303-1A) y los mutantes Gto y Gtt derivados de esta cepa. Las cepas usadas en este análisis fueron: MML535 (∆gto1), MML538 (∆gto2), MML542 (∆gto3), MML686 (∆gto1∆gto2 ∆gto3), MML628 (∆gtt1), MML629 (∆gtt2), MML661 (∆gtt1∆gtt2) y MML716 (∆gto1 ∆gto2 ∆gto3 ∆gtt1 ∆gtt2). Las concentraciones de los agentes se indican en la gráfica y las condiciones del ensayo se describen en Warringer y Blomber (2003). Las barras representan el cociente entre la tasa de crecimiento exponencial de las células tratadas y la tasa de las no tratadas. Este dato se normalizó dividiendo este cociente por el cociente correspondiente a la cepa silvestre. Los resultados representan el promedio de dos experiementos independientes. La falta de GTO1 causa una sensibilidad importante a la diamida y una sensibilidad todavía significativa pero menos considerable al dietilmaleato y al t-BOOH, comparado con la cepa silvestre. Por otra parte, la ausencia de uno de los genes GTT o de ambos simultáneamente causa hipersensibilidad a los oxidantes dietilmaleato, diamida y t-BOOH, mientras que la ausencia de GTT2 (pero no de GTT1) causa hipersensibilidad frente a la NQO, aunque esta hipersensibilidad es menos grave en el mutante que carece de todos los genes GTO y GTT. Estos resultados concuerdan con el papel antioxidante propuesto anteriormente para los genes GTT1 y GTT2 (Collinson y 117 Resultados Grant, 2003), y los datos permiten ampliar esta capacidad detoxificadora de GTT2 también sobre NQO. Otro fenotipo significativo es la hipersensibilidad del quíntuple mutante ∆gto1 ∆gto2 ∆gto3 ∆gtt1 ∆gtt2 al cloruro de cadmio, lo que pondría en evidencia el efecto aditivo de las Gto y las Gtt en la detoxificación del cadmio. Es sorprendente ver que este mismo mutante es hiperresistente al t-BOOH comparado con la cepa silvestre y con los demás mutantes. Aunque no se tiene una explicación para este hecho, no es la primera vez que se observa un efecto similar. En S. pombe los mutantes simples o múltiples para las GST son hiperresistentes a la diamida comparados con la cepa silvestre (Veal et al., 2002). 4.7. LA FUNCIÓN DE Gto1 Y LAS Gtt TIENEN UN EFECTO ADITIVO EN LA PROTECCIÓN FRENTE A LA TOXICIDAD DEL CADMIO Con el fin de ampliar la información acerca de la importancia que pueda tener cada uno de los genes GTT y GTO en la protección frente a la toxicidad del cadmio, se Figura 38. Efecto del cadmio sobre el crecimiento de diferentes mutantes de los genes GTT y GTO. La cepa silvestre W303-1A y los mutantes indicados (MML661 ∆gtt1 ∆gtt2; MML649 ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto1; MML653 ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto2; MML657 ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto3; MML687 ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto1 ∆gto2; MMO716 ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto1 ∆gto2 ∆gto3) se cultivaron 7 exponencialmente en medio SC a 30ºC hasta una concentración de 1x10 celulas/ml a 30ºC. A la mitad del cultivo se le agregó cloruro de cadmio (7µg/ml) y se continúo con la incubación a 30ºC. Se midió la densidad óptica (600nm) de todos los cultivos después de 48 horas de incubación. El cociente entre el nivel de crecimiento de las células tratadas y no tratadas mide el efecto del cadmio sobre cada cepa y este se dividió por el cociente para la cepa silvestre, el cual se considera como valor unitario. Los resultados corresponden a la media de tres experimentos independientes y sobre cada barra se indica la desviación estándar. 118 Resultados llevaron a cabo estudios de crecimiento, en medio SC con cloruro de cadmio (7µg/ml) de los mutantes Gtt que adicionalmente llevan una mutación simple en cada uno de los genes GTO, del cuádruple mutante ∆gto1 ∆gto2 ∆gtt1 ∆gtt2 y del quíntuple mutante ∆gto1 ∆gto2 ∆gto3 ∆gtt1 ∆gtt2. Los resultados se muestran en la figura 38. Se observó que el quíntuple mutante no tiene una sensibilidad mayor que el cuádruple mutante ∆gto1 ∆gto2 ∆gtt1 ∆gtt2, lo cual indica que el gen GTO3 no es importante en la protección frente al efecto tóxico del cadmio. Por otra parte, el triple mutante ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto1 tiene una sensibilidad similar a la del quíntuple mutante (Figura 38), lo que indica que solamente Gto1 junto con Gtt1 y Gtt2 protegen de manera cooperativa contra la toxicidad del cadmio en S. cerevisiae. 4.8. EL MUTANTE ∆gto1 NO CRECE NORMALMENTE EN MEDIO CON ÁCIDO OLEICO En bastantes pero no en todos los casos, los promotores de los genes que codifican proteínas peroxisomales y factores de biogénesis de este organelo contienen el elemento de respuesta al oleato (ORE, de “Oleate Response Element”), el cual es reconocido por los factores de transcripción Pip2 y Oaf1 (Einerhand et al., 1993). Se ha propuesto la secuencia CGG(N3)TNA(N7–13)(GyC)CG como consenso para el elemento ORE, utilizada además para la identificación de genes inducibles por oleato o asociados con el peroxisoma (Geraghty et al., 1999). Analizando la secuencia del promotor de GTO1 se observó que no existe en ella el elemento ORE, lo que se relaciona con que la expresión de este gen no se induzca en la cepa silvestre cuando se cambia de medio con glucosa a ácido oleico (Figura 39A). También se analizó el nivel relativo de la proteína Gto1 en los medios de cultivo con glucosa y con ácido oleico, observando que este nivel es incluso menor cuando se cultivan las células con esta última fuente de carbono (Figura 39A). Adicionalmente se determinó que el crecimiento de la cepa ∆gto1 es deficiente en medio de cultivo con ácido oleico comparada con la cepa silvestre (Figura 39B), aunque el crecimiento de estas dos cepas en medio con glucosa (YPD) no muestra diferencias importantes (ver recuadro en la Figura 39B). 119 Resultados (A) GTO1 U1 Gto1 Glu Ole (B) Densidad óptica relativa 5 4 3 2 1 0 10 20 30 40 50 tre o1 es ∆gt lv si 114 92 Tiempo (horas) Figura 39. (A) Expresión de GTO1 en medio de cultivo con glucosa (Glu) o con ácido oléico (Ole). La cepa silvestre W303-1A transformada con el plásmido que contiene el gen GTO1 bajo su propio promotor y con la secuencia TAP en N-terminal (pMM736), se 7 cultivó en medio SC con glucosa a 30ºC hasta una concentración de 4 x 10 celulas/ml. En este momento se diluyeron las células diez veces dividiendo el cultivo en dos partes; una mitad del cultivo se mantuvo en medio SC con glucosa mientras que la otra mitad fue transferida a medio SC con ácido oléico. Se tomaron muestras de cada cultivo 16 horas después para análisis por Northern (primer panel). Como control de carga se utiizó mRNA de U1 (segundo panel) y en cada carril se cargaron 20µg de RNA total. Simultáneamente se tomaron muestras para análisis por Western de la expresíon de la construcción GTO1-TAP en ambos medios de cultivo (tercer panel). Para el análisis se utilizaron 20 µg/µl de extracto total de proteínas. (B) Curva de crecimiento de la cepa W303-1A (cuadrados azules) y la cepa mutante ∆gto1 (MML535, triángulos negros), cultivadas en YP con ácido oléico a 30ºC. Las células fueron precultivadas en YPD 7 hasta una concentración de 3x10 células/ml y diluidas diez veces en medio YP con ácido oléico (t=0h). Se midió la densidad óptica (600nm) en los tiempos indicados. El recuadro indica el tiempo de generación en minutos de la cepa silvestre y del mutante en la etapa exponencial en medio YPD. Estos datos indican que alguna función de Gto1 es importante para el crecimiento de S. cerevisiae en medio con ácido oleico como única fuente de carbono. 4.9. LA MUTACIÓN DE GTO1 EN S. cerevisiae AFECTA EL METABOLISMO DE LOS AMINOÁCIDOS QUE CONTIENEN AZUFRE Los resultados respecto de la sensibilidad al cadmio indican que la función de Gto1, además de estar relacionada con los defectos en el crecimiento en medio de cultivo con ácido oleico, también puede ser importante durante el crecimiento en glucosa, es decir, durante condiciones fermentativas. Para determinar la posible función 120 Resultados de Gto1 en estas condiciones, se llevó a cabo un análisis del transcriptoma del mutante ∆gto1 en etapa exponencial de crecimiento en medio YPD a 30ºC, utilizando micrordenamientos de DNA con el conjunto de genes de S. cerevisiae (véase Materiales y Métodos). En la tabla 4 se indican los genes en los que se observaron diferencias significativas de expresión entre la cepa mutante ∆gto1 y la cepa silvestre W303-1A. COCIENTE GEN FUNCIÓN ∆gto1/ silvestre CHA1 CIT2 AVO2 Serina/treonina deshidratasa Citrato sintasa peroxisomal Desconocida 3.74 2.21 2.15 Secuencia reconocida por el complejo Met4/Met28/Cfb1 - Secuencia reconocida por el complejo Met4/Met31/Met32 + - MET16 SAM3 MUP1 MET5 MET17 SER3 MET14 GAP1 3´-fosfo-5´-adenilsulfatoquinasa S-adenosil-L-metionina permeasa Metionina permeasa de alta afinidad Sulfitoreductasa Homocisteína sintasa 3-fosfoglicerato deshidrogenasa 5´-adenilsulfato quinasa Permeasa general de aminoácidos 0.499 0.493 0.472 0.471 0.450 0.372 0.320 0.186 + + + + - + + + + + Tabla 4. Genes sobreexpresados y reprimidos en el mutante ∆gto1 respecto de la cepa silvestre W303-1A (con una diferencia de al menos el doble o la mitad de la expresión). El análsis con microordenamientos de DNA se llevó a cabo a partir de RNA extraído de células de cada cepa, cultivadas exponencialmente a 30ºC en medio YPD. La presencia (+) o ausencia (-) en el promotor de secuencias reconocidas por el complejo Met4/Met28/Cbf1 (TCACGTG) y por el complejo Met4/Met30/Met31 (CTGTGG) se indica para cada uno de los genes. Es remarcable que el número de genes cuya expresión está alterada significativamente en el mutante es bastante limitado, en comparación con otros muchos estudios de otros mutantes de S. cerevisiae, y que la mayoría de estos genes están relacionados con la asimilación del azufre y biosíntesis de la metionina y la cisteína. Para confirmar los resultados anteriores se llevaron a cabo análisis por Northern de los genes CHA1 y GAP1, y de MET6 como control. Los resultados del Northern y de los micrordenamientos de DNA coinciden, confirmando que en el mutante ∆gto1 CHA1 se encuentra sobre expresado y GAP1 reprimido (Figura 40). El gen MET6 121 Resultados no muestra ningún cambio significativo en el análisis por micrordenamientos, lo cual también se comprobó por Northern (Figura 40). U1 MET6 GAP1 CHA1 ∆gto1 silvestre Figura 40. Análisis por Northern de los genes CHA1, GAP1 y MET6 en el mutante ∆gto1 y en la cepa silvestre W303-1A. Las muestras de RNA se obtuvieron en las mismas condiciones utilizadas en el análisis por micrordenamientos de DNA. U1 se utilizó como control de carga y para cada análisis se utilizaron 25µg de RNA total. Como ya se ha apuntado, la mayoría de los genes que tienen alterada su expresión en el mutante ∆gto1 están involucrados en la vía de asimilación del azufre y biosíntesis de la metionina y la cisteína (Tabla 4 y Figura 14). Algunos genes implicados en las reacciones de la vía previas a la síntesis de homocisteína (precursor de la metionina y la cisteína) están reprimidos en el mutante ∆gto1 como son MET14, MET16, MET5 Y MET17 (Tabla 4 y Figura 14). Por otra parte, en el mutante ∆gto1 también está alterada la expresión de los genes SER3 y CHA1, los cuales están involucrados respectivamente en la síntesis y metabolismo de la serina. Esta última, junto con la homocisteína, son precursores de la cistationina. SER3 codifica para una 3-fosfogliceratodeshidrogenasa que cataliza la conversión de 3-fosfoglicerato en 3-fosfohidroxipiruvato (uno de los precursores de la serina) (Albers et al., 2003) y CHA1 codifica para una Serina/treonina deshidratasa que cataliza la conversión de la serina en piruvato (Petersen et al., 1988; Albers et al., 2003). Comparado con la cepa silvestre, en el mutante ∆gto1 la expresión de SER3 es menor mientras que CHA1 está sobrexpresada (Tabla 4 y Figura 38). Otro conjunto de genes que tienen una expresión menor en el mutante ∆gto1 comparado con la cepa silvestre son los que codifican para algunos transportadores de aminoácidos: GAP1, MUP1 y SAM3 (Tabla 4). GAP1 es una permeasa general de aminoácidos que permite tomar directamente del medio los L-aminoácidos y otros compuestos similares (Jauniaux y Grenson, 1990), mientras que SAM3 y MUP1 son específicos para la captación de aminoácidos que contienen azufre. La primera es una permeasa que permite tomar del medio la S-adenosil-L-metionina, la cual puede ser 122 Resultados utilizada como fuente de azufre para la síntesis de homocisteína. MUP1 es una permeasa de alta afinidad para la captación de metionina del medio que también está relacionada en la captación de cisteína (Isnard et al., 1996; Kosugi et al., 2001) (Figura 14). Todos estos datos apuntan a que existe una relación entre GTO1 y la vía de captación del azufre, de modo que en el mutante ∆gto1 podrían estar alterados los niveles intracelulares de los aminoácidos que contienen azufre. Uno de estos aminoácidos es la cisteína y se ha visto que los cambios en la concentración de cisteína intracelular también alteran los niveles de GSH en S. cerevisiae (Jauniaux y Grenson, 1990; Dormer et al., 2000). Para comprobar si existía una relación entre la alteración de la captación de azufre y la formación de GSH en el mutante ∆gto1, se llevó a cabo la determinación de la concentración de GSH y GSSG intracelulares en este mutante y en la cepa silvestre. Los resultados de este análisis se ilustran en la figura 41. 3.69 1.450 0.157 0.161 GSH GSSG GSH GSSG Silvestre ∆gto1 Figura 41. Concentración intracelular (mM) de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) en la cepa silvestre W303-1A y en el mutante ∆gto1 (MML535). Los valores absolutos de la concentración de ambos compuestos se determinaron a partir de cultivos exponenciales de ambas cepas crecidas en medio YPD a 30ºC y este valor se refirió al volumen celular determinado posteriormente. Los valores corresponden a la media de tres experimentos independientes y sobre cada valor se indica la desviación estandar. Comparado con la cepa silvestre, el mutante ∆gto1 tiene un nivel de GSH menor mientras que los valores de GSSG no son diferentes entre ambas cepas, lo cual concuerda con los resultados del análisis por micrordenamiento de DNA. Este nivel bajo 123 Resultados de GSH explicaría la sensibilidad al cadmio que presentan los mutantes que carecen de los genes GTT1, GTT2 y GTO1 simultáneamente. Además, respecto de la cepa silvestre, el mutante ∆gto1 tiene una tasa de crecimiento menor en medio SD suplementado exclusivamente con los aminoácidos correspondientes a las auxotrofías de la cepa, defecto que no se observa en medio SC suplementado con los 20 aminoácidos, indicando que en el mutante habría deficiencias en la síntesis de uno o más aminoácidos. Para determinar qué aminoácidos no se sintetizaban correctamente en este mutante, se realizaron cultivos en distintos medios SC en los que faltaba uno de los 20 aminoácidos necesarios, con el fin de determinar la tasa de crecimiento del mutante en estas condiciones respecto de la cepa silvestre. Así se determinó que sólo la ausencia de treonina, serina o lisina causaba un crecimiento defectuoso del mutante ∆gto1. Los resultados se muestran en la figura 42, solo para aquellos aminoácidos que dieron diferencias significativas. 1 0.92 0.86 0.79 0.71 0.54 0.49 0.95 0.96 silvestre ∆gto1 0.52 SC SD SC -T hr SC -Ser SC -Lys Figura 42. Tasa de crecimiento de cultivos exponenciales de la cepas silvestre (W3031A) y ∆gto1 (MML535) a 30ºC en medio SC, SD y SC sin treonina (-Thr), sin serina (-Ser) o sin lisina (-Lys). Los valores que se indican son relativos a la cepa silvestre crecida en medio SC, la cual tiene una tasa de crecimiento de 0,62 duplicaciones/hora. El ensayo indicó que la ausencia de serina genera un defecto moderado en el crecimiento del mutante mientras que la ausencia de serina o lisina causa un defecto en el crecimiento similar al que se observa en el medio SD. Podemos concluir que, aunque en diferente grado, el mutante tiene defectos en la síntesis de estos tres aminoácidos o 124 Resultados en sus niveles intracelulares. Sin embargo la ausencia de cisteína o metionina en el medio no tiene ningún efecto en el crecimiento del mutante ∆gto1. 4.10. RELACIÓN ENTRE EL FUNCIONAMIENTO DE LOS PEROXISOMAS Y LA VÍA DE ASIMILACIÓN DEL AZUFRE EN S. cerevisiae La relación de la proteína Gto1 con la vía de la asimilación del azufre y su localización peroxisomal sugieren que este organelo participa de alguna manera en esta ruta metabólica. Es importante anotar que el producto del gen STR3 de S. cerevisiae, la enzima cistationina β-liasa, tiene una señal de localización del tipo PTS1 en posición Cterminal y que, además, se ha demostrado experimentalmente que Str3 se localiza en el peroxisoma (Schafer et al., 2001; Yi et al., 2002). Por otra parte, las demás proteínas de la vía de asimilación del azufre no tienen señales tipo PTS y ninguna de ellas ha sido detectada en este organelo. La proteína Str3 participa en la vía de la asimilación del azufre, concretamente en el proceso de la transulfuración, interviniendo en la conversión de cisteína en homocisteína (Figuras 14 y 18). Como se ha mencionado en el apartado 1.9.6., en las bacterias entéricas, las plantas y S. cerevisiae se produce la transulfuración en el sentido de la formación de homocisteína a partir de cisteína, mientras que los mamíferos solo realizan el paso de homocisteína a cisteína. La proteína Str3 de S. cerevisiae cataliza la conversión de cistationina en homocisteína y el mutante correspondiente es incapaz de crecer en medios donde la cisteína o la cistationina son las únicas fuentes de azufre (Hansen y Johannesen, 2000). Dado que Gto1 es una tiol transferasa, posiblemente el papel de Gto1 sea regular la actividad enzimática de Str3 a través de la regulación de su estado de oxidación. Str3 tiene diez cisteínas de las cuales tres están situadas en la región Cterminal de la molécula, específicamente en las posiciones 353, 362 y 387. Estas tres cisteínas están conservadas en las moléculas de cistationina β-liasas de otras especies de hongos indicando que pueden ser importantes para la función de estas proteínas (Figura 43). 125 Resultados 38 7 35 3 36 2 P53101 Q6FL54 Q5ACX5 Q9UV02 Q96VU8 Q4ILH6 Q5AXC9 P53780 Q9MT31 Q9LWJ5 Q4QFT8 P0A4K3 Q4EQ45 Q97M09 Q81LL6 ScStr3 Cg Ca Bc Nc Gz An At St Os Lm Ll Lmo Cac Ba IWAVTV SF G CVNSLLSM P CKMS HA SIDPEL R KERDFPEDLV RLCC G IE NI LWNVTV SF G CVNSLISM P CLMS HA SIDPEL R KERQFPEDLI RLCC G IE DV IFGIAV SF G CVNSLISM P CKMS HA SIDAKT R EEREFPEDLI RLCI G IE NC LWGISV SF G CVNSLISM P CQMS HA SIDAKT R KERQMPEDII RLCV G IE DV LWGISV SF G CVNSLISM P CRMS HA SIDAKT R AERQMPEDII RLCV G IE DA LWAISV SF G CVNSLISM P CQMS HA SIDAKT R AERQMPEDII RLCV G IE DP LWAISV SF G CVNSLISL P CRMS HA SIDAKT R KERAMPEDLI RLCV G IE DV YFSIAV SF G SVKSLISM P CFMS HA SIPAEV R EARGLTEDLV RISA G IE DV YFSITV SF G SVKSLISL P CFMS HA SIPVEV R EARGLTEDLV RISV G IE DV YFNVTV SF G SVKSLISL P CFMS HA SIPSAV R EERGLTDDLV RISV G IE DA LFKLTV SF G SCNSLVEM P CLLS HA SIPKEK R ---TLPVDLI RLSV G IE QI YFTLAE SL G GVESLIEV P AVMT HA SIPKEL R EEIGIKDGLI RLSV G VE AI LPVFSV SL G AVESILSY P AKMS HA AVPEEE R LAQGITPGLL RFSA G LE DA CAAVGV SL G GVETIVSY P AKMS HA EIPHNE R IKLGIGDNLI RVSV G LE DI YFTLAE SL G AVESLISI P SQMT HA SIPADR R KELGITDTLI RISV G IE DG 393 376 369 411 402 395 398 448 455 459 435 366 369 365 365 Figura 43. Alineamiento múltiple por ClustalW de la región C-terminal de las cistationina β-liasas de varios organismos. En esta región se encuentran las tres cisteínas conservadas, indicándose las posiciones de éstas en la molécula de S. cerevisiae. Las abreviauras correponden en su orden a: Sc, S. cerevisiae; Ca, C. albicans; Cg, Candida glabrata; Bc, Botrytis cinerea; Nc, Neurospora crassa; Gz, Giberella zeae; An, Aspergillus nidulans; At, Arabidopsis thaliana; St, Solanum tuberosum; Os, Oryza sativa; Lm, Leishmania mayor; Ll, Lactobacilus lactis; Lmo, Listeria monocitogenes; Cac, Clostridium acetobutylicum; Ba, Bacillus anthracis. Para comprobar que la actividad de la proteína Str3 es defectuosa en ausencia de Gto1, se estudió la capacidad del mutante ∆gto1 para crecer en medios de cultivo que tienen como única fuente de azufre la cistationina o la cisteína. Al comparar este crecimiento con la cepa silvestre, se observa que el mutante tiene defectos en su crecimiento en estos medios de cultivo, en mayor grado cuando la única fuente de azufre es la cistationina (Figura 44). 126 Resultados Silvestre ∆gto1 Sulfato de amonio Cisteína Cistationina Figura 44. Crecimiento de la cepa silvestre (W303-1A) y del mutante ∆gto1 (MML535) en placas de medio B suplementadas con sulfato de amonio, cistationina o cisteína como únicas fuentes de azufre, e incubadas a 30ºC. Las placas que contenían sulfato de amonio y cisteína se incubaron durante tres días, mientras que la placa que contenía cistationina se incubó durante cinco días. Los resultados indicarían que el mutante ∆gto1 no puede convertir eficientemente la cistationina en homocisteína, lo que genera un aumento de la concentración intracelular de cistationina y, que además, el mutante no pueda utilizar eficientemente la cisteína como única fuente de azufre. Se ha descrito que concentraciones altas de cisteína o cistationina en el medio de cultivo son tóxicas para S. cerevisiae (Kumar et al., 2006). La posible hiperacumulación de cisteína y/o cistationina en el mutante ∆gto1 podría explicar el crecimiento defectuoso del mismo en medio B, dada la toxicidad de ambos compuestos. Para determinar si el mutante ∆gto1 es más sensible a altas concentraciones de cisteína que la cepa silvestre, se comparó el crecimiento de ambas cepas en medio SD con varias concentraciones de cisteína. El ensayo demostró que el mutante ∆gto1 no tiene una sensibilidad mayor que la cepa silvestre a altas concentraciones de cisteína (Figura 45), lo cual estaría indicando que el defecto en el crecimiento del mutante ∆gto1 en un medio donde la única fuente de azufre es la cisteína, no se debe a un efecto de toxicidad por cisteína sino a un defecto en la conversión de cistationina en homocisteína. 127 Resultados 1 1 0,97 0,99 0,97 0,84 Silvestre ∆gto1 0,58 0,50 0,08 0,2 mM 4 mM 0,8 m 2 mM 0,11 8 mM Figura 45. Tasa de crecimiento de la cepa silvestre (W303-1A) y el mutante ∆gto1 (MML535) en medio de cultivo SD con varias concentraciones de cisteína. Células de cada cepa se precultivaron en SD a 30ºC con agitación durante 16 horas y posteriormente se dividió el cultivo en cinco partes iguales a una concentración final de 5 5x10 células/ml, agregando después la concentración de cisteína correspondiente. Los cultivos fueron incubados a 30ºC con agitación y se registró el crecimiento de los mismos después de 24 horas (densidad óptica 600nm). Los valores indicados son relativos a la tasa de crecimiento de cada una de las cepas en medio de cultivo SD con 0,2 mM de cisteína, al que se le da el valor de 1. En la estructura terciaria de la cistationina β-liasa de Arabidopsis thaliana no se indica la presencia de cisteínas en el centro activo, aunque la actividad de esta enzima se inhibe con el compuesto N-etilmaleimida (Breitinger et al., 2001), lo cual indica que algunas de las cisteínas presentes en la molécula podrían ser importantes para mantener la estructura terciaria funcional de la molécula (Ravanel et al., 1996; Breitinger et al., 2001). Para determinar si las tres cisteínas conservadas tienen alguna relación con la actividad de la proteína Str3 en S. cerevisiae, se llevaron a cabo mutaciones independientes de cada una de las cisteínas y se expresaron estas proteínas mutantes en la cepa ∆str3. Los transformantes obtenidos se cultivaron posteriormente en un medio de cultivo que tiene cisteína como única fuente de azufre. Los resultados indican que la proteína silvestre y las proteínas que llevan las mutaciones C353S y/o C362S restauran el defecto de crecimiento del mutante ∆str3 en este medio (Figura 46). Por otro lado, la proteína que contiene la mutación C387S no permite el crecimiento del mutante en dicho medio, lo que indica que este residuo, pero no los otros dos, es esencial para la actividad de la enzima (Figura 46). Estos resultados reafirman la 128 Resultados importancia del estado redox de la proteína en el control de la actividad de la cistationina β-liasa de S. cerevisiae. 1 0,91 0,92 0,91 0,01 r3 St 0,02 r S S S 2S 53 87 62 cto 36 Ve C3 C3 C3 / / /C 53 r3 r3 r3 C3 St St St / r3 St Figura 46. Células del mutante ∆str3 (cepa MML826) transformada con los plásmidos pMM756 (que contiene el gen salvaje STR3), pCM188 (vector vacío), pMM758 (que contiene STR3 con la mutación C353S), pMM760 (STR3 con la mutación C362S), pMM797 (STR3 con las mutaciones C353S y C362S) y pMM762 (STR3 con la mutación C387S), se cultivaron exponencialmente en medio SD, para centrifugarlas y resuspenderlas posteriormente en medio B con cisteína como única fuente de azufre, a 6 una concentración de 3 x 10 celulas/ml. Los cultivos fueron incubados a 30ºC con agitación y se registró el crecimiento de los mismos después de 24 horas (densidad óptica de 600nm). Los valores indicados son relativos al crecimiento del mutante ∆str3 transformado con el plásmido que contiene el gen salvaje STR3, al que se le da el valor de unidad. 129 6. DISCUSIÓN 131 Discusión 5. DISCUSIÓN La secuenciación del genoma de S. cerevisiae evidenció que en algún momento de la evolución un ancestro de esta especie duplicó su genoma completo y sufrió seguidamente una serie de rearreglos y pérdidas de regiones enteras (Wong et al., 2002). Por esta razón no es sorprendente encontrar en el genoma de S. cerevisiae dos o más copias de bastantes genes (parálogos), evento que se refleja en las GST de clase Omega descritas en este trabajo y en otros grupos de proteínas. Sin embargo, la similitud estructural de las proteínas codificadas por estos genes parálogos no implica una relación entre su función biológica y tampoco implica que coexistan en el mismo espacio intracelular. Se ha propuesto que las GST se originaron a partir de un progenitor tioredoxina/glutaredoxina (Hayes et al., 2005), relacionando estructural y funcionalmente a las GST con las glutaredoxinas. Este hecho se observa en el plegamiento tipo tioredoxina, compartido por el dominio N-terminal de las GST y por la estructura completa de las glutaredoxinas ditiólicas. La actividad de ambos tipos de enzimas también guarda una relación. Las glutaredoxinas tienen actividad tiol oxidoreductasa sobre el sustrato HED y el mecanismo puede ser monotiólico o ditiólico dependiendo del número de cisteínas del centro activo empleadas en la reacción. Las glutaredoxinas utilizan el GSH como donador de electrones en la reducción de los puentes disulfuro, mientras que las GST clásicas utilizan el GSH para conjugar compuestos electrofílicos (Holmgren y Aslund, 1995; Hayes et al., 2005). Las GST de hongos tienen estructuras primarias variadas y son diferentes a las estructuras presentes en las GST de mamíferos o de otros organismos (McGoldrick et al., 2005b). Las GST descritas previamente en S. cerevisiae, Gtt1 y Gtt2, tienen una similitud cercana al 50% con GST de insectos como Manduca sexta, Bombix mori, Musca domestica y de plantas como Zea mays, Silene vulgaris y Arabidopsis thaliana (Choi et al., 1998). La comparación de las secuencias de estas GST indicó que los aminoácidos conservados se encuentran mayoritariamente en la región N-terminal correspondiente al sitio de unión con el GSH; además, Gtt1 y Gtt2 son activas sobre CDNB, sustrato estándar de las GST (Choi et al., 1998). En este estudio se ha comparado la secuencia de Gtt1 y Gtt2 con las GST de otras clases, mostrándose una cierta similitud con las enzimas de la clase Zeta. Sin embargo, se ha descrito que las enzimas de esta clase carecen de actividad sobre el sustrato CDNB aunque pueden 133 Discusión tener actividad sobre algunos hidroperóxidos orgánicos como es el caso de otras GST citosólicas (Board y Anders, 2005). El nivel de homología en cualquier caso no permite adscribir Gtt1 y Gtt2 a la clase Zeta ni a ninguna otra clase establecida para las GST. En el caso de las GST de clase Omega, solo comparten un 20% de identidad con los miembros de otras clases aunque estudios estructurales confirman que son miembros de la gran superfamilia de las GST (Board et al., 2000). Tomando como referencia la secuencia de la proteína humana hGSTO1-1, se determinó que no solo hay GST de clase Omega en eucariotes superiores, sino que también están presentes en bacterias y en eucariotas inferiores tales como parásitos y hongos (Whitbread et al., 2005). La estructura básica de las GST de clase Omega está presente a lo largo de la escala evolutiva, lo cual junto con su actividad tiol transferasa sugiere que las GST con capacidad de conjugar GSH han evolucionado a partir de las glutaredoxinas; la presencia de una cisteína en su centro activo sería también evidencia de este hecho (Caccuri et al., 2002). En la presente memoria se describen tres proteínas de S. cerevisiae homólogas a las GST de clase Omega previamente conocidas, las cuales están codificadas por las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w. A los respectivos genes los denominamos GTO1, GTO2 y GTO3 (por Glutathione Transferase Omegalike). Además de compartir similitud estructural con las enzimas de la clase Omega, estas proteínas también presentan las mismas actividades enzimáticas que se han descrito previamente para esta clase de GST. Si se compara la estructura primaria de las Gto con otras GST de clase Omega se puede ver que tienen más similitud con las enzimas bacterianas, aunque los residuos importantes para la estructura terciaria así como para la unión con el GSH en la hGSTO1-1 humana también están presentes en las tres proteínas Gto, incluyendo la cisteína del centro activo, que es esencial para la actividad tiol transferasa. A nivel de distribución celular es posible encontrar proteínas con estructura y actividad enzimática similares pero con localización celular diferente. Un ejemplo son las glutaredoxinas monotiólicas de S. cerevisiae, Grx3, Grx4 y Grx5. Estas tres proteínas son estructuralmente similares pero las dos primeras tienen localización nuclear mientras que la última es mitocondrial (Rodriguez-Manzaneque et al., 1999; RodriguezManzaneque et al., 2002). Las tres GST de clase Omega de S. cerevisiae que se describen aquí también tienen una compartimetalización diferencial. Mientras que Gto1 es peroxisomal, Gto2 y Gto3 son citosólicas. Esta diferencia en la localización celular 134 Discusión podría estar relacionada con funciones biológicas diferentes. En el presente estudio se hace énfasis en la función biológica de la proteína Gto1. En el caso de las actividades enzimáticas de las GST Omega de S. cerevisiae, las tres proteínas son activas como tiol oxidoreductasas sobre el sustrato HED, empleando un mecanismo monotiólico. Así, en Gto2 la cisteína Cys46, presente en la región homóloga con el sitio activo de hGSTO1-1, es necesaria y suficiente para la actividad tiol oxidoreductasa de la molécula. La medida de la actividad de las Gto in vitro se correlaciona con las actividades detectadas In vivo. En el fondo genético utilizado en este estudio la actividad glutaredoxina endógena se debe en gran parte a la actividad de las enzimas ditiólicas Grx1 y Grx2 simultáneamente (70% aproximadamente), mientras que el aporte de las Gto a la actividad glutaredoxina total de la célula es menor en condiciones normales de crecimiento. Posiblemente la actividad de las proteínas Gto sólo se requiera para funciones celulares específicas que no necesiten niveles cuantitativamente elevados, o bien dicha actividad se induzca en situaciones ambientales especiales. Al igual que las enzimas de la familia tioredoxina, se ha descrito que las GST también responden frente al tratamiento con pro-oxidantes (Veal et al., 2002; Allocati et al., 2003; Leiers et al., 2003), de modo que la inducción de las GST bajo estas condiciones es una respuesta evolutivamente conservada de las células al estrés oxidativo. Esta respuesta frente a agentes oxidantes también se observa en las GST descritas en este trabajo, indicando que probablemente intervengan en menor o mayor medida en la defensa frente al estrés oxidativo. Así, la actividad de Gto2 se incrementa considerablemente después de un tratamiento con diamida. La actividad glutaredoxina intracelular basal baja detectada in vivo estaría relacionada con la participación en funciones que requerirían la regulación del estado redox de proteínas específicas. Esta función reguladora redox sobre algunas proteínas es también característica de las glutaredoxinas monotiólicas de S. cerevisiae (Rodriguez-Manzaneque et al., 2002; Fernandes y Holmgren, 2004). La localización peroxisomal de Gto1 en S. cerevisiae es importante dado que solo se han reportado dos GST de mamíferos localizadas en este organelo. Una ellas es humana y pertenece a la clase Kappa (Morel et al., 2004), mientras que la otra es microsomal y se ha detectado en los peroxisomas hepáticos de rata (Islinger et al., 2006). Analizando las secuencias homólogas de Gto1 presentes en otros hongos se observa que sólo las proteínas de especies muy cercanas a S. cerevisiae podrían tener localización peroxisomal. Esta sería, pues, una adquisición evolutiva muy reciente. 135 Discusión Otras proteínas que se localizan en los peroxisomas de S. cerevisiae son Lys 1 y Lys4, las cuales hacen parte de la vía de síntesis de la lisina; probablemente Lys12 también es peroxisomal ya que ha detectado en su secuencia una señal de localización tipo PTS2 (Breitling et al., 2002). En el caso del mutante ∆pex12, en el que existen deficiencias en la biogénesis de los peroxisomas, se sobrexpresan genes relacionados con la síntesis de la lisina, probablemente como parte de un mecanismo compensatorio. Además, los mutantes ∆pex5, ∆pex7 y ∆pex12 crecen normalmente en un medio sin este aminoácido, indicando que a pesar del defecto en la biogénesis de los peroxisomas se sigue sintetizando lisina posiblemente mediante una vía alternativa en el citosol (Breitling et al., 2002). En el caso del mutante ∆gto1, su crecimiento se ve afectado en parte cuando el medio de cultivo carece de lisina, además de tener una deficiencia general en el funcionamiento de los peroxisomas dado que no crece normalmente en un medio de cultivo con ácido oleico como única fuente de carbono. Sin embargo, los genes de la vía de síntesis de la lisina no están sobrexpresados en este mutante. Esto indicaría que la ausencia de Gto1 podría estar afectando la síntesis o la regulación de la concentración intracelular de este aminoácido debido a un defecto en la actividad de algunas proteínas peroxisomales. No se descarta, sin embargo, que el efecto de la ausencia de Gto1 sobre la síntesis de lisina sea indirecto. Además de la β−oxidación de ácidos grasos y la síntesis de lisina, los peroxisomas también participan en vías metabólicas como la síntesis de eterfosfolípidos, α-oxidación o el metabolismo del glioxilato, entre otras. Otra proteína que tiene una localización peroxisomal es la cistationina β-liasa en S. cerevisiae. La cistationina β-liasa, codificada por STR3 en esta levadura, es la única enzima de la vía de síntesis de aminoácidos sulfurados que se localiza en el peroxisoma (Gabaldón et al., 2006). Específicamente cataliza la conversión de la cistationina en homocisteína, paso intermedio de la transulfuración o síntesis de metionina a partir de cisteína (Figura 18). La relación entre la cistationina β-liasa y Gto1 posiblemente consistiría en la regulación del estado redox de una o varias cisteínas de Str3 mediante la actividad glutaredoxina de Gto1. La matriz del peroxisoma es un ambiente oxidante debido a la producción de H2O2, aniones superóxido y epóxidos resultantes de algunos procesos metabólicos que allí ocurren. Estos oxidantes podrían estar modificando el estado de oxidación de las cisteínas de las proteínas peroxisomales y por consiguiente su actividad biológica. Para contrarrestar este efecto podría existir un sistema que regulase el estado redox de estas proteínas en el peroxisoma, de modo que la oxidación de las cisteínas fuese un evento 136 Discusión reversible mediante procesos de glutationilación. La actividad de Str3 estaría regulada por su estado redox, el cual sería modificado por Gto1 mediante la actividad glutaredoxina de ésta. El análisis realizado en este trabajo indica que la Cys387 de Str3 está conservada en las cistationina β-liasas de otros hongos, que es importante para su actividad y que este residuo podría ser una diana para la regulación de Str3 mediante la actividad glutaredoxina de Gto1. La localización de Gto1 y Str3 en el peroxisoma posiblemente fue un evento paralelo que ocurrió después de la duplicación del genoma en el ancestro de los saccharomicetes, lo que permitió en la especialización funcional y la compartimentalización diferencial de las proteínas homólogas resultantes. Teniendo en cuenta esta idea, la actividad de Str3 se ve afectada en ausencia de Gto1, ya que el mutante ∆gto1 no crece normalmente cuando la cisteína o la cistationina son las únicas fuentes de azufre disponibles en el medio, además de resultar dicha mutación en la disminución de la concentración intracelular de GSH. Todos estos datos indican que los peroxisomas de S. cerevisiae están relacionados con la síntesis de aminoácidos que contienen azufre. El desbalance que existe en la vía de asimilación y fijación del azufre en el mutante ∆gto1 causa indirectamente alteraciones en el metabolismo de la serina y la treonina. Los resultados de este estudio muestran que en el mutante ∆gto1 la expresión de CHA1 (gen que codifica para una serina/treonina hidratasa que cataliza la conversión de la serina en piruvato y la treonina en 2-oxobutanoato) es superior comparada con la cepa silvestre. Esto causa que dicho mutante tenga concentraciones intracelulares bajas de ambos aminoácidos y que dependa del suministro externo presente en el medio de cultivo. Es importante recordar que la serina es importante para la síntesis de cisteína a partir de homocisteína y su déficit también afecta la concentración intracelular de GSH (Figura 35). Quizás la sobreexpresión de CHA1 tenga por finalidad evitar la acumulación excesiva de la cistationina, que puede resultar tóxica en S. cerevisiae (Figura 44). Dicha acumulación se produciría debido a una proteína Str3 defectuosa. La cistationina β-liasa de otras especies de levaduras evolutivamente relacionadas con S. cerevisiae como Candida glabrata, Kuyveromyces lactis y Ashbya gossypii también tienen una señal tipo PTS1, indicando que la participación de los peroxisomas en la transulfuración, al igual que en la síntesis de lisina, es también una especialización reciente de algunos hemiascomicetos. La razón por la que se localizan ciertos pasos de una vía metabólica en un organelo específico no se ha aclarado pero podría deberse a la toxicidad que tienen algunos metabolitos intermedios. Una evidencia 137 Discusión de ello puede ser que altas concentraciones de homocisteína y cisteína son tóxicas para S. cerevisiae (Kumar et al., 2006), lo cual no descarta que la cistationina también sea tóxica cuando se supera la concentración habitual de este compuesto en condiciones normales de crecimiento. Otro aspecto importante que se ha observado previamente es la diferencia en el pH del lumen peroxisomal entre levaduras y mamíferos. El pH es una condición importante para la actividad enzimática y se ha reportado que en los peroxisomas de mamíferos el pH está dentro del rango 6,9-7,1 el cual es similar al del citosol (Jankowski et al., 2001), mientras que en S. cerevisiae el interior peroxisomal es alcalino (pH 8,2) aunque en el citosol este valor es neutral (van Roermund et al., 2004). Esto indica que las células de levadura han desarrollado un sistema de gradiente de H+ para el correcto funcionamiento de los procesos metabólicos que allí se llevan a cabo, lo que también puede estar relacionado con la compartimentalización de un solo paso de ciertas rutas metabólicas como es el caso de la síntesis de lisina o la transulfuración. La presencia de una GST con actividad glutaredoxina en el peroxisoma lleva a la pregunta sobre la necesidad de internalizar GSH en este organelo. Se sabe poco acerca de la concentración de GSH que pueda haber dentro del peroxisoma y cómo se regula dicha concentración. Sin embargo, se ha reportado la presencia de GSH en los peroxisomas de la levadura Candida boidinii (Horiguchi et al., 2001) y en los peroxisomas de plantas (Churin et al., 1999). Además, se ha detectado la presencia de glutatión peroxidasas en peroxisomas de mamíferos (Schrader y Fahimi, 2004) y de plantas (del Rio et al., 2003), indicando que debe haber una cantidad mínima de GSH para el funcionamiento de estas enzimas y que debe existir un sistema de transporte y regulación del GSH peroxisomal. Recientemente se ha demostrado in vitro que la membrana de los peroxisomas de mamíferos permite el paso libre de moléculas hidrofílicas de pequeño tamaño como el glicolato y el ureato, pero es impermeable a cofactores de tamaño mayor como NAD/H, NADP/H o CoA (Antonenkov et al., 2004), lo cual implica la existencia de transportadores de metabolitos que faciliten la entrada de estos compuestos y de otros sustratos de enzimas peroxisomales. Mantener la concentración intracelular de GSH también es importante para S. cerevisiae, entre otras razones porque esta molécula interviene en la detoxificación del cadmio, el cual forma un congujado con el GSH que es expulsado del citosol hacia la vacuola (Li et al., 1997). La hipersensibilidad que presenta el mutante triple gtt1 gtt2 gto1 al cadmio resultaría de la suma de dos factores: la concentración baja de GSH generada por la falta de Gto1 y la ausencia de enzimas que favorezcan la formación del conjugado 138 Discusión Cd-GSH. Se ha observado en S. cerevisiae varios efectos relacionados con este hecho. Por un lado, el mutante ∆gsh1 (incapaz de sintetizar GSH) es hipersensible al cadmio y por otro la expresión de GTT2 en esta especie se induce hasta 25 veces después de tratar la cepa silvestre con Cd+2 (Fauchon et al., 2002). Además, en los mutantes ∆gtt1 y ∆gtt2 no se forma eficientemente el conjugado después de exponer las células a este metal, causando una hiperacumulación en el citosol que no compromete la supervivencia de los mutantes (Adamis et al., 2004). En el presente estudio hemos observado que el doble mutante ∆gtt1 ∆gtt2 no presenta una hipersensibilidad al Cd+2, aunque sí existe un efecto aditivo cuando en ausencia de Gtt1 y Gtt2 hay una concentración baja de GSH causada por la falta de Gto1. Otro aspecto importante respecto de la detoxificación mediada por GST es que la ausencia de Gtt2 afecta la detoxificación del NQO (4-nitroquinolona), ya que el mutante correspondiente ∆gtt2 es hipersensible a este compuesto. Sorprendentemente, el quíntuple mutante que carece tanto de las Gto como de las Gtt resulta ser menos sensible al NQO que el mutante ∆gtt2 aunque más sensible que la cepa silvestre y que los demás mutante evaluados en este estudio (Figura 37). El NQO y sus metabolitos forman aductos en los ácidos nucleicos, lo que conlleva una actividad carcinogénica que se ha observado previamente en modelos animales, además de sus efectos citotóxicos (Bailleul et al., 1989). Se ha visto en mamíferos que la coexpresión de los genes MRP1 o MRP2, que codifican para transportadores de membrana, junto con GSTP1-1 tiene un efecto sinérgico en la protección frente a los efectos citotóxicos y genotóxicos de la NQO, indicando que la formación y el transporte del conjugado con GSH (QO-SG) deben ocurrir simultáneamente para la correcta detoxificación de la NQO (Morrow et al., 1998). Además, se ha visto que Mrp1 no transporta NQO en ausencia de GSH y que el conjugado NQO-SG es transportado por Mrp1 con una eficiencia similar a la de otros sustratos (Peklak-Scott et al., 2005). A pesar de esta relación entre las GST y la detoxificación de la NQO, no queda claro el papel de las proteínas Gto en este proceso en S. cerevisiae, ya que la ausencia simultánea de los genes GTO y GTT reduce la sensibilidad a este compuesto; sin embargo, sí se puede deducir la importancia que tiene Gtt2 en la detoxificación de NQO en S. cerevisiae mediante su actividad GST. En resumen, este estudio muestra cómo el defecto en la función de una GST con actividad glutaredoxina (Gto1) causa una serie de fenotipos que probablemente son consecuencia de alteraciones en la vía de síntesis de aminoácidos que contienen azufre. Los genes que intervienen en esta vía están regulados por la concentración 139 Discusión intracelular de AdoMet y de cisteína mediante el factor de transcripción Met4 (Thomas y Surdin-Kerjan, 1997). Como se ha mencionado en el apartado 1.9.4., la actividad de Met4 es regulada por ubiquitinación y la proteína hace parte de dos complejos, Met4/Met28/Cbf1 y Met4/Met31/Met32, que reconocen secuencias o elementos específicos presentes en los promotores de los genes MET así como en los de algunos genes que intervienen en el metabolismo de los carbohidratos. Dichos genes se sobrexpresan en S. cerevisiae cuando existe un exceso de homocisteína o cisteína en el medio de cultivo (Kumar et al., 2006). Los genes que tienen un nivel de expresión menor en el mutante ∆gto1 contienen uno o los dos elementos reconocidos por los complejos inductores de la transcripción (Tabla 4). Es interesante observar en estos resultados que genes como MUP1, GAP1, SAM3 y SER3, los cuales no intervienen directamente en la síntesis de metionina y cisteína, también tienen las secuencias que pueden ser reconocidas por dichos complejos. La expresión baja de estos genes no concuerda con la baja concentración de cisteína, que a su vez resulta en una concentración intracelular baja de GSH en el mutante ∆gto1. Esto señalaría que este mutante estaría acumulando otro metabolito intermedio y que dicha acumulación afectaría la transcripción de los genes necesarios para la síntesis de cisteína y metionina así como la captación de estos aminoácidos del medio. Como se ha mencionado anteriormente, la falta de Gto1 puede estar afectando la actividad de la cistationina β-liasa generando una acumulación de cistationina intracelular. Ello nos lleva a sugerir que la cistationina podría ser también un regulador de la transcripción de estos genes, aunque sea necesario hacer estudios más profundos sobre esta posible regulación. Aunque en este trabajo se ha llevado a cabo una aproximación sobre la posible función biológica de Gto1, es importante abarcar otros aspectos para determinar la relación entre las funciones que regulan el estado redox de las proteínas peroxisomales mediadas por Gto1 y la vía del metabolismo de la cisteína y la metionina. Determinar el estado redox de las cisteínas de algunas de las proteínas peroxisomales que posiblemente están alteradas por la ausencia de Gto1 es una de las tareas pendientes que pueden proporcionar información interesante sobre los interrogantes que este trabajo ha abierto. La determinación de los blancos de acción de las otras dos proteínas Gto, en este caso de localización citosólica, son otra línea de estudio abierta. 140 6. CONCLUSIONES 141 Conclusiones 6. CONCLUSIONES De los estudios realizados durante este trabajo se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. S. cerevisiae tiene tres GST de clase Omega denominadas Gto1, Gto2 y Gto3, las cuales presentan las actividades enzimáticas típicas de esta clase de enzimas, esto es poseer una actividad tiol transferasa elevada, una actividad conjugante de glutatión muy baja o nula, actividad dehidroascorbato reductasa y dimetilarsonato reductasa. 2. La actividad tiol oxidoreductasa de las tres Gto de S. cerevisiae detectada in vitro se manifiesta también in vivo, aunque el grado de esta actividad es diferente para cada una de ellas. 3. La cisteína localizada en la posición 46 de la proteína Gto2 es necesaria y suficiente para la actividad tiol oxidoreductasa de esta enzima. 4. La expresión de los genes GTO de S. cerevisiae se induce por estrés oxidativo, aunque con patrones diferentes para los tres genes, y la dependencia de esta expresión de los factores de transcripción Yap1, Msn2 y Msn4 está relacionada con la presencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. 5. Gto1 junto con Gtt1 y Gtt2 protegen de manera cooperativa contra la toxicidad del cadmio en S. cerevisiae. Además, Gtt2 es importante para la detoxificación del compuesto genotóxico 4-nitroquinolona (NQO) en esta especie. 6. La proteína Gto1 tiene localización peroxisomal mientras que las proteínas Gto2 y Gto3 son citosólicas. Además, solamente los homólogos para Gto1 en especies cercanas a S. cerevisiae tienen una señal de localización peroxisomal de tipo PTS1 en la región C-terminal. 7. En S. cerevisiae la concentración intracelular de glutatión reducido en el mutante ∆gto1 es menor que en la cepa silvestre. Esta deficiencia explica la sensibilidad del triple mutante ∆gtt1 ∆gtt2 ∆gto1 al cadmio. 143 Conclusiones 8. El mutante ∆gto1 de S. cerevisiae muestra crecimiento defectuoso cuando utiliza ácido oleico como única fuente de carbono, lo que se relaciona con deficiencias en el funcionamiento de los peroxisomas en este mutante. 9. La falta de la proteína Gto1 en S. cerevisiae causa una reducción de la expresión de diversos genes implicados en la vía de síntesis de aminoácidos que contienen azufre, así como de genes involucrados en el transporte de metionina y S-adenosil metionina a la célula. 10. En el mutante que carece de Gto1 se sobrexpresa el gen CHA1 causando la reducción de serina y treonina intracelulares. 11. El mutante ∆gto1 de S. cerevisiae utiliza deficientemente la cistationina o la cisteína como únicas fuentes de azufre debido a que en este mutante la actividad cistationina β-liasa de la proteína Str3 está afectada. 12. La cisteína localizada en la posición 387 de la proteína Str3 de S. cerevisiae es importante para su actividad cistationina β-liasa y podría ser blanco de regulación redox por Gto1 mediante su actividad tiol oxidoreductasa. 144 7. ABREVIATURAS 145 Abreviaturas 7. ABREVIATURAS AD APS CDNB CRIDS DCNB DMAR DHAR GFP GPx Glr GSH GSSG GST HCCI HED 4-HNE IL-1 MBP NADPH NQO PBDs ROS r.p.m. TCHQD Enfermedad de Alzheimer Adenil-sulfato 1-cloro-2,4-dinitrobenceno Fármacos inhibidores de la liberación de citoquinas Dicloronitrobenceno dimetilarsenato reductasa dehidroascorbato reductasa Proteína verde fluorescente peroxidasa dependiente de glutatión glutatión reductasa L-γ-glutamil L-cisteinil-glicina o glutatión glutatión oxidado Glutatión transferasa(s) ácido 2-hidroxicromeno-2-carboxilico isomerasas 2-hidroxietildisulfuro 4-hidroxinonenal Interleucina-1 Proteína de unión a maltosa (Maltosa Binding Protein) Nicotinamida-Adenina Dinucleótido Fosfato 4-nitroquinolona-1-óxido Desórdenes en la Biogénesis de los Peroxisomas Especies Reactivas de Oxígeno Revoluciones por minuto tertaclorohidroquinona deshalogenasa 147 8. BIBLIOGRAFÍA 149 8. BIBLIOGRAFÍA Adamis, P. D., Gomes, D. S., Pinto, M. L., Panek, A. D. y Eleutherio, E. C. 2004. 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