DEPARTAMENT DE VIROLOGIA VARIABILIDAD GENÉTICA Y EVOLUCIÓN DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS (CTV) EN PROCESOS DE TRANSMISIÓN. PATRICIA MOYA GAY UNIVERSITAT DE VALÈNCIA Servei de Publicacions 2010 Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a València el dia 9 de juliol de 2010 davant un tribunal format per: Dra. Amparo Latorre Castillo Dr. Miguel Aranda Regules Dra. Carmen Hernández Fort Dra. Mª Ángeles Ayllón Talavera Dr. Luis Rubio Miguélez Va ser dirigida per: Dr. Pedro Moreno Gómez Dr. José Guerri Sirera ©Copyright: Servei de Publicacions Patricia Moya Gay Dipòsit legal: V-2065-2011 I.S.B.N.: 978-84-370-7925-7 Edita: Universitat de València Servei de Publicacions C/ Arts Gràfiques, 13 baix 46010 València Spain Telèfon:(0034)963864115 Variabilidad genética y evolución del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en procesos de transmisión Patricia Moya Gay facultat de ciéncies biológiques departament de genética valencia , 2010 1 Facultat de Ciències Biològiques Departament de Genètica VARIABILIDAD GENÉTICA Y EVOLUCIÓN DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS (CTV) EN PROCESOS DE TRANSMISIÓN Memoria presentada por: Patricia Moya Gay Directores: Pedro Moreno Gómez José Guerri Sirera 2 D. Pedro Moreno Gómez, Dr. Ingeniero Agrónomo y Profesor de Investigación del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias y D. José Guerri Sirera, Dr. en Ciencias Biológicas y Profesor de Investigación del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. CERTIFICAN: Que Patricia Moya Gay ha realizado bajo su dirección el trabajo que con el título “Variabilidad genética y evolución del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en procesos de transmisión”, presenta para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas. D. Andrés Moya Simarro, Catedrático del Departament de Genètica de la Universitat de València y director del Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva avala como tutor la presentación y defensa de este trabajo como Tesis Doctoral. Para que así conste a los efectos oportunos, firma el presente certificado en Burjassot a Dr. Pedro Moreno Gómez Dr. José Guerri Sirera Dr. Andrés Moya Simarro 3 RESUMEN Variabilidad genética y evolución del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) en procesos de transmisión Los aislados de CTV están formados generalmente por una mezcla de variantes de secuencia, en ocasiones alejadas filogenéticamente, que se generan mediante procesos de mutación y recombinación. Su frecuencia en la población viral es el resultado de distintas presiones selectivas y de fenómenos de migración y deriva genética, estos últimos generalmente asociados a los procesos de transmisión. Se sabe que éstos suponen un cuello de botella para la población viral y pueden provocar alteraciones de ésta, en ocasiones asociadas con cambios en la patogenicidad del aislado transmitido, lo que puede tener consecuencias epidemiológicas importantes. El objetivo general de esta tesis era analizar por separado el efecto de diversos factores de los procesos de transmisión sobre la estructura poblacional y la diversidad genética de distintos aislados del virus. En primer término se analizó el efecto de la transmisión por pulgón transmitiendo los aislados T388 y T385 con un número mínimo de pulgones. La transmisión del aislado virulento T388 ocurrió con una eficiencia igual o inferior al 10% y fue preciso utilizar al menos 10 pulgones por planta receptora, mientras que el aislado avirulento T385 no pudo transmitirse ni siquiera con 50 pulgones/planta. Excepto por un cambio nucleotídico en el gen p33 en una de las plantas receptoras inoculada con el aislado T388, las secuencias consenso del resto de genes analizados fueron idénticas a las de las plantas donantes y el aislado de colección, y los síntomas inducidos por todas ellas en lima Mexicana fueron indistinguibles. El injerto es la forma habitual de transmisión de virus de cítricos, y al igual que la transmisión por pulgón supone un cuello de botella que puede reducir el tamaño efectivo de la población y dar lugar a un efecto fundador al establecerse en la planta sana una nueva población que no representa necesariamente la original. Se analizó en primer lugar el efecto de la transmisión por injerto entre plantas de una misma especie huésped en la estructura poblacional y diversidad genética del aislado T388. Para ello se transmitió a plantas sanas de cítricos de la misma variedad utilizando como inóculo 1, 2, 4 o 6 trozos de corteza de la planta donante, asumiendo una proporcionalidad entre el número de éstos y el tamaño efectivo de la población, ya que en el sistema CTV-cítricos no es posible estimar éste de forma fiable como se ha hecho en otros sistemas virus-planta. De nuevo encontramos una gran estabilidad y no se observaron cambios llamativos en la estructura poblacional ni en la diversidad nucleotídica de los genes analizados, con independencia del número de injertos utilizados o del tiempo transcurrido desde la inoculación. Se observaron en las plantas inoculadas algunas variantes de secuencia que diferían en muy pocos nucleótidos de la variante mayoritaria y que generalmente no llegaban a fijarse en la población viral, pero dos de ellas fueron predominantes en algunas poblaciones, sugiriendo que podían ser tan eficientes como la variante mayoritaria de la planta donante. 4 Una vez comprobado que la inoculación por injerto a plantas sanas de la misma variedad no afectaba de forma sustancial la estructura y diversidad genética de la población viral se estudió si la transmisión por injerto a diferentes especies y variedades comerciales de cítricos propagadas sobre citrange Carrizo que es el patrón predominante en la citricultura española, podía inducir cambios en ésta. Para ello se inocularon variedades de naranjo dulce, mandarino y pomelo con los aislados de CTV T388 y T385. Aunque no observamos cambios significativos en la diversidad nucleotídica de los genes analizados, la estructura poblacional de estos genes se vio alterada en plantas de naranjo Berna inoculadas con T385 y en plantas de pomelo inoculadas con cualquiera de los aislados. Esta alteración fue debida a la aparición de nuevas variantes de secuencia que diferían en escasos nucleótidos de las variantes mayoritarias y que en ocasiones llegaban a predominar en la población, indicando una mejor adaptación de la variante seleccionada a las condiciones específicas del huésped. Finalmente, la disponibilidad del aislado clonal T36-947 de CTV, obtenido a partir de un clon infeccioso del genoma completo del aislado T36 de Florida se utilizó para el estudio de la variación genética de novo en distintos huéspedes a lo largo del tiempo. Para ello se efectuaron pases sucesivos por injerto de dicho aislado desde su huésped original (lima Mexicana) a plantas de semilla de lima Mexicana, naranjo dulce Pineapple y pomelo Duncan, que son huéspedes susceptibles, y a naranjo amargo Común, que presenta una resistencia inicial a la infección y acumula menos virus que los demás huéspedes. Mientras que las poblaciones analizadas en los huéspedes susceptibles presentaron una elevada estabilidad, los pases sucesivos en el huésped naranjo amargo, dieron lugar a cambios importantes en la población viral con un elevado incremento de la diversidad nucleotídica debido a la aparición de variantes de secuencia muy divergentes de la de T36-947. Dichas variantes presentaban una estrecha relación filogenética con la secuencia predominante de los aislados T388 y T385, lo que sugiere que la evolución de CTV podría seguir el modelo de paisajes adaptativos de Wright, en el que los tres genotipos hallados representarían picos de eficiencia biológica. La detección de una serie de secuencias minoritarias cuya posición filogenética se sitúa entre los tres genotipos principales avala la idea de una evolución entre el genotipo original T36947 y los otros dos detectados para intentar adaptarse al huésped. Asimismo la detección de secuencias recombinantes que incluyen a los genotipos T36-947, T388 y T385 como parentales apoya la presencia y replicación de más de un genotipo en una misma célula de naranjo amargo. La inoculación de huéspedes susceptibles como el naranjo dulce o la lima Mexicana a partir de las plantas de naranjo amargo pusieron de manifiesto la progresiva pérdida de infectividad de la población viral mantenida en naranjo amargo, debido en parte al bajo título viral de CTV en este huésped. Más aún, cuando se propagaron yemas de lima Mexicana sobre estas mismas plantas de naranjo amargo, fue imposible detectar el virus en los brotes de lima, lo que sugiere la posibilidad de que, además del bajo título viral en naranjo amargo, algún factor del huésped pudiese dificultar el paso desde el floema de naranjo amargo al de lima. 5 INTRODUCCIÓN GENERAL ......................................................................................10 1. GENERALIDADES SOBRE LOS VIRUS.................................................................11 2. VARIABILIDAD GENÉTICA Y EVOLUCIÓN DE LOS VIRUS..................................11 2.1. Variabilidad en los virus de RNA y la teoría de las cuasiespecies ....................12 2.2. Fuentes de variación genética ......................................................................... 12 2.2.1. Mutación................................................................................................... 12 2.2.2. Recombinación......................................................................................... 13 2.2.3. Reordenamiento génico............................................................................ 14 2.3. Factores que determinan la estructura genética de las poblaciones virales..... 14 2.3.1. Deriva genética......................................................................................... 14 2.3.2. Selección.................................................................................................. 15 2.3.3. Migración ó flujo genético ......................................................................... 15 3. EL CULTIVO DE LOS CÍTRICOS ...........................................................................16 3.1. Importancia económica ................................................................................... 16 3.2. Prácticas culturales de la citricultura y sus repercusiones en la sanidad del cultivo..................................................................................................................... 16 4. LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS..........................................................................17 4.1. Gama de huéspedes y síntomas ..................................................................... 18 4.2. El virus de la tristeza de los cítricos (Citrus tristeza virus, CTV) ...................... 20 4.2.1. Organización genómica de CTV ............................................................... 21 4.2.2. Expresión del genoma viral....................................................................... 23 4.2.3. Métodos de diagnóstico y caracterización ................................................ 25 4.3. Variabilidad genética de CTV .......................................................................... 27 4.4. Transmisión..................................................................................................... 29 4.4.1. Transmisión por pulgón............................................................................ 29 4.5. Control de la enfermedad ................................................................................ 32 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS.................................................................................34 MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................37 1. AISLADOS DE CTV ................................................................................................38 2. DETECCIÓN DEL VIRUS .......................................................................................38 3. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN DE CTV .................................................................39 3.1. Extracción de ácidos nucleicos........................................................................ 39 3.2. Retrotranscripción y amplificación de cDNA .................................................... 39 3.3. Análisis de las poblaciones mediante polimorfismo conformacional de DNA de simple cadena (SSCP) ...................................................................................... 40 6 4. ESTIMACIÓN DE LA VARIABILIDAD DE LAS POBLACIONES DE CTV ...............41 4.1. Clonación de los genes ................................................................................... 41 4.2. Análisis de clones mediante SSCP y secuenciación de distintos haplotipos.... 41 5. ANÁLISIS DE SECUENCIAS ..................................................................................42 6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .......................................................................................43 CAPÍTULO I: EFECTO DE LA TRANSMISIÓN POR PULGÓN EN LA ESTRUCTURA POBLACIONAL DE CTV....................................................................45 I.1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................46 I.2. DISEÑO EXPERIMENTAL....................................................................................47 I.2.1. Plantas donantes y receptoras ...........................................................................47 I.2.2. Cría de pulgones y método de transmisión de CTV ...........................................47 I.3. RESULTADOS......................................................................................................48 I.3.1. Ensayos de transmisión con un pulgón ..............................................................48 I.3.2. Ensayos de transmisión con 10 pulgones ..........................................................48 I.3.3. Análisis de la población de CTV en las plantas inoculadas por pulgón...............48 I.3.4. Caracterización biológica ...................................................................................52 I.4. DISCUSIÓN ..........................................................................................................52 CAPÍTULO II: TRANSMISIÓN POR INJERTO A LA MISMA ESPECIE HUÉSPED: EFECTO DEL NÚMERO DE INJERTOS EN LA EVOLUCIÓN Y ESTRUCTURA DE LA NUEVA POBLACIÓN VIRAL .................................................................................55 II.1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................56 II.2. DISEÑO EXPERIMENTAL ..................................................................................57 II.3. RESULTADOS.....................................................................................................57 II.3.1. Análisis de SSCP de las poblaciones virales............................................... 57 II.3.2. Examen de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de los haplotipos................................................. 59 II.3.3. Estimación de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas..... 62 II.3.3.1. Relaciones filogenéticas entre las variantes de secuencias................... 62 II.3.3.2. Análisis de la variabilidad nucleotídica y aminoacídica de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas ........................................................................... 64 II.3.3.3. Variación genética dentro de y entre las poblaciones.....................................68 II.4. DISCUSIÓN .........................................................................................................75 7 CAPÍTULO III: TRANSMISIÓN DE CTV POR INJERTO A DISTINTAS ESPECIES COMERCIALES DE CÍTRICOS: EFECTO DEL CAMBIO DE HUÉSPED EN LA ESTRUCTURA DE LA POBLACIÓN VIRAL................................................................80 III.1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................81 III.2. DISEÑO EXPERIMENTAL .................................................................................82 III.3. RESULTADOS....................................................................................................82 III.3.1. Análisis de SSCP de las poblaciones virales...............................................82 III.3.2. Estimación de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de los haplotipos................................................. 84 III.3.3. Estimación de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas..... 85 III.3.3.1. Relaciones filogenéticas entre las variantes de secuencia.................... 85 III.3.3.2. Análisis de la variabilidad nucleotídica y aminoacídica de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas ........................................................................... 92 III.3.3.3. Variación genética dentro y entre de las poblaciones ........................... 98 III.4. DISCUSIÓN ......................................................................................................108 CAPÍTULO IV: TRANSMISIÓN DE UNA POBLACIÓN CLONAL DE CTV POR INJERTO A DISTINTAS ESPECIES SUSCEPTIBLES Y A UN HUÉSPED PARCIALMENTE RESISTENTE ...............................................................................113 IV.1. INTRODUCCIÓN..............................................................................................114 IV.2. DISEÑO EXPERIMENTAL................................................................................115 IV.3. RESULTADOS .................................................................................................116 IV.3.1. Análisis de SSCP de las poblaciones virales en los huéspedes susceptibles ......................................................................................................... 116 IV.3.2. Examen de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas de los huéspedes susceptibles mediante análisis de los haplotipos117 IV.3.3. Estimación de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas de los huéspedes susceptibles mediante análisis de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas.............................................................................. 120 IV.3.3.1. Relaciones filogenéticas entre las variantes de secuencias ............... 120 IV.3.3.2. Análisis de la variabilidad nucleotídica y aminoacídica de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas .................................................................... 121 IV.3.3.3. Variación genética dentro de y entre las poblaciones......................... 122 IV.3.4. Análisis de SSCP de las poblaciones virales en el huésped parcialmente resistente naranjo amargo.................................................................................... 129 8 IV.3.5. Estimación de la variabilidad genética de p20 en las poblaciones seleccionadas del huésped parcialmente resistente mediante análisis de los haplotipos............................................................................................................. 130 IV.3.6. Estimación de la variabilidad genética de p20 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas... 133 IV.3.6.1. Relaciones filogenéticas entre las variantes de secuencia ................. 133 IV.3.6.2. Variación genética y presiones selectivas en los cuatro linajes del huésped parcialmente resistente...................................................................... 135 IV.3.6.3. Análisis de los posibles eventos de recombinación en el huésped parcialmente resistente .................................................................................... 138 IV.3.6.4. Análisis de las secuencias minoritarias en el huésped parcialmente resistente.......................................................................................................... 139 IV.3.7. Análisis de SSCP de las poblaciones virales en el huésped parcialmente resistente tres años después del inicio del experimento....................................... 143 IV.3.8. Estudio de la infectividad de CTV a partir del huésped parcialmente resistente ............................................................................................................. 144 IV.4. DISCUSIÓN......................................................................................................147 DISCUSIÓN GENERAL ............................................................................................155 CONCLUSIONES GENERALES...............................................................................163 BIBLIOGRAFÍA .........................................................................................................166 APÉNDICES .............................................................................................................192 9 INTRODUCCIÓN GENERAL 10 INTRODUCCIÓN GENERAL 1. GENERALIDADES SOBRE LOS VIRUS Los virus son microorganismos sencillos formados por una o más moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), encapsidadas en una cubierta proteica y en ocasiones protegidos por una envuelta exterior, que suelen transmitirse horizontalmente entre huéspedes, y que necesitan de la maquinaria de síntesis proteica de la célula invadida para replicar su material genético y producir nuevas copias del virus original. Este proceso puede perjudicar a la célula huésped hasta destruirla. Los virus infectan tanto células eucarióticas como procarióticas (revisado en Hull, 2002). En la actualidad hay descritos más de 1000 virus de plantas clasificados en 14 familias y 70 géneros, lo que refleja la gran variabilidad existente entre los mismos. Los genomas virales presentan gran variación en su composición, estructura y estrategia de replicación. Pueden ser de DNA o RNA, de cadena sencilla o de cadena doble, y circulares o lineales. También pueden presentar genomas segmentados o multipartitos. Los genomas de RNA de cadena sencilla pueden ser de orientación positiva (+), lo que significa que sirven como RNA mensajero, o de orientación negativa (-), en cuyo caso necesitan de una RNA polimerasa viral para sintetizar la cadena complementaria que sirva como mensajero (Fauquet y Fargette 2005). Aproximadamente el 75% de los virus de plantas tienen genoma de RNA monocatenario y orientación positiva. 2. VARIABILIDAD GENÉTICA Y EVOLUCIÓN DE LOS VIRUS Los virus con genoma de RNA son capaces de variar y evolucionar más rápidamente que los de DNA, debido a que las RNA polimerasas RNA dependientes presentan una tasa de error mayor que las DNA polimerasas DNA dependientes, a consecuencia de la ausencia (o muy baja actividad) de las funciones correctoras y reparadoras (Domingo y Holland, 1997). Este hecho, junto con una rápida multiplicación viral y grandes tamaños poblacionales, permiten generar numerosos mutantes que difieren en uno o más nucleótidos en un tiempo corto, lo que permite una rápida evolución viral. El estudio de la variabilidad genética y de la evolución de las poblaciones es importante para distintas áreas de la biología. En los virus de plantas, el conocimiento de su evolución es esencial para el desarrollo de estrategias estables de control, ya que en muchos casos las metodologías de control utilizadas no son efectivas debido a la diversidad genética de las poblaciones virales y a su capacidad para evolucionar rápidamente (García-Arenal y McDonald 2003). Esta capacidad de variación les proporciona gran facilidad para adaptarse a nuevas situaciones, lo que puede conducir a la aparición de nuevas variantes con distinta sintomatología o con capacidad para infectar nuevos huéspedes. A pesar de los datos sobre variabilidad de virus de plantas generados en los últimos años, que han ayudado a entender algunos de los factores evolutivos que modelan las poblaciones virales, la información que poseemos sobre dichos factores es todavía limitada. 11 INTRODUCCIÓN GENERAL 2.1. Variabilidad en los virus de RNA y la teoría de las cuasiespecies Las primeras pruebas de la variación genética en virus de plantas se remontan a 1926 (Kunkel, 1947) y corresponden a observaciones que sugerían la posibilidad de aislar variantes con diferente sintomatología a partir de una misma fuente de virus. Desde estas observaciones iniciales, numerosos estudios han puesto de manifiesto que los genomas de RNA no existen como una secuencia única de nucleótidos, sino que hay un gran número de variantes de secuencia a partir de las cuales se puede obtener una secuencia consenso o promedio. Esta estructura genética ha sido denominada con el término de cuasiespecie (Eigen, 1993). Éste término, fue acuñado por Eigen, Schuster y colaboradores para referirse a las primeras estructuras autoreplicativas (Eigen y Schuster, 1981). Tales formas se corresponderían con replicones de corta longitud y alta mutación. Estas dos propiedades han llevado a algunos investigadores a pensar que los virus de RNA podrían estar sujetos a las reglas evolutivas de las cuasiespecies, diferentes a las formas de vida basadas en DNA (con tamaños genómicos mayores y tasas de mutación más bajas). Las poblaciones de tales estructuras poseerían también una alta tasa de mutación que conduciría a la existencia de una mezcla compleja de genomas relacionados, que se comportarían como una unidad de selección. La distribución de variantes en las cuasiespecies no es arbitraria sino que se centra en torno a una secuencia maestra que es la de mayor eficacia biológica. Esta secuencia puede ser sustituida rápidamente a causa de las perturbaciones a las que se ven sometidas las poblaciones virales en condiciones naturales, o bien permanecer en equilibrio y mostrar estabilidad evolutiva durante largos periodos de tiempo cuando las cuasiespecies están muy adaptadas (Domingo y Holland, 1994). Aunque el concepto de cuasiespecies ha sido cuestionado por investigadores en genética de poblaciones (Domingo, 2002; Holmes y Moya, 2002) y el término se ha utilizado con frecuencia sin tener en cuenta algunas implicaciones de la teoría (Domingo et al., 2006) indudablemente ha contribuido a la comprensión de la naturaleza heterogénea de las poblaciones virales. 2.2. Fuentes de variación genética En los virus, los mecanismos que generan variación genética son la mutación, la recombinación y el reordenamiento génico. 2.2.1. Mutación La mutación es el proceso por el cual nucleótidos que no están presentes en la secuencia molde son incorporados en la cadena hija durante la replicación, y es la principal fuente de variación de las poblaciones. Este proceso incluye tanto mutaciones puntuales como inserciones o supresiones. Las mutaciones puntuales se deben principalmente a la ausencia de actividad correctora de las RNA polimerasas RNA dependientes y pueden ser de dos tipos: transiciones (una base púrica o pirimidínica es substituida por otra del mismo tipo) y transversiones (una base púrica es substituida por una pirimidínica o viceversa). Las primeras son más frecuentes que las segundas. Las substituciones en regiones 12 INTRODUCCIÓN GENERAL codificantes pueden ser sinónimas (no dan lugar a un cambio de aminoácido) o no sinónimas (producen un cambio de aminoácido). Las inserciones y supresiones son menos frecuentes en regiones codificantes, en las que suelen tener efectos deletéreos, ya que pueden dar lugar a un cambio en la pauta de lectura si la ganancia o pérdida de nucleótidos no es múltiplo de tres. La tasa de mutación de una población es el número de incorporaciones erróneas por nucleótido y ronda de replicación, y la frecuencia de mutación observada, es la frecuencia con la que se observa un tipo particular de mutación (o mutante) en esa población. Estas dos variables pueden ser muy diferentes, debido a que una fracción desconocida de los mutantes generados es deletérea y puede ser eliminada de la población por selección. Las estimaciones de la tasa de mutación para virus de RNA que infectan mamíferos oscilan entre 10-3 y 10-5 incorporaciones erróneas por nucleótido y ronda de replicación, lo que resulta en aproximadamente un error por genoma y ciclo replicativo (Drake y Holland, 1999). Una estimación de la tasa de mutación de un virus de plantas, Tobacco mosaic virus (TMV), indica que dicha tasa es similar a la de los virus de RNA de mamíferos (Malpica et al., 2002). Las elevadas tasas de mutación de los virus de RNA pueden reflejar una estrategia adaptativa, aunque esta propiedad también conlleva algunos costes como una elevada proporción de mutantes deletéreos y la pérdida de infectividad, fenómenos que pueden conducir a una rápida extinción de la población (Holland et al., 1990). Aunque se ha postulado que las altas tasas de mutación son una adaptación para poder evolucionar rápidamente, muchos virus de RNA presentan gran estabilidad genética. Las frecuencias de mutación estimadas para virus de RNA varían mucho en función del virus estudiado, por ejemplo, los Tobamovirus presentan una gran estabilidad (Rodríguez-Cerezo et al., 1991) mientras que los Cucumovirus son más variables (revisado en Roossinck, 1997). Es decir, aunque las poblaciones virales tengan la capacidad intrínseca de variar pueden ser sistemas genéticos muy estables. Se ha observado una relación entre la variación que presentan los virus y la gama de huéspedes que infectan. En general las frecuencias de mutación más altas corresponden a virus que pueden infectar muchos huéspedes diferentes (Roossinck, 1997). Asimismo se han encontrado diferencias en las frecuencias de mutación en distintas regiones de un mismo genoma de RNA. 2.2.2. Recombinación Otro mecanismo capaz de generar diversidad es la recombinación, proceso mediante el cual se intercambian segmentos de información genética entre las cadenas nucleotídicas de diferentes variantes de secuencia durante el proceso de replicación. Análisis de secuencias de virus de plantas con genomas de RNA o de DNA indican que la recombinación puede ser una fuente de variación relevante para la evolución de ciertos géneros (Roossinck, 1997; García-Arenal et al., 2001; Chare y Holmes, 2006). La recombinación puede generar cambios en las propiedades biológicas de los virus con importantes consecuencias epidemiológicas, incluyendo la aparición de cepas con capacidad para infectar nuevos huéspedes (Fernández-Cuartero et 13 INTRODUCCIÓN GENERAL al., 1994). Se han detectado evidencias de recombinación en Luteovirus, Nepovirus, Bromovirus, Cucumovirus, Potyvirus, Begomovirus (Sanz et al., 1999, 2000; NavasCastillo et al., 2000; Moreno et al., 2004; Bonnet et al., 2005, García-Andrés et al., 2006; Escriu et al., 2007), y en muchos otros sistemas virales se han detectado eventos de recombinación para la formación de RNAs defectivos. En Citrus tristeza virus (CTV) se ha encontrado recombinación homóloga en distintos genes (Mawassi et al., 1996; Vives et al., 1999, 2005; Rubio et al., 2001; Sambade et al., 2003; Martín et al., 2009) y la recombinación heteróloga para formar RNAs defectivos es muy frecuente (Guerri et al., 1991; Mawassi et al., 1995a, b, 2000; Yang et al. 1997; Ayllón et al., 1999; Che et al., 2002, 2003), sugiriendo que puede ser un mecanismo importante en su evolución. La existencia de frecuentes eventos de recombinación puede explicar en parte la alta variación biológica y molecular encontrada entre distintos aislados de CTV (Roistacher y Moreno, 1991; Ballester-Olmos et al., 1993; Martín et al., 2009). Si los datos sobre tasas de mutación en virus de plantas son escasos, la información disponible sobre frecuencia de recombinación en ausencia de selección es aún más reducida (Fraile et al., 1997). 2.2.3. Reordenamiento génico El reordenamiento génico puede tener lugar mediante la reagrupación de segmentos genómicos procedentes de aislados diferentes en virus con genomas bipartitos o multipartitos. Este fenómeno se ha descrito en poblaciones naturales de virus de plantas (Bonnet et al., 2005, Escriu et al., 2007) y puede desempeñar un papel importante en la evolución viral. 2.3. Factores que determinan la estructura genética de las poblaciones virales La distribución de las variantes generadas mediante mutación o intercambio genético en las poblaciones virales dependerá principalmente de tres tipos de procesos evolutivos: la deriva genética, la selección (revisado en Domingo y Holland 1994; García-Arenal et al., 2001) y la migración ó flujo genético. 2.3.1. Deriva genética Cuando el tamaño de una población es insuficiente para asegurar que cada variante de la misma tenga descendencia en la siguiente generación, la transmisión de los rasgos genéticos a las nuevas generaciones puede alterarse por factores aleatorios. Este proceso de cambio se conoce con el nombre de deriva genética. Aunque los virus de plantas suelen alcanzar grandes tamaños poblacionales, el número de individuos susceptibles de transmitir sus genes a una nueva generación (tamaño poblacional efectivo) puede ser reducido, debido a que una parte de la población sean mutantes que no se multiplican o que tengan baja infectividad. Lógicamente es el tamaño poblacional efectivo y no el tamaño total de la población el que determina la evolución de la población viral. Además la infección a un nuevo huésped puede comenzar a partir de un número muy bajo de partículas virales, lo 14 INTRODUCCIÓN GENERAL que reduce todavía más el tamaño poblacional efectivo. Los cuellos de botella en la población viral pueden ocurrir en distintos momentos de su ciclo vital, por ejemplo, al entrar o salir de los tubos cribosos en la infección sistémica de la planta (Sacristán et al., 2003; Li y Roossinck, 2004), en la transmisión por vector (Ali et al., 2006) o injerto a una nueva planta o al colonizar una nueva área geográfica. Estos cuellos de botella conducen a un modo de deriva genética llamada efecto fundador, que tiene lugar cuando una población nueva se inicia con un número pequeño de genotipos seleccionados al azar, disminuyendo la diversidad dentro de la población e incrementándola entre poblaciones (García-Arenal y Palukaitis, 1999). Cuellos de botella sucesivos, pueden provocar que el tamaño poblacional efectivo se encuentre por debajo del umbral necesario para asegurar la transmisión de los genotipos más eficaces, y la población sufra un pérdida progresiva de eficacia biológica en un proceso conocido como “Trinquete de Muller”, que puede incluso conducir a su extinción (Chao, 1990; Duarte et al., 1992; de la Peña et al., 2000; de la Iglesia y Elena 2007). 2.3.2. Selección La selección es el proceso direccional por el cual, variantes que están bien adaptadas a un cierto ambiente aumentarán su frecuencia en una población (selección positiva), mientras que otras menos apropiadas disminuirán la suya (selección negativa) (Freeman y Herron, 2002). En muchas ocasiones los efectos de la selección y de la deriva son difíciles de diferenciar, porque la selección también da lugar a una disminución de la diversidad dentro de la población viral y a un aumento de ésta entre poblaciones. Los análisis de las secuencias virales muestran en la mayoría de los casos una selección en contra del cambio de aminoácidos. La intensidad de esta selección puede estimarse mediante el cociente entre los cambios no sinónimos por posición no sinónima y los cambios sinónimos por posición sinónima (dNS/dS). Los valores de este cociente para genes que codifican proteínas estructurales y no estructurales de virus de plantas, con genoma de RNA o DNA, son generalmente inferiores a 1, indicando que son más probables los cambios sinónimos que los no sinónimos (García-Arenal et al., 2001). 2.3.3. Migración ó flujo genético Desde un punto de vista evolutivo la migración o flujo génico es el movimiento de alelos entre poblaciones. Las tasas de migración entre poblaciones varían mucho según el organismo analizado dependiendo de la movilidad de los individuos. Aunque la migración ha sido una fuerza evolutiva poco estudiada en evolución de virus, podemos encontrar algunos análisis (Miralles et al., 1999; Frost et al., 2001; Cuevas et al., 2003). En el caso de los cítricos y debido a su cultivo propagativo durante siglos existió tráfico de material propagativo infectado con tristeza entre regiones del mundo muy alejadas. Esto ha hecho que poblaciones de CTV distantes geográficamente presenten estructuras poblacionales muy similares debido a la migración (Rubio et 15 INTRODUCCIÓN GENERAL al., 2001), hecho que también se ha observado en otros virus de cítricos (Martín et al., 2006). 3. EL CULTIVO DE LOS CÍTRICOS 3.1. Importancia económica El término “cítricos” se refiere al conjunto de especies e híbridos que pertenecen a los géneros Citrus, Fortunella y Poncirus, incluidos en la familia Rutaceae, subfamilia Aurantioidea. Estas especies son originarias del sudeste asiático y su cultivo probablemente se inició en China, desde donde se diseminó a otras zonas del mundo en un primer momento mediante movimiento de semillas y posteriormente, como plantas completas o material propagativo, siendo esta la principal vía de dispersión de patógenos de unas zonas a otras. En la actualidad, el cultivo de los cítricos se extiende por la mayor parte de las regiones tropicales y subtropicales del mundo. Las especies cítricas cultivadas se pueden englobar en cuatro grandes grupos: las naranjas, que incluye naranjas dulces (Citrus sinensis (L.) Osb.) y amargas (C. aurantium L.); las mandarinas, incluyendo satsumas (C. unshiu (Mak.) Marc.) y clementinas (C. clementina Hort. ex Tan.); los limones (C. limon (L.) Burm. f.) y limas (C. aurantifolia (Christm.) Swing. y C. latifolia Tan.); las zamboas (C. grandis (L.) Osb.) y los pomelos (C. paradisi Macf.). Datos de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) indican que actualmente se dedican más de 7 millones de hectáreas al cultivo de los cítricos, con una producción aproximada de 107 millones de toneladas, constituyendo así el cultivo frutal de mayor importancia en el mundo. En España, los cítricos se cultivan principalmente en las zonas costeras del Este y del Sur de la Península Ibérica y se localizan sobre todo en lugares próximos al litoral. España dedica unas 330.000 hectáreas a este cultivo y produce anualmente más de 6 millones de toneladas ocupando así el quinto puesto entre los países productores por detrás de Brasil, Estados Unidos, China y México. Sin embargo, España ocupa el primer lugar como país exportador de fruta fresca con más de 3 millones de toneladas. Dentro de esta producción el grupo más importante es el de las naranjas que aporta el 53%, seguido por las mandarinas con el 35% y los limones con el 11%. La producción de limas, zamboas y pomelos es insignificante. 3.2. Prácticas culturales de la citricultura y sus repercusiones en la sanidad del cultivo En la mayor parte del mundo el cultivo de los cítricos se efectúa injertando yemas de una variedad seleccionada sobre un patrón cultivado a partir de semilla. Este proceso permite elegir como patrón la especie o híbrido más adecuado para las condiciones locales de cultivo, y proporciona la posibilidad de obtener árboles de la variedad seleccionada genéticamente idénticos, que aseguran la homogeneidad de la producción. Pero al reducir la diversidad genética del cultivo, las plantaciones se hacen más vulnerables al ataque por patógenos. Por esta razón, la utilización de 16 INTRODUCCIÓN GENERAL patrones en la citricultura ha venido condicionada en buena medida por la aparición y dispersión de determinadas enfermedades. En 1863, una epidemia de podredumbre del pie causada por oomicetos del género Phytophthora, que se inició en Azores y afectó sucesivamente a los países mediterráneos, diezmó las plantaciones de cítricos establecidas a partir de semillas o propagadas sobre raíces de naranjo dulce. Esta catástrofe obligó a rehacer la citricultura propagando sobre naranjo amargo, un portainjertos resistente a la podredumbre del pie y muy adaptable a todos los tipos de suelos. Así el naranjo amargo se convirtió en el portainjertos casi exclusivo de las zonas citrícolas del Mediterráneo y de los Estados Unidos. La aparición y dispersión de CTV, que afecta a las plantas propagadas sobre naranjo amargo, dio lugar a la destrucción masiva de estas plantaciones y a su sustitución por otras propagadas sobre patrones tolerantes al decaimiento. En la actualidad el citrange Carrizo (C. sinensis x P. trifoliata) es el patrón más utilizado en España y ocupa aproximadamente el 80% de la superficie cultivada. Sin embargo, la utilización masiva del citrange Carrizo supone un nuevo riesgo para la citricultura frente a la posibilidad de aparición de nuevos patógenos que pudieran afectarle. Por otra parte el proceso de multiplicación vegetativa tiende a acumular y perpetuar patógenos transmisibles por injerto (virus, viroides, micoplasmas, fitoplasmas, bacterias y otros aún no identificados) y causó durante años el deterioro sanitario progresivo de las variedades más utilizadas. Para revertir esta tendencia y mejorar la productividad de las plantaciones y la calidad de la fruta fue necesario poner en vigor sistemas de cuarentena, saneamiento y certificación de plantas (Navarro, 1993). 4. LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS El uso del naranjo amargo fue fundamental para el desarrollo comercial de la citricultura en muchos países, pero sin saberlo creó las condiciones idóneas para la aparición de epidemias sucesivas de tristeza, que fue el resultado directo de la interacción del virus de la tristeza de los cítricos con un nuevo huésped sensible, creado por el hombre al propagar distintas variedades sobre este patrón. El resultado de esta interacción fue dramático para la industria de cítricos e incluyó la pérdida a nivel mundial de casi 100 millones de árboles propagados sobre naranjo amargo, y la necesidad de utilizar nuevos portainjertos tolerantes a la tristeza para reconstruir la citricultura en los países afectados. Las epidemias más destructivas de la tristeza se produjeron en Argentina (1930), Brasil (1937), California (1939), Florida (1951), España (1957), Israel (1970) y Venezuela (1980), pero también se detectaron brotes en Chipre (1989), Cuba (1992), México (1995), República Dominicana (1996), Grecia (2001) e Italia (2002) (Garnsey y Jackson, 1975; Bar-Joseph et al., 1989; Gottwald et al., 1996a, 2002; Kyriakou et al., 1996; Cambra y Moreno, 2000; Garnsey et al., 2000; Timmer et al., 2000; Davino et al., 2003). En España la tristeza ha causado la muerte de más de 50 millones de árboles de naranjo dulce, mandarino y pomelo injertados sobre 17 INTRODUCCIÓN GENERAL naranjo amargo. En la actualidad CTV se encuentra presente con incidencia desigual en casi todas las zonas citrícolas del mundo. Es prácticamente endémico en Asia, Australia, África del Sur y gran parte de Sudamérica, mientras que tiene una incidencia mínima en varios países del Mediterráneo (Cambra y Moreno, 2000; Moreno et al., 2008). Además de las pérdidas de árboles, las epidemias de CTV han producido daños indirectos como la imposibilidad de utilizar el naranjo amargo, cuyas cualidades agronómicas no son igualadas por otros patrones, y la aparición de nuevos problemas asociados con el uso de portainjertos tolerantes a tristeza, incluidos los daños causados por la salinidad o alcalinidad del suelo, la asfixia radicular en los suelos pesados, o la sensibilidad a hongos del suelo y a otros agentes patógenos transmisibles por injerto. 4.1. Gama de huéspedes y síntomas CTV infecta de forma natural sólo plantas de la familia Rutaceae, aunque se ha transmitido experimentalmente a algunas especies del género Passiflora (Müller et al., 1974; Cambra y Moreno, 2000). Dentro de la familia Rutaceae se ha detectado en la mayoría de las especies y variedades del género Citrus y en algunas especies de los géneros Fortunella, Aegle, Aeglopsis, Afraegle, Atalantia, Citropsis, Clausena, Eremocitrus, Hesperthusa, Merrillia, Microcitrus, Pamburus, Pleiospermium y Swinglea (Bar-Joseph et al., 1989; Bar-Joseph y Lee, 1989; Moreno et al., 2008). Algunas especies son resistentes a casi todos los aislados de CTV e impiden la acumulación del virus como es el caso de Poncirus trifoliata (L.) Raf. y algunos híbridos de éste con naranjo dulce o pomelo, Severina buxifolia y Swinglea glutinosa. Otras como algunas variedades de zamboa, especies del género Fortunella o el citrumelo 4476 (C. paradisi x Poncirus trifoliata) son resistentes a algunos aislados del virus (Garnsey et al., 1987; Mestre et al., 1997; Ruiz-Ruiz et al., 2009). El tipo e intensidad de los daños provocados por la tristeza en campo depende de las especies infectadas, del patrón sobre el que están injertadas, del aislado de CTV y de las condiciones ambientales (Grant y Costa, 1951; Aubert y Bové, 1984; Ballester-Olmos et al., 1988, 1993; Roistacher y Moreno, 1991). Algunos aislados resultan asintomáticos incluso en las especies o combinaciones más sensibles, como es el caso de la cepa K detectada en Córcega (Albertini et al., 1988; Bové et al., 1988), pero la mayoría de ellos producen uno o más de los siguientes síndromes: i) decaimiento de plantas injertadas sobre naranjo amargo (“decline”, DL), un síndrome conocido como “tristeza”, ii) enanismo, acanaladuras en la madera y fruta pequeña en algunas variedades (“stem pitting”, SP) y iii) enanismo y amarilleo de plantas francas de limonero (Citrus limon (L.) Burn. F.), pomelo o naranjo amargo, un síndrome conocido como “seedling yellows” (SY) (Fraser, 1952). 18 INTRODUCCIÓN GENERAL Figura 1: Diferentes síndromes inducidos por CTV. A1 y A2) decaimiento y muerte de plantas injertadas sobre naranjo amargo, B) orificios en la corteza del patrón naranjo amargo por debajo de la línea de injerto, C) Acanaladuras en la madera de pomelo causadas por un aislado virulento de CTV, D1 y D2) enanismo y amarilleo en plantas de semilla de pomelo, E1 y E2) Clorosis nervial en hojas de Citrus macrophyla y lima Mexicana, F) Acorchamiento en nerviaciones de lima Mexicana, G) Amarilleo y acopamiento en hojas de lima Mexicana. El síndrome de decaimiento de las plantas injertadas sobre naranjo amargo ha sido el causante de la muerte masiva de árboles en numerosas zonas citrícolas y el que inspiró el nombre de la enfermedad “tristeza” y posteriormente el del virus (Figura 1: A1 y A2). La mayoría de las especies de cítricos son sensibles al decaimiento por CTV cuando están injertadas sobre naranjo amargo. Sin embargo, también se han descrito aislados que causan infecciones asintomáticas en estas combinaciones (Moreno et al., 1991; Borbón et al., 1995). En las plantas injertadas sobre naranjo amargo CTV desencadena una necrosis de los tubos cribosos del floema del patrón, que da lugar a la desnutrición y muerte de las raicillas y con el tiempo conduce a la muerte del árbol. Este proceso puede ocurrir en unas pocas semanas (colapso o “quick decline”), quedando el árbol totalmente seco con las hojas y los frutos colgando de las ramas (Figura 1: A2) (Ben-Ze´ev et al., 1989). No obstante, en la mayoría de los casos la infección por el virus conlleva un deterioro progresivo de la planta, que experimenta un amarilleo general de las hojas, pérdida del follaje, reducción del crecimiento y del número de brotaciones y la producción de frutos pequeños y de color pálido. Al cabo de varios años se produce la muerte del árbol (McClean, 1974; Moreno et al., 1983, 2008). Normalmente, los árboles afectados presentan pequeñas proyecciones en la cara cambial de la madera, por debajo de 19 INTRODUCCIÓN GENERAL la línea de injerto, que se corresponden con pequeños orificios en la corteza (Figura 1: B). Este último síntoma se utiliza frecuentemente para el diagnóstico de CTV en campo (Moreno et al., 1983, 2008). Los aislados más virulentos de CTV, además de inducir el decaimiento de árboles injertados sobre naranjo amargo, pueden producir daños directos en distintas especies y variedades de cítricos injertadas sobre cualquier patrón. Los síntomas más característicos incluyen la formación de acanaladuras en la madera que conlleva la fragilidad de las ramas (Figura 1: C) (Grant, 1959; McClean, 1974), clorosis nervial discontinua o acorchamiento general de las nerviaciones (Figura 1: E1, E2 y F) , hojas pequeñas, deformadas y amarillas (Figura 1: G) reducción del crecimiento de la planta y disminución en la producción y calidad de los frutos (Müller y Costa 1968; Sasaki, 1981; Da Graça et al., 1984). Algunos aislados de CTV, cuando son inoculados en plantas de semilla de pomelo, limonero o naranjo amargo, inducen una reacción denominada "SY", que consiste en una clorosis generalizada en la nueva brotación y una detención del crecimiento (Fraser, 1952; McClean y Van de Plank, 1955; Grant, 1959; McClean 1974; Wallace, 1978). Esta reacción que suele ir asociada con los aislados más virulentos, no aparece en campo, pero se utiliza en invernadero para caracterizar biológicamente aislados del virus de la tristeza (Figura 1: D1 y D2). 4.2. El virus de la tristeza de los cítricos (Citrus tristeza virus, CTV) El virus de la tristeza de los cítricos (Citrus tristeza virus, CTV), es un miembro del género Closterovirus, familia Closteroviridae (Bar-Joseph et al., 1979, Bar-Joseph y Lee, 1989; Martelli et al., 2000). Los miembros de esta familia, cuya especie tipo es el virus del amarilleo de la remolacha (Beet yellows virus, BYV) tienen viriones de morfología filamentosa (12 x 800-2000 nm), genomas formados por una, dos o tres moléculas de RNA de cadena sencilla y sentido mensajero, que encapsidan separadamente, y al menos dos proteínas de cápsida (CP y CPm), cuyas subunidades se ensamblan separadamente formando una estructura helicoidal en cada extremo del virión que le da una morfología similar a una serpiente de cascabel (Boyko et al., 1992; Agranovsky, 1996; Febres et al., 1996) (Figura 2). En todos los miembros de la familia se halla además conservado un bloque de cinco genes, que codifican proteínas implicadas en el ensamblaje y movimiento de los viriones, y que incluye una pequeña proteína transmembrana, otra homóloga de las proteínas de choque térmico de la familia HSP70, una proteína de cápsida mayoritaria (CP) y una versión divergente de ésta minoritaria (CPm) y una última proteína de mayor tamaño considerada también como divergente de CP (Figura 2) (Dolja et al., 2006). 20 INTRODUCCIÓN GENERAL Proteasa Potenciador de la replicación Transporte sistémico Módulo de replicación Supresor del silenciamiento Movimiento sistémico Movimiento de célula a célula 1b HEL HSP70 CPm p20 3' UTR RdRp p6 ú n ic o ORF 1a PRO 5' UTR MT p64 CP p21 Algunos virus de RNA (+) Todos los virus de RNA (+) tipo alfavirus Todos los virus de RNA (+) Componentes del virión Todas Único las células Virus de plantas filamentosas Único Figura 2: Aspecto del virión y estructura génetica de BYV, especie tipo del género Closterovirus, que muestra la organización genómica, funciones virales de las distintas regiones génicas y conexiones evolutivas de los diferentes módulos génicos, con virus de plantas de otros géneros (Figura y micrografía electrónica de viriones de BYV tomada de Dolja et al., 2006). Otras características son la formación de vesículas membranosas citoplasmáticas, aisladas o agrupadas con masas de viriones en las células del floema, y la transmisión de modo semipersistente por insectos vectores homópteros, siendo la transmisión mecánica generalmente difícil. 4.2.1. Organización genómica de CTV Los viriones de CTV son partículas flexuosas de alrededor de 2000 nm de longitud x 11 nm de diámetro, con una única mólecula de RNA genómico (gRNA) de aproximadamente 19.3 kilobases y dos proteínas de cápsida de 25 (CP) y 27 (CPm) kDa que cubren el 97% y 3% de la longitud del virión, respectivamente (Febres et al., 1996; Satyanarayana et al., 2004). El gRNA de CTV está organizado en 12 pautas de lectura (ORFs) que potencialmente codifican para al menos 17 proteínas y dos zonas no codificantes (UTR) de 107 y 273 nt en los extremos 5´ y 3´, respectivamente (Figura 3). 21 INTRODUCCIÓN GENERAL Módulo de replicación Módulo de ensamblaje del virión y movimiento de célula a célula 1b HEL ORF 1a PRO 5' UTR MT 2 3 p33 4 HSP70 5 6 CPm 7 8 9 10 11 p18 p20 3' UTR RdRp p6 p61 CP p13 p23 Supresores de silenciamiento Figura 3: Representación gráfica de la organización genómica del gRNA de CTV. Las cajas (números 1 a 11) representan las ORFs y en la parte superior o inferior de las mismas se indica la proteína que codifican. También se muestran los dominios homólogos de metiltransferasa (MT), helicasa (HEL) y proteasa (PRO) presentes en la ORF 1a y se indican las regiones no traducibles (UTR) de los extremos 5´ y 3´. La mitad 5´ del gRNA comprende el módulo de replicación (ORFs 1a y 1b) y la región 5’ UTR (Figura 3). La ORF 1a codifica una poliproteína de 349 kDa, que incluye dominios papain-proteasa (PRO), helicasa (HEL) y metiltransferasa (MT). La ORF 1b codifica una proteína de 57 kDa con los dominios típicos de las RNA polimerasas RNA dependientes (RdRp). La región 5´ UTR debe participar en la unión de los ribosomas para la traducción de la ORF 1, que da lugar a la replicasa viral. Esta región 5´ UTR potencialmente presenta una estructura secundaria de mínima energía muy estable formada por dos horquillas, que podrían servir para el reconocimiento y unión de los ribosomas durante la traducción de la ORF 1 (López et al., 1998). Además contiene una pequeña región que es crítica para la encapsidasión (Gowda et al., 2003a). La región 3’ UTR del genoma de CTV debe estar implicada en el reconocimiento de la RNA polimerasa como ocurre en otros virus vegetales (Gallie y Kobayashi, 1994). Aunque, en CTV no se han encontrado estructuras tipo poli A ó RNA de transferencia como las utilizadas por otros virus para estabilizar sus RNAs, se ha descrito la presencia potencial de una compleja estructura secundaria de mínima energía, compuesta por múltiples horquillas que probablemente cumplen la misma función (Pappu et al., 1994; Satyanarayana et al., 2002a). La mitad 3´ terminal del gRNA contiene: un módulo de cinco genes (p6, p65, p61, p27 y p25) que codifican proteínas implicadas en el ensamblaje del virión y el movimiento de célula a célula; el gen p20, homólogo del gen p21 de BYV, y cuatro genes que codifican las proteínas p33, p18, p13 y p23, que no tienen homólogos en otros Closterovirus (Figura 3) (Dolja et al., 2006). El módulo de 5 genes conservados en todos los miembros de la familia Closteroviridae incluye las proteínas p65 y p61, la primera de ellas con homología con proteínas de choque térmico (heat shock protein, HSP) de plantas de la familia HSP70, que junto con las proteínas de cubierta p27 y p25 participan en el ensamblaje de los viriones 22 INTRODUCCIÓN GENERAL (Satyanarayana et al., 2000). La homóloga a la proteína p6 en BYV actúa como una proteína de movimiento (Peremyslov et al., 2004). La proteína p20 tiene una alta afinidad por si misma y forma cuerpos de inclusión amorfos en células infectadas (Gowda et al., 2000). La proteína p23 es una proteína que une específicamente RNA de manera cooperativa (López et al., 2000), y es la responsable del control de la acumulación asimétrica de RNAs de ambas polaridades durante la replicación y transcripción del gRNA (Satyanarayana et al., 2002b). Se han delimitado zonas conservadas en su secuencia implicadas en la formación de una estructura en dedo de Zinc que son imprescindibles para su función. Además se sabe que p23 es un determinante de patogenicidad de CTV, ya que i) su expresión ectópica en plantas transgénicas de varias especies de cítricos, da lugar a síntomas foliares similares a los que CTV produce en lima Mexicana (Ghorbel et al., 2001; Fagoaga et al., 2005), y ii) recientemente se ha localizado el determinante de SY en la región p23-3´UTR del genoma (Albiach-Martí et al., 2010). Las proteínas p20, p23 y p25 actúan como supresores de silenciamiento en plantas de Nicotiana benthamiana y N. tabacum, con p23 inhibiendo el silenciamiento intracelular, p25 el silenciamiento intercelular y p20 ambos (Lu et al., 2004). La función de p13, p18 y p33 es aún desconocida. Virus mutantes con los genes p13, p18 y p33 suprimidos fueron capaces de replicarse y ensamblarse en protoplastos de N. benthamiana, por lo que no son necesarios para estas funciones (Satyanarayana et al., 1999, 2000). Recientemente se puso de manifiesto que estos mutantes son también capaces de causar infección sistémica y síntomas normales en algunas especies de cítricos (Tatineni et al., 2008). 4.2.2. Expresión del genoma viral La replicación del gRNA de CTV implica la síntesis de un RNA complementario de polaridad negativa, que posteriormente sirve como molde para la síntesis de nuevas moléculas de RNA de polaridad positiva, que constituyen el genoma del virus. Las ORFs 1a y 1b se traducen directamente a partir del gRNA. La ORF 1a codifica una poliproteína que es procesada proteolíticamente, mientras que la traducción de la ORF 1b ocurre por un mecanismo de deriva ribosomal tipo +1 ocasional (Figura 4) (Karasev et al., 1995). Los 10 genes de la mitad 3´ del gRNA de CTV se expresan mediante la síntesis de RNAs subgenómicos (sgRNAs) 3´ co-terminales con el gRNA, que actúan como RNAs mensajeros a partir de los cuales se traduce el gen que ocupa la posición 5´ terminal (Hilf et al., 1995). En la células infectadas se sintetiza un grupo similar de sgRNAs de polaridad negativa, que se acumulan en torno a 40-50 veces menos que los sgRNAs de polaridad positiva (Satyanarayana et al., 2002b). La producción de los sgRNAs le permite al virus regular cada gen independientemente de los otros, en tiempo y cantidad (Navas-Castillo et al., 1997). El sgRNA del ORF 11, que codifica la proteína p23, es el que primero se detecta durante la infección de CTV en protoplastos de N. benthamiana y los ORFs 10 y 7, que codifican para las proteínas p20 y p25, son los más abundantes (Figura 4). 23 INTRODUCCIÓN GENERAL ORF 1a PRO 5' RdRp Poliproteína Proteasa Metiltransferasa Helicasa 1b HEL 2 3 p33 4 HSP70 5 6 p27 7 8 9 10 11 p18 p20 3' MT p6 p61 p25 p13 p23 Deriva ribosomal Polimerasa RdRp p33 p6 HSP70 p61 p27 p25 p18 Expresión de sgRNAs 3´co-terminales p13 p20 p23 Figura 4: Representación gráfica del gRNA de CTV y de las estrategias de expresión de las distintas ORFs: procesamiento proteolítico y deriva ribosomal para las ORFs 1a y b, y producción de sgRNAs 3´ co-terminales para las ORFs de la mitad 3’ del gRNA. 24 INTRODUCCIÓN GENERAL Figura 5: Modelo propuesto para la replicación de CTV y para la síntesis de las diferentes especies de RNAs producidos en células infectadas (tomado de Gowda et al., 2001). Las hebras onduladas esquematizan RNAs transcritos durante la replicación a partir del gRNA; en negro o azul se indica la polaridad positiva o negativa, respectivamente. Las posiciones de los elementos controladores de los sgRNAs se indican con cuadrados grises sobre el gRNA. A) Expresión de las ORFs 2 a 11 mediante sgRNAs 3´ co-terminales, que actúan como mensajeros de la ORF contenida en su extremo 5´, y síntesis de sgRNAs 5´ coterminales. B) Modelo propuesto para la replicación de los sgRNAs por acción de los elementos controladores; las flechas con un asterisco indican terminación o inicio de la transcripción en el elemento controlador. Se han delimitado las secuencias reguladoras de la transcripción de los distintos sgRNAs (Figura 5), pero no se ha podido determinar si se trata de secuencias promotoras (secuencias en la cadena negativa del gRNA a las que se une la polimerasa e inicia la síntesis de una cadena de polaridad positiva), o si se trata de secuencias terminadoras (secuencia donde finaliza la copia de la cadena negativa por parte de la polimerasa, y que luego sirven de molde para la síntesis de copias de polaridad positiva), por lo que se las ha llamado “elementos controladores” (Gowda et al., 2001, 2003b; Ayllón et al., 2004). Cada elemento controlador induce la formación de tres RNAs diferentes: un RNA de cadena sencilla y polaridad positiva, que sirve como mensajero para la expresión del gen adyacente a dicho elemento controlador, un RNA de polaridad negativa complementario al anterior, pero con una acumulación mucho menor por la acción de la proteína p23 (Satyanarayana et al., 2002b), y un tercer RNA de cadena sencilla y polaridad positiva que se extiende desde el extremo 5´ del gRNA al extremo 5´ del elemento controlador (Gowda et al., 2001). Este tercer tipo de RNA se podría originar por una terminación prematura de la síntesis de nuevas copias del gRNA en las proximidades de cada elemento controlador. Se ha caracterizado además dos RNAs 5´ co-terminales de simple cadena y polaridad positiva denominados LMTs (Low Molecular-weight Tristeza) (Che et al., 2001; Gowda et al., 2003b). El LMT1 (750 nt) situado cerca del extremo 5´ está relacionado con el proceso de transcripción, y el LMT2 (650 nt) está ligado al proceso de encapsidación (Gowda et al., 2009). Aunque su función es todavía desconocida posiblemente sean un subproducto de la replicación. Por lo tanto las células infectadas con CTV contienen más de 30 especies virales diferentes entre los gRNAs, sgRNAs 3´ co-terminales de ambas polaridades y los sgRNAs 5´ co-terminales (Mawassi et al., 1995a; Che et al., 2001; Gowda et al., 2001, 2003b; Ayllón et al., 2004). Además, debido a eventos de recombinación no homóloga, las células infectadas con CTV suelen acumular RNAs defectivos (dRNAs) de ambas polaridades, que contienen los extremos 3´ y 5´ del gRNA, pero carecen de una porción variable de la región central. El papel biológico de estos dRNAs de CTV es desconocido, si bien podrían participar en eventos de recombinación homóloga, y restituir en algunos casos la viabilidad a mutantes deletéreos. 4.2.3. Métodos de diagnóstico y caracterización El síntoma más significativo de la enfermedad en plantas injertadas sobre naranjo amargo, es la presencia de proyecciones en la madera y orificios en la cara cambial 25 INTRODUCCIÓN GENERAL de la corteza del naranjo amargo por debajo de la línea de injerto (Figura 1: B), por lo que se ha utilizado para un diagnóstico preliminar de la enfermedad. El método tradicional de diagnóstico son los ensayos de infectividad en invernadero (Roistacher, 1982, Garnsey et al., 1995), que consisten en inocular por injerto plantas de semilla de especies sensibles a CTV (lima Mexicana o C. macrophylla), y observar al cabo de unos meses la aparición de síntomas tales como: enanismo, acopamiento de las hojas, clorosis nervial discontinua, o SP (Figura 1). Este procedimiento es específico y sensible, pero resulta lento y caro y no es apropiado para estudios epidemiológicos. Por otra parte, se han detectado aislados de tristeza que son asintomáticos incluso en las especies más sensibles (Bové et al., 1988). El método de diagnóstico más utilizado es la detección serológica de CTV mediante técnicas inmunoenzimáticas, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales (Bar-Joseph et al., 1979; Vela et al., 1986; Cambra et al., 1990). Una variante simplificada de este procedimiento consiste en utilizar improntas de brotes o pecíolos de hojas en una membrana de nitrocelulosa, y detectar el antígeno inmovilizado mediante ELISA directo o indirecto (Garnsey et al., 1993). Este procedimiento es particularmente adecuado para el análisis masivo de muestras, y permite almacenar las membranas durante años o enviarlas para su procesamiento en un laboratorio lejano. Tras la secuenciación del gRNA de varios aislados de CTV, se han desarrollado diversos métodos de diagnóstico basados en la detección específica del RNA viral, mediante hibridación molecular con sondas de cDNA y cRNA (Rosner y BarJoseph, 1984; Narváez et al., 2000; Barbarossa y Savino, 2006) o mediante retrotranscripción y amplificación (RT-PCR) de secuencias virales (Nolasco et al., 1993; Olmos et al., 1999). Se han descrito algunos protocolos muy sensibles que combinan la utilización de anticuerpos, en un paso previo a las reacciones de RT y PCR, para “capturar” partículas del virus desde extractos vegetales, en el mismo tubo donde posteriormente se realiza la reacción de amplificación (Cambra et al., 2002). Estos métodos son adecuados para casos particulares, cómo la detección de ácidos nucleicos virales en pulgones, pero no para usos masivos. La sensibilidad de detección se ha visto mejorada con la reciente utilización de sistemas de RTPCR en tiempo real (Ruiz-Ruiz et al., 2007; Bertolini et al., 2008; Saponari et al., 2008). Desde las primeras epidemias de tristeza se observó que los aislados de CTV difieren en características biológicas tales como la intensidad de los síntomas inducidos en los árboles de campo (Da Graça et al., 1984; Roistacher y Moreno, 1991) o en plantas indicadoras (Ballester-Olmos et al., 1988, 1993), transmisibilidad por pulgones (Bar-Joseph y Loebenstein, 1973; Hermoso de Mendoza et al., 1984, 1988; Roistacher y Bar-Joseph, 1987), o en la capacidad para interferir la multiplicación de otras cepas de distinta virulencia (Costa y Müller, 1980; van Vuuren et al., 1993). Las bases genéticas subyacentes a esta variabilidad biológica son aún desconocidas, si bien se tienen evidencias sobre la presencia en los aislados de CTV de diferentes “variantes”, que pueden separarse en los procesos de cambio de huésped o transmisión por pulgón (Grant y Higgins, 1957; Raccah et al., 1980; Hermoso de Mendoza et al., 1988a). 26 INTRODUCCIÓN GENERAL La caracterización biológica de los aislados de CTV se ha efectuado utilizando un panel de plantas indicadoras que permite comparar la intensidad de los síntomas que causan, así como su capacidad para inducir los síndromes de SY y SP en distintas especies (Garnsey et al., 1991, 2006). También se han desarrollado procedimientos para caracterizar la variabilidad de CTV, identificar grupos específicos de aislados o intentar asociar las características patogénicas con diferentes marcadores moleculares (Moreno y Guerri, 1997). Algunos de estos métodos detectan diferencias en la proteína de la cápsida usando anticuerpos monoclonales y policlonales (Vela et al., 1986; Permar et al., 1990; Nikolaeva et al., 1998), o mediante análisis de los mapas peptídicos generados por digestión con endoproteasas (Albiach-Martí et al., 2000a). Otros procedimientos se basan en la caracterización de RNAs virales, incluyendo: a) análisis de dsRNA que refleja la presencia de distintos dRNAs (Dodds et al., 1987; Moreno et al., 1990, 1993a, b; Guerri et al., 1991), b) el perfil de hibridación con sondas de cDNA o cRNA (Rosner y Bar-Joseph, 1984; Rosner et al., 1986; Albiach-Martí et al., 2000b; Narváez et al., 2000), c) análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) obtenidos con distintas endonucleasas (Gillings et al., 1993; Roy et al., 2003), d) perfiles de amplificación mediante RT-PCR con parejas de cebadores específicos para varios genotipos de CTV (Hilf et al., 1999, 2005; Ayllón et al., 2001; Sambade et al., 2003), y d) análisis del polimorfismo de conformación del DNA monocatenario (SSCP) (Rubio et al., 1996; Ayllón et al., 1999b; d´Urso et al., 2000, 2003; Sambade et al., 2002, 2007). Esta técnica ha sido utilizada en esta tesis y anteriormente en otros trabajos para caracterizar la estructura poblacional de aislados de CTV y seleccionar variantes específicas para su secuenciación (Rubio et al., 2001; Sambade et al., 2003; Ayllón et al., 2006). Recientemente se ha desarrollado una técnica de RT-PCR cuantitativa a tiempo real (Ruiz-Ruiz et al., 2009) que permite la discriminación de tres genotipos de CTV. 4.3. Variabilidad genética de CTV Se conoce la secuencia nucleotídica del gRNA mayoritario de varios aislados con orígenes geográficos y características patogénicas diferentes: T36 (Pappu et al., 1994; Karasev et al., 1995) y T30 (Albiach-Martí et al., 2000c) de Florida, VT de Israel (Mawassi et al., 1996), SY568 de California (Yang et al., 1999; Vives et al., 2005), T385 (Vives et al., 1999) y T318A (Ruiz-Ruiz et al., 2006) de España, NUagA de Japón (Suastika et al., 2001), Qaha de Egipto (GenBank accesión number AY340974), CBG-VTC1 de México (Quiroz-Velásquez et al., 2008), B165 de India (GenBank accesión number EU076703) y 6 aislados de Nueva Zelanda (NRZBM12, NZRB-G90, NZRB-TH28, NZRB-TH30, NZRB-M17 y NZRB-B18; GenBank accesión number FJ525431, FJ525432, FJ525433, FJ525434, FJ525435 y FJ525436 respectivamente), más secuencias parciales de otros aislados. Los aislados T385 y T30 son esencialmente asintomáticos, T36 y CBG-VTC1 causan síntomas moderados en lima mexicana, DL y SY. VT induce además SP suave en pomelo. T318A, SY568 y NUagA causan síntomas severos en lima Mexicana y otros huéspedes, DL y SY y T318A y SY568 causan además SP en naranjo dulce y pomelo, mientras que los síntomas inducidos por NUagA en estos 27 INTRODUCCIÓN GENERAL huéspedes no han sido descritos (Suastika et al., 2001). Los síntomas causados por Qaha, B165 y los 6 NZRBs tampoco han sido descritos. Todos los aislados secuenciados hasta el momento presenta la misma organización genómica. El análisis filogenético de las secuencias completas mostraron 3 grupos principales que incluían: a) los aislados virulentos SY568, NUagA, VT y T318A, b) los aislados avirulentos T30 y T385, y c) los aislados T36, CBG-VTC1 y Qaha. Las identidades nucleotídicas dentro de cada grupo fueron superiores al 97,5%, mientras que la identidad más baja se daba entre los aislados VT y Qaha (75,6%). La variación genética está irregularmente distribuida a lo largo del gRNA de CTV, siendo la región más conservada el extremo 3´ UTR con una identidad entre aislados superior al 95% y la más variable el extremo 5´ UTR, con valores de identidad inferiores al 50%. Sin embargo, todas las secuencias de 5´ UTR obtenidas pudieron ser clasificadas en tres grupos (I, II y III), con valores de identidad intra-grupo superiores al 88% y valores entre grupos de 55-57% entre I y II, 62-64% entre II y III, y 44-45% entre I y III. A pesar de esta variabilidad los tres grupos presentan una estructura secundaria de mínima energía muy similar, lo que sugiere un papel importante de la misma en el ciclo biológico de CTV (López et al., 1998). Las secuencias 5´ UTR más frecuentes son las de tipo III, detectadas en casi todos los aislados analizados, pero mientras que los aislados poco agresivos sólo contienen este tipo de secuencia, los más virulentos contiene además secuencias tipo I, II o ambos (López et al., 1998; Ayllón et al., 2001; Ruiz-Ruiz et al., 2006). Se ha observado una distribución desigual de la variación genética entre regiones codificantes, e incluso dentro de un mismo gen, que probablemente reflejan diferentes presiones de selección a lo largo del gRNA. Comparaciones de secuencia entre aislados de CTV con orígenes geográficos y características patogénicas diferentes mostraron: i) un alto grado de conservación entre genomas de CTV separados en el tiempo y espacio, con un repertorio limitado de genotipos (Vives et al., 1999; Albiach-Martí et al., 2000c; Ruiz-Ruiz et al., 2006; Martín et al., 2009) y ii) una estructura poblacional variable entre aislados, con algunos de ellos compuestos por una variante de secuencia mayoritaria y otras relacionadas estrechamente, y otros que presentan una estructura compleja con variantes de secuencia divergentes (Vives et al., 2005; Ayllón et al., 2006; Martín et al., 2009). Los valores de diversidad nucleotídica estimados entre aislados de CTV variaron según las regiones codificantes analizadas, los valores máximos encontrados fueron en torno a 0,13, si bien la mayoría de las sustituciones eran transiciones que generalmente afectaban a la tercera posición del codón. La relación entre sustituciones sinónimas y no sinónimas (dNS/dS) estimada para todas las regiones del gRNA analizadas, estuvo por debajo de 1 (Rubio et al., 2001; Martín et al., 2009) y dentro del rango de valores calculados para otros virus de plantas (García– Arenal et al., 2001). Se han observado diferencias de secuencia compatibles con la deriva genética, probablemente asociadas con un tamaño eficaz reducido de las poblaciones virales causado por los cuellos de botella que suponen la transmisión por pulgón o el cambio de huésped (Albiach-Martí et al., 2000b; Ayllón et al., 2006; Sentandreu et 28 INTRODUCCIÓN GENERAL al., 2006). Estos cambios a veces van acompañados de diferentes comportamientos patogénicos de los aislados (Hermoso de Mendoza et al., 1988b; Albiach-Martí et al., 2000b; Brlansky et al., 2003). La distribución desigual de variantes de secuencia dentro de las plantas infectadas, y/o la selección al azar de alguna de ellas durante la adquisición o transmisión por pulgón, pueden ser factores adicionales que contribuyen a cambios en la población de CTV en campo (d´Urso et al., 2000, 2003; Sambade et al., 2007). La presencia de variantes de secuencia divergentes en un aislado de CTV también incrementa la posibilidad de variación genética por recombinación (Vives et al., 2005; Martín et al., 2009). Por otro lado el movimiento de yemas infectadas con CTV, tiende a reducir la diversidad genética entre regiones, creando una única población de CTV, como se ha observado para la poblaciones de CTV de California y España (Rubio et al., 2001). 4.4. Transmisión La dispersión de CTV a nuevas zonas ocurre fundamentalmente por la propagación de yemas infectadas, mientras que la dispersión secundaria dentro de las plantaciones la efectúan diversas especies de pulgones. Experimentalmente el virus puede transmitirse por medio de algunas especies de cuscuta (Weathers y Harjung, 1964) o por inoculación mecánica, mediante cortes repetidos en el floema con una cuchilla mojada en savia de planta infectada (Garnsey et al., 1977; Garnsey y Müller, 1988), pero la eficacia de transmisión por estos procedimientos es baja y carecen de importancia epidemiológica. No se ha podido demostrar la transmisión de CTV por semilla (McClean, 1957). 4.4.1. Transmisión por pulgón Los pulgones se alimentan de savia insertando sus partes bucales a través del tejido de la planta, y se desplazan a nuevos huéspedes en busca de tejidos tiernos para seguir alimentándose. Figura 6: Flor, yema de Hibisco y tallo de haba infestados con pulgones. Su biología, comportamiento durante la alimentación y amplia distribución en todo el mundo hace que sean idóneos para la transmisión de virus de plantas. De los más de 600 virus vegetales conocidos que se transmiten por invertebrados, aproximadamente el 50% lo hacen por pulgones (Hemíptera: Aphidoidea: Aphididae: Aphis) (Harris, 1990). 29 INTRODUCCIÓN GENERAL Las cuatro especies de pulgones con mayor incidencia en el cultivo de cítricos son Toxoptera citricida (Kirkaldy), Toxoptera aurantii (Boyer de Fonscolombe), Aphis gossypii (Glover) y Aphis spiraecola (Patch) (Figura 7). Otras especies de pulgones que atacan a este cultivo en menor medida son Aphis craccivora (Koch), Aphis fabae (Scopoli), Aphis nerii (Boyer), Aulacorthum solani (Kaltenbach), Brachycaudus helichrysi (Kaltenbach), Myzus persicae (Sulzer), Macrosiphum euphorbiae (Thomas), Toxoptera odinae (Van der Goot) y Ureleucon jaceae (L.). Toxoptera citricida Toxoptera aurantii Aphis gossypii Aphis spiraecola Figura 7: Principales especies de pulgones que atacan cítricos. El vector más eficaz de CTV a nivel mundial es T. citricida (Meneghini, 1946; Bennet y Costa, 1949; Costa y Grant, 1951) que está presente en las zonas citrícolas de Asia, América Central y del Sur, Florida e islas del Caribe, África Central y del Sur y Australia. Sin embargo, A. gossypii es el vector principal en la cuenca del Mediterráneo, California y en todos aquellos lugares donde T. citricida está ausente o aún no es predominante (Dickson et al., 1951; Bar-Joseph y Loebenstein, 1973; Raccah et al., 1976; Hermoso de Mendoza et al., 1984; Yokomi et al., 1987; Gottwald et al., 1996b, 1997; Cambra et al., 2000a). Se han descrito también como vectores de CTV A. spiraecola (Norman y Grant, 1954; Hermoso de Mendoza et al., 1984), T. aurantii (Norman y Grant, 1956; Hermoso de Mendoza et al., 1984), M. persicae (Varma et al., 1960), A. craccivora y Uroleucon jaceae (Varma et al., 1965). Aunque experimentalmente estas especies 30 INTRODUCCIÓN GENERAL son vectores menos eficientes que T. citricida y A. gossypii, son predominantes en algunas zonas, por lo que podrían jugar un papel en la dispersión de CTV. Recientemente T. citricida ha sido detectado también en distintas localidades del norte de España (Galicia, Asturias y Cantabria) y Portugal (Ilharco, 2005). Figura 10: Hoja de cítrico infestada con A. gossypii, alado y ninfas ápteras de A. gossypii. Tras la primera demostración de que CTV era transmitido por T. citricida (Meneghini et al, 1946), diversos autores confirmaron que éste era el principal vector de CTV, que poblaciones escasas de pulgones eran capaces de transmitir la enfermedad y que 4 horas eran suficientes para la adquisición del virus, aunque la máxima eficacia de transmisión se alcanzaba tras 24 horas de adquisición (Bennett y Costa, 1947, 1949; Hughes y Lister, 1949; Costa y Grant, 1951). Costa y Grant también demostraron que los pulgones no eran virulíferos tras 24 horas de alimentación en una planta sana, probando así la naturaleza semipersistente de la transmisión. La transmisión de CTV por T. citricida ocurre sin período de retención y generalmente con períodos de adquisición e inoculación de al menos 30 minutos, si bien algunos autores han obtenido períodos de segundos (Retuerma y Price, 1972). Aunque generalmente se acepta que la transmisión de CTV por T. citricida es semipersistente algunos autores la han clasificado como bimodal (Herron et al., 2006), es decir, que puede comportarse como no persistente o semipersistente. La eficiencia de transmisión de CTV por un vector varía con los aislados del virus. Aunque se han descrito aislados no transmisibles (Roistacher, 1982), la mayoría de ellos son transmisibles en mayor o menor medida (Roistacher et al., 1980; Ballester-Olmos et al., 1993). Durante años se pensó que los aislados más virulentos (inductores de los síndromes de SY y SP) sólo eran transmitidos por T. citricida, sin embargo, en 1979 se observó en California la dispersión natural (en ausencia T. citricida) de aislados muy virulentos, que habían estado durante más de 30 años en una colección sin moverse a árboles vecinos (Roistacher et al., 1979). Más aún, en experimentos de transmisión con A. gossypii, se observó mayor eficiencia de transmisión con los aislados más virulentos (Roistacher et al., 1980). En general la eficiencia de transmisión depende tanto del aislado del virus, como de la especie y número de pulgones y la variedad de las plantas donante y receptora (Hermoso de Mendoza et al., 1984, 1988b; Roistacher y Bar-Joseph, 1984; Yokomi, 1994; Broadbent, 1996; Tsai 2000). No hay diferencia en la capacidad de 31 INTRODUCCIÓN GENERAL transmisión de CTV entre formas aladas y ápteras tanto para A. gossypii como para T. citricida. 4.5. Control de la enfermedad Los métodos curativos contra los virus de plantas no existen y sólo pueden utilizarse medidas de tipo preventivo o que ayuden a disminuir los daños causados. Las medidas preventivas tienden a evitar la infección o a reducir la difusión del patógeno. Entre éstas están las medidas de cuarentena, la erradicación de plantas infectadas, y el control sanitario del material vegetal propagativo mediante programas de saneamiento y certificación. En países donde CTV no se ha establecido, lo más recomendable son los programas de cuarentena y certificación del material propagativo, que deben completarse con el saneamiento de las variedades locales (Navarro et al., 2002). En las áreas citrícolas donde predomina el patrón naranjo amargo y la incidencia de tristeza es aún muy baja, se puede establecer un programa de erradicación de los árboles infectados para retrasar o evitar las epidemias (Bar-Joseph et al., 1989; Kyriakou, 1993; Rocha-Peña, 1995). Cuando no es posible evitar la dispersión porque CTV está ampliamente distribuido, la única forma de evitar el decaimiento, es la utilización de patrones tolerantes al decaimiento: P. trifoliata y sus híbridos los citranges Troyer y Carrizo y el citrumelo, el mandarino Cleopatra (C. reshni Hort. ex Tan.), los limoneros rugoso (C. jambhiri Lush) o volkameriana (C. volkameriana Ten. y Pasq.) o la lima Rangpur (C. limonia Osb.). Esta solución es efectiva en las zonas donde predominan aislados poco agresivos, porque en presencia de éstos las variedades injertadas sobre patrones tolerantes permanecen asintomáticas. En las zonas donde predominan aislados virulentos que inducen daños directos en las variedades, esta medida de control no es suficiente y se requieren medidas adicionales, como evitar la propagación en vivero de los aislados más virulentos, o implementar un programa de protección cruzada mediante preinoculación de las plantas con un aislado no virulento (Costa y Müller, 1980; Müller y Costa, 1987). La utilización de esta técnica es totalmente empírica, ya que se desconocen sus fundamentos moleculares, y se requieren numerosos y prolongados ensayos para seleccionar aislados avirulentos con capacidad protectora. Su aplicación en campo conlleva el riesgo de evolución del aislado protector hacia formas más virulentas, al ser propagado en variedades o condiciones de cultivo diferentes (Fulton, 1986). Por ello, la protección cruzada sólo debe emplearse en lugares donde la tristeza sea endémica y los aislados sean muy virulentos. En Brasil se ha aplicado con éxito para proteger el naranjo dulce Pera (Costa y Müller, 1980) y en Sudáfrica para proteger el pomelo Marsh (van Vuuren et al., 1993), mientras que en otros lugares ha fracasado o ha proporcionado sólo una protección temporal (Thornton y Stubbs, 1976; Wallace y Drake, 1976; Bar-Joseph, 1978; Powell et al., 1992). Se ha propuesto como mecanismo de la protección cruzada el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS), un proceso que forma parte del sistema natural de defensa de las plantas frente a virus y que degrada de forma específica los RNAs virales (Covey et al., 1997; Ratcliff et al., 1997, 1999; 32 INTRODUCCIÓN GENERAL Hammond et al., 2000). Sin embargo, la complejidad del genoma de CTV y el hecho de que codifique tres supresores de silenciamiento diferentes (Lu et al., 2004), probablemente hacen que la protección dependa de otros factores desconocidos. Aunque se han identificado en algunas especies de cítricos genes de resistencia (Mestre et al., 1997b; Fang y Roose, 1999; Yang et al., 2001, 2003; Rai, 2006), no ha sido posible la obtención de plantas resistentes mediante cruzamientos convencionales, debido entre otros factores a la compleja biología reproductiva de los cítricos. La posibilidad de obtener plantas transgénicas con resistencia mediada por genes de CTV, era una opción prometedora tras los avances en las técnicas de transformación de cítricos (Peña et al., 1995a, b, Peña y Seguín, 2001), sin embargo los ensayos realizados con el gen de la CP (Domínguez et al., 2002) y con el gen p23 (Ghorbel et al., 2001; Fagoaga et al., 2005) no han conseguido obtener una resistencia consistente y estable. 33 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 34 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS Los aislados de campo de CTV están formados generalmente por una mezcla de variantes de secuencia que se generan mediante procesos de mutación y recombinación, y cuya frecuencia en la población viral es el resultado de distintas presiones selectivas y de fenómenos de migración y deriva genética. El conocimiento sobre la variabilidad y evolución de las poblaciones de los virus de plantas es esencial para el desarrollo de estrategias estables de control, ya que en muchos casos las metodologías utilizadas no son efectivas debido a la diversidad genética de las poblaciones virales y a su capacidad para evolucionar rápidamente (García-Arenal et al., 2001). Se han observado alteraciones de las poblaciones virales de CTV en los procesos de transmisión por pulgón e injerto (Ayllón et al., 1999b, 2006; Albiach-Martí et al., 2000b; Brlansky et al., 2003; D’Urso et al., 2003; Huang et al., 2005; Powell y Lin, 2005). Estos cambios podrían ser debidos en parte a fenómenos de deriva genética como consecuencia del cuello de botella que supone el proceso de transmisión, que provoca una disminución en el tamaño efectivo de la población y un posterior efecto fundador al establecerse en la planta sana una nueva población que no representa necesariamente la original (D’Urso et al., 2003; Ayllón et al., 2006; Sentandreu et al., 2006; Nolasco et al., 2008). En ocasiones estos cambios poblacionales van asociados con cambios en la patogenicidad del aislado transmitido (Ballester-Olmos et al., 1988; Brlansky et al., 2003), que pueden tener consecuencias epidemiológicas importantes o dar lugar a una nueva enfermedad emergente en una zona determinada. Anteriormente se analizó en el laboratorio la diversidad genética y la estructura poblacional de dos genes del virus (p18 y p20) en varios aislados obtenidos mediante transmisión por injerto a distintas especies huésped y se observaron diferencias en la estructura de sus respectivas poblaciones (Ayllón et al., 1999b, 2006), lo que indicaba que la transmisión por injerto podía moldear las poblaciones de CTV. Sin embargo, al incluir estos experimentos un proceso de transmisión por injerto junto con un cambio de la especie huésped los cambios poblacionales observados podían ser debidos a cualquiera de los dos factores o a una interacción entre ambos, por lo que resultaba interesante analizar por separado dichos factores y evaluar su efecto sobre las poblaciones virales. Además, una limitación de los aislados naturales de CTV es que la heterogeneidad inicial de sus poblaciones puede afectar de forma impredecible los resultados de los experimentos. Sin embargo, actualmente disponemos de un aislado generado a partir de un clon infeccioso de cDNA del genoma completo del aislado T36 de Florida (denominado 947). La población de este aislado clonal se supone completamente homogénea y por tanto permite analizar los efectos de la especie huésped o del tiempo en la evolución de dicha población. Dada la escasa información disponible sobre la variación genética de CTV y las presiones evolutivas que actúan sobre sus poblaciones, los objetivos establecidos para esta tesis doctoral fueron los siguientes: 35 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 1) Evaluación de la transmisión de dos aislados de CTV usando poblaciones mínimas de A. gossypii y análisis de la variación genética de los aislados después de la transmisión. 2) Análisis del efecto de la transmisión por injerto entre plantas de una misma especie huésped en la estructura poblacional y diversidad genética de un aislado natural de CTV. 3) Análisis del efecto de la transmisión por injerto a distintas variedades comerciales sobre la estructura poblacional y diversidad genética de dos aislados CTV de distinto origen geográfico y características patogénicas. 4) Análisis del efecto del huésped y de la transmisión por injerto en la estructura poblacional y diversidad genética de un aislado clonal de CTV. 36 MATERIALES Y MÉTODOS 37 MATERIALES Y MÉTODOS 1. AISLADOS DE CTV Los aislados T385 y T388 utilizados en esta tesis pertenecen a la colección del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (Moncada, Valencia, España). El aislado T385 proviene de un naranjo dulce asintomático propagado sobre naranjo amargo en Alicante (Moreno et al., 1990, 1991). Este aislado se transmitió por pulgón a lima Mexicana para eliminar otros patógenos transmisibles por injerto y finalmente fue transmitido por injerto a naranjo dulce propagado sobre citrange Troyer. El aislado T388 fue obtenido a partir de un aislado de Japón (T387) introducido ilegalmente, que inducía síntomas intensos en diversas especies indicadoras (Ballester-Olmos et al., 1988). Este aislado también se transmitió por pulgón a lima Mexicana y posteriormente por injerto a naranjo dulce propagado sobre citrange Troyer. El aislado T385 sólo induce ocasionalmente clorosis nervial muy suave en lima Mexicana mientras que T388 en general induce en lima Mexicana enanismo, acopamiento de hojas, clorosis nervial intensa y acorchamiento de las nerviaciones, abundantes acanaladuras en la madera y decaimiento progresivo. Además, induce SY en pomelo y naranjo amargo, decaimiento de naranjo dulce/naranjo amargo y acanaladuras en la madera de pomelo y naranjo dulce. El aislado T36-947 procede de un clon de cDNA obtenido en el laboratorio del Dr. W.O Dawson (Universidad de Florida, C.R.E.C., Lake Alfred) que representa la variante mayoritaria del aislado de T36 de Florida. A partir de este clon (que se denominó 947), se sintetizaron in vitro transcritos de RNA del genoma completo, y se transfectaron en protoplastos de Nicotiana benthamiana para producir viriones de CTV. Éstos se incrementaron mediante sucesivos pases a nuevos lotes de protoplastos y se inocularon mecánicamente en plantas de cítricos, en las que reproducían la sintomatología característica del aislado T36: acopamiento de hojas, clorosis nervial y acanaladuras en la madera en lima Mexicana, y SY en pomelo y naranjo amargo (Satyanarayana et al., 1999, 2001). Las plantas inoculadas mediante esta técnica presentan una población de CTV originada a partir de una sola molécula del clon infeccioso, y su composición se supone genéticamente homogénea. 2. DETECCIÓN DEL VIRUS La presencia de CTV en las plantas inoculadas en los distintos experimentos se comprobó generalmente mediante inmunoimpresión ELISA (IP-ELISA), utilizando una mezcla de los anticuerpos monoclonales 3DF1 y 3CA5 (Vela et al., 1986), que reconoce todos los aislados de CTV utilizados (Cambra et al., 1991; Garnsey et al., 1993). Para la detección en naranjo amargo se utilizó además ELISA indirecto en microplacas (Cambra et al., 2001) tapizando los pocillos con el anticuerpo policlonal CREC 35 (amablemente cedido por el Dr. R.F. Lee, University of Florida, C.R.E.C., Lake Alfred) y utilizando 3DF1+3CA5 como anticuerpo intermedio. 38 MATERIALES Y MÉTODOS 3. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN DE CTV 3.1. Extracción de ácidos nucleicos La extracción de RNA total se realizó a partir de 100 mg de hoja joven utilizando fenol/ isotiocianato de guanidinio (TRIZOL®, Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante para muestras con alto contenido en azúcares. El RNA se resuspendió en 50 l de agua destilada tratada con DEPC (dietil pirocarbonato). Para el huésped naranjo amargo el cDNA se obtuvo a partir de dsRNA purificado por el método de Dodds et al. (1987) en las condiciones previamente establecidas en el laboratorio (Moreno et al., 1990). Este método incluye la extracción de ácidos nucleicos con fenol-detergente, purificación de dsRNA mediante cromatografía en columna de celulosa no iónica en presencia de 16,5% de etanol, elución con tampón sin etanol, precipitación con etanol a -20ºC y resuspensión en 20 µL de agua destilada tratada con DEPC. 3.2. Retrotranscripción y amplificación de cDNA El RNA total o dsRNA se desnaturalizó incubando 10 min con hidróxido de metilmercurio (0.1 M), agregando ß-mercaptoetanol (1.4 M) y manteniendo en frío la preparación para evitar el anillado de hebras complementarias. La retrotranscripción (RT) se efectuó en un volumen final de 20 L utilizando tampón de retrotranscripción, 5 mM DTT, 0.25 mM de cada nucleótido, 0.25 M de cada cebador elegido (Tabla 1), 2 unidades (U) de inhibidor de RNAasa y 10U de retrotranscriptasa SuperScript II (Invitrogen) e incubando la mezcla a 42°C durante 1 hora y a 70 ºC durante 15 min. Para la amplificación mediante PCR se utilizó 1 l del producto de RT, 0.2 mM de cada dNTP, 10 M de los mismos cebadores utilizados en la RT, 0.05U de Taq DNA polimerasa (Roche) con su tampón específico hasta un volumen final de 25 L. La reacción se efectuó en un termociclador Gene Amp PCR System 9700 (PERKIN ELMER) en las siguientes condiciones: Para los genes p13, p18, p25 y p27: 2 min a 94°C, 38 ciclos de 20 s a 94°C, 20 s a 60°C y 1 min a 72°C y un ciclo final de 10 min a 72°C. Para los genes p20, p23 y p33: 2 min a 94°C, 3 ciclos de 20 s a 92°C, 25 s a 62°C y 40 s a 72°C, 3 ciclos de 20 s a 92°C, 25 s a 58°C y 40 s a 72°C, 3 ciclos de 20 s a 92°C, 25 s a 55°C y 40 s a 72°C y 25 ciclos de 20 s a 92°C, 25 s a 50°C y 40 s a 72°C, seguidos de un ciclo final de 10 min a 72°C. Los productos de PCR (5 L) se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa del 1% en tampón 1XTAE (40 mM Tris-acetato pH 8.3, 1 mM EDTA) a 100 voltios durante 15 min, se tiñeron con bromuro de etidio y se observaron en un transiluminador de luz ultravioleta. 39 MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 1: Secuencia nucleotídica de los cebadores utilizados en las reacciones de RT-PCR GEN p33 (ORF2) p33 (ORF2) p27 (ORF6) p27 (ORF6) p25 (ORF7) p25 (ORF7) p18 (ORF8) p13 (ORF9) p20 (ORF10) p20 (ORF10) p23 (ORF11) p23 (ORF11) CEBADORES‫٭‬ PM62 (d) PM63 (r) PM152 (d) PM176 (r) PM130 (d) PM168 (r) PM148 (d) PM194 (r) PM48 (d) PM49 (r) PM85 (d) PM88 (r) SECUENCIA NUCLEOTÍDICA 5’-3’‫٭٭‬ TATATTTCTTTCTGCTTAACA TCTCACATACTTAACGTCTTC ACTGATGACAAAGAAATGGAC TGTGCGTCAGTTAAGTACCCAA AAATTGAAGAACAAAAACAAGGAAA TTTAACACACGTTGATCTATTGCG CGCTAGATGCAGGGATTC CAGATGAAAATCCTGTTGCGTAATAAGCGGA CGAGCTTACTTTAGTGTTA TAATGTCAAACTGACCGC GGACAAACTTTIITTTCTGTGAACCTTTC CTCGTCTTCTCCCTTTCAGCGGC POSICIÓN‫٭٭٭‬ 11028-11048 11435-11455 15321-15341 16239-16260 c 16126-16150 c 16765-16788 c 16595-16612 c 17575-17606 c 17767-17785 b 18269-18286 b 18409-18437 b 18773-18795 b a a c ‫(٭‬r) indica el cebador complementario a la cadena positiva y (d) el complementario a la cadena negativa. ‫ ٭٭‬I: INOSINA. ‫ ٭٭٭‬Posición de los cebadores en el RNA genómico de los aislados de CTV T385 (a), T36 (b) y T318A (c). 3.3. Análisis de las poblaciones mediante polimorfismo conformacional de DNA de simple cadena (SSCP) La estructura de la población viral de aislados de CTV sometidos a distintos procesos de transmisión se caracterizó mediante análisis del polimorfismo de conformación de DNA de cadena sencilla (SSCP). Esta técnica permite detectar cambios de nucleótidos en fragmentos homólogos de DNA, generalmente obtenidos por PCR, basándose en las modificaciones de estructura secundaria que inducen y las consiguientes variaciones en la velocidad de migración en un gel no desnaturalizante (Hongyo et al., 1993; Oto et al., 1993). Los fragmentos con distinto patrón de migración difieren en su secuencia nucleotídica, mientras que la secuencia de aquellos que tienen el mismo perfil de SSCP suele ser idéntica. Esta técnica puede detectar el cambio de sólo un nucleótido en un fragmento de 700 (Rubio et al., 1996) y permite reducir el número de muestras a secuenciar para analizar la diversidad genética de una población viral (Rubio et al., 2001; Vives et al., 2002, 2005; Sambade et al., 2003; Ayllón et al., 2006). Para el análisis de SSCP, 2 l de producto de PCR mezclados con 8 l de una solución desnaturalizante (95% formamida, 20mM EDTA, pH 8.0, 0.05% azul de bromofenol y 0.05% de xilen-cianol) se calentaron a 99ºC durante 10 min e inmediatamente se enfriaron en hielo. Las cadenas de DNA se separaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8% en condiciones no desnaturalizantes, usando TBE (89 mM Tris-borato, 2 mM EDTA, pH 8.0) como tampón de electroforesis, a un voltaje constante de 300 voltios durante 3 horas, siguiendo el método de Rubio et al. (1996) ligeramente modificado. Los geles de poliacrilamida se tiñeron con nitrato de plata usando el protocolo de Beidler et al. (1982) con algunas modificaciones (Rubio, 1997). En todos los geles se incluía 40 MATERIALES Y MÉTODOS como marcador el producto de amplificación del gen correspondiente a partir del aislado de referencia de la colección. 4. ESTIMACIÓN DE LA VARIABILIDAD DE LAS POBLACIONES DE CTV La variabilidad genética de las poblaciones virales se estimó i) a partir de la secuencias consenso de distintos genes obtenidas en ambas direcciones a partir de los productos de PCR amplificados de cada planta individual (Capítulo I), o ii) utilizando las secuencias nucleotídicas de clones individuales de los distintos genes y su frecuencia en la población viral de cada planta (Capítulos II-IV). 4.1. Clonación de los genes Tras caracterizar la población viral de cada una de las plantas inoculadas mediante análisis de SSCP de determinados genes, se seleccionó algunas de ellas para analizar la frecuencia de distintos haplotipos presentes en la población, determinar su secuencia nucleotídica y estimar así la diversidad genética de cada población o la diversidad entre poblaciones. Para ello, los productos de PCR de las poblaciones y genes seleccionados se purificaron con el estuche comercial GENECLEAN Turbo for PCR (Q-BIO gene), según las indicaciones del fabricante para aumentar la eficiencia de ligación, y la concentración de DNA final se midió a 260 nm en un espectrofotómetro (Nanodrop, Thermo Scientific). La ausencia de DNA inespecífico se confirmó mediante electroforesis (3-5 l DNA) en gel de agarosa. El DNA purificado se clonó en el plásmido pGEM-T Easy Vector System I (Promega) incubando durante toda la noche a 16ºC un volumen de reacción de 20 l con 50 ng de plásmido, 25 ng de inserto, 2X Tampón de ligación y 3 U de T4 DNA ligasa (Promega). La ligasa se inactivó a 65ºC durante 20 min y se dializó durante 30 min con membranas de nitrocelulosa (Millipore) para eliminar el exceso de sales de la ligación. Después de la ligación, células de Escherichia coli JM109 se transformaron con el plásmido mediante electroporación (Bio-Rad Gene Pulser Xcell), se mantuvieron durante 1 hora a 37ºC en medio líquido LB (Peptona de caseina 1% p/v, extracto de levadura 0.8% p/v y NaCL 0.5% p/v) y a continuación se sembraron en placas de LB con 100 mg/ml de ampicilina, 100 l de IPTG y 30 l de X-gal para poder seleccionar las colonias que contenían el plásmido recombinante (Sambrook et al., 1989). 4.2. Análisis de clones mediante SSCP y secuenciación de distintos haplotipos De cada población clonada se seleccionaron al menos 20 colonias transformadas de las que se amplificó el inserto de cDNA mediante PCR a partir de cultivo bacteriano (3 l), usando los cebadores y condiciones descritos anteriormente. Los productos de PCR se examinaron en un gel de agarosa y se analizaron mediante SSCP en las condiciones establecidas. En todos los geles de SSCP se incluyó como marcador el producto de PCR de la población original de la que provenían los 41 MATERIALES Y MÉTODOS clones. Los clones que mostraron distinto perfil de SSCP en un mismo gel se consideraron haplotipos diferentes. De cada población analizada se seleccionaron todos los clones que mostraron un perfil de SSCP diferente al predominante en la población y 2-5 clones del haplotipo predominante. Para la extracción de plásmidos recombinantes se utilizó el estuche comercial “REAL MINIPREP TURBO KIT” (Durviz). La secuencia de cada clon se obtuvo en ambas direcciones utilizando cebadores con la secuencia de los promotores T7 y SP6, con un secuenciador automático ABI PRISM DNA Sequencer 377 (PE Biosystems). 5. ANÁLISIS DE SECUENCIAS Los alineamientos múltiples de las secuencias obtenidas y las de referencia de otros aislados disponibles en las bases de datos se efectuaron con el programa EMMA disponible en: http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/apps/emboss/cgibin/emma. Los árboles filogenéticos se obtuvieron con el programa MEGA, versión 4 (Tamura et al., 2007), siguiendo el método del vecino más próximo (neighbor joining, NJ) y utilizando remuestreo con reemplazamiento (bootstrap) con 1000 réplicas para analizar la significación de los nodos. Una vez estimadas las frecuencias de cada uno de los haplotipos secuenciados, se calcularon con el programa MEGA las distancias nucleotídicas tanto intra como interpoblacionales usando el método de Jukes y Cantor y aplicando de nuevo la técnica de remuestreo con reemplazamiento. Las secuencias se tradujeron a proteína para observar el tipo y frecuencia de cambios aminoacídicos y se calculó para cada población el cociente dNS/dS mediante el método de Pamilo y Bianchi (Pamilo y Bianchi, 1993) y Li (Li, 1993) para analizar la presión selectiva a que están sometidas las regiones génicas analizadas. La estructura secundaria de mínima energía predecible para algunas regiones de RNA se obtuvo con el programa MFOLD (Zuker, 1989). En algunas poblaciones se identificaron las posiciones aminoacídicas sometidas a presión de selección, calculando la diferencia entre las tasas de substituciones no sinónimas (dNS) y sinónimas (dS) para cada posición en el alineamiento mediante el método FEL (fixed effects likelihood) implementado en el servidor HYPHY (http:// www.datamonkey.org). La recombinación se detectó con el programa GARD disponible en el servidor DATAMONKEY usando el modelo de substitución HKY85 La confirmación de los eventos de recombinación y la identificación de las secuencias parentales se realizó con el paquete RDP3 (Martín et al., 2000) que incorpora los siguientes algoritmos para la detección de recombinación: GENECONV (Padidam et al., 1999), BOOTSCAN (Salminem et al., 1995; Martín et al 2005), MAXCHI (Smith, 1992; Posada y Crandall, 2001), 3SEQ (Boni et al., 2007), y RDP (Martín y Rybicki, 2000), usando los valores de los parámetros que por defecto presenta el programa. 42 MATERIALES Y MÉTODOS La relación entre substituciones no sinónimas y sinónimas en las diferentes ramas de un árbol de máxima verosimilitud se estimó usando el algoritmo genético basado en codones implementado en el programa GA-BRANCH (Kosakovsky-Pond et al., 2005) disponible en el servidor DATAMONKEY. 6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para comparar la distribución de haplotipos observada con respecto a la esperada de acuerdo con la hipótesis de evolución neutral, se utilizó el test de EwensWatterson (Waterson, 1978). Este test determina si la homocigosidad (probabilidad de que dos haplotipos seleccionados al azar sean idénticos) esperada bajo un modelo de evolución neutral de infinitos alelos difiere estadísticamente de la observada. Un valor de homocigosidad observado significativamente superior al esperado bajo condiciones neutrales indica la presencia de un haplotipo predominante como resultado de la selección natural, aunque otros factores relacionados con la estructura de la población pueden generar altos valores de homocigosidad. Este test fue contrastado mediante re-muestreo usando 10.000 repeticiones. Bajo la teoría neutral de la evolución todas las mutaciones son selectivamente neutras, y el mantenimiento del polimorfismo en las poblaciones se debe principalmente a la acción de la deriva genética y la fijación al azar de esas mutaciones neutras o ligeramente deletéreas. Para determinadas poblaciones de interés se aplicaron diferentes pruebas de neutralidad; Tajima (1989), Fu y Li (1993) y Fu (1997). Todas estas pruebas se realizaron con el programa DNAsp 3.0 (Rozas y Rozas 1999). La prueba D de Tajima utiliza para detectar la presencia de selección, la diferencia entre dos estimas del parámetro theta (ϴ), ϴ= 2N donde N es el tamaño poblacional efectivo y es la tasa de mutación por secuencia y generación. La prueba D= (Π-K/an)/√Var(Π- K/an), donde Π es el número medio de diferencias nucleotídicas entre dos secuencias; K es el número de sitios segregantes, que es igual al total de mutaciones bajo un modelo de alelos infinitos y n es el tamaño poblacional. Los parámetros Π y K/an son dos estimadores diferentes de theta que se comportan de diferentes manera bajo el efecto de la selección. K se ve muy afectado por la presencia de mutaciones deletéreas que se encontrarán en muy baja frecuencia, mientras que Π no se verá afectada por estas mutaciones porque depende en mayor medida de las frecuencias de las variantes. Si la población presenta variantes deletéreas la estima de theta basada en el número de sitios segregantes será superior a la estima de theta basada en el número medio de diferencias nucleotídicas y D tendrá signo negativo. Si por el contrario predominan las mutaciones con frecuencias intermedias por efecto de la selección positiva, la diferencia entre Π y K/an será positiva y D tendrá signo positivo. La prueba desarrollada por Fu y Li hace estimas de theta a partir del número de mutaciones en las ramas internas y externas de una genealogía utilizando una estructura muy similar a la prueba de Tajima. Ambas pruebas D‫ ٭‬y F‫ ٭‬asumen que puesto que la selección purgará las mutaciones deletéreas, es más probable que 43 MATERIALES Y MÉTODOS las mutaciones presentes hayan aparecido recientemente y así se encontrarán en las ramas externas. De igual modo las mutaciones en las ramas internas es más probable que sean antiguas y por lo tanto selectivamente neutras. Valores iguales a 0 indican neutralidad, valores significativamente menores que 0 indican selección direccional o aumento del tamaño poblacional, valores significativamente mayores que 0 indican la presencia de selección estabilizadora o disminución del tamaño poblacional. La prueba de Fu, establece que Fs tiende a ser negativo cuando se da arrastre selectivo (proceso mediante el cual una posición se encuentra ligada a otra que ha sido fijada por selección en la población) o crecimiento poblacional. Según Fu la prueba de Fs es muy potente, detectando crecimiento poblacional y arrastre selectivo, mientras que D‫ ٭‬y F‫ ٭‬lo son detectando selección de fondo. Fenómenos como el arrastre selectivo y la selección de fondo, al disminuir la variabilidad genética debido a la fijación de una mutación ventajosa o la eliminación de una deletérea, serán responsables de un exceso de alelos de frecuencia única. Esta situación provoca que estos estadísticos sean significativamente menores que cero (aunque también encontramos esta situación cuando se produce un aumento en el tamaño de la población tras eventos tales como un cuello de botella). Por otra parte fenómenos como la selección estabilizadora provocará un exceso de alelos a frecuencias intermedias que se reflejará en valores significativamente mayores que cero, si bien también podemos obtener estos valores debido a una disminución en el tamaño poblacional. La estructura genética de distintas poblaciones se comparó por medio del análisis de la varianza molecular (AMOVA), implementado en el programa ARLEQUÍN v2.0 (Schneider et al., 2000). AMOVA realiza estimas de los componentes de la varianza y los estadísticos F, que reflejan la correlación entre la diversidad haplotípica y diferentes niveles de subdivisión jerárquica (Excoffier et al., 1992). El primer nivel de variación (diferenciación entre grupos) se analizó con el estadístico Fct (Va). El segundo nivel, entre árboles dentro de cada grupo, se analizó intercambiando haplotipos en la población de cada grupo y utilizando el estadístico Fsc (Vb). El tercer nivel de variación (dentro de árboles) se analizó intercambiando haplotipos entre árboles y usando el estadístico Fst (Vc) con re-muestreo de 10.000 réplicas como en los casos anteriores. 44 CAPÍTULO I EFECTO DE LA TRANSMISIÓN POR PULGÓN EN LA ESTRUCTURA POBLACIONAL DE CTV 45 CAPÍTULO I I.1.INTRODUCCIÓN Desde los primeros trabajos de transmisión de CTV por pulgones (Meneghini, 1946; Dickson et al., 1951), se puso de manifiesto que ésta ocurría de modo semipersistente y que distintos factores podían afectar la eficiencia del proceso (Meneghini, 1948; Costa y Grant, 1951; Norman y Grant, 1954, 1956). Estos factores incluyen la especie de pulgón utilizada como vector (Hermoso de Mendoza et al., 1984; Yokomi y Garnsey, 1987; Yokomi et al., 1994), el tipo de aislado (BarJoseph y Loebenstein, 1973; Roistacher et al., 1980; Hermoso de Mendoza et al., 1984, 1988b; Yokomi y Garnsey, 1987; Yokomi et al., 1989; Ballester-Olmos et al., 1993), el número de pulgones utilizado (Costa y Grant, 1951; Norman et al., 1968; Raccah et al., 1976; Roistacher y Bar-Joseph, 1984; Smith y Farrald, 1988), los tiempos de adquisición e inoculación (Retuerma y Price, 1972; Raccah et al., 1976), la temperatura (Bar-Joseph y Loebenstein, 1973) y las especies donante y receptora (Costa y Grant, 1951; Norman et al., 1962; Bar-Joseph y Loebenstein, 1973; Roistacher et al., 1984; Yokomi y Garnsey, 1987; Hermoso de Mendoza et al., 1988b; Lin et al., 2002). Aunque la eficiencia de transmisión en algunos casos aparece asociada con la carga viral de la planta donante, en otros casos es completamente independiente de ésta (Bar-Joseph y Loebenstein, 1973) y podría estar relacionada con la preferencia de los pulgones por determinadas especies de cítricos (Roistacher et al., 1984; Hermoso de Mendoza et al., 1988b) o con factores específicos del huésped o del virus que pudiesen coadyuvar en la transmisión. Las interacciones de CTV con sus vectores y con la planta huésped son actualmente desconocidas, si bien en un experimento de transmisión con T. citricida utilizando la adquisición in vitro a partir de extracto bruto de planta infectada, se observó que la alimentación del pulgón con un antisuero anti-p20 después de la adquisición daba lugar a un incremento en la transmisibilidad (Herron et al., 2006). Un aspecto que podría apoyar la especificidad de la interacción de CTV con los pulgones vectores es la alteración repetidamente observada de las poblaciones virales en el proceso de transmisión (Ayllón et al., 1999b, 2006; Albiach-Martí et al., 2000b; D’Urso et al., 2003; Brlansky et al., 2003; Huang et al., 2005; Powell y Lin, 2005). Estos cambios podrían ser debidos en parte a fenómenos de deriva genética como consecuencia del cuello de botella que supone el proceso de transmisión, que provoca una disminución en el tamaño efectivo de la población (D’Urso et al., 2003; Ayllón et al., 2006; Sentandreu et al., 2006; Nolasco et al., 2008), pero al menos en algunos casos los cambios de población parecen específicamente asociados a la mayor transmisibilidad de algunos componentes de la población viral (Sambade et al., 2007). En ocasiones estos cambios poblacionales van asociados con cambios en la patogenicidad del aislado transmitido (Ballester-Olmos et al., 1988; Brlansky et al., 2003), que pueden tener consecuencias epidemiológicas importantes o dar lugar a una nueva enfermedad emergente en una zona determinada. Para evaluar la frecuencia de este fenómeno en nuestras condiciones, en este capítulo se ensayó la transmisión de dos aislados de características patogénicas diferentes con un número mínimo de pulgones de una población española de A. gossypii y se analizó la variación genética de CTV después de la transmisión en comparación con los aislados originales. 46 CAPÍTULO I I.2. DISEÑO EXPERIMENTAL I.2.1. Plantas donantes y receptoras PULGÓN COLECCIÓN DEL IVIA PLANTA DONANTE PLANTA RECEPTORA Figura 1: Representación esquemática de los ensayos de transmisión. Los aislados de CTV T385 y T388 de la colección del IVIA se propagaron por injerto sobre citrange Carrizo y éstas se utilizaron como plantas donantes en los sucesivos experimentos (Figura 1). Una vez comprobada la infección mediante ELISA estas plantas se mantuvieron en una cámara climática a 26ºC, 65-70% de humedad relativa y un fotoperiodo de 16/8 horas (luz/oscuridad) efectuando podas periódicas para generar la brotación joven necesaria para la adquisición del virus por los pulgones. Para los ensayos de transmisión se utilizaron plantas receptoras sanas de lima Mexicana y de naranjo dulce Pineapple, obtenidas de semilla. Cuando tenían un tamaño de unos 10 -15 centímetros se transplantaban a macetas de 1 litro y se trasladaban a un invernadero libre de tratamientos fitosanitarios donde se mantenían hasta su uso. Las plantas se cultivaron en una mezcla de 50% de arena y 50% de turba y se fertilizaron según el procedimiento previamente optimizado (Arregui et al., 1982). I.2.2. Cría de pulgones y método de transmisión de CTV Las colonias de A. gossypii empleadas en esta tesis, se obtuvieron a partir de una hembra virginópara áptera recogida en un cultivo de melón de Almería en 1998. De esta forma se obtuvieron por partenogénesis ninfas a partir de una sola madre, siendo los individuos genéticamente idénticos. La colonia de A. gossypii a partir de la que se estableció la cría, fue cedida por el laboratorio del Doctor Alberto Fereres del Instituto de Ciencias Agrarias-Centro de Ciencias Medioambientales (ICACCMA) del CSIC. Los clones se mantuvieron en plantas de melón variedad Regal aisladas en jaulas, en una cámara climática a 23/16ºC (día/noche) y fotoperiodo de 16/8 horas (luz/oscuridad). Las colonias de pulgones se renovaban semanalmente seleccionando pulgones adultos ápteros de la población generada quince días antes que se colocaban en grupos de 5 en plantas de melón libres de pulgones. Así se evitaba una alta densidad de población que normalmente afecta al tamaño de los individuos en las generaciones siguientes y da lugar a formas aladas muy pequeñas. Con la ayuda de un pincel se recogían pulgones adultos y ápteros de la cría de A. gossypii, y se depositaban sobre un brote tierno de la planta donante dentro de un tubo de plástico con ventanas de malla y se mantenían en la planta durante 24 horas para la adquisición del virus. Pasado este tiempo, los pulgones se colocaban individualmente o en grupos de 10 (según las condiciones del experimento) en cada una de las plantas receptoras, dentro de tubos de plástico similares, durante un 47 CAPÍTULO I período de inoculación de 24 horas. Finalmente, las plantas se trataban con Algoflash (permetrina 1%) y una vez comprobado que no quedaba ningún pulgón vivo se trasladaban al invernadero, donde se mantenían durante al menos 2 meses para comprobar si habían resultado infectadas. I.3. RESULTADOS I.3.1. Ensayos de transmisión con un pulgón Se realizaron 145 ensayos de transmisión con un solo pulgón, con cada uno de los aislados T385 y T388, utilizando como plantas receptoras naranjo dulce de unos 15 centímetros y tiempos de adquisición e inoculación de 24 horas. Dos meses después de la inoculación las plantas se analizaron individualmente por IP-ELISA y ninguna dio reacción positiva a CTV. En algunas plantas en las que el resultado de IP-ELISA era dudoso se ensayó la detección de CTV mediante RT-PCR con cebadores específicos para los genes p18, p20 y p23 y de esta forma se confirmó la ausencia del virus. Más aún, estas plantas se transplantaron a maceta más grande y se podaron para forzar una brotación nueva que se volvió a analizar por IP-ELISA, confirmando de nuevo que no había infección. Por lo tanto no se consiguió transmitir ninguno de los dos aislados con un solo pulgón. I.3.2. Ensayos de transmisión con 10 pulgones En vista de la ausencia de transmisión con un solo pulgón se hicieron nuevos ensayos utilizando naranjo dulce y lima Mexicana como especies receptoras y 10 pulgones/planta. De las 50 plantas de naranjo dulce y 50 de lima Mexicana inoculadas con el aislado T388 sólo 5 naranjos dulces y 2 limas dieron reacción positiva a CTV mediante ELISA, lo que supone una eficiencia del 10% para el primer huésped y un 4% para el segundo. Ninguna de las 61 plantas de naranjo dulce y 41 de lima Mexicana inoculadas con el aislado T385 utilizando 10 pulgones/planta dio reacción positiva a CTV por ELISA. Finalmente se intentó transmitir T385 utilizando 30-50 pulgones/planta en las mismas condiciones y usando como planta receptora naranjo dulce, pero ninguna de las 75 plantas inoculadas en estas condiciones resultó infectada. I.3.3. Análisis de la población de CTV en las plantas inoculadas por pulgón En las 7 plantas que resultaron infectadas con el aislado T388 utilizando 10 pulgones/planta receptora (codificadas como DULCE1, DULCE2, DULCE3, DULCE5, DULCE10, LIMA1 y LIMA3), se analizó la población viral obteniendo a los 6 meses de la inoculación la secuencia consenso en ambos sentidos de los genes p13, p18, p20, p23, p25, p27 y p33, a partir del producto de RT-PCR obtenido con cebadores específicos para estos genes (Tabla 1 materiales y métodos). En el caso de p20 y p23 se efectuó en cada una de las plantas un primer análisis (I) a los 6 meses de la inoculación y un segundo análisis (II) al año y medio. En todos los casos se detectó una única secuencia sin ambigüedades. 48 CAPÍTULO I Para ver si el proceso de transmisión por pulgón había afectado a la población viral, las secuencias de cada uno de los genes de las plantas receptoras se alinearon y compararon con las secuencias homólogas obtenidas de las plantas donantes utilizadas para la adquisición del virus por los pulgones (DONANTE), y con las de las plantas de la colección de las que se había propagado las plantas donantes (COLECCIÓN), indicadas en color verde en los árboles filogenéticos. Para realizar las comparaciones filogenéticas se incluyeron las secuencias de los genes homólogos en aislados de referencia de CTV disponibles en las bases de datos (T30, T385, T318A, T36, SY568R, VT, NUagA y Qaha), que se muestran en rojo en los árboles filogenéticos. Las figuras 2-10 muestran los árboles filogenéticos sin raíz obtenidos por el método de neighbor joining con 1000 réplicas de re-muestro (bootstrap) usando las secuencias consenso de cada uno de los genes, e incluyendo en el caso de p20 y p23 las secuencias obtenidas a distintos tiempos post-inoculación. En los nodos se indican todos los valores porcentuales obtenidos mediante el análisis de remuestreo. El código de cada secuencia incluye el nombre de la planta de la que proceden y d ó r según sea la secuencia directa o reversa. Como puede observarse, todas las plantas infectadas presentaron la misma secuencia consenso que las plantas donante y de la colección para todos los genes analizados, con la única excepción de la planta DULCE 1 que mostró para el gen p33 tanto en la secuencia directa como en la reversa un cambio de timina a citosina (T397C), que coincide en posición y tipo de cambio con el observado en las secuencias de los aislados T385 y T30. Se trata de un polimorfismo sinónimo en la tercera base de un codón que codifica para el aminoácido serina. Incluso cuando se dejaron las plantas un año y medio en el invernadero y se volvieron a analizar para dos de los genes (p20 y p23) no se observó variación alguna a nivel de secuencia consenso. 97 DULCE10.r LIMA3.d DULCE2.r DULCE3.d DULCE5.r LIMA3.r DONANTE.d COLECCIÓN.d 54 COLECCIÓN.r T318A DULCE3.r DULCE5.d 81 LIMA1.d LIMA1.r DULCE2.d DONANTE.r 53 DULCE10.d DULCE1.d 95 65 DULCE1.r SY568R NUagA VT 99 99 T36 T385 T30 Qaha 54 93 99 DULCE5.r COLECCIÓN.d DULCE5.d DULCE3.r LIMA3.d DULCE10.d LIMA1.r DULCE2.d 77 DULCE10.r DULCE3.d DULCE1.d DULCE2.r DULCE1.r 92 DONANTE.d LIMA3.r DONANTE.r COLECCIÓN.r LIMA1.d T318A NUagA SY568R 99 T36 99 T30 T385 VT Qaha 0.02 0.01 Figura 2: gen p33 Figura 3: gen p27 49 CAPÍTULO I DULCE10.r DULCE1.d DONANTE.r DULCE5.d DONANTE.d DULCE2.r DULCE5.r COLECCIÓN.r DULCE3.r 99 LIMA3.r DULCE3.d DULCE10.r DULCE10.d LIMA1.d DULCE1.r T318A LIMA1.r DULCE2.d LIMA3.d COLECCIÓN.d 93 VT 99 Qaha T36 T30 99 T385 0.01 99 NUagA VT 99 99 Qaha T385 T30 T36 T318A LIMA1.r LIMA3.r COLECCIÓN.d DULCE1.d DULCE2.d DULCE5.r 98 COLECCIÓN.r DONANTE.d DULCE3.d DULCE5.d DULCE1.r 87 DONANTE.r DULCE10.d DULCE2.r LIMA3.d DULCE3.r LIMA1.d SY568R 89 89 99 SY568R NUagA 0.005 Figura 4: gen p25 Figura 5: gen p18 DULCE1.d DULCE5.d DULCE2.r DULCE10.d DONANTE.d DULCE10.r LIMA3.d DULCE5.r 71 LIMA3.r COLECCIÓN.r DONANTE.r DULCE3.r LIMA1.d 56 DULCE2.d COLECCIÓN.d LIMA1.r 99 99 T318A DULCE3.d DULCE1.r NUagA SY568R VT 99 Qaha 100 T385 T30 0.01 0.01 T36 DULCE1.d LIMA1.r DONANTE.d DULCE5.r DONANTE.r DULCE3.r LIMA1.d COLECCIÓN.r 96 DULCE10.d DULCE3.d LIMA3.r COLECCIÓN.d DULCE2.d DULCE10.r 59 DULCE1.r DULCE5.d DULCE2.r 89 LIMA3.d T318A 77 SY568R NUagA VT 99 T385 T30 99 T36 Qaha Figura 6: gen p13 Figura 7: gen p20 50 CAPÍTULO I DULCE3.r DONANTE.d DULCE3.d DONANTE.r LIMA1.d T318A COLECCIÓN.r DULCE10.d DULCE10.r 86 DULCE5.r COLECCIÓN.d DULCE1.d DULCE5.d LIMA1.r 98 LIMA3.d LIMA3.r DULCE2.d 97 63 DULCE2.r DULCE1.r SY568R NUagA VT 100 T36 Qaha 99 T385 T30 0.01 0.01 D1. d.II D2.d.I L1.r.II D3.d.II D1.r.II L1.d.I D2.r.II L1.d.II D5.d.I L1.r.I T318A L3.d.II COLECCIÓN.d D5.r.II COLECCIÓN.r 96 L3.r.II D5.d.II D10.r.II DONANTE.r D3.d.I DONANTE.d D10.d.II L3.d.I D3.r.II 59 D2.r.I D2.d.II D10. d.I D1.r.I D3.r.I 89 D10.r.I L3.r.I D1.d.I D5. 75 NUagA r.I SY568R VT 100 T30 T385 100 T36 Qaha Figura 8: gen p23 Figura 9: gen p20 con el tiempo D2.r.I L3.d.II D5.d.I D2.d.II D10.r.I D1.d.I L3.d.I T318A D2.d.I L1.d.I D5.r.I COLECCIÓN.d D1.d.II D3.d.I D10.d.II D1.r.I 87 D3.r.I DONANTE.d D3.d.II L3.r.II D1.r.II D2.r.II COLECCIÓN.r L3.r.I DONANTE.r D10.d.I D5.r.II L1.r.II D10.r.II D3.r.II D5.d.II L1.r.I L1.d.II NUagA SY568R VT 99 T36 Qaha 99 T385 T30 0.01 98 98 63 Figura 10: gen p23 con el tiempo 51 CAPÍTULO I Figura 2-10: Árboles filogenéticos sin raíz obtenidos con el método neighbor joining a partir de las secuencias consenso para los genes p33, p27, p25, p18, p13, p20 y p23 de las plantas inoculadas, de la planta donante y de la colección. d =secuencia con el primer directo. r = secuencia con el primer reverso. Los valores de los nodos se obtuvieron mediante 1000 réplicas de re-muestreo (bootstrap). I.3.4. Caracterización biológica Las dos plantas LIMA1 y LIMA3 presentaban la sintomatología típica del aislado T388, es decir, clorosis nervial intensa y acorchamiento de las nerviaciones, fuerte acopamiento de las hojas, enanismo acusado y numerosas acanaladuras en la madera. Las plantas de naranjo dulce Pineapple infectadas mostraban acanaladuras en la madera menos intensas que las limas, como es característico del aislado T388. Para comparar mejor con el aislado T388 de colección, cada uno de los sub-aislados DULCE1, DULCE2, DULCE3, DULCE5, DULCE10 obtenidos en la transmisión por pulgón se inocularon en 3 plantas de lima Mexicana. Estas plantas mostraron síntomas indistinguibles de los observados en LIMA1 y LIMA3, así como en las limas control inoculadas con el aislado T388 de colección. Por lo tanto, la estabilidad de T388 observada a nivel genético se correspondió con la estabilidad observada en la expresión de síntomas. I.4. DISCUSIÓN Los aislados T385 y T388 se establecieron en la colección del IVIA hace aproximadamente 15-20 años, transmitiéndolos mediante A. gossypii desde una propagación de la planta de campo a lima Mexicana para eliminar otros patógenos transmisibles por injerto y pasándolos a continuación por injerto a las plantas de naranjo dulce sobre citrange Troyer en las que se conservan. Por tanto, ambos aislados eran inicialmente transmisibles por A. gossypii. Sin embargo, en este trabajo no se consiguió transmitir el aislado T385 en numerosos ensayos utilizando 1, 10 o incluso hasta 50 pulgones por planta receptora, fuese ésta lima Mexicana o naranjo dulce. El aislado T388 sí resultó transmisible por A. gossypii, pero con una eficiencia menor de la esperada y fue necesario utilizar 10 pulgones por planta receptora. Los datos de transmisión obtenidos son coherentes con trabajos previos en los que se observó i) que el aislado T30, cuya secuencia tiene una identidad nucleotídica del 99.8% con la de T385 (Albiach-Martí et al., 2000c), presentaba una baja capacidad de transmisión (Powell y Lin, 2005) y ii) que los aislados severos se transmiten mejor que los suaves tanto con T. citricida como con A. gossypii, independientemente del número de pulgones que se utilice en los ensayos de transmisión (Roistacher y Bar-Joseph, 1984). El análisis de las secuencias consenso de siete genes de la mitad 3’ terminal de las plantas infectadas por pulgones con el aislado T388 mostró que no hay diferencias entre la población viral de éstas plantas y las de las plantas donantes o la planta original de la colección. Aunque la mitad 3´ terminal del genoma de CTV está en general más conservada que la mitad 5’ terminal (Mawassi et al., 1996; Vives et al., 1999), la selección de esta región se hizo considerando i) que las proteínas codificadas por algunos de estos genes están implicadas en el ensamblaje del virión y el movimiento célula a célula, y ii) que algunas de ellas probablemente 52 CAPÍTULO I están implicadas en la transmisión por pulgones (por ejemplo p25 y/o p27), y alguna de aquellas cuya función se desconoce (p33, p18 y p13) podrían ser factores que ayudasen en el proceso de transmisión (helper component). Además, se disponía de información previa sobre la estructura genética y variabilidad de algunos de estos genes (p18, p20, p23, p25 y p27) (Gago-Zachert et al., 1999; Ayllón et al., 1999b, 2006; d’ Urso et al., 2000, 2003; Rubio et al., 2001; Sambade et al., 2003, Martín et al., 2009). La mutación puntual encontrada en una de las plantas en el gen p33 no supone en el análisis global de todas las secuencias un cambio significativo, especialmente considerando que en estudios previos de la diversidad genética de aislados de distintos países el gen p33 resultó el más variable de la región analizada (Martín et al., 2009). La función biológica de p33 es aún desconocida, pero se ha visto que mutantes de supresión que carecen de este gen pueden multiplicarse e invadir sistémicamente plantas de cítricos en forma similar al aislado original (Tatineni et al., 2008). Por lo tanto podemos concluir que no hemos encontrado ninguna variación en las plantas receptoras en comparación con las donantes, ni hemos sido capaces de observar una segregación en la población del virus debido al proceso de cuello de botella que supone la transmisión por pulgón. La selección de los aislados T388 y T385 se hizo considerando sus distintos orígenes geográficos (Japón y España) y características biológicas y moleculares, así como el conocimiento de su estructura poblacional y variabilidad genética (Ayllón et al., 1999b, 2006; d’ Urso et al., 2000; Martín et al., 2009). En estos estudios se observó una diversidad genética intra-poblacional muy reducida para T385 y algo más elevada en el gen p18 de T388, si bien en ensayos previos con ambos aislados realizados 10-15 años antes se había observado que la transmisión por injerto a un nuevo huésped daba lugar a cambios de distinta intensidad en la composición de las poblaciones virales (Moreno et al., 1993; Ayllón et al., 1999b). El hecho de que en el estudio previo de Ayllón et al., (1999b, 2006) se observasen distintas variantes de secuencia mientras que en el análisis actual se obtuviese una secuencia única, y la reducida eficiencia de transmisión observada en este estudio para ambos aislados, podrían ser debidos a una evolución de las respectivas poblaciones hacia variantes de secuencia muy predominantes y con baja transmisibilidad durante el largo período de aislamiento en las plantas de colección. La presencia en aislados de CTV de variantes de secuencia con distinta virulencia y/o transmisibilidad por vectores, que pueden separarse en los procesos de transmisión y dar lugar a poblaciones con características biológicas y moleculares diferentes a las de la planta madre, ha sido demostrada por distintos autores (Hermoso de Mendoza et al., 1988a; Branskly et al., 2003; Raccah et al., 1980; Roistacher y Bar-Joseph, 1987; Broadbent et al., 1996; Lutting et al., 2002; Nolasco et al., 2008). Igualmente se ha puesto de manifiesto que la adquisición de CTV por pulgones individuales supone un cuello de botella que hace cambiar la composición de la población adquirida y en ocasiones de la transmitida (Albiach-Martí et al., 2000b; d’Urso et al., 2000; Nolasco et al., 2008). Sin embargo, en la mayoría de estos trabajos se utilizaron aislados de campo que, a diferencia de T388 presentaban mayor variabilidad genética, lo que podría explicar en parte la 53 CAPÍTULO I ausencia de variación genética entre el aislado fuente y los transmitidos por pulgones en nuestros experimentos. Los resultados de estos experimentos sugieren que el aislamiento de algunas poblaciones de CTV en una misma planta durante años tiende a incrementar la homogeneidad genética y podría dar lugar a una menor transmisibilidad por pulgón. 54 CAPÍTULO II TRANSMISIÓN POR INJERTO A LA MISMA ESPECIE HUÉSPED: EFECTO DEL NÚMERO DE INJERTOS EN LA EVOLUCIÓN Y ESTRUCTURA DE LA NUEVA POBLACIÓN VIRAL 55 CAPÍTULO II II.1. INTRODUCCIÓN Aunque en los últimos años han aumentado los trabajos sobre variabilidad de los virus de plantas, los análisis encaminados a la cuantificación de esta variabilidad y a la caracterización de la estructura genética de sus poblaciones son más escasos. La información disponible indica que, en contra de lo que se pensó en un principio, las poblaciones de virus de plantas son genéticamente estables. Como se ha comentado anteriormente, los aislados de campo de CTV están formados generalmente por una mezcla de variantes de secuencia que se generan mediante procesos de mutación y recombinación, y cuya frecuencia en la población viral es el resultado de distintas presiones selectivas y de fenómenos de migración y deriva genética. Estos últimos están generalmente asociados a los procesos de transmisión por pulgón o a la propagación de yemas infectadas. En particular la transmisión de CTV mediante injerto supone un cuello de botella que reduce el tamaño efectivo de la población, y un posterior efecto fundador al establecerse en la planta sana una nueva población que no representa necesariamente la original. Anteriormente se analizó en el laboratorio la diversidad genética y la estructura poblacional de dos genes del virus (p18 y p20) en varios aislados obtenidos mediante transmisión por injerto a distintos huéspedes y se observaron diferencias en la estructura de sus respectivas poblaciones (Ayllón et al., 1999b, 2006), lo que indicaba que la transmisión por injerto era un proceso importante en el moldeado de las poblaciones de CTV. Sin embargo, al incluir estos experimentos un proceso de transmisión por injerto junto con un cambio de huésped los cambios poblacionales observados podían ser debidos a cualquiera de los dos factores o a una interacción entre ambos. En este capítulo de la tesis se intentó analizar separadamente el posible efecto de la transmisión por injerto, una práctica cotidiana en los experimentos con virus de cítricos, en la estructura poblacional de los aislados de CTV. Para ello se transmitió por injerto el aislado T388 a plantas sanas de cítricos de la misma variedad pero utilizando una cantidad variable de inóculo (1, 2 ,4 o 6 trozos de corteza de la planta donante) y presumiblemente un tamaño efectivo de la población también variable. 56 CAPÍTULO II II.2. DISEÑO EXPERIMENTAL DONANTE T388 x1 x2 x4 x6 1 I 2 3 I 1 2 3 I 1 2 3 I 1 2 3 II II II II III III III III Figura 1: Representación esquemática del diseño experimental. A partir del naranjo dulce Pineapple en el que se mantiene el aislado T388 de la colección de virus, se tomaron trozos de corteza joven para inocular por injerto grupos de tres plantas de semilla de naranjo dulce Pineapple utilizando 1, 2, 4 o 6 injertos (tratamientos x1, x2, x4 y x6). Una vez comprobada la infección mediante IP-ELISA, se analizó la población de los genes p20 y p23 de cada una de las plantas a los 6, 12 y 18 meses post-inoculación (análisis I, II y III), a partir de una mezcla de hojas jóvenes de la última brotación. También se analizó la población de estos genes en la planta donante como término de comparación. El código utilizado para las muestras incluye, junto con el código de aislado, el número de la planta dentro del tratamiento, el número de injertos (tratamiento) y el número de análisis, por ejemplo, la muestra 388.2.6.II corresponde al segundo análisis (12 meses postinoculación) de la planta número 2 de las inoculadas con 6 trozos de corteza. II.3. RESULTADOS II.3.1. Análisis de SSCP de las poblaciones virales Una vez comprobada la infección mediante IP-ELISA de cada una de las plantas, se amplificó un fragmento del gen p20 y otro de p23. Los productos de RT-PCR obtenidos de todas las plantas con los cebadores PM48-PM49 para p20 y PM85PM88 para p23, contenían bandas únicas de 483 y 372 nt respectivamente, que coincidían con los tamaños esperados usando estas parejas de cebadores. Se realizó el análisis de SSCP de estos productos de RT-PCR y todos los perfiles presentaron solo dos bandas (Figura 2). Para el gen p20 todas las plantas analizadas a lo largo del experimento en las 4 condiciones mostraron el mismo perfil de SSCP (Figura 2 panel A), que además coincidía con el perfil de la planta donante para este gen. Para p23 todas las plantas analizadas excepto 388.2.6.III y 57 CAPÍTULO II 388.3.6.III mostraron el mismo perfil de SSCP, que también coincidía con el de la planta donante (Figura 2 panel B). Excepto en estas dos muestras se observó para ambos genes, una gran homogeneidad en el perfil de SSCP independientemente del número de injertos utilizados en la inoculación o del momento del análisis. Panel A: SSCP poblacional del gen p20 Plantas x1 injertos 1 2 3 I PLANTA DONANTE Plantas x2 injertos Plantas x4 injertos 1 2 3 1 2 3 Plantas x6 injertos 1 2 3 II III 388.3.1.III 20 CLONES 388.2.6.II 20 CLONES 19/20 1/20 18/20 1/20 1/20 Panel B: SSCP poblacional del gen p23 PLANTA DONANTE Plantas x1 injertos Plantas x2 injertos 1 I 2 3 1 2 3 Plantas x4 injertos 1 2 3 Plantas x6 injertos 1 2 3 II III 388.3.1.I 20 CLONES 2/20 18/20 58 CAPÍTULO II Figura 2: Análisis de SSCP de la población de los genes p20 (panel A) y p23 (panel B) en plantas de naranjo dulce Pineapple inoculadas con el aislado T388 (donante) usando 1, 2, 4 o 6 injertos, a los 6 (I), 12 (II) y 18 (III) meses de la inoculación. De las poblaciones marcadas con un óvalo se analizaron 20 clones al azar. En la parte inferior de cada panel se muestran ejemplos de los perfiles de SSCP de los clones de algunas muestras indicando la frecuencia de los mismos. Se señalan con (p20) o con (p23) las poblaciones en las que se detectó un haplotipo específico. II.3.2. Examen de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de los haplotipos Para estudiar la variabilidad genética y observar la evolución a lo largo de todo el experimento se seleccionaron las plantas inoculadas con x1 y x6 injertos (consideradas como las condiciones más extremas) a distintos tiempos postinoculación, así como la planta donante (Figura 2 poblaciones señaladas con un círculo) y se analizaron clones al azar de las mismas. Esta selección incluía las dos muestras con un perfil de SSCP de p23 diferente. Se analizaron un total de 396 clones para el gen p20 y otros tantos para p23 (20 clones de cada una de las muestras seleccionadas y 36 clones de la planta donante) amplificándolos mediante PCR con los mismos cebadores indicados previamente y obteniendo su perfil de SSCP en las mismas condiciones descritas (Figura 2 y Tablas 1 y 2). Se observó de nuevo una gran homogeneidad en los perfiles de SSCP de todos los clones analizados, coincidiendo el perfil del haplotipo más frecuente con las bandas de DNA predominantes en el perfil de SSCP de la población analizada y también con el de la planta donante. Las únicas excepciones fueron dos poblaciones de p23 que mostraron un perfil poblacional diferente al de las demás muestras. En las Tablas 1 y 2 se muestra la frecuencia de los haplotipos presentes en cada población analizada y en la planta donante. Existe un patrón de distribución característico que se repite en todas las poblaciones, que consiste en un haplotipo muy frecuente (mayoritario) y varios haplotipos minoritarios generalmente representados por un solo clon. En p20 se encontró un haplotipo (B1) diferente del mayoritario (A1) que se repetía en 6 poblaciones (Figura 2 panel A poblaciones marcadas con ). Para p23 el haplotipo Q1 se detectó en 14 de las 19 poblaciones analizadas y fue mayoritario en las dos poblaciones cuyo perfil de SSCP era diferente al del resto de las muestras y al de la planta donante (Figura 2 panel B poblaciones marcadas con ). Los haplotipos B1 y Q1 no se encontraron en la población de la planta donante. 59 CAPÍTULO II Tabla 1: Haplotipos detectados mediante análisis de SSCP de clones de p20 y frecuencia de los mismos en cada planta a distintos tiempos post-inoculación (población). POBLACIÓN* H A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 E1 E2 E3 E4 E5 F1 F2 F3 G1 G2 G3 H1 H2 H3 I1 I2 J1 J2 K1 K2 L1 L2 M1 M2 M3 N1 N2 O1 TOTAL 36(17) D 1(1) 1(1) 4(4) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 4(4) 5(5) 1(1) 1(1) 1(1) 1.1I 1.1II 1.1III 2.1I 2.1II 2.1III 3.1I 3.1II 3.1III 1.6I 1(1) 1.6II 1.6III 2.6I 2.6II 2.6III 3.6I 3.6II 3.6III 34(13+1+1) 14(2) 13(2+1) 14(5) 15(2+1) 17(4) 20(5) 20(4) 17(5) 19(5) 17(3+1) 16(3+1) 18(6) 20(5) 18(5) 18(3) 17(4) 17(2+1) 18(3) 20(8) 20(10) 20(11) 20(8) 20(7) 20(5) 20(4) 20(8) 20(6) 20(7) 20(8) 20(8) 20(5) 20(7) 20(5) 20(7) 20(6) 20(5) * Por razones de espacio se ha omitido en el código de cada muestra la indicación del aislado inoculado (T388). D = planta donante. Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados de cada haplotipo (H). En morado se representan los haplotipos que se repiten en diversas poblaciones (A2, B1, F1) y difieren del haplotipo mayoritario señalado en verde (A1) en un sólo nucleótido. Todos los haplotipos diferentes al mayoritario (que aparecen una sola vez en la población) representados en negro difieren de éste en un sólo cambio nucleotídico, en azul en dos y en rojo en tres. Junto con los clones secuenciados del haplotipo A1 se muestran en negro los clones considerados A1 por su 60 CAPÍTULO II perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. Tabla 2: Haplotipos detectados mediante análisis de SSCP de clones de p23 y frecuencia de los mismos en cada planta a distintos tiempos post-inoculación (población). POBLACIÓN* H P1 P2 Q1 Q2 R1 R2 S1 U1 V1 V2 W1 W2 X1 X2 Y1 ZA TOTAL D 1(1) 7(7) 1(1) 1(1) 1(1) 2(2) 1(1) 1(1) 1(1) 2(2) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 3(3) 5(5) 2(2) 2(2) 3(3) 11(5) 7(7) 3(3) 7(7) 19(4) 6(6) 6(6) 18(5) 1.1I 1.1II 1.1III 2.1I 2.1II 2.1III 3.1I 3.1II 3.1III 1.6I 1.6II 1.6III 15(5) 13(5) 20(6) 20(4) 20(4+1) 18(4) 17(5) 17(4) 20(4) 2.6I 2.6II 2.6III 3.6I 3.6II 3.6III 14(5+1) 13(2) 2(2) 35(13+1+1) 12(5) 7(3) 10(3+1) 17(5+1) 11(5) 36(16) 20(13) 20(10) 20(12) 20(6)20(4) 20(5) 20(6) 20(8) 20(7) 20(4) 20(10) 20(14) 20(9) 20(14) 20(5) 20(12) 20(9) 20(7) * Por razones de espacio se ha omitido en el código de cada muestra la indicación del aislado inoculado (T388). D = planta donante. Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados de cada haplotipo (H). En morado se representan los haplotipos que se repiten en diversas poblaciones (Q1) o en la misma población (W1) y difieren del haplotipo mayoritario indicado en verde (P1) en un solo nucleótido. Todos los haplotipos diferentes al mayoritario (que aparecen una sola vez en la población) representados en negro difieren de éste en un sólo cambio nucleotídico, en azul en dos y en rojo en tres. Junto con los clones secuenciados del haplotipo P1 se muestran en negro los clones considerados P1 por su perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. 61 CAPÍTULO II II.3.3. Estimación de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas II.3.3.1. Relaciones filogenéticas entre las variantes de secuencias Para determinar de forma más precisa la variabilidad genética de ambos genes y establecer relaciones filogenéticas de cada población se secuenciaron todos los clones que presentaban un perfil diferente al mayoritario y entre 2 y 15 de los clones con el perfil mayoritario. En total se secuenciaron 142 clones para p20 y 171 para p23. De los 342 clones de p20 considerados iguales por su perfil de SSCPs se secuenciaron 88, de los que 81 mostraron la secuencia de T388 y 7 mostraron algún cambio (marcados en color negro en el haplotipo A1). Los 54 clones de p20 considerados diferentes por su perfil de SSCP mostraron secuencias diferentes. A su vez de los 281 clones de p23 con el mismo perfil de SSCP se secuenciaron 90, 84 de los cuales mostraron la secuencia de T388 y 6 mostraron algún cambio (marcados en color negro en el haplotipo P1). De los 115 clones de p23 con haplotipos diferentes al mayoritario se secuenciaron 81 y todos fueron diferentes. Las secuencias de p20 y p23 que mostraban diferencias con respecto a las características de T388 se alinearon junto con las homólogas de los 8 aislados de comparación que se utilizaron en el capítulo I. En los apéndices A1II y A2II se muestran todos los cambios nucleotídicos y aminoacídicos detectados en las distintas variantes de secuencia (resumidos en la línea Cambios) con respecto a la secuencia de T388 y a las de los aislados de comparación. El análisis filogenético de las secuencias nucleotídicas usando el método de neighbor joining con un análisis de re-muestro (bootstrap) con 1000 réplicas dio lugar a dos árboles sin raíz que se muestran en la Figura 3. Se observa para ambos genes poca variabilidad, ya que la gran mayoría de las variantes de secuencia forman un grupo muy próximo a la secuencia de T388 (que representa también el perfil mayoritario de la población) y separado de las secuencias del resto de los aislados. 62 CAPÍTULO II 62 388.2.1.II.16 388.3.1.III.17 388.1.1.IV.9 388.1.1.III.1 388.2.1.II.17 388.1.6.III.6 388.1.1.II.17 3888.8donante 65 388.3.1.IV.1 3888.16donante 65 388.2.1.III.16 388.1.6.III.13 388.1.6.III.17 388.2.6.IV.6 388.2.6.III.9 388.1.6.IV.7 388.1.1.II.18 388.1.6.III.7 388.2.1.III.12 388.2.1.II.2 T388 388.3.6.III.6 388.3.6.III.8 388.2.1.III.5 388.2.1.II.11 T318A 388.1.6.II.4 8.33donante 388.1.6.III.19 388.1donante 4 388.2.1.II.15 388.3.6.II.3 388.3.6.III.1 388.1.6.II.18 388.1.6.II.12 388.6.IV.2 388.2.6.IV.4 388.3.1.III.9 388.1.1.III.16 388.1.1.III.5 388.1.1.IV.17 388.1.1.II.12 388.1.1.III.3 388.3.6.III.7 388.1.1.II.5 8 388.1.1.IV.4 388.1.1.IV.13 388.1.1.II.11 62 388.1.1.II.13 388.6.IV.8 388.1.1.IV.16 388.1.6.III.2 388.1.1.IV.19 388.3.6.II.9 21 388.1.1.III.14 388.1.1.III.10 388.1.1.II.4 388.1.1.III.2 57 388.32donante 388.3.6.II.11 388.2.6.III.5 79 388.2.1.II.19 388.1.6.IV.2 52 388.3.1.III.11 388.1.1.III.4 87 SY568R 91 NUagA VT 388.2.6.II.6 388.1.1.I.13 388.3.1.I.6 388.2.6.I.5 388.2.6.II.15 388.3.1.III.f 388.1.1.I.16 388.2.6.II.12 388.3.6.III.13 388.2.6.II.b 388.2.6.III.13 388.1.1.III.f 388.1.6.III.18 388.2.6.I.19 388.3.1.II.5 388.3.6.II.14 388.1.6.II.20 388.1.1.III.g 388.3.6.III.10 388.3.6.II.10 388.3.6.III.4 388.2.6.III.10 388.3.6.III.7 388.2.6.II.20 388.1.6.II.1 388.1.1.III.10 388.1.6.III.1 388.2.6.II.c 388.1.6.II.a 388.1.6.III.18 388.1.6.II.17 388.3.6.II.5 388.3.6.II.14 388.1.6.II.b 388.3.6.I.6 388.1.1.I.15 388.3.6.I.6 63 388.3.6.II.14 388.3.1.III.e 388.2.6.III.20 388.3.6.I.4 388.3.6.II.10 388.1.6.III.6 388.2.6.II.1 388.1.1.II.3 388.1.1.I.15 388.3.6.I.17 388.1.1.II.4 388.3.1.III.b 388.2.6.III.4 388.1.1.I.4 388.1.1.I.16 388.1.1.III.e 388.3.6.I.4 388.1.1.II.14 388.1.6.II.4 388.2.6.I.11 64 388.1.1.I.11 388.1.1.III.6 72 388.1.1.III.i 388.1.6.III.14 388.3.6.III.1 24 388.1.1.III.2 388.2.6.III.3 388.3.6.I.17 388.2.6.II.a 388.3.1.II.17 64 388.1.1.II.3 388.2.6.II.3 388.1.6.III.18 388.1.6.III.14 388.1.1.II.13 388.3.6.II.10 388.1.6.II.11 40 388.1.1.I.2 388.3.1.I.7 388.1.6.III.1 T318A 388.2donante 388.3.6.I.12 58 388.14donante 388.3.1.II.3 388.28donante T388 65 388.1.6.III.4 49 388.1.6.III.10 388.2.1.III.e 99 388.2.6.I.12 388.1.6.III.11 NUagA SY568R VT T36 100 Qaha T385 100 T30 A: gen p20 B: gen p23 88 T385 T30 99 T36 99 Qaha 0.01 0.01 63 CAPÍTULO II Figura 3: Árbol filogenético sin raíz obtenido por el método neighbor joining con las variantes de secuencia de los genes p20 (A) y p23 (B), detectadas en plantas inoculadas con el aislado T388 usando un número variable de injertos y a distintos tiempos post-inoculación. Las secuencias indicadas en rojo corresponden a aislados de referencia y en verde a la planta donante (T388). Esta última es también la secuencia predominante en todas las poblaciones analizadas. Los valores de los nodos se obtuvieron mediante re-muestreo con 1000 réplicas. El número al final del código indica el número del clon. II.3.3.2. Análisis de la variabilidad nucleotídica y aminoacídica de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas El análisis de las 61 secuencias diferentes que se obtuvieron del gen p20 mostró que 49 de ellas presentaban un cambio nucleotídico con respecto a la secuencia característica de T388, 11 presentaban 2 cambios y una tenía 3 cambios (Tabla 1, haplotipos indicados en letras de color negro o morado, azul y rojo, respectivamente). El número total de posiciones polimórficas fue de 74 (tantas como mutaciones detectadas), lo que representa el 15% de las posiciones en el alineamiento, de las cuales el 93% eran transiciones. A su vez, de las 87 variantes de secuencia que se detectaron del gen p23, también la mayoría (74) presentaban un solo cambio nucleotídico, 10 presentaban 2 cambios y 3 tenían 3 cambios (Tabla 2, haplotipos indicados con letras de color negro o morado, azul y rojo, respectivamente). El número total de posiciones polimórficas fue de 103 (28% de las posiciones del alineamiento) y el 98% fueron transiciones. En las Tablas 3 y 4 se detalla la naturaleza de los cambios nucleotídicos y la proporción entre cambios únicos y compartidos entre las secuencias. Para p20 la mayoría de los cambios fueron únicos y sólo 26 fueron compartidos entre las secuencias obtenidas (Tabla 3). De los 74 cambios detectados sólo 8 están presentes en alguna de las 8 secuencias de aislados de CTV utilizadas para comparación en el alineamiento múltiple: 6 se hallan en las secuencias de los aislados T385 y T30 y 2 en las de T36 y Qaha. Por el contrario, la mayoría de los cambios detectados en p23 fueron compartidos (debido a la frecuencia con la que encontramos el cambio presente en el haplotipo Q1), y sólo 2 de ellos se hallan presentes en T385. 64 CAPÍTULO II Tabla 3: Número de sitios nucleotídicos y aminoacídicos polimórficos, no sinónimos (NS), sinónimos (S), únicos (U) y compartidos (C) con otras secuencias, detectados en variantes de p20 de las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388. Sitios polimórficos nucleotídicos Tipo de substitución Sitios polimórficos aminoacídicos Gen p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 Total Población donante 388.1.1.I 388.1.1.II 388.1.1.III 388.2.1.I 388.2.1.II 388.2.1.III 388.3.1.I 388.3.1.II 388.3.1.III 388.1.6.I 388.1.6.II 388.1.6.III 388.2.6.I 388.2.6.II 388.2.6.III 388.3.6.I 388.3.6.II 388.3.6.III Total 4 7 11 6 9 3 0 0 5 1 4 6 3 0 2 2 4 5 2 74 U 3 2 5 1 8 2 0 0 4 0 4 4 3 0 2 2 3 4 1 48 C 1 5 6 5 1 1 0 0 1 1 0 2 0 0 0 0 1 1 1 26 NS 4 7 8 6 4 3 0 0 3 1 3 5 1 0 2 1 1 4 1 54 S 0 0 3 0 5 0 0 0 2 0 1 1 2 0 0 1 3 1 1 20 Total 4 7 8 6 4 3 0 0 3 1 3 5 1 0 2 1 1 4 1 54 U 3 2 2 1 4 2 0 0 3 0 3 3 1 0 2 1 0 3 0 30 C 1 5 6 5 0 1 0 0 0 1 0 2 0 0 0 0 1 1 1 24 Tabla 4: Número de sitios nucleotídicos y aminoacídicos polimórficos, no sinónimos (NS), sinónimos (S), únicos (U) y compartidos (C) con otras secuencias, detectados en variantes de p23 de las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388. Sitios polimórficos nucleotídicos Tipo de substitución Sitios polimórficos aminoacídicos Gen p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 Total Población donante 388.1.1.I 388.1.1.II 388.1.1.III 388.2.1.I 388.2.1.II 388.2.1.III 388.3.1.I 388.3.1.II 388.3.1.III 388.1.6.I 388.1.6.II 388.1.6.III 388.2.6.I 388.2.6.II 388.2.6.III 388.3.6.I 388.3.6.II 388.3.6.III Total 3 9 7 11 0 0 1 2 4 3 0 9 12 4 12 6 7 8 5 103 U 3 1 2 0 0 0 1 0 2 0 0 2 2 1 3 1 1 1 0 20 C 0 8 5 11 0 0 0 2 2 3 0 7 10 3 9 5 6 7 5 83 NS 3 9 7 11 0 0 0 2 2 3 0 9 10 4 11 6 6 8 5 96 S 0 0 0 0 0 0 1 0 2 0 0 0 2 0 1 0 1 0 0 7 Total 3 9 7 11 0 0 0 2 2 3 0 9 10 4 11 6 6 8 5 96 U 3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 1 1 0 1 0 11 C 0 9 6 11 0 0 0 2 2 3 0 7 8 4 10 5 6 7 5 85 65 CAPÍTULO II La mayoría de las mutaciones puntuales que encontramos en éstas secuencias para ambos genes se encuentran distribuidas al azar a lo largo de la secuencia (Figuras 4 y 5), excepto el cambio nucleotídico presente en el haplotipo B1 de p20 que se repite 20 veces en las poblaciones analizadas (16 veces en el haplotipo B1 y 4 veces en otros haplotipos que presentan dos cambios) y el cambio presente en el haplotipo Q1 de p23 que se repite 77 veces (65 en Q1 y 12 en el resto). 20 18 16 14 número de 12 10 cambios nt 8 6 4 2 0 20 30 25 26 18 10 9 7 5 5 2 6 2 8 9 10 11 12 20 número de 15 cambios aa 10 5 0 1 6 3 1 2 2 3 3 4 5 6 4 2 3 4 7 secuencia nucleotídica de p20 90 80 70 60 número de 50 cambios nt 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 secuencia nucleotídica de p23 8 9 7 3 2 3 3 82 secuencia aminoacídica de p20 100 80 número de 60 cambios aa 40 20 5 1 2 secuencia aminoacídica de p23 5 3 86 1 1 1 0 Figuras 4 y 5: Distribución de los cambios nucleotídicos (nt) (verde) y aminoacídicos (aa) (naranja) detectados a lo largo de las secuencias de p20 (paneles superiores) y p23 (paneles inferiores). En las gráficas de p20 cada intervalo representa 42 nucleótidos, excepto el último que representa 21 (verde), o 44 aminoácidos, excepto el último que representa sólo 29 (naranja). En las de p23 cada intervalo representa 42 nucleótidos, excepto el último que representa 36 (verde), o 42 aminoácidos, excepto el último que representa sólo 40 (naranja). La mutación del haplotipo B1 de p20 es una transición A401G que no coincide con las secuencias de otros aislados de CTV utilizados en los alineamientos, y que afecta a la segunda base del codón y da lugar a un cambio de lisina por arginina (ambos aminoácidos del grupo básico). A su vez la mutación presente en el haplotipo Q1 de p23 es una transición T134C que no se halla en las secuencias tipo utilizadas en el alineamiento, pero que se ha detectado en la secuencia de p23 del aislado K de Córcega y del aislado Galego 50 de Argentina (Sambade et al., 2003). Esta transición afecta la segunda base del codón y da lugar a un cambio de isoleucina (neutro no polar) por treonina (neutro polar). Cuando se examina la estructura secundaria de mínima energía libre predecible con el programa MFOLD (Zucker, 1989) para cada una de estas dos regiones mutadas en comparación con la secuencia consenso, se observa que el cambio nucleotídico del haplotipo B1 de p20 está localizado en un bucle y no afecta a la estabilidad de la estructura predicha (Figura 6), mientras que el del haplotipo Q1 de p23 da lugar a un ligero 66 CAPÍTULO II cambio en la estructura, con la aparición de un bucle en la zona de la mutación (Figura 7). A: Secuencia consenso B: Secuencia mutada Figura 6: Comparación de la estructura secundaria de mínima energía libre predicha con el programa MFOLD para una región del gen p20 entre la secuencia consenso (A) y la secuencia mutada del haplotipo B1 (B). La flecha indica la posición nucleotídica que varía entre ambas. A: Secuencia consenso B: Secuencia mutada Figura 7: Comparación de la estructura secundaria de mínima energía libre predicha con el programa MFOLD para una región del gen p23 entre la secuencia consenso (A) y la secuencia mutada del haplotipo Q1 (B). El círculo indica la posición nucleotídica que varía entre ambas. 67 CAPÍTULO II El número de posiciones aminoacídicas polimórficas encontradas en p20 (54 de un total de 161 residuos) representan el 33,5% del total, y de éstas, 30 son únicas y 24 compartidas (Tabla 3). Sólo uno de los cambios coincide con la secuencia de p20 de otros aislados de CTV (T36 y Qaha). Para p23 el 77,4% de las posiciones aminoacídicas fueron polimórficas (96 de los 124 residuos), con 85 cambios compartidos y 11 únicos (Tabla 4). De todos los cambios aminoacídicos observados sólo 2 se hallan en las secuencias tipo de p23 utilizadas en los alineamientos (T385 y T30), y el cambio detectado en el haplotipo Q1 coincide con la secuencia de un aislado no incluido en los alineamientos (Sambade et al., 2003). De los 54 cambios aminoacídicos observados en p20, 38 pertenecen al mismo grupo (ácido, básico, neutro polar o neutro apolar) y 16 supusieron un cambio de grupo, mientras que de los 96 observados en p23 sólo 6 pertenecieron al mismo grupo y el resto supusieron un cambio de grupo, si bien 80 de esos cambios fueron entre neutro no polar y neutro polar. II.3.3.3. Variación genética dentro de y entre las poblaciones Con el fin de evaluar la fiabilidad del análisis de SSCP para seleccionar variantes de secuencia, se calculó la distancia nucleotídica entre todos los pares de clones con el mismo perfil de SSCP para cada gen. La diversidad nucleotídica entre todos los clones que presentan un mismo haplotipo para p20 es 0.00042 ± 0.00013 y 0.00053 ± 0.00026 para p23. Se calculó la diversidad genética dentro de cada población seleccionada y de la planta donante usando la distancia nucleotídica entre los haplotipos y su frecuencia en cada población (determinada por el análisis de SSCP). Los valores de diversidad intrapoblacional oscilaron entre 0 y 0.00208 para p20 y entre 0 y 0.00241 para p23. Para p20 el valor máximo lo encontramos en la población 388.2.1.I y para p23 en la población 388.1.6.III. Aunque en p23 encontramos valores ligeramente superiores que en p20, en general todos ellos, incluidos los de la planta donante, fueron muy bajos. Tabla 5: Diversidad nucleotídica de p20 y error estándar* (entre paréntesis) en la planta donante, dentro de cada una de las poblaciones seleccionadas y agrupándolas por individuo o tiempo post-inoculación. PLANTA DONANTE 0.00046 (0.00022) Plantas x1 injertos 1 2 3 I II III TOTAL 0.00129 (0.00085) TOTAL 0.00117 (0.00040) Plantas x6 injertos 1 2 3 0.00062 (0.00035) TOTAL 0.00048 (0.00016) 0.00208 (0.00065) 0 (0) 0 (0) 0.00083 (0.00038) 0.00196 (0.00096) 0.00062 (0.00035) 0.00109 (0.00047) 0.00130 (0.00045) 0.00145 (0.00051) 0.00041 (0.00029) 0.00099 (0.00042) 0.00097 (0.00026) 0.00103 (0.00081) 0 (0) 0.00021 (0.00019) 0.00046 (0.00033) 0.00030 (0.00017) 0.00044 (0.00033) 0.00038 (0.00025) 0.00049 (0.00018) 0.00140 (0.00079) 0.00090 (0.00025) 0.00042 (0.00017) 0.00090 (0.00024) 0.00028 (0.00013) 0.00075 (0.00027) * Estimado mediante re-muestreo con 1000 réplicas. 68 CAPÍTULO II Tabla 6: Diversidad nucleotídica de p23 y error estándar* (entre paréntesis) en la planta donante, dentro de cada una de las poblaciones seleccionadas y agrupándolas por individuo o tiempo post-inoculación. PLANTA DONANTE 0.00045 (0.00025) Plantas x1 injertos 1 2 3 I II III TOTAL 0.00163 (0.00135) TOTAL 0.00085 (0.00076) Plantas x6 injertos 1 2 3 0 (0) TOTAL 0.00088 (0.00070) 0 (0) 0.00051 (0.00049) 0.00099 (0.00073) 0.00146 (0.00117) 0.00160 (0.00109) 0 (0) 0.000105 (0.00062) 0.00092 (0.00059) 0.00183 (0.00130) 0.00221 (0.00143) 0.00156 (0.00127) 0.00191 (0.00138) 0.00231 (0.00144) 0.00027 (0.00026) 0.00072 (0.00070) 0.00121 (0.00079) 0.00241 (0.00144) 0.00027 (0.00026) 0.00051 (0.00049) 0.00143 (0.00099) 0.00184 (0.00125) 0.00009 (0.00008) 0.00074 (0.00056) 0.00178 (0.00124) 0.00181 (0.00136) 0.00155 (0.00135) * Estimado mediante re-muestreo con 1000 réplicas. El efecto de distintos factores en la variación y distribución de los haplotipos en la población se estudió mediante análisis de la varianza molecular (AMOVA). Ésta realiza estimas de los componentes de la varianza y los valores de los estadísticos F y evalúa su significación estadística (Excoffier et al., 1992). Los análisis AMOVA se efectuaron agrupando los datos según el número de injertos o según el tiempo transcurrido hasta el análisis, considerando el tipo y frecuencia de haplotipos detectados en cada grupo y estimando la probabilidad de que esa distribución sea al azar. Tanto en el caso de p20 (Tablas 7 y 9) como en el de p23 (Tablas 8 y 10) el análisis AMOVA mostró que la variación entre grupos no era significativa, fuesen los grupos en función del número de injertos (Tablas 7 y 8) o en función del tiempo transcurrido desde la inoculación (Tablas 9 y 10). La variación dentro de plantas o entre plantas del mismo grupo sí resultó significativa en la mayoría de los casos, siendo la variación dentro de plantas la que más contribuía a la variación total. Estos datos indican que el virus es estable y que ni el factor injerto ni el factor tiempo desde la inoculación están influyendo significativamente en la estructura de la población. Tablas 7: AMOVA de p20 agrupando las plantas según el número de injertos (grupos: donante, x1 y x6 injertos). Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total * p<0.05 Grados de libertad 2 16 377 395 Suma de cuadrados 0.749 5.200 66.889 72.838 Componentes de la varianza -0.00003 Va 0.00738 Vb 0.17742 Vc 0.18477 Porcentaje de variación -0.02 3.99 96.02 F -0.00019 0.03993‫٭‬ 0.03975‫٭‬ 69 CAPÍTULO II Tablas 8: AMOVA de p23 agrupando las plantas según el número de injertos (grupos: donante, x1 y x6 injertos). Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total * p<0.05 Tabla 9: AMOVA de p20 agrupando las plantas según el tiempo transcurrido desde la inoculación hasta el análisis (grupos: donante, análisis I, II y III). Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total * p<0.05 Tabla 10: AMOVA de p23 agrupando las plantas según el tiempo transcurrido desde la inoculación hasta el análisis (grupos: donante, análisis I, II y III). Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total * p<0.05 Grados de libertad 3 15 377 395 Suma de cuadrados 9.068 25.658 70.067 104.793 Componentes de la varianza 0.00997 Va 0.07624 Vb 0.18585 Vc 0.27206 Porcentaje de variación 3.66 28.02 68.31 F 0.03664 0.29088‫٭‬ 0.31686 Grados de libertad 3 15 377 395 Suma de cuadrados 0.516 5.433 66.889 72.838 Componentes de la varianza -0.00249 Va 0.00924 Vb 0.17742 Vc 0.18418 Porcentaje de variación -1.35 5.02 96.33 F -0.01349 0.04950‫٭‬ 0.03667‫٭‬ Grados de libertad 2 16 377 395 Suma de cuadrados 12.315 22.411 70.067 104.793 Componentes de la varianza 0.03767 Va 0.06074 Vb 0.18585 Vc 0.28427 Porcentaje de variación 13.25 21.37 65.38 F 0.13252 0.24632‫٭‬ 0.34620‫٭‬ Para simplificar los análisis agrupamos los datos según el número de injertos usados en la inoculación o del tiempo transcurrido entre ésta y el análisis, para observar el efecto de estos factores en la diversidad nucleotídica intra- e interpoblacional (Tablas 11 y 12). 70 CAPÍTULO II p20 DONANTE x1injertos x6injertos DONANTE 0.00046 (0.00023) x1injertos 0.00103 (0.00037) x6injertos 0.00076 (0.00023) 0.00058 (0.00013) 0.00087 (0.00029) 0.00069 (0.00014) p23 DONANTE x1injertos x6injertos DONANTE 0.00045 (0.00025) x1injertos 0.00099 (0.00067) x6injertos Tabla 11: Diversidad nucleotídica de p20 y p23 en función del número de injertos utilizados en la inoculación. 0.00078 (0.00041) 0.00168 (0.00122) 0.00163 (0.00125) 0.00174 (0.00129) La característica general de los datos obtenidos con las dos formas de agrupación es la baja diversidad nucleotídica que se observa en ambos casos. Los valores de diversidad de la planta donante fueron muy bajos y prácticamente idénticos en ambos genes. La diversidad de p20 fue ligeramente mayor en las plantas inoculadas con un solo injerto que en las inoculadas con 6 (Tabla 11), y en el análisis II que en el primero o el tercero (Tabla 12), mientras que en p23 se observó una ligera tendencia a aumentar la diversidad con el número de injertos (Tabla 11) y con el tiempo transcurrido entre la inoculación y el análisis (Tabla 12). Esta tendencia podría estar relacionada con el incremento en la frecuencia del haplotipo Q1 en plantas inoculadas con 6 injertos (Tabla 2). Los valores de diversidad intra- e inter-poblacionales fueron del mismo orden en cada uno de los genes. p20 DONANTE I II III DONANTE 0.00046 (0.00023) I 0.00092 (0.00030) II III 0.00070 (0.00023) 0.00080 (0.00020) 0.00102 (0.00029) 0.00113 (0.00037) 0.00051 (0.00013) 0.00073 (0.00023) 0.00084 (0.00023) 0.00055 (0.00012) p23 DONANTE I II III DONANTE 0.00045 (0.00025) I 0.00086 (0.00071) II III Tabla 12: Diversidad nucleotídica de p20 y p23 en función del tiempo transcurrido desde la inoculación. 0.00072 (0.00043) 0.00126 (0.00079) 0.00127 (0.00095) 0.00159 (0.00112) 0.00171 (0.00121) 0.00158 (0.00124) 0.00176 (0.00127) 0.00180 (0.00130) La presión de selección que actúa sobre cada región codificante puede ser estimada mediante el cociente entre los valores de diversidad nucleotídica en las posiciones no sinónimas y sinónimas (dNS/dS). Sin embargo este análisis presenta algunas limitaciones cuando los datos son muy homogéneos y la variabilidad es muy baja, como ocurre en nuestro caso. En muchas de las poblaciones el valor de dS para ambos genes es cero y el cociente dNS/dS no aporta ninguna información. En la mayoría de las poblaciones hay pocas secuencias con cambios nucleotídicos, de ahí los bajos valores de diversidad obtenidos, pero muchos de esos cambios son 71 CAPÍTULO II no sinónimos, lo que da lugar a cocientes superiores a 1 que pueden dar una idea equivocada del grado de presión de selección de las poblaciones. Como se observa en las Tablas 3 y 4 el número absoluto de substituciones no sinónimas es muy superior al de sinónimas para ambos genes. Además, para casi todas las estimaciones de sustituciones sinónimas y no sinónimas el valor del error estándar (Nei y Kumar, 2000) es del mismo orden de magnitud que los valores de dNS y dS (Tabla 13), por lo que estos valores son poco significativos y no permiten inferir diferencias en el grado de selección. Tabla 13: Rango de valores obtenidos al estimar las sustituciones no sinónimas por sitio no sinónimo dNS, las sustituciones sinónimas por sitio sinónimo dS y la relación media dNS/dS para ambos genes en cada una de las plantas analizadas. p20 Donante p23 Donante dNS 0.00066 (0.00032) dS 0 (0) dNS⁄dS x1 injerto dNS [0-0.00210 (0.00146)] dS [0-0.00439 (0.00204)] dNS⁄dS [0.2-1.1] x6 injerto dNS [0-0.00159 (0.00064)] dS [0-0.00176 (0.00101)] dNS⁄dS [0.1-2.4] dNS 0.00068 (0.00039) dS 0 (0) dNS⁄dS x1 injerto dNS [0-0.00344 (0.00231)] dS [0-0.00250 (0.00251)] dNS⁄dS [0-0.52] x6 injerto dNS [0-0.00308 (0.00234)] dS [0-0.00146 (0.00144)] dNS⁄dS [2-4] El análisis FEL de la población donante junto con las poblaciones en las que aparecía el haplotipo B1 de p20 o el haplotipo Q1 de p23 puso de manifiesto que no hay ninguna posición sometida a presión de selección positiva. Los codones 44, 67 y 89 de p20 y el 33 de p23 presentan presión de selección negativa. En la población donante y en aquellas en que se observaron los haplotipos B1 de p20 o Q1 de p23 se comparó la distribución de haplotipos observados y esperados bajo un modelo de evolución neutral con el test de Ewens-Watterson (Tabla 14). Sólo se analizaron estas poblaciones i) porque el resto presentaba obviamente una situación muy alejada de la evolución neutral, con un perfil típico de las quasiespecies, y ii) para ver hasta qué punto era significativa la aparición de los haplotipos B1 y Q1 en las poblaciones seleccionadas. La comparación de los valores de homocigosidad esperados y observados para p20 mostró que éstos difieren significativamente de la neutralidad en la planta donante y en las demás poblaciones analizadas, excepto 388.1.1.III (Tabla 14). Los valores de homocigosidad observados en las plantas analizadas fueron menores que en la donante, excepto en la población 388.3.6.III (Tabla 14), probablemente debido a que la frecuencia del haplotipo predominante (A1) en la planta donante y en 388.3.6.III se reduce en el resto de las plantas por la aparición del nuevo haplotipo 72 CAPÍTULO II B1 junto a un número variable según la población de haplotipos minoritarios. Para p23, las poblaciones marcadas en rojo (Tabla 14) presentan valores de homocigosidad que no difieren significativamente de la neutralidad debido a la frecuencia del haplotipo Q1, mientras que el resto de poblaciones incluida la de la planta donante, presentan valores que se alejan de la neutralidad. El haplotipo mayoritario en la planta donante (P1) es diferente al de las plantas 388.2.6.III y 388.3.6.III (Q1). La población 388.3.1.III presenta valores de neutralidad aunque la frecuencia de haplotipos en la población es de 17 (P1) y 3 (Q1), siendo la única población en la que el resultado de esta prueba no es coherente. Tabla 14: Homocigosidad observada y esperada para p20 y p23 según el modelo neutral de infinitos alelos y probabilidad de que ambas sean diferentes (re-muestreo con 10.000 distribuciones aleatorias). p20 Donante 388.1.1.I 388.1.1.II 388.1.1.III 388.1.6.II 388.3.6.II 388.3.6.III p23 Donante 388.1.1.I 388.1.1.II 388.1.1.III 388.3.1.I 388.3.1.II 388.3.1.III 388.1.6.II 388.1.6.III 388.2.6.I 388.2.6.II 388.2.6.III 388.3.6.I 388.3.6.II 388.3.6.III Observada Esperada Probabilidad 0.79321 0.535 0.41 0.555 0.575 0.65 0.815 0.41067 0.43981 0.29389 0.56029 0.29479 0.35729 0.55777 1.0 0.82 0.93 0.58 1.0 1.0 1.0 Observada 0.84259 0.485 0.59 0.495 0.82 0.735 0.745 0.43 0.34 0.665 0.43 0.905 0.515 0.515 0.82 Esperada 0.49439 0.55812 0.44188 0.56167 0.73219 0.56103 0.73589 0.44168 0.35559 0.5578 0.44342 0.7326 0.56021 0.55871 0.72873 Probabilidad 1.0 0.3994 0.8986 0.4342 0.7029 0.8928 0.5369 0.573 0.5643 0.7951 0.5696 1.0 0.4901 0.4873 0.7148 Se efectuaron también las pruebas de Tajima D (1989), Fu y Li D‫ ٭‬y F‫ )3991( ٭‬o Fu Fs (1997), para determinar si el patrón de variación observado dentro de poblaciones se comporta de acuerdo con el esperado bajo la hipótesis de neutralidad (su base teórica fue explicada en el apartado de materiales y métodos). El rechazo de la hipótesis nula supone que existen fuerzas evolutivas que provocan el alejamiento de la situación de neutralidad. No obstante, como la interpretación de estas pruebas es a veces complicada, establecimos el criterio de aceptar la 73 CAPÍTULO II hipótesis nula sólo cuando ninguno de los estadísticos fuese significativamente diferente de cero. Tabla 15: Pruebas de neutralidad de las poblaciones de p20 y p23 en la planta donante y en las plantas inoculadas en las que aparecen los haplotipos B1 (p20) o Q1 (p23). 1 p20 Donante 388.1.1.I 388.1.1.II 388.1.1.III 388.1.6.II 388.3.6.II 388.3.6.III p23 Donante 388.1.1.I 388.1.1.II 388.1.1.III 388.3.1.I 388.3.1.II 388.3.1.III 388.1.6.II 388.1.6.III 388.2.6.I 388.2.6.II 388.2.6.III 388.3.6.I 388.3.6.II 388.3.6.III 1 D -1.885‫٭‬ -0.792 -1.445 -0.286 -2.056 -1.974‫٭٭٭‬ -1.512 D‫٭‬ -2.793‫٭‬ -1.254 -2.258 -0.593 -2.959‫٭٭‬ -2.812‫٭‬ -2.053 F‫٭‬ -2.879‫٭‬ -1.297 -2.333 -0.586 -3.124‫٭٭‬ -2.974‫٭‬ -2.188 Fs -4.799‫٭٭٭‬ -1.177 -2.446‫٭٭‬ -0.233 -3.952‫٭٭٭‬ -2.991‫٭٭٭‬ -1.863‫٭٭٭‬ D -1.7235‫٭‬ 0.1727 -0.79238 0.03881 -0.59155 -1.44071 -0.0861 -0.52640 -0.59759 -0.81235 -0.78678 -1.16439 -0.08998 0.06325 -0.59155 D‫٭‬ -2.81255‫٭‬ -0.59347 -1.25499 1.00649 0.64952 -1.25499 0.64952 -1.25499 -0.75932 -0.59347 -1.69308 -1.53959 -0.59347 -0.59347 0.64952 F‫٭‬ -2.89347‫٭‬ -0.44379 -1.29760 0.85286 0.36728 -1.50165 0.52031 -1.21388 -0.82315 -0.74868 -1.66138 -1.64766 -0.52510 -0.47767 0.36728 Fs -3.695‫٭٭‬ 0.15308 -1.177 0.875 -0.097 -0.674 0.381 -0.882 -1.401 -0.775 -0.457 -0.871 -0.060 0.066 -0.097 D: Estadístico de la prueba de Tajima. D‫ ٭‬y F‫ :٭‬Estadístico de las pruebas de Fu y Li. Fs: Estadístico de la prueba de Fu. ‫ :٭‬p< 0.05. ‫ :٭٭‬p< 0.02. ‫ :٭٭٭‬p< 0.01. Para p20 los valores de los estadísticos de todas las poblaciones fueron significativos, excepto en 388.1.1.I y 388.1.1.III donde aceptamos la hipótesis nula (Tabla 15). Por tanto, la estructura de la mayoría de las poblaciones se desvía significativamente de la neutralidad indicando selección direccional. El hecho de que 388.1.1.III no se desvíe significativamente de la neutralidad con estas pruebas coincide con el resultado obtenido mediante el test de Ewens-Watterson. Para p23 los resultados de las pruebas fueron menos consistentes. Mientras la población donante muestra claramente una selección direccional, los valores de los estadísticos en las demás plantas no presentan una desviación significativa de la neutralidad, contrastando en algunos casos con los resultados del test de EwensWatterson. Aunque la mayoría de las poblaciones presentan valores negativos en todos los estadísticos, que indicarían una posible selección direccional, algunas de 74 CAPÍTULO II ellas presentan valores positivos para unas pruebas y negativos para otras, y la población de 388.1.1.III presenta valores positivos en todos los casos, que indicarían la presencia de selección estabilizadora (Tabla 15). II.4. DISCUSIÓN La reducción en el tamaño efectivo de una población viral como consecuencia de un cuello de botella frecuentemente da lugar a fenómenos de deriva genética que pueden cambiar la estructura de la población y sus características biológicas. En el caso de CTV, estudios previos pusieron de manifiesto que la transmisión por pulgón o injerto a un nuevo huésped puede dar lugar a cambios de frecuencia en las distintas variantes de secuencia del virus, que en ocasiones resultan en cambios de sus características patogénicas (Ayllón et al., 1999b, 2006, D’Urso et al., 2000; Sentandreu et al., 2006). Sin embargo, en estos estudios las transmisiones se efectuaron entre especies diferentes de cítricos, por lo que los cambios observados en la población viral podrían ser debidos al injerto, al cambio de especie huésped o a la interacción entre ambos. En este trabajo se intentó analizar el efecto específico del cuello de botella que se produce cuando se inoculan poblaciones de CTV mediante injerto, inoculando el aislado T388 a plantas de semilla de naranjo dulce del mismo cultivar. Una limitación inherente al sistema CTV-cítricos es la imposibilidad de cuantificar de forma fiable el número de viriones que se aportan en cada inoculación, y por tanto la intensidad del cuello de botella. En consecuencia, asumimos que la cantidad de viriones sería en principio proporcional a la cantidad de corteza utilizada para la inoculación, e injertamos lotes de plantas con 1, 2, 4 o 6 trozos de corteza lo más homogéneos posible en cuanto a su tamaño y brotes de procedencia. La planta de la colección que se utilizó como fuente de inóculo estaba infectada desde al menos 15 años antes de iniciar este experimento, por lo que se consideró que su población viral estaría en equilibrio. El análisis de la población de los genes p20 y p23 de la planta donante y de todas las plantas inoculadas se efectuó a partir de RNA total de una mezcla de hojas para minimizar el posible efecto de la distribución irregular de variantes de secuencia en la planta infectada (D’Urso et al., 2000). Los análisis se repitieron cada 6 meses a lo largo de 1 año y medio para observar además un posible efecto del factor tiempo de infección. En una primera etapa se analizaron mediante SSCP los productos de RT-PCR de p20 y p23 obtenidos con cebadores internos diseñados en zonas conservadas en distintos aislados, por lo que asumimos que no generarían una selección preferente de determinadas variantes de secuencia. En este análisis se separan electroforéticamente moléculas de DNA con el mismo tamaño y secuencias diferentes, proporcionando un perfil de bandas de DNA característico de la población. La intensidad de estas bandas es proporcional a la frecuencia de las correspondientes variantes de secuencia en la población viral y en general cualquier variante que suponga al menos un 10% de la población puede ser detectada (Rubio et al., 2000), por lo que los perfiles de SSCP de los productos amplificados dan una primera idea de las diferencias entre poblaciones. Las dos limitaciones que presenta esta primera imagen de la población son: por una parte, variantes de secuencia que están en baja frecuencia no dan lugar a cambios 75 CAPÍTULO II visibles en el perfil de SSCP de la población, como fue el caso de las plantas 388.1.6.II, 388.3.6.II y 388.3.6.III que contienen en su población alrededor de un 5% de la variante B1 de p20; y por otra, una variante de secuencia cuyo perfil de SSCP sea similar al de otra, puede no ser visible en el perfil de SSCP de la población aunque su frecuencia sea superior al 10%. Tal fue el caso de la variante B1, cuyo perfil de SSCP se parece al de la variante mayoritaria de p20 A1, y que no dio lugar a cambios visibles en las poblaciones de las plantas 388.1.1.I, 388.1.1.II y 388.1.1.III, pese a estar presente en las mismas con una frecuencia superior al 20%. Análogas limitaciones se observaron en el análisis de las poblaciones de p23, en el que sólo las plantas 388.2.6.III y 388.3.6.III mostraron un perfil distinto de SSCP, pese a que la variante de secuencia Q1, que no se detectó en la planta donante, se halla en la mayoría de las plantas inoculadas con frecuencias superiores al 10%. Considerando la homogeneidad de los perfiles poblacionales de casi todas las plantas, y que las diferencias de secuencia entre las variantes detectadas eran mínimas, se analizó en detalle la población de las plantas inoculadas con 1 o con 6 trozos de corteza, por representar éstas los dos extremos del tratamiento. De cada una de las plantas seleccionadas se analizaron mediante SSCP 20 clones al azar de p20 y otros tantos de p23 para caracterizar los haplotipos presentes en cada población y estimar su frecuencia en la misma. De cada población se secuenciaron todos los clones que presentaban un perfil de SSCP diferente al mayoritario y entre 2 y 15 clones del perfil mayoritario. Este método para caracterizar las poblaciones virales ha sido utilizado con distintos virus (Rubio et al., 2001; Vives et al., 2002; Ayllón et al., 2006; Martín et al., 2006, 2009; Sentandreu et al., 2006). La diversidad nucleotídica entre todos los clones con el mismo haplotipo de p20 o de p23 fue de 0.00042 ± 0.00013 y 0.00053 ± 0.00026, respectivamente, valores generalmente inferiores a la distancia nucleotídica media entre clones con distinto haplotipo, lo que indica que el análisis de SSCP es una herramienta adecuada para la identificación de variantes de secuencia. Por otra parte, aunque algunas de las mutaciones detectadas podrían ser errores introducidos por la retrotranscriptasa SuperScript o por la Taq polimerasa durante la RT-PCR (Bracho et al., 1998), la gran homogeneidad encontrada en las poblaciones analizadas hace pensar que la pequeña variabilidad potencialmente generada por las enzimas no alteraría las conclusiones del estudio. La estructura de la población de ambos genes encontrada en la mayoría de las plantas analizadas fue la característica de las cuasiespecies virales, con un haplotipo predominante y algunas variantes de secuencia que difieren de 1 a 3 nucleótidos con respecto a la secuencia mayoritaria. En un estudio previo se caracterizó la población de p20 del aislado de colección T388 y se encontró un haplotipo mayoritario que representaba el 93% de los clones analizados y distintas variantes de secuencias minoritarias, algunas de ellas alejadas filogenéticamente del haplotipo mayoritario, si bien para detectar éstas fue necesario analizar más de 300 clones (Ayllón et al., 1999b, 2006). En nuestro caso la mayoría de haplotipos minoritarios detectados aparecían sólo en alguna población o sólo en alguno de los análisis y aparentemente no llegan a fijarse en la población como efecto de la selección estabilizadora, ya que no deben proporcionar ningún beneficio al conjunto 76 CAPÍTULO II de la misma. Sin embargo, para cada uno de los genes se detectó un haplotipo que difiere en un solo nucleótido del mayoritario y que se repite en distintas poblaciones, llegando en algún caso a convertirse en el haplotipo mayoritario. Ninguno de estos haplotipos (B1 de p20 y Q1 de p23) fue detectado en la población de la planta donante, si bien es posible que existiesen en la población de partida y no fuesen detectados en nuestro análisis, ya que al menos el haplotipo Q1 fue detectado en otro análisis de la misma planta de la colección efectuado en el laboratorio (Comellas, et al. datos no publicados). Sólo una de las poblaciones de p20 en las que aparecía el haplotipo B1 presentó una estructura que no era significativamente distinta de la esperada bajo selección neutral, lo que sugiere una perdida de adaptación del haplotipo mayoritario y la aparición de un nuevo haplotipo B1 tan eficiente como el A1. La aparición de B1 fue más frecuente en las plantas inoculadas con un injerto que en las inoculadas con seis, si bien su frecuencia no es estadísticamente significativa como observamos en las diferentes pruebas de neutralidad. En el caso de p23 esta situación se repitió en 8 de las 14 poblaciones en las que aparecía el haplotipo Q1, lo que sugiere que su eficiencia debe ser comparable a la del mayoritario P1. Sin embargo la aparición y frecuencia de Q1 no puede asociarse con un fenómeno de deriva genética debido a la un cuello de botella, ya que este haplotipo es más frecuente en las plantas con seis injertos que en las inoculadas con uno solo. El análisis AMOVA basado en las distancias genéticas y agrupando los datos en función del número de injertos o del tiempo transcurrido entre la inoculación y el análisis, mostró que la variación entre grupos no era estadísticamente significativa para ninguno de los dos genes, mientras que si lo era la variación entre plantas del mismo grupo y dentro de plantas. Esto indica que ni el tiempo ni el número de injertos son factores importantes en la modulación de la estructura de la población, y por tanto podemos considerar una única población global. Agrupando las poblaciones por el número de injertos o por el tiempo transcurrido entre la inoculación y el muestreo, a efectos de facilitar el análisis de los datos, se observó que no había una variación significativa de la diversidad genética entre la planta donante y las inoculadas con uno o con seis injertos y analizadas a distintos tiempos, si bien en el caso de p23 se observaba una ligera tendencia a aumentar la diversidad con el número de injertos y con el tiempo transcurrido hasta el análisis. La diversidad general estimada es de 0.00083 ± 0.00022 para p20 y de 0.00144 ± 0.00111 para p23, valores inferiores a los obtenidos en otros virus de plantas (García-Arenal et al., 2001; Vives et al., 2002; Martín et al., 2006) y en otros análisis de diversidad de CTV (Ayllón et al., 2006). En cuanto a los valores de diversidad nucleotídica intrapoblacionales oscilaron entre 0 y 0.00208 para p20 y entre 0 y 0.00241 para p23. La diversidad de p20 estimada previamente para el aislado T388 fue de 0.0023 ± 0.0003 (Ayllón et al., 2006). No hay datos sobre la diversidad de p23 en T388. Algunas de las variantes de p20 o p23 que se encontraron en otros trabajos no se detectaron en nuestro estudio. La comparación de las secuencias nucleotídicas de los distintos haplotipos de p20 y p23 puso de manifiesto que la diferencia máxima entre clones de cada gen fue de 3 nucleótidos, lo que evidencia de nuevo la gran homogeneidad de las poblaciones. 77 CAPÍTULO II La distribución de los cambios nucleotídicos a lo largo de ambos genes fue aleatoria y no se detectaron zonas que acumulasen más cambios que otras. Sólo una fracción menor de los cambios detectados en p20 fueron compartidos entre clones (26 de 74) y la mayoría de ellos (20) correspondieron al cambio presente en el haplotipo B1 detectado en distintas poblaciones. En el caso de p23 la proporción de cambios compartidos entre clones fue mayor (83 de 103) pero también la mayoría de ellos (77) correspondieron al cambio presente en el haplotipo Q1 que se detectó con más frecuencia que el B1. La situación a nivel aminoacídico fue muy similar. Es decir, con la excepción de los cambios presentes en los haplotipos B1 de p20 y Q1 de p23 muy pocos cambios se repiten entre las poblaciones. El haplotipo B1 se detectó en seis de las poblaciones analizadas, con una frecuencia de entre 5 y 20% de los clones y tiene un único cambio nucleotídico que no se halla en otras secuencias de CTV (Martín et al., 2009) y que no altera la estructura secundaria en comparación con el tipo salvaje. Sin embargo el haplotipo Q1 de p23 aparece en 14 de las poblaciones, con una frecuencia de entre 10 y 95% de los clones, llegando a ser el haplotipo mayoritario en dos de ellas. Este haplotipo, que también contiene un solo cambio nucleotídico, coincide con la secuencia del aislado K (Sambade et al., 2003; Martín et al., 2009) y potencialmente produce un ligero cambio en la estructura secundaria de la proteína. La inferencia de las relaciones filogenéticas entre los clones analizados por el método del vecino más próximo dieron lugar para ambos genes a dos árboles sin raíz que muestran la misma topología, donde todas la variantes de secuencia se agrupan estrechamente con la secuencia tipo de T388. La dirección e intensidad de la presión selectiva que actúa sobre una región codificante puede ser estimada por el cociente entre los valores de diversidad nucleotídica en las posiciones no sinónimas y sinónimas (dNS/dS), pero este parámetro resulta poco informativo cuando los datos son muy homogéneos, como fue el caso en este trabajo y en otros anteriores (Marco y Aranda, 2005). Por otra parte, la mayoría de los valores de diversidad nucleotídica obtenidos presentaban un valor de error estándar del mismo orden, lo que hace que fuesen poco significativos. Curiosamente, el cambio nucleotídico de los dos haplotipos que se repiten (B1 de p20 y Q1 de p23) fue un cambio no sinónimo. A pesar de la aparición repetida de estos haplotipos, a veces con alta frecuencia, un análisis FEL de las poblaciones en que aparecen no encontró ninguna posición seleccionada positivamente, pero sí algunos codones con selección negativa. La proteínas p20 y p23 actúan como supresores del silenciamiento en N. benthamiana y N. tabaccum (Lu et al., 2004) y probablemente ejercen una función similar en cítricos (Fagoaga et al., 2005). En la secuencia de p20 hay determinadas posiciones (I38, Y113, R130, L137, S141 y L159) relacionadas con esta función que se encuentran estrictamente conservadas entre los closterovirus (Reed et al., 2003). Dichas posiciones permanecen invariables en las variantes de secuencia encontradas en este experimento con excepción de la posición R130, que en todas las variantes de secuencia analizadas y en los aislados de referencia, excepto T36, Qaha y en una de nuestras variantes, es K130. Asimismo, en la secuencia de p23 hay un dominio de unión de RNA, que incluye varios residuos básicos entre las posiciones 50 y 67, y un motivo de dedo de Zinc entre las posiciones 68 y 86 que son importantes para su función biológica (López et al., 2000; Satyanarayana et al., 78 CAPÍTULO II 2002b). Ambos motivos están conservados en todas las variantes de secuencia encontradas en este experimento. En resumen, la transmisión por injerto a plantas de la misma variedad no altera de forma apreciable la estructura poblacional y diversidad nucleotídica de un aislado de CTV con población homogénea como T388, incluso cuando se utiliza un único trozo de corteza para la inoculación. No obstante, para los dos genes analizados se detectan nuevas variantes de secuencia, muy próximas a la secuencia maestra, que incrementan su frecuencia hasta hacerse predominantes en algunas poblaciones. Dilucidar si la transmisión por injerto no causa por sí misma una reducción del tamaño poblacional efectivo suficiente para inducir fenómenos de deriva genética, o si en el caso de aislados con poblaciones más heterogéneas los resultados podrían ser diferentes, necesitaría experimentación adicional. 79 CAPÍTULO III TRANSMISIÓN DE CTV POR INJERTO A DISTINTAS ESPECIES COMERCIALES DE CÍTRICOS: EFECTO DEL CAMBIO DE HUÉSPED EN LA ESTRUCTURA DE LA POBLACIÓN VIRAL 80 CAPÍTULO III III.1. INTRODUCCIÓN Como ya se indicado, los procesos de transmisión por pulgón o injerto suponen un cuello de botella que reduce el tamaño efectivo de la población y pueden dar lugar a fenómenos de deriva genética y cambios en la población viral al establecerse en la planta sana una nueva población que no representa necesariamente la original. Cuando la transmisión se efectúa a una especie o variedad diferente a la de la planta donante, a estos cambios aleatorios pueden sumarse efectos derivados de la selección de variantes que interactúen de forma más eficiente con el nuevo huésped. Estudios anteriores pusieron de manifiesto que aislados de CTV obtenidos mediante transmisión por injerto a nuevos huéspedes mostraban diferencias en la estructura de sus respectivas poblaciones de los genes p18 y p20 (Ayllón et al., 1999b, 2006), lo que sugería que la transmisión por injerto podía ser un proceso importante en el moldeado de las poblaciones de CTV. Sin embargo, estos experimentos incluían la transmisión por injerto junto con un cambio de huésped, por lo que los cambios poblacionales observados podían ser debidos a cualquiera de los dos factores o a una interacción entre ambos. En el capítulo anterior se estudió con detalle el efecto del injerto en la población viral de plantas inoculadas a partir de una donante de la misma especie que contenía una población viral homogénea y presumiblemente estable, ya que al inicio del experimento llevaba infectada unos 15 años. Una vez comprobado que la inoculación por injerto tal y como se practica habitualmente no afecta de forma sustancial la estructura y diversidad genética de una población estable de CTV, el objetivo de este capítulo fue analizar los cambios que la transmisión por injerto a diferentes especies y variedades podían causar en las poblaciones de CTV. Para aproximarse en lo posible a las condiciones del campo se eligieron variedades comerciales de naranjo dulce, mandarino y pomelo propagadas sobre citrange Carrizo, que es el patrón predominante en la citricultura española, y se utilizaron dos poblaciones presumiblemente estables de CTV de distinto origen geográfico y características patogénicas. 81 CAPÍTULO III III.2. DISEÑO EXPERIMENTAL CONTROL T388/T385 INJERTO NARANJO WASHINGTON NAVEL BERNA MANDARIN0 SATSUMA OWARI CLEMENULES POMELO MARSH STAR RUBY 1 I II III IV 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Figura 1: Representación esquemática del diseño experimental. A partir de las plantas de naranjo dulce Pineapple propagado sobre citrange Carrizo en las que se mantienen los aislados de CTV T388 y T385 de la colección de virus, se inocularon por injerto con dos trozos de corteza joven grupos de cuatro plantas (1, 2, 3 y 4) de naranjo dulce (variedades Washington navel y Berna), mandarino (variedades satsuma Owari y Clemenules), y pomelo (variedades Marsh y Star Ruby) propagadas sobre citrange Carrizo con cada uno de los aislados. Una vez comprobada la infección mediante IP-ELISA, se analizó mediante SSCP de los genes p20 y p23 la población de cada una de las plantas a los 6, 12, 18 y 24 meses post-inoculación (análisis I, II, III y IV), a partir de una mezcla de hojas jóvenes de la última brotación. También se analizó la población de estos genes en la planta donante como término de comparación. El código utilizado para las muestras incluye la letra inicial de la variedad, el número de la planta y el número de análisis, por ejemplo, la muestra R2IV correspondería al cuarto análisis (24 meses postinoculación) de la planta número 2 de pomelo Star Ruby. El código de letras utilizado fue: N= Washington navel, B= Berna, S= satsuma Owari, C= Clemenules, M= Marsh y R= Star Ruby. III.3. RESULTADOS III.3.1. Análisis de SSCP de las poblaciones virales Una vez comprobada la infección mediante IP-ELISA de todas las plantas, se amplificó para cada uno de los aislados un fragmento del gen p20 y otro de p23 con los mismos cebadores utilizados en los capítulos I y II, obteniéndose fragmentos únicos de DNA de 483 nt para p20 y 372 nt para p23. Se realizó el análisis de SSCP de estos productos de RT-PCR y todos los perfiles presentaron solo dos bandas. Todas las plantas inoculadas con el aislado T388 mostraron el mismo perfil de SSCP para p20 en los cuatro análisis, excepto las muestras R4I y R4IV de la planta 4 de pomelo Star Ruby (Figura 2A), y el mismo perfil del p23, excepto las muestras R2I, R2IV y R4IV también de pomelo Star Ruby (Figura 2B). Dichos 82 CAPITULO III perfiles comunes coincidían con los correspondientes de la planta donante (Figura 2 A y B). Las plantas inoculadas con T385 también mostraban en los cuatro análisis los mismos perfiles de p20 y p23 que su planta donante, excepto la muestra B3IV de naranjo Berna para p20, y las muestras B3I y B3IV de naranjo Berna y R4IV de pomelo Star Ruby para p23, (Figura 2C y D). A) p20 W. Navel 1 I II III IV B) p23 2 3 4 1 Berna 2 3 Donante T388 Satsuma O. 4 1 2 3 4 Clemenules 1 2 3 4 Marsh 1 2 3 4 S. Ruby 1 2 3 4 Donante T388 W. Navel 1 I II III IV C) p20 2 3 4 1 Berna 2 3 4 Satsuma O. 1 2 3 4 Clemenules 1 2 3 4 1 Marsh 2 3 4 S. Ruby 1 2 3 4 Donante T385 W. Navel 1 I II III IV 2 3 4 1 Berna 2 3 4 Satsuma O. 1 2 3 4 Clemenules 1 2 3 4 1 Marsh 2 3 4 S. Ruby 1 2 3 4 D) p23 Donante T385 W. Navel 1 I II III IV 2 3 4 1 Berna 2 3 4 Satsuma O. 1 2 3 4 Clemenules 1 2 3 4 Marsh 1 2 3 4 S. Ruby 1 2 3 4 83 CAPÍTULO III Figura 2: Análisis de SSCP de la población de los genes p20 (paneles A y C) y p23 (paneles B y D) en plantas individuales (1, 2, 3 y 4) de diferentes variedades inoculadas con los aislados T388 (paneles A y B) y T385 (paneles C y D) y en las respectivas plantas donantes, a los 6 (I), 12 (II), 18 (III) y 24 (IV) meses de la inoculación. Las poblaciones con la figura de color gris presentaron un perfil de SSCP diferente. De las poblaciones destacadas con el fondo en rosa y de las poblaciones donantes se analizaron entre 20 y 45 clones al azar. III.3.2. Estimación de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de los haplotipos En vista de la aparente homogeneidad en las poblaciones virales de cada aislado, para estudiar en detalle la variabilidad y evolución de las mismas se seleccionó una planta de cada combinación variedad-aislado y se estudió la composición de la población mediante clonación del producto de PCR y análisis de clones individuales a los 6 y a los 24 meses de la inoculación (análisis I y IV) (Figura 2 casillas marcadas con fondo rosa). En la selección se incluyeron las plantas que habían dado algún perfil diferente en alguno de los análisis, y en el caso del pomelo Star Ruby inoculado con el aislado T388 se seleccionaron las dos plantas que estaban en esta situación. De cada una de las muestras seleccionadas para el análisis en las plantas inoculadas con T388 (Figuras 2A y B) se eligieron entre 20 y 30 clones de cDNA de los genes p20 y p23, se amplificaron mediante PCR con los mismos cebadores y se analizaron mediante SSCP con las mismas condiciones que los productos de RTPCR iniciales. Se analizó un total de 339 clones de p20 y 360 de p23, incluyendo 36 clones de cada gen de la planta donante. Para ambos genes, como se observó en el capítulo II, la planta donante de T388 presentó un perfil más frecuente (A1 para p20 y B1 para p23) y varios haplotipos minoritarios representados por un solo clon (Tablas 1 y 2). Entre las plantas inoculadas con este aislado, en seis de las poblaciones de p20 analizadas se detectó únicamente el haplotipo A1, en otras seis apareció A1 como haplotipo mayoritario y de uno a cuatro haplotipos minoritarios adicionales, y las poblaciones R4I y R4IV de pomelo Star Ruby presentaron un haplotipo mayoritario diferente al resto (A19) si bien en la población R4I aparecía A1 en baja frecuencia (Tabla 1). Entre las poblaciones de p23 analizadas de estas mismas plantas, en una se detectó como único haplotipo B1, el mayoritario de la planta donante, en otra el haplotipo B30, que también se hallaba a baja frecuencia en otra población, otras diez presentaban B1 como haplotipo mayoritario junto con uno a cuatro haplotipos minoritarios adicionales, y las dos poblaciones restantes presentaban un haplotipo mayoritario distinto (B22) junto a otros minoritarios (Tabla 2). De las plantas inoculadas con el aislado T385 se analizaron 319 clones de p20 y 280 de p23, incluyendo 30 clones de cada gen de la planta donante. Como en el caso de T388, la planta donante de T385 presentó para ambos genes un haplotipo mayoritario (C1 para p20 y D1 para p23), si bien el número de haplotipos minoritarios detectados fue mayor en este aislado (5 para p20 y 4 para p23) (Tablas 3 y 4). En contraste con T388, algunos de los haplotipos minoritarios de la planta donante se detectaron también en las poblaciones inoculadas, convirtiéndose en 84 CAPITULO III algún caso en el haplotipo más frecuente (Tablas 3 y 4). Excepto en una población de naranjo Berna (B3IV), el haplotipo mayoritario de p20 de la planta donante (C1) lo fue también en todas las poblaciones de las plantas inoculadas con T385: en dos de ellas aparecía como haplotipo único mientras que en las demás se detectaron de uno a doce haplotipos minoritarios adicionales. El haplotipo de p20 más frecuente en la población B3IV fue C2, uno de los haplotipos minoritarios en la planta donante (Tabla 3). De forma similar, excepto en las dos poblaciones de naranjo Berna (B3I y B3IV) y en una de pomelo Star Ruby (R4IV), el haplotipo mayoritario de p23 en la planta donante (D1) fue también mayoritario en las poblaciones de las plantas inoculadas con T385: en tres de ellas aparecía como haplotipo único y en las demás acompañado de uno a cuatro haplotipos minoritarios (Tabla 4). El haplotipo más frecuente en las poblaciones B3I y B3IV fue D3, detectado como minoritario en la planta donante, y el más frecuente en la población R4IV fue D7, detectado como minoritario en las poblaciones B3I y B3IV (Tabla 4). III.3.3. Estimación de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas III.3.3.1. Relaciones filogenéticas entre las variantes de secuencia Siguiendo la metodología utilizada en el capítulo anterior, a partir de las plantas inoculadas con T388 se secuenciaron 133 clones de p20 y 143 de p23, y a partir de las inoculadas con T385, 136 clones de p20 y 130 de p23. De los 285 clones de p20 del haplotipo A1 detectados en las plantas inoculadas con T388 y en la donante se secuenciaron 96 (Tabla 1), de los que 93 mostraron la misma secuencia y 3 mostraron algún cambio (marcados en color negro en el haplotipo A1). De los 54 clones de p20 que mostraron un haplotipo diferente en el análisis de SSCP se secuenciaron 37 y todos mostraron secuencias diferentes al haplotipo A1, por lo que se obtuvo un total de 40 secuencias incluyendo las tres diferentes del haplotipo A1 (Tabla 1). En las mismas plantas se encontraron 271 clones de p23 con el haplotipo B1 de los que se secuenciaron 89 (Tabla 2): 84 de estos mostraron la misma secuencia y 5 una secuencia diferente (en color negro en el haplotipo B1). De los 89 clones que mostraron un haplotipo diferente en el análisis de SSCP se secuenciaron 54 y todos fueron diferentes al haplotipo B1. En total se obtuvieron 59 secuencias diferentes. En las plantas infectadas con T385 se encontraron 260 clones de p20 con el haplotipo C1, de los que se secuenciaron 83 (Tabla 3): 77 mostraron la misma secuencia y 6 una secuencia diferente (en color negro en el haplotipo C1). De los 59 clones de p20 con haplotipo diferente se secuenciaron 53 y todos mostraron secuencias diferentes a la de C1, obteniéndose en total 59 secuencias diferentes. En las mismas plantas se encontraron 200 clones de p23 con el haplotipo D1 de los que se secuenciaron 66 (Tabla 4): 64 tenían la misma secuencia y 2 una secuencia diferente (en color negro en el haplotipo D1). De los 80 clones de p23 con haplotipo diferente se secuenciaron 64 y todos mostraron secuencias diferentes a la de D1, por lo que en total de obtuvieron 66 secuencias diferentes. Las secuencias de p20 y p23 que mostraban diferencias con respecto a las características de T388 o T385 se alinearon junto con las homólogas de los 8 aislados de comparación que se utilizaron en el capítulo II. En los apéndices A1III, 85 CAPÍTULO III A2III y A3III se muestran todos los cambios nucleotídicos y aminoacídicos detectados en las distintas variantes de secuencia (resumidos en la línea Cambios) con respecto a la secuencias de T388 o T385 y a las de los demás aislados de comparación. El análisis filogenético de estas secuencias por el método neighbor joining dio lugar a 4 árboles sin raíz (Figuras 3 y 4), en los que se observaba de nuevo para ambos genes que las variantes de secuencia detectadas estaban muy próximas a la correspondiente secuencia mayoritaria de la planta donante (difieren como máximo en cinco nucleótidos). La gran mayoría de estas variantes formaban grupos bien definidos en torno a las secuencias características de T388 o T385 y separados de las secuencias de otros aislados. Tabla 1: Haplotipos detectados mediante análisis de SSCP de clones de p20 y frecuencia de los mismos en plantas inoculadas con T388 a distintos tiempos post-inoculación H A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 total 36(21) 22(12) 20(5) 20(8) 20(5) 20(8) 27(6) 20(6) 24(5) 30(8) 20(8) 20(9) 20(9) 20(12) D 34(17+1+1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 13(5) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 17(8) N3I 18(7+1) N3IV 20(5) B3I 20(8) B3IV 20(5) S3I 20(8) S3IV 26(5) C4I 19(5) C4IV 24(5) M4I 30(8) M4IV 17(5) R2I 16(5) R2IV 18(7) R4I 3(3) R4IV 20(11) Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados para cada haplotipo (H) y población. D= planta donante, N= naranjo dulce Washington navel, B= naranjo dulce Berna, S= satsuma Owari, C= Clemenules, M= pomelo Marsh y R= pomelo Star Ruby. Análisis efectuados a los 6 (I) y a los 24 (IV) meses post-inoculación. Todos los haplotipos con secuencia diferente al mayoritario en la planta donante (en marrón) representados con números en negro difieren de éste en un sólo nucleótido, en azul en dos y en rosa en cuatro. Junto con los clones secuenciados del haplotipo A1 se muestran en negro los clones 86 CAPITULO III considerados A1 por su perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. Tabla 2: Haplotipos detectados mediante análisis de SSCP de clones de p23 y frecuencia de los mismos en plantas inoculadas con T388 a distintos tiempos post-inoculación. D B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 B31 total 36(16) 20(9) 20(6) 30(11) 20(7) 30(14) 23(7) 20(9) 24(6) 30(11) 20(10) 21(11) 21(11) 35(13+1+1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 4(4) 1(1) 15(5) 5(5) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 25(10) 20(5) 20(5) 15(5) 1(1) 1(1) N3I 17(5+1) N3IV 19(5) B3I 27(8) B3IV 18(5) S3I 26(8+1+1) S3IV 22(6) C4I 17(6) C4IV 24(6) M4I 28(9) M4IV 15(5) R2I R2IV R4I 23(8) R4IV Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados para cada haplotipo (H) y población. D= planta donante, N= naranjo dulce Washington navel, B= naranjo dulce Berna, S= satsuma Owari, C= Clemenules, M= pomelo Marsh y R= pomelo Star Ruby. Análisis efectuados a los 6 (I) y a los 24 (IV) meses post-inoculación. Todos los haplotipos con secuencia diferente al mayoritario en la planta donante (en marrón) representados con números en negro difieren de éste en un sólo nucleótido, en azul en dos, en rojo en tres y en rosa en cuatro. Junto con los clones secuenciados del haplotipo B1 se muestran en negro los clones considerados B1 por su perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. 87 CAPÍTULO III Tabla 3: Haplotipos detectados mediante análisis de SSCP de clones de p20 y frecuencia de los mismos en plantas inoculadas con T385 a distintos tiempos post-inoculación H C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C30 C31 C32 C33 C34 C35 C36 C37 total D 21(7+1+1) 5(5) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) N2I 18(5+1) N2IV 23(5) 1(1) B3I 16(6) 4(4) B3IV 9(5) 11(5) S3I 32(10+2) 2(2) S3IV 18(5+1) C4I 24(9) C4IV 21(5) M3I 20(5) 1(1) M3IV 20(5) R4I 20(5) R4IV 18(5) 30(18) 23(11) 26(8) 22(12) 20(10) 45(25) 23(11) 24(9) 23(7) 21(6) 22(7) 20(5) 20(7) Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados para cada haplotipo (H) y población. D= planta donante, N= naranjo dulce Washington navel, B= naranjo dulce Berna, S= satsuma Owari, C= Clemenules, M= pomelo Marsh y R= pomelo Star Ruby. Análisis efectuados a los 6 (I) y a los 24 (IV) meses post-inoculación. Todos los haplotipos con secuencia diferente al mayoritario en la planta donante (en marrón) representados con números en negro difieren de éste en un sólo nucleótido, en azul en dos, en rojo en tres y en blanco en cinco. Junto con los 88 CAPITULO III clones secuenciados del haplotipo C1 se muestran en negro los clones considerados C1 por su perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. Tabla 4: Haplotipos detectados mediante análisis de SSCP de clones de p23 y frecuencia de los mismos en plantas inoculadas con T385 a distintos tiempos post-inoculación. H D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 total 30(14) 20(7) 20(5) 30(30) 20(10) 20(10) 20(9) 20(8) 20(5) 20(5) 20(10) D 22(5+1) 5(5) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 7(7) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 2(2) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 2(2) 11(5) 16(16) 15(5) 3(3) N2I 19(6) N2IV 20(5) B3I 3(3) B3IV 3(3) S3I 15(5) S3IV 18(6+1) C4I 18(6) C4IV 20(5) M3I 20(5) M3IV 15(5) R4I 19(5) R4IV 8(5) 20(6) 20(11) Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados para cada haplotipo (H) y población. D= planta donante, N= naranjo dulce Washington navel, B= naranjo dulce Berna, S= satsuma Owari, C= Clemenules, M= pomelo Marsh y R= pomelo Star Ruby. Análisis efectuados a los 6 (I) y a los 24 (IV) meses post-inoculación. Todos los haplotipos con secuencia diferente al mayoritario en la planta donante (en marrón) representados con números en negro difieren de éste en un sólo nucleótido, en azul en dos y en rojo en tres. Junto con los clones secuenciados del haplotipo D1 se muestran en negro los clones considerados D1 por su perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. 89 CAPÍTULO III A) B) T388 x93 M4IV.5 R2I.4 D.8 M4IV.16 R4I.3 T318A N3I.5 M4IV.3 S3IV.2 D.33 N3I.15 N3I.13 D.16 R2I.17 R2I.15 R2I.2 D.32 R4IV.18 R4I.42 R4I.8 x5 R4IV.19 x8 R4I.29 R4I.55 R4IV.5 R2IV.4 64 R4IV.16 N3I.30 C.8 10 12 60 35 42 65 42 R2IV.2 N3I.25 85 SY568R 95 NUagA VT T30 99 T385 Qaha 99 T36 0.01 95 S3I.12 D.14 D.2 B3IV.11 S3I.10 B3I.27 N3I.15 B3IV.8 S3I.27 S3I.26 N3I.18 61 M4I.12 N3I.3 6 M4IV.5 x4 D.28 S3IV.3 T318A N3I.9 64 R4I.38 T388 x84 15 S3I.25 C4I.20 B3I.6 C4I.16 N3IV.15 65 R2IV.10 11 M4I.27 B3I.9 R2I.8 R2IV.14 42 R2I.13 x5 52 R2IV.5 x5 M4IV.10 28 C4I.15 40 R2I.12 x5 36 R2IV.20 R2IV.17 44 37 56 R2IV.1 R2IV.6 97 R4I.21 47R4IV.6 x5 56 NUagA SY568R VT T36 100 Qaha T385 T30 100 0.01 Figura 3: Árbol filogenético sin raíz obtenido por el método neighbor joining con las variantes de secuencia de los genes p20 (A) y p23 (B), detectadas en plantas de diferentes variedades comerciales inoculadas con el aislado T388 a distintos tiempos post-inoculación. Las secuencias indicadas en rojo corresponden a aislados de referencia o a la planta donante (T388). Esta última es también la secuencia predominante en la mayoría de las poblaciones analizadas. Los valores de los nodos se obtuvieron mediante re-muestreo con 1000 réplicas. Al final del código se indica el número del clon y cuando la secuencia aparece más de una vez se indica su frecuencia (x número de veces). 90 CAPITULO III A) 65 S3I.10 T30 N2I.7 S3I.21 M3IV.2 N2I.16 S3I.33 S3I.48 B3I.9 S3I.2 S3IV.3 S3I.6 S3I.17 S3I.1 S3IV.3 N2IV.4 S3IV.12 N2I.2 R4IV.10 N2I.5 D.15 N2IV.15 D.22 S3IV.5 C4IV.15 B3IV.1 x5 S3I.23 x2 D.20 x5 B3I.17 x4 M3I.10 D.6 B3I.13 N2IV.12 R4IV.16 N2I.10 M3IV.5 N2I.4 S3IV.8 S3I.8 S3I.15 C4IV.18 S3IV.17 D.32 D.10 S3I.14 T385 x77 D.39 S3I.31 S3I.22 B) B3I.9 B3I.5 64 B3I.4 x7 B3IV.4 x2 R4IV.5 x5 C4I.16 D.33 66 C4I.3 S3I.16 N2I.15 D.38 x5 53 R4I.4 S3IV.3 R4IV.2 T385 x65 T30 60 62 21 M3IV.20 x2 M3IV.2 M3IV.6 M3IV.13 S3IV.12 S3IV.17 B3I.3 x16 18 S3I.12 x2 S3I.21 B3I.19 57 D.35 B3IV.1 x5 100 D.18 B3I.8 D.3 100 VT Qaha 99 T36 98 98 57 0.01 T318A NUagA SY568R T36 Qaha 65 38 63 45 53 71 42 41 99 74 SY568R NUagA 90 53 T388 90 T318A VT 0.01 Figura 4: Árbol filogenético sin raíz obtenido por el método neighbor joining con las variantes de secuencia de los genes p20 (A) y p23 (B), detectadas en plantas de difrentes variedades comerciales inoculadas con el aislado T385 a distintos tiempos post-inoculación. Las secuencias indicadas en rojo corresponden a aislados de referencia o a la planta donante (T385). Esta última es también la secuencia predominante en la mayoría de las poblaciones analizadas. Los valores de los nodos se obtuvieron mediante re-muestreo con 1000 réplicas. Al final del código se indica el número del clon y cuando la secuencia aparece más de una vez se indica su frecuencia (x número de veces). 91 CAPÍTULO III III.3.3.2. Análisis de la variabilidad nucleotídica y aminoacídica de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas El análisis de las 40 secuencias diferentes que se obtuvieron para el gen p20 del aislado T388 mostró que 29 de ellas presentan sólo un cambio nucleotídico con respecto a la secuencia característica de T388, 10 presentaban 2 cambios y 1 tenía 4 cambios (Tabla 1 haplotipos indicados con letras de color negro, azul y rosa respectivamente). El número total de posiciones polimórficas fue de 53, lo que representa el 10,9% de las posiciones en el alineamiento, y el 96% de los cambios fueron transiciones. A su vez, de las 59 variantes de secuencia de p23 que se detectaron, 47 presentaban un solo cambio nucleotídico, 8 presentaban 2 cambios, 1 presentaba 3 cambios y 3 presentaban 4 cambios (Tabla 2 haplotipos indicados con letras de color negro, azul, rojo y rosa). El número total de posiciones polimórficas fue 78 (20,9% de las posiciones del alineamiento) y el 93% de los cambios fueron transiciones. Para el gen p20 del aislado T385, de las 59 variantes de secuencia que se detectaron, 47 presentaban un solo cambio nucleotídico, 7 presentaban 2 cambios, 4 presentaban 3 cambios y 1 tenía 5 cambios (Tabla 3 haplotipos indicados en negro, azul, rojo y blanco respectivamente). El número total de posiciones polimórficas (78) representaba el 16% de las posiciones en el alineamiento, y el 96% de los cambios fueron transiciones. A su vez, de las 66 variantes de secuencia de p23 detectadas, 54 presentaban un solo cambio nucleotídico, 10 presentaban 2 cambios y 2 presentaban 3 cambios (Tabla 4 haplotipos indicados en negro, azul y rojo respectivamente). El número total de posiciones polimórficas (80) representaba el 21% de las posiciones del alineamiento y el 92% de los cambios fueron transiciones. Cuando se analizó la naturaleza de los cambios nucleotídicos (sinónimos o no sinónimos) y la proporción entre cambios únicos y compartidos entre las secuencias (Tablas 5 a 8), se observó que en las variantes de p20 obtenidas de las plantas inoculadas con T388 casi la mitad de los cambios (22 de 53) eran compartidos por dos o más secuencias (Tabla 5). De los 53 cambios detectados 28 están presentes en alguna de las ocho secuencias de otros aislados de CTV utilizadas para comparación en el alineamiento múltiple: 25 se hallan en las secuencias de los aislados T385 y T30, uno en la de VT, uno en las de Qaha y T36, y otro en todas menos en VT y T388. También en las variantes de p23 de estas mismas plantas más de la mitad de los cambios observados (49 de 78) eran compartidos entre secuencias (Tabla 6). De los 78 cambios detectados solo 23 están presentes en alguna de las secuencias de referencia de CTV: 10 se hallan en T385, T30, T36 y Qaha, 9 en T385, T30 y SY568R, 3 en Qaha, T36 y T385 y 1 en T36, T385 y VT. A su vez, en las plantas inoculadas con T385, sólo 29 de los 78 cambios detectados en las variantes de p20 eran compartidos entre secuencias (Tabla 7), y solo ocho de ellos están presentes en las secuencias de referencia de CTV: 6 en T36 y Qaha, 1 en T30 y 1 en SY568R, T388, T318A, T36 y Qaha. En cuanto a las variantes de p23 de estas plantas (Tabla 8), 58 de los 80 cambios detectados eran compartidos y 36 de ellos están presentes en las secuencias de referencia de CTV: 31 en Qaha, T318A, T388, SY568R y T36 y 5 en T36. 92 CAPITULO III Tabla 5: Número de sitios nucleotídicos y aminoacídicos polimórficos, no sinónimos (NS), sinónimos (S), únicos (U) y compartidos (C) con otras secuencias, detectados en variantes de p20 de las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388. Sitios polimórficos nucleotídicos Tipo de substitución Sitios polimórficos aminoacídicos Gen p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 Total Población donante NI NIV BI BIV SI SIV CLI CLIV MI MIV R2I R2IV R4I R4IV Total 4 5 0 0 0 0 1 1 0 0 4 5 6 13 14 53 U 4 5 0 0 0 0 1 1 0 0 4 5 4 5 2 31 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 8 12 22 NS 4 1 0 0 0 0 1 0 0 0 4 3 3 4 2 22 S 0 4 0 0 0 0 0 1 0 0 0 2 3 9 12 31 Total 4 1 0 0 0 0 1 0 0 0 4 3 3 4 2 22 U 4 1 0 0 0 0 1 0 0 0 4 3 1 4 2 20 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2 Tabla 6: Número de sitios nucleotídicos y aminoacídicos polimórficos, no sinónimos (NS), sinónimos (S), únicos (U) y compartidos (C) con otras secuencias, detectados en variantes de p23 de las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388. Sitios polimórficos nucleotídicos Tipo de substitución Sitios polimórficos aminoacídicos Gen p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 Total Población donante NI NIV BI BIV SI SIV CLI CLIV MI MIV R2I R2IV R4I R4IV Total 3 5 1 3 2 7 1 3 0 2 5 16 23 2 5 78 U 3 4 0 3 2 7 1 2 0 1 0 1 4 1 0 29 C 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 5 15 19 1 5 49 NS 3 4 0 2 2 4 1 1 0 2 5 10 17 2 5 58 S 0 1 1 1 0 3 0 2 0 0 0 6 6 0 0 20 Total 3 4 0 2 2 4 1 1 0 2 5 10 17 2 5 58 U 3 3 0 2 2 4 1 1 0 1 0 0 4 1 0 22 C 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 5 10 13 1 5 36 93 CAPÍTULO III Tabla 7: Número de sitios nucleotídicos y aminoacídicos polimórficos, no sinónimos (NS), sinónimos (S), únicos (U) y compartidos (C) con otras secuencias, detectados en variantes de p20 de las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385. Sitios polimórficos nucleotídicos Tipo de substitución Sitios polimórficos aminoacídicos Gen p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 p20 Total Población donante NI NIV BI BIV SI SIV CLI CLIV MI MIV RI RIV Total 15 6 5 8 5 24 8 0 2 1 2 0 2 78 U 7 6 4 3 0 18 6 0 1 0 2 0 2 49 C 8 0 1 5 5 6 2 0 1 1 0 0 0 29 NS 9 5 3 7 5 10 5 0 1 1 1 0 2 49 S 6 1 2 1 0 14 3 0 1 0 1 0 0 29 Total 9 5 3 7 5 10 5 0 1 1 1 0 2 49 U 3 5 2 5 0 7 4 0 0 0 1 0 2 29 C 6 0 1 2 5 3 1 0 1 1 0 0 0 20 Tabla 8: Número de sitios nucleotídicos y aminoacídicos polimórficos, no sinónimos (NS), sinónimos (S), únicos (U) y compartidos (C) con otras secuencias, detectados en variantes de p23 de las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385. Sitios polimórficos nucleotídicos Tipo de substitución Sitios polimórficos aminoacídicos Gen p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 p23 Total Población donante NI NIV BI BIV SI SIV CLI CLIV MI MIV RI RIV Total 11 1 0 32 7 7 4 2 0 0 9 1 6 80 U 3 1 0 5 0 2 4 1 0 0 4 1 1 22 C 8 0 0 27 7 5 0 1 0 0 5 0 5 58 NS 9 1 0 30 7 6 1 2 0 0 8 1 6 71 S 2 0 0 2 0 1 3 0 0 0 1 0 0 9 Total 9 1 0 30 7 6 1 2 0 0 8 1 6 71 U 1 1 0 3 0 2 1 1 0 0 3 1 1 14 C 8 0 0 27 7 4 0 1 0 0 5 0 5 57 94 CAPITULO III La mayoría de las mutaciones que encontramos en las variantes de secuencia de ambos genes, en las plantas inoculadas con cualquiera de los aislados, se encuentran distribuidas al azar a lo largo de la secuencia (Figuras 5 y 6), excepto en las zonas donde aparecen cambios repetidos en diversas las poblaciones. p20 30 25 20 15 10 5 0 nucleótidos 8 3 5 2 2 3 4 26 23-83 nt 83-143nt 143-203nt 203-263nt 263-323nt 323-383nt 383-443nt 443-506nt p23 30 25 20 15 10 5 0 nucleótidos 9 5 5 16 17 26 45-105nt 105-165nt 165-225nt 225-285nt 285-345nt 345-417nt Figura 5: Distribución de los cambios nucleotídicos detectados en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388 a lo largo de la secuencia de p20 (483 nt) y p23 (372 nt). Cada intervalo representa 60 nucleótidos de la secuencia, excepto el último para p20 que representa 63 y 72 para p23. p20 30 25 20 15 10 5 0 nucleótidos 3 8 6 11 11 7 6 26 70 23-83nt 83-143nt 143-203nt 203-263nt 263-323nt 323-383nt 383-443nt 443-506nt 60 50 40 30 20 10 0 p23 59 45-105nt 105-165nt 165-225nt 225-285nt 285-345nt 5 2 4 7 345-417nt 3 nucleótidos Figura 6: Distribución de los cambios nucleotídicos detectados en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385 a lo largo de la secuencia de p20 (483 nt) y p23 (372 nt). Cada intervalo representa 60 nucleótidos de la secuencia, excepto el último para p20 que representa 62 y 72 para p23. Así, en las plantas inoculadas con T388 hay una acumulación de cambios entre las posiciones 383-443 de p20 debido a que la transición G384A se repite 20 veces y aparece en las poblaciones de R4I, R4IV y R2IV. Este cambio se halla en las secuencias de T385 y T30 y es sinónimo. En estas mismas plantas encontramos tres mutaciones en p23 que también se repiten: una transición G161A que se repite 9 veces en las poblaciones R4I, R4IV y R2IV, que también se halla en T385, T30 y SY568R, que afecta a la segunda base del codón y da lugar a un cambio de serina a asparagina (ambos aminoácidos del grupo neutro polar), otra transición A234G que se repite 10 veces en las poblaciones R4I, R4IV y CI, que coincide con la secuencia de T36, Qaha, T385 y T30 y que es un cambio sinónimo, y por último, una transición A317G que se repite 21 veces en las poblaciones R2I, R2IV y MIV, que no se halla en las secuencias de los aislados de referencia de CTV y que afecta a la segunda base del codón dando lugar a un cambio de lisina a arginina (ambos aminoácidos del grupo básico). 95 CAPÍTULO III En las plantas inoculadas con T385 encontramos dos mutaciones repetidas en p20: una transición G96A que se repite 5 veces en las poblaciones donante, SI y SIV, que no coincide con ninguna secuencia de referencia de CTV y que es sinónima, y una transición C305T que se repite 20 veces en las poblaciones donante, NIV, BI, BIV, SI y MI, que no coincide con ninguna secuencia de referencia de CTV y que afecta a la segunda base del codón dando lugar a un cambio de alanina por valina (ambos aminoácidos del grupo neutro no polar). Finalmente, en estas plantas encontramos también cuatro mutaciones de p23 que se repiten: una transversión A108T que se repite 5 veces solo en MIV, que también se halla en T36 y Qaha y que afecta a la tercera base del codón y da lugar a un cambio de ácido glutámico por ácido aspártico (ambos aminoácidos del grupo ácido), otra transición C115T que se repite 16 veces en las poblaciones BI, BIV y RIV, que no se halla en otras secuencias de referencia de CTV y que afecta a la primera base del codón dando lugar a un cambio de arginina (básico) por cisteína (neutro polar), otra transición G136A que se repite 29 veces en las poblaciones donante, BI, BIV y SI, que también se encuentra en Qaha, T36, SY568R, T318A y T388 y que afecta a la primera base del codón dando lugar a un cambio de valina por isoleucina (ambos aminoácidos del grupo neutro no polar), y por último, una transición A155G que se repite 5 veces sólo en la población control, que no coincide con otras secuencias de referencia de CTV y que afecta a la segunda base del codón y da lugar a un cambio de lisina por arginina (ambos aminoácidos del grupo básico). Cuando examinamos los efectos de cada una de las anteriores mutaciones repetidas en la estructura secundaria de mínima energía libre predecible con el programa MFOLD (Zucker, 1989) en comparación con las correspondientes secuencias mayoritarias en T388 y T385 observamos que la mayoría de los cambios nucleotídicos en p20 o p23 no afectan la estabilidad de la estructura predicha, o dan lugar a cambios mínimos en la misma (ver ejemplo de cambios en las Figuras 7 y 8). A B Figura 7: Estructura secundaria de mínima energía libre predicha con el programa MFOLD para la secuencia consenso de p23 en el aislado T388 (A) y la secuencia mutada con el cambio G161A (B). La flecha indica la posición nucleotídica que varía entre ambas. 96 CAPITULO III A B Figura 8: Estructura secundaria de mínima energía libre predicha con el programa MFOLD para la secuencia consenso de p23 en el aislado T385 (A) y la secuencia mutada con el cambio A108T (B). La flecha indica la posición nucleotídica que varía entre ambas. El número de posiciones aminoacídicas polimórficas encontradas en la proteína p20 de las plantas inoculadas con el aislado T388 (22 de un total de 161 residuos) representan el 13,6% del total, y de éstas 20 fueron únicas y sólo 2 compartidas (Tabla 5). Solo 2 de los cambios observados se encuentran en otros aislados de referencia de CTV (T385 y T30). Nueve de los 22 cambios aminoacídicos observados pertenecen al mismo grupo (ácido, básico, neutro polar o neutro apolar) y 13 supusieron un cambio de grupo, aunque en más de la mitad de los casos los cambios fueron entre neutro polar y apolar. En las mismas plantas, el 46% de las posiciones de p23 fueron polimórficas (58 de 124 residuos), con 22 cambios únicos y 36 compartidos (Tabla 6). Solo 10 de ellos se hallan en las secuencias de p23 de otros aislados de referencia (9 en SY568R, T385 y T30 y 1 en T385 y T30). De los 58 cambios observados, 48 lo fueron entre aminoácidos del mismo grupo y solo 10 supusieron un cambio de grupo, si bien 6 de éstos fueron entre neutro polar y apolar. En las plantas infectadas con T385 el número de posiciones aminoacídicas polimórficas encontradas en p20 (49 de un total de 161 residuos) representan el 30,4% del total, y de éstas, 29 fueron únicas y 20 compartidas (Tabla 7). Ninguno de los cambios observados se encuentra en los aislados de referencia de CTV. De los 49 cambios observados en p20, 31 lo fueron entre aminoácidos del mismo grupo (ácido, básico, neutro polar o neutro apolar) y 18 supusieron un cambio de grupo. En las mismas plantas el 57,2% de las posiciones de p23 fueron polimórficas (71 de 124 residuos), con 14 cambios únicos y 57 compartidos (Tabla 8). De estos cambios 35 se hallan en los aislados de referencia (1 en VT, 5 en T36 y Qaha y 29 en todos ellos menos T30 y T385). De los 71 cambios observados en p23, 49 lo fueron entre aminoácidos del mismo grupo y 22 supusieron un cambio de grupo. 97 CAPÍTULO III III.3.3.3. Variación genética dentro y entre de las poblaciones Con el fin de evaluar la fiabilidad del análisis de SSCP para seleccionar variantes de secuencia, se calculó la distancia nucleotídica entre todos los pares de clones con el mismo perfil de SSCP para cada gen. En las plantas inoculadas con T388 la diversidad nucleotídica entre todos los clones que presentaban un mismo haplotipo fue de 0.00013 ± 0.00007 para p20 y de 0.00030 ± 0.00013 para p23, y en las inoculadas con T385, estos valores fueron de 0.00030 ± 0.00012 para p20 y 0.00016±0.00011 para p23. Se calculó la diversidad genética dentro de cada población seleccionada y de la planta donante usando la distancia nucleotídica entre los haplotipos y su frecuencia en cada población (determinada por el análisis de SSCP). En las poblaciones de T388 analizadas los valores de diversidad genética intrapoblacional de p20 (Tabla 9) oscilaron entre 0 y 0.00182, con valores similares en la planta donante y en las variedades inoculadas, excepto el pomelo Star Ruby que presentó valores de diversidad ligeramente superiores. La planta R4 de esta variedad presentó un haplotipo mayoritario (A19) diferente al de las demás plantas (A1) (Tabla 1) y la población del primer análisis (R4I) presentó el valor más alto de diversidad genética. En las mismas plantas, los valores de diversidad para p23 (Tabla 10) oscilaron entre 0 y 0.00337, correspondiendo el valor máximo a una planta de pomelo Star Ruby (R2IV). De nuevo plantas de esta variedad mostraron haplotipos mayoritarios (B22 o B30) diferentes al de las demás plantas (B1) (Tabla 2). En las poblaciones de T385 los valores de diversidad intrapoblacional oscilaron entre 0 y 0.00221 para p20 y entre 0 y 0.00344 para p23, y estos valores fueron similares en las plantas inoculadas y en la donante (Tablas 11 y 12). Con una variabilidad genética tan reducida, el análisis del cociente entre los valores de diversidad nucleotídica en las posiciones no sinónimas y en las sinónimas (dNS/dS) presenta las mismas limitaciones comentadas en el capítulo anterior. Como se observa en las Tablas 9-12 en muchas poblaciones la variación en ambos tipo de posiciones fue nula, y en otras, los pocos cambios observados fueron en posiciones no sinónimas. Un caso extremo fue el de las poblaciones de p23 en las plantas inoculadas con T385, en las que de los 80 cambios nucleotídicos observados 71 fueron no sinónimos y sólo 9 fueron sinónimos, y en consecuencia cuatro de los cinco valores de dNS/dS calculados son superiores a la unidad. 98 CAPITULO III Tabla 9: Diversidad nucleotídica (d), sustituciones no sinónimas por sitio no sinónimo (dNS), sustituciones sinónimas por sitio sinónimo (dS) y relación dNS/dS en las poblaciones de p20 de distintas variedades inoculadas con el aislado T388 y en la planta donante. d SE dNS SE dS SE dNS/dS T388 población 0.00022 0.00066 0.00032 0 0 p20 donante 0.00046 0.00094 0.00040 0.00030 0.00028 0.00214 0.000108 0.14 p20 N3I 0 0 0 0 0 0 p20 N3IV 0 0 0 0 0 0 p20 B3I 0 0 0 0 0 0 p20 B3IV 0 0 0 0 0 0 p20 S3I 0 0.00015 0.00015 0.00024 0.00024 0 p20 S3IV 0 0.00021 0.00021 0 0.00059 0.00051 0 p20 C4I 0 0 0 0 0 0 p20 C4IV 0 0 0 0 0 0 p20 M4I 0 0.0083 0.00040 0.00131 0.00062 0 p20 M4IV 0.00044 0.00098 0.00053 0.00119 0.00087 0.00104 0.82 p20 R2I 0.00125 0.00060 0.00090 0.00051 0.00178 0.00099 0.5 p20 R2IV 0.0220 0.00182 0.00085 0.00137 0.00067 0.00269 0.5 p20 R4I 0.00048 0.00065 0.00044 0.00111 0.00111 0.00081 0.58 p20 R4IV SE: error estándar mediante re-muestreo con 1000 réplicas. En rojo se indican los valores más altos de cada parámetro. Tabla 10: Diversidad nucleotídica (d), sustituciones no sinónimas por sitio no sinónimo (dNS), sustituciones sinónimas por sitio sinónimo (dS) y relación dNS/dS en las poblaciones de p23 de distintas variedades inoculadas con el aislado T388 y en la planta donante. d SE dNS SE dS SE dNS/dS T388 población 0 0 p23 donante 0.00045 0.00025 0.00068 0.00039 0.00140 0.00060 0.00189 0.00091 0.00083 0.00078 2.2 p23 N3I 0 0.00027 0.00026 0 0.00077 0.00079 0 p23 N3IV 0.00030 0.00049 0.00033 0.00054 0.00050 0.00054 0.9 p23 B3I 0 0.00054 0.00037 0.00085 0.00060 0 p23 B3IV 0.00125 0.00046 0.00105 0.00051 0.00151 0.00088 0.69 p23 S3I 0 0.00023 0.00022 0.00037 0.00036 0 p23 S3IV 0.00095 0.00055 0.00036 0.00035 0.00427 0.00357 0.08 p23 C4I 0 0 0 0 0 0 p23 C4IV 0 0.00037 0.00025 0.00058 0.00043 0 p23 M4I 0 0.00167 0.00133 0.00264 0.00224 0 p23 M4IV 0 0.00128 0.00101 0 0.00360 0.00307 0 p23 R2I 0.00337 0.00128 0.00314 0.00135 0.00394 0.00276 0.79 p23 R2IV 0 0.00022 0.00015 0.00030 0.00022 0 p23 R4I 0 0 0 0 0 0 p23 R4IV SE: error estándar mediante re-muestreo con 1000 réplicas. En rojo se indican los valores más altos de cada parámetro y en azul valores dNS/dS>1. 99 CAPÍTULO III Tabla 11: Diversidad nucleotídica (d), sustituciones no sinónimas por sitio no sinónimo (dNS), sustituciones sinónimas por sitio sinónimo (dS) y relación dNS/dS en las poblaciones de p20 de distintas variedades inoculadas con el aislado T385 y en la planta donante. d SE dNS SE dS SE dNS/dS T385 población 0.75 p20 donante 0.00151 0.00062 0.00169 0.00091 0.00224 0.00086 0.00108 0.00044 0.00143 0.00062 0.00051 0.00052 2.8 p20 N2I 0.00034 0.00076 0.00044 0.00089 0.00063 0.00080 0.85 p20 N2IV 0 0.00133 0.00080 0.00211 0.00130 0 p20 B3I 0 0.00108 0.00102 0.00175 0.00160 0 p20 B3IV 0.00034 0.00171 0.00039 0.00311 0.00071 0.00221 0.5 p20 S3I 0.00144 0.00050 0.00136 0.00057 0.00153 0.00088 0.8 p20 S3IV 0 0 0 0 0 0 0 p20 C4I 0.00036 0.00024 0.00029 0.00029 0.0119 0.00121 0.2 p20 C4IV 0 0.00020 0.00020 0.00031 0.00031 0 p20 M3I 0.00025 0.00030 0.00029 0.00053 0.00051 0.00038 0.56 p20 M3IV 0 0 0 0 0 0 p20 R4I 0 0.00052 0.00034 0.00082 0.00054 0 p20 R4IV SE: error estándar mediante re-muestreo con 1000 réplicas. En rojo se indican los valores más altos de cada parámetro y en azul valores dNS/dS>1. Tabla 12: Diversidad nucleotídica (d), sustituciones no sinónimas por sitio no sinónimo (dNS), sustituciones sinónimas por sitio sinónimo (dS) y relación dNS/dS en las poblaciones de p23 de distintas variedades inoculadas con el aislado T385 y en la planta donante. d SE dNS SE dS SE dNS/dS T385 población 2.2 p23 donante 0.00207 0.00130 0.00267 0.00216 0.00118 0.00069 0.00027 0.00026 0.00042 0.00042 0 0 p23 N2I 0 0 0 0 0 0 p23 N2IV 0.00344 0.00153 0.00467 0.00247 0.00105 0.00041 4.4 p23 B3I 0.00164 0.00119 0.00259 0.00195 0 0 p23 B3IV 0.00178 0.00096 0.00217 0.00139 0.00089 0.00091 2.4 p23 S3I 0.00108 0.00054 0.00043 0.00041 0.00229 0.00132 0.18 p23 S3IV 0.00060 0.00041 0.00095 0.00065 0 0 p23 C4I 0 0 0 0 0 0 p23 C4IV 0 0 0 0 0 0 p23 M3I 0.00214 0.00117 0.00251 0.00137 0.00112 0.00097 2.2 p23 M3IV 0.00027 0.00025 0.00043 0.00042 0 0 p23 R4I 0.00167 0.00137 0.00264 0.00224 0 0 p23 R4IV SE: error estándar mediante re-muestreo con 1000 réplicas. En rojo se indican los valores más altos de cada parámetro y en azul valores dNS/dS>1. El efecto de distintos factores en la variabilidad genética de las poblaciones se estudió mediante análisis de la varianza molecular (AMOVA) jerarquizando de distintas formas los factores de variación. En primer lugar se agruparon todas las plantas inoculadas con el mismo aislado y se analizó para cada gen la variación entre plantas de cada grupo y la variación dentro de cada planta (Tablas 13 a 16). Para todos los aislados y genes se observó una variación significativa entre plantas, a pesar de que la mayor contribución porcentual a la variación total fue la 100 CAPITULO III observada dentro de cada planta, excepto para el gen p23 en las plantas inoculadas con T388. Tabla 13: AMOVA para el gen p20 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388. Fuente de variación Entre poblaciones Dentro de poblaciones Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 14 324 338 37.394 180.875 218.268 0.09377 Va 0.55825 Vb 0.65202 14.38 85.62 0.14381‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 Tabla 14: AMOVA para el gen p23 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388. Fuente de variación Entre poblaciones Dentro de poblaciones Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 14 345 359 57.838 49.231 107.069 0.16670 Va 0.14270 Vb 0.30940 53.88 46.12 0.53878‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 Tabla 15: AMOVA para el gen p20 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385. Fuente de variación Entre poblaciones Dentro de poblaciones Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 12 306 318 8.262 73.362 81.624 0.01839 Va 0.23974 Vb 0.25814 7.13 92.87 0.07126‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 101 CAPÍTULO III Tabla 16: AMOVA para el gen p23 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385. Fuente de variación Entre poblaciones Dentro de poblaciones Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 12 267 279 27.468 60.100 87.568 0.09605 Va 0.22509 Vb 0.32114 29.91 70.09 0.29908‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 Para examinar el posible efecto de las variedades inoculadas, para cada aislado y gen se agruparon los datos de cada variedad (planta donante, Washington navel, Berna, Satsuma, Clemenules, Marsh y Star Ruby) y se efectuó un análisis AMOVA considerando el tipo y frecuencia de haplotipos detectados en cada grupo y estimando la probabilidad de que esa distribución fuese al azar (Tablas 17 a 20). Tabla 17: AMOVA para el gen p20 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388 agrupadas por variedades. Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 6 8 324 338 15.460 21.934 180.875 218.268 -0.01005 Va 0.10290 Vb 0.55825 Vc 0.65111 -1.54 15.80 85.74 -0.01543 0.15564‫٭‬ 0.14261‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 Tabla 18: AMOVA para el gen p23 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388 agrupadas por variedades. Grados de libertad 6 8 345 359 Componentes de la varianza -0.03392 Va 0.19747 Vb 0.14270 Vc 0.30625 Porcentaje de variación -11.08 64.48 46.60 Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Suma de cuadrados 20.967 36.871 49.231 107.069 F -0.11076 0.58050‫٭‬ 0.53404‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 102 CAPITULO III En las plantas inoculadas con el aislado T388 no se observó variación significativa entre grupos para ninguno de los dos genes (Tablas 17 y 18), pero sí lo fue la variación dentro de plantas o entre las plantas del mismo grupo, siendo la variación dentro de plantas la que más contribuyó a la variación total de p20 (Tabla 17) y la variación entre plantas la que más contribuyó a la de p23. Tabla 19: AMOVA para el gen p20 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385 agrupadas por variedades. Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 6 6 306 318 6.362 1.900 73.362 81.624 0.01633 Va 0.00328 Vb 0.23974 Vc 0.25936 6.30 1.26 92.44 0.06298‫٭‬ 0.01350‫٭‬ 0.07563‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 Tabla 20: AMOVA para el gen p23 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385 agrupadas por variedades. Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad 6 6 267 279 Suma de cuadrados 22.376 5.092 60.100 87.568 Componentes de la varianza 0.07099 Va 0.03017 Vb 0.22509 Vc 0.32625 Porcentaje de variación 21.76 9.26 68.99 F 0.21759‫٭‬ 0.11819‫٭‬ 0.31007‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 En las plantas inoculadas con el aislado T385 tanto la variación entre grupos como la variación entre plantas del mismo grupo y dentro de plantas contribuyeron significativamente a la variación total de p20 y p23 (Tablas 19 y 20). Para ambos genes fue la variación dentro de plantas la que más contribuyó a la variación total. 103 CAPÍTULO III Tabla 21: AMOVA para el gen p20 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388 agrupadas según el tiempo transcurrido desde la inoculación hasta el análisis. Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 2 12 324 338 1.340 36.054 180.875 218.268 -0.03101 Va 0.11340 Vb 0.55825 Vc 0.64065 -4.84 17.70 87.14 -0.04840 0.16884‫٭‬ 0.12861‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 Tabla 22: AMOVA para el gen p23 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T388 agrupadas según el tiempo transcurrido desde la inoculación hasta el análisis. Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 2 12 345 359 2.856 22.411 70.067 107.069 -0.04117 Va 0.19245 Vb 0.14270 Vc 0.29398 -14 65.46 48.54 -0.14004 0.57422‫٭‬ 0.51459‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 Finalmente se examinó el posible efecto del tiempo transcurrido desde la inoculación efectuando para cada aislado y gen un análisis AMOVA con los datos agrupados según el momento del análisis (planta donante, análisis I y análisis IV). En las plantas inoculadas con el aislado T388 no se observó una contribución significativa de los grupos a la variación total de los genes p20 o p23, que vino determinada por la variación entre plantas del mismo grupo y dentro de plantas (Tablas 21 y 22). Al igual que en los análisis agrupando los datos por variedades, la variación entre plantas fue la que más contribuyó a la variación total de p23 (Tabla 22) y la variación dentro de plantas la que más contribuyó a la variación total de p20 (Tabla 21). 104 CAPITULO III Tabla 23: AMOVA para el gen p20 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385 agrupadas según el tiempo transcurrido desde la inoculación hasta el análisis. Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 2 10 306 318 1.025 7.237 73.362 81.624 -0.00311 Va 0.02036 Vb 0.23974 Vc 0.25699 -1.21 7.92 93.29 -0.01210 0.07826‫٭‬ 0.06710‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 Tabla 24: AMOVA para el gen p23 en las plantas inoculadas con el aislado de CTV T385 agrupadas según el tiempo transcurrido desde la inoculación hasta el análisis. Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 2 10 267 279 1.491 25.977 60.100 87.568 -0.02842 Va 0.11424 Vb 0.22509 Vc 0.31091 -9.14 36.74 72.40 -0.09142 0.33665‫٭‬ 0.27601‫٭‬ ‫٭‬p<0.05 En las plantas inoculadas con T385 tampoco fue significativa la contribución de los grupos a la variación de p20 y p23 (Tablas 23 y 24). En este aislado la variación dentro de las plantas fue la que más contribuyó a la variación total de ambos genes. El análisis FEL de las variantes de secuencia de ambos genes obtenidas en las distintas poblaciones de los dos aislados, incluidas las de las plantas donantes, puso de manifiesto que no hay ninguna posición sometida a presión de selección positiva. Los codones 18, 22, 67, 117, 128 y 147 de p20 y 16, 21, 52, 53 y 80 de p23 en el aislado T388, y los codones 8, 23, 32, 101, 102, 117, 119, 120 y 147 de p20 y 48, 57 y 129 de p23 en el aislado T385, presentan presión de selección negativa. Finalmente, en las distintas poblaciones donde se encontró más de un haplotipo de ambos aislados se comparó la distribución observada de haplotipos de p20 y de p23 y la esperada bajo un modelo de evolución neutral con el test de EwensWatterson, y con las pruebas D de Tajima (1989), D‫ ٭‬y F ‫٭‬de Fu y Li (1993), o Fs de Fu (1997), para determinar si el patrón de variación observado dentro de dichas poblaciones podía considerarse neutral (Tablas 25 y 26). 105 CAPÍTULO III Tabla 25: Pruebas de neutralidad de las poblaciones de p20 y p23 en las plantas donante e inoculadas con el aislado T388. T388-p20 donante N3I S3IV C4I M4IV R2I R2IV R4I R4IV T388-p23 donante N3I N3IV B3I B3IV S3I S3IV C4I M4I M4IV R2I R2IV R4I 1 1 Observada 0.79321 0.60744 0.928 0.905 0.73 0.65 0.8152 0.455 0.732 Esperada 0.41174 0.30301 0.75147 0.73032 0.44195 0.35578 0.56070 0.29498 0.44366 P 1 1 1 1 1 1 1 0.9713 1 D -1.88514‫٭٭‬ -1.98725‫٭٭‬ -1.15354 -1.16439 -1.86788‫٭٭‬ -2.663‫٭٭٭‬ -2.05624‫٭٭٭‬ -1.60994‫٭‬ -1.72331‫٭٭‬ D‫٭‬ -3.146‫٭‬ -2.915‫٭‬ -1.646 -1.539 -2.626‫٭‬ -2.812‫٭‬ -2.959‫٭٭‬ -2.258 -2.384 F‫٭‬ -3.224‫٭‬ -3.066‫٭‬ -1.737 -1.647 -2.784‫٭‬ -2.974‫٭‬ -3.124‫٭٭‬ -2.397 -2.535 Fs -4.8‫٭٭‬ -4.798‫٭٭٭‬ -1.12456‫٭‬ -0.87930‫٭‬ -2.07370‫٭٭٭‬ -2.991‫٭‬ 0.136 -2.82275‫٭٭٭‬ -2.74926‫٭٭٭‬ Observada 0.84259 0.65 0.905 0.81333 0.815 0.64667 0.91682 0.73 0.87333 0.605 0.56912 0.52381 0.84960 Esperada 0.49105 0.35754 0.73616 0.47977 0.55817 0.28423 0.74028 0.44185 0.54398 0.56041 0.56267 0.25134 0.58209 P 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.6904 0.6045 1 1 D -1.7235‫٭٭٭‬ -1.97429‫٭٭٭‬ -1.16439 -1.73178‫٭‬ -1.51284‫٭‬ -2.17427‫٭٭٭‬ -1.16097 -1.72331‫٭٭‬ -1.50738 -0.52778 -0.33029 -1.70104‫٭‬ -1.51406 D‫٭‬ -2.812‫٭‬ -2.695‫٭‬ -1.539 -2.687‫٭‬ -2.053 -3.603‫٭٭‬ -1.59 -2.254 -2.263 -0.593 -0.611 -2.292 -2.523‫٭‬ F‫٭‬ -2.893‫٭‬ -2.867‫٭‬ -1.647 -2.793‫٭‬ -2.188 -3.699‫٭٭‬ -1.69 -2.414 -2.367 -0.423 -0.615 -2.46 -2.567‫٭‬ Fs -3.695‫٭٭٭‬ -2.99081‫٭٭٭‬ -0.8793‫٭‬ -3.38072‫٭٭٭‬ -1,86305‫٭٭٭‬ -5.88212‫٭٭٭‬ -0.99304‫٭٭٭‬ -2.74926‫٭٭٭‬ -2.35488‫٭٭٭‬ -0.46437 -0.27034 -2.63422‫٭‬ -2.12796‫٭٭٭‬ D: Estadístico de la prueba de Tajima (re-muestreo con 10.000 distribuciones aleatorias). D‫ ٭‬y F‫ :٭‬Estadísticos de las pruebas de Fu y Li. Fs: Estadístico de la prueba de Fu. ‫ :٭‬p< 0.05. ‫ :٭٭‬p< 0.02. ‫ :٭٭٭‬p< 0.01. P= Probabilidad. Para el aislado T388 la comparación de los valores de homocigosidad esperados y observados del gen p20 mostró que las poblaciones analizadas difieren significativamente de la neutralidad. El valor más bajo de homocigosidad observada fue el de la población de pomelo Star Ruby R4I en la que la frecuencia del haplotipo predominante (A1) se redujo por la aparición de un nuevo haplotipo predominante (A19) y un número variable de haplotipos minoritarios (Tabla 1). En el último análisis de esta misma planta (población R4IV) la frecuencia del nuevo haplotipo (A19) es mayor y la población difiere significativamente de la neutralidad. Todos los valores de los estadísticos de las pruebas de neutralidad excepto uno fueron negativos, indicando que la estructura de las poblaciones se desvía de la neutralidad, en la mayoría de los casos significativamente, y que hay selección direccional. La misma selección direccional se observó para la mayoría de las poblaciones de p23; sin embargo, en dos de ellas (M4IV y R2I) todas las pruebas realizadas coincidían en que estas poblaciones no se desvían significativamente de 106 CAPITULO III la neutralidad. En ambas la frecuencia del haplotipo predominante aparecía reducida por el aumento de frecuencia de alguna variante minoritaria (Tabla 2). Tabla 26: Pruebas de neutralidad de las poblaciones de p20 y p23 en las plantas donante e inoculadas con el aislado T385 T385-p20 donante N2I N2IV B3I B3IV S3I S3IV C4IV M3I M3IV R4IV T385-p23 donante N2I B3I B3IV S3I S3IV C4I M3IV R4I R4IV 1 1 Observada 0.435 0.55766 0.78698 0.56612 0.505 0.45284 0.55766 0.83743 0.9093 0.83058 0.815 Esperada 0.243 0.25969 0.46511 0.45054 0.733 0.13134 0.26019 0.57186 0.73741 0.56606 0.55753 P 0.98 1 1 0.8385 0.08 1 1 1 1 1 1 D -1.84033‫٭٭‬ -2.07807‫٭٭٭‬ -2.00199‫٭٭٭‬ -1.16856 1.53133 -2.58625‫٭٭٭‬ -2.20299‫٭٭٭‬ -1.51496‫٭‬ -1.16356 -1.51481‫٭‬ -1.51284 D‫٭‬ -2.998‫٭‬ -3.127‫٭٭‬ -3.091‫٭٭‬ -1.763 0.649 -5.489‫٭٭‬ -3.379‫٭٭‬ -2.134 -1.557 -2.109 -1.914 F‫٭‬ -3.123‫٭‬ -3.274‫٭٭‬ -3.219‫٭٭‬ -1.843 1.01 -5.308‫٭٭‬ -3.525‫٭٭‬ -2.26 -1.663 -2.23 -2.06 Fs -4.31053‫٭٭٭‬ -5.94554‫٭٭٭‬ -1.92850‫٭‬ -0.92013 1.467 -13.61‫٭٭٭‬ -4.68288‫٭٭٭‬ -2.02722‫٭٭٭‬ -0.9189‫٭‬ -1.97435‫٭٭٭‬ -1.86305‫٭٭٭‬ Observada 0.52 0.905 0.3533 0.595 0.655 0.73 0.825 0.58 0.905 0.465 Esperada 0.33423 0.73237 0.28360 0.56114 0.44103 0.44295 0.5593 0.35725 0.73441 0.55924 P 0.947 1 0.82 0.62 0.96 1 1 0.98 1 0.34 D -1.27219 -1.16439 -0.84038 0.08514 -1.43544 -1.86788‫٭٭‬ -1.51284 -1.33438 -1.16439 0.23837 D‫٭‬ -1.505 -1.539 -2.209 0.874 -1.569 -2.626‫٭‬ -1.988 -2.012 -1.539 -0.593 F‫٭‬ -1.549 -1.647 -2.096 0.780 -1.731 -2.784‫٭‬ -2.130 -2.102 -1.647 -0.423 Fs -2.89901‫٭٭٭‬ -0.8793‫٭‬ -1.93 0.08398 -1.104 -2.0737‫٭٭٭‬ -1.86305‫٭٭‬ -1.7119 -0.8793‫٭‬ 0.20373 D: Estadístico de la prueba de Tajima (re-muestreo con 10.000 distribuciones aleatorias). D‫ ٭‬y F‫ :٭‬Estadísticos de las pruebas de Fu y Li. Fs: Estadístico de la prueba de Fu. ‫ :٭‬p< 0.05. ‫ :٭٭‬p< 0.02. ‫ :٭٭٭‬p< 0.01. P= Probabilidad. Para el aislado T385 la comparación de los valores de homocigosidad esperados y observados del gen p20 mostró que las poblaciones difieren significativamente de la neutralidad, excepto la del naranjo Berna B3IV (Tabla 26), probablemente debido a la menor frecuencia del haplotipo predominante (C1) y la aparición de un nuevo haplotipo (C2) con frecuencia superior (Tabla 3). Los valores de homocigosidad observada fueron claramente superiores en las variedades de Pomelo y en Clemenules. Excepto para la población B3IV, los valores de los estadísticos de las pruebas de neutralidad fueron negativos, indicando que la estructura de las poblaciones se desvía de la neutralidad, en la mayoría de los casos significativamente, y que hay selección direccional. La población B3IV no se desvía de la neutralidad y presenta valores positivos en todos los estadísticos que indicarían la presencia de selección estabilizadora. Para p23 las poblaciones de naranjo Berna B3IV y pomelo Star Ruby R4IV no se desvían significativamente de la neutralidad en ninguno de los test realizados, mientras que las demás 107 CAPÍTULO III poblaciones difieren significativamente de la neutralidad en el test de homocigosidad y presentan valores negativos en todos los estadísticos de neutralidad, que indicarían selección direccional, si bien en la mayoría de los casos estos valores no son significativos (Tabla 26). Para ambos genes la población donante del aislado T388 se separa de la neutralidad más claramente que la del aislado T385, como consecuencia de la diferente distribución de haplotipos de ambos aislados (Tablas 1 a 4). III.4. DISCUSIÓN Estudios previos pusieron de manifiesto que la transmisión por pulgón o injerto a un nuevo huésped podía dar lugar a cambios en la frecuencia de las distintas variantes de secuencia de la población viral, que en ocasiones resultan en cambios de sus características patogénicas (Ayllón et al., 1999b, 2006, D’Urso et al., 2000; Sentandreu et al., 2006). En el capítulo II se estudió la transmisión por injerto entre plantas de la misma especie y se concluyó que ésta no altera de forma significativa la estructura poblacional y diversidad nucleotídica de un aislado de CTV con población homogénea como T388, incluso cuando se utiliza un único trozo de corteza para la inoculación. En este capítulo se analizó el efecto del cambio de huésped transmitiendo por injerto dos aislados de orígenes y características diferentes (T388 y T385) a plantas de diversas variedades comerciales injertadas sobre patrón citrange Carrizo. Las plantas utilizadas como fuente de inóculo de T388 y T385 (la de T388 fue la misma planta utilizada en el capítulo II) estaban infectadas desde al menos 15 años antes de iniciar este experimento, por lo que se consideró que las respectivas poblaciones virales estarían en equilibrio. Los análisis poblacionales de los genes p20 y p23 se efectuaron a partir de RNA total de una mezcla de hojas para minimizar el posible efecto de la distribución irregular de variantes de secuencia en la planta infectada (D’Urso et al., 2000) y se repitieron cada 6 meses a lo largo de 2 años para observar un posible efecto del tiempo transcurrido desde la inoculación. El análisis de los productos de RT-PCR de p20 y p23 de las plantas donantes y de todas las plantas inoculadas mediante SSCP a distintos tiempos post-inoculación mostró que, salvo en unas pocas plantas, la estructura poblacional de las plantas inoculadas era muy similar a la de las donantes. Considerando esta homogeneidad se analizó en detalle la población de una planta de cada variedad al inicio y final del experimento, excepto en el caso del pomelo Star Ruby inoculado con T388 que había mostrado diferencias poblacionales en dos plantas y se analizaron ambas. De las poblaciones seleccionadas se analizaron mediante SSCP entre 20 y 45 clones al azar de cada gen para caracterizar los haplotipos presentes en cada población y estimar su frecuencia en la misma. Para estudiar la diversidad genética se secuenciaron entre 3 y 19 clones del perfil mayoritario en cada población y casi todos los clones que presentaban un perfil de SSCP diferente. La diversidad nucleotídica entre todos los clones con el mismo haplotipo de p20 o de p23 fue de 0.00013 ± 0.00007 y 0.00030 ± 0.00013 para el aislado T388, y de 0.00030 ± 0.00012 y 0.00016 ± 0.00011 para T385, valores generalmente inferiores a la distancia nucleotídica media entre clones con distinto haplotipo, lo que indicó de nuevo que el análisis de SSCP es una herramienta adecuada para la identificación de variantes 108 CAPITULO III de secuencia. Como se ha indicado en el capítulo II, aunque algunas de las mutaciones detectadas podrían ser errores introducidos por la retrotranscriptasa SuperScript o por la Taq polimerasa durante la RT-PCR (Bracho et al., 1998), la gran homogeneidad encontrada en las poblaciones analizadas hace pensar que la pequeña variabilidad potencialmente generada por las enzimas no alteraría las conclusiones del estudio. La estructura de la población de ambos genes del aislado T388 en la mayoría de las plantas analizadas fue la característica de las cuasiespecies virales, con un haplotipo predominante y entre 1 y 7 variantes de secuencia que diferían de 1 a 4 nucleótidos con respecto a la secuencia mayoritaria. La mayoría de los haplotipos minoritarios detectados aparecían sólo en alguna población o sólo en alguno de los análisis y aparentemente no llegan a fijarse en la población como efecto de la selección estabilizadora, ya que no deben proporcionar ningún beneficio al conjunto de la misma. Sin embargo, en plantas de pomelo Star Ruby se detectó un haplotipo mayoritario de p20 (A19) y dos de p23 (B22 y B30) que diferían en un solo nucleótido de los mayoritarios en otras variedades (A1 y B1, respectivamente) y que se habían llegado a ser predominantes en estas poblaciones. El haplotipo A19 de p20 no fue detectado en la población de la planta donante, como tampoco lo fueron los haplotipos B22 y B30 de p23, si bien estos últimos aparecían como haplotipos minoritarios en otras poblaciones. La estructura de la población de ambos genes en el aislado T385 presentaba algunas diferencias con la de T388. Aunque en la mayoría de las plantas la estructura poblacional encontrada era la característica de las cuasiespecies virales con un haplotipo predominante, el número de haplotipos minoritarios fue superior, con 1 a 15 variantes de secuencia que diferían de 1 a 5 nucleótidos con respecto a la secuencia mayoritaria. En un estudio previo se caracterizaron 30 clones de la población de p20 del aislado T385 y se encontró un haplotipo mayoritario que representaba el 70% de los clones analizados y distintas variantes de secuencia minoritarias, la mayoría de ellas muy cercanas filogenéticamente a T385 (Ayllón et al., 1999b, 2006). Aunque la mayoría de los haplotipos minoritarios de p20 sólo aparecían en alguna población y aparentemente no llegan a fijarse por efecto de la selección estabilizadora, uno de los haplotipos minoritarios de la población donante (C2) se encontró en 5 de las plantas inoculadas y llegó a ser el haplotipo mayoritario en un naranjo Berna. Algo similar ocurrió con p23 en esta misma variedad, en la que un haplotipo minoritario de la población donante (D3) se convirtió en el mayoritario, y uno de los haplotipos minoritarios detectados en Berna pero no en la población donante de T385, se convirtió en mayoritario en una de las poblaciones de Star Ruby. Aunque estos cambios de frecuencia de los haplotipos no suponen una alteración apreciable de la diversidad genética de la población, ya que los haplotipos detectados son genéticamente muy próximos, la sustitución de una variante de secuencia por otra podría responder a una mejor adaptación de la variante seleccionada a las condiciones específicas del huésped. La mayoría de las poblaciones de p20 y p23, en las plantas donantes y en las inoculadas con los aislados T388 o T385, presentaban una estructura poblacional significativamente separada de la neutralidad, que sugiere la acción de una selección direccional. Sin embargo, dos de las poblaciones de p23 de plantas de 109 CAPÍTULO III pomelo inoculadas con T388 (M4IV y R2I), una población de p20 de naranjo Berna inoculado con T385 (B3IV) y otras dos de p23 de plantas inoculadas también con T385, una de naranjo Berna (B3IV) y otra de pomelo Star Ruby (R4IV), presentaron una estructura que no era significativamente distinta de la esperada bajo la hipótesis de selección neutral. Más aún, en el caso del último análisis del naranjo Berna (B3IV), las poblaciones de p20 y p23 no sólo presentan baja homocigosidad, compatible con la neutralidad, sino que los valores de todos los estadísticos de neutralidad ensayados son positivos, lo que sugiere una posible selección estabilizadora, si bien los valores estimados no llegan a ser estadísticamente significativos. El análisis AMOVA basado en las distancias genéticas intrapoblacionales de las plantas infectadas con cada uno de los aislados mostró que la variación entre plantas de cada aislado era estadísticamente significativa para los dos genes, mientras que no lo era la variación dentro de plantas, pese a que esta última variación es la que más contribuye a la variación total, excepto en la población de p23 de las plantas inoculadas con T388. Cuando se agruparon los datos en función del tiempo transcurrido entre la inoculación y toma de muestras (6 meses o 2 años) el análisis AMOVA mostró que tanto en las plantas inoculadas con T388 como en las inoculadas con T385 la variación entre grupos no era estadísticamente significativa para ninguno de los dos genes, mientras que si lo era la variación entre plantas del mismo grupo y dentro de plantas. Esto indica que el tiempo de infección no fue un factor importante en la modulación de la estructura de las poblaciones. Finalmente, cuando se agruparon por variedades las plantas inoculadas con cada aislado, el análisis AMOVA mostró que en las plantas inoculadas con T388 la variación entre grupos no era significativa para ninguno de los dos genes, pero sí lo era en las plantas inoculadas con T385. La variación entre plantas del mismo grupo y dentro de plantas fue significativa en todos los casos. Estos resultados indican que la variedad puede ser un factor importante en la modulación de la estructura de la población viral al menos con algunos aislados de CTV. La diferencia de comportamiento entre aislados podría estar relacionada con la composición de la población viral de las respectivas plantas donantes o con diferencias en las interacciones entre factores virales y del huésped, dependiendo de las variantes de secuencia inoculadas en cada caso. Los valores de diversidad nucleotídica intrapoblacionales oscilaron entre 0 y 0.00182 para p20 y entre 0 y 0.00337 para p23 en las plantas infectadas con T388, y de 0 a 0.00221 y de 0 a 0.00344, respectivamente, en las infectadas con T385. Los valores de diversidad estimados previamente para p20 fueron de 0.0023 ± 0.0003 en el aislado T388 y de 0.0068 ± 0.0010 en T385 (Ayllón et al., 2006), que son similares a los obtenidos en este estudio. No se dispone de datos sobre la diversidad nucleotídica intrapoblacional de p23 en estos u otros aislados. La comparación de las secuencias nucleotídicas de los distintos haplotipos de p20 y p23 de ambos aislados puso de manifiesto que la diferencia máxima entre clones de cada gen era de 5 nucleótidos y que la distribución de los cambios nucleotídicos a lo largo de los dos genes de ambos aislados era aleatoria. De los cambios nucleotídicos detectados en p20 en las plantas infectadas con ambos aislados, sólo 110 CAPITULO III una fracción menor fue compartida con otros clones, mientras que esta proporción fue mayor para p23. En ambos casos la mayoría de los cambios compartidos correspondían a unas cuantas variantes de secuencia presentes en varias poblaciones con frecuencia media o alta. A nivel aminoacídico la mayoría de los cambios observados correspondieron a cambios únicos y sólo en p23 de las plantas infectadas con T385 el número de cambios aminoacídicos compartidos fue superior al de cambios únicos. Las relaciones filogenéticas inferidas por el método neighbor joining entre los clones detectados en las plantas infectadas con cada aislado, dieron lugar para ambos genes a árboles sin raíz con morfología similar, en los que todas la variantes de secuencia se agrupaban estrechamente con las secuencias predominantes en las plantas donantes de T388 y T385, lo que es coherente con la baja diversidad genética observada en todas las poblaciones. Es decir, aunque la estructura poblacional de algunas de las plantas inoculadas fuese diferente a la de las plantas donantes o la del resto de las plantas inoculadas, este cambio no comportó en ningún caso diferencias genéticas significativas debido a la similitud de las variantes de secuencia detectadas en las poblaciones. El estudio de la presión selectiva que actúa sobre una región codificante estimada por el cociente entre los valores de diversidad nucleotídica en las posiciones no sinónimas y sinónimas (dNS/dS), presenta las limitaciones expuestas en el capítulo II, es decir, este parámetro es poco informativo cuando los datos son muy homogéneos, como en este trabajo y en otros anteriores (Marco y Aranda 2005). Sólo para el gen p20 del aislado T388 el número de cambios sinónimos fue superior al de no sinónimos, y de los cambios nucleotídicos que se repiten entre clones sólo 2 fueron sinónimos. Incluso el cociente dNS/dS del gen p23 de la población donante de T385 resultó superior a la unidad. A pesar de la aparición repetida de cambios no sinónimos, un análisis FEL de las poblaciones en que éstos aparecen no encontró ninguna posición seleccionada positivamente, pero sí distintos codones con selección negativa. En la secuencia de p20, las posiciones relacionadas con su función como supresor del silenciamiento (I38, Y113, R130, L137, S141 y L159), que se encuentran estrictamente conservadas entre los closterovirus (Reed et al., 2003), permanecieron generalmente invariables en las variantes de secuencia encontradas en este trabajo. Las únicas excepciones fueron: la posición R130 que, en todas las variantes de secuencia analizadas y en los aislados de referencia, excepto T36 y Qaha, es K130, y la posición S141 que varía a F141 en una secuencia de T388 y a P141 en otra de T385. Asimismo, el dominio de unión a RNA de p23, que incluye varios residuos básicos entre las posiciones 50 y 67 y un motivo de dedo de Zinc entre las posiciones 68 y 86, importantes para su función biológica (López et al., 2000; Satyanarayana et al., 2002b), se hallaban conservados en todas las variantes de secuencia encontradas en este estudio. En resumen, en comparación con la homogeneidad poblacional encontrada en las plantas donantes y en la mayoría de las variedades comerciales inoculadas, el pomelo Star Ruby inoculado con cualquiera de los aislados y el naranjo dulce Berna 111 CAPÍTULO III inoculado con T385 parecen comportarse de forma diferente y presentan cambios en la estructura de sus poblaciones virales. Aunque ello no comportó variaciones genéticas importantes debido a que las variantes de secuencia que incrementaban su frecuencia eran genéticamente próximas a las variantes mayoritarias de las poblaciones donantes, nuestros resultados indican: i) que el cambio a un nuevo huésped de distinta especie/variedad puede alterar la estructura de la población viral inoculada, y ii) que esta alteración puede ser dependiente del aislado inoculado. 112 CAPÍTULO IV TRANSMISIÓN DE UNA POBLACIÓN CLONAL DE CTV POR INJERTO A DISTINTAS ESPECIES SUSCEPTIBLES Y A UN HUÉSPED PARCIALMENTE RESISTENTE 113 CAPÍTULO IV IV.1. INTRODUCCIÓN En los últimos años se ha avanzado significativamente en el conocimiento de la función de las distintas partes del genoma de CTV, fundamentalmente en lo referente a la replicación del virus, gracias a la obtención de un clon de cDNA del genoma completo del aislado T36 de Florida (denominado 947) y al desarrollo de un sistema genético basado en el mismo. Este sistema consiste en la obtención in vitro de transcritos de RNA del genoma completo que son infecciosos en protoplastos de Nicotiana benthamiana y dan lugar a viriones normales de CTV (Satyanarayana et al., 1999). Como la infectividad así obtenida es muy baja (del orden de 10-4) y la cantidad de viriones generados es mínima, éstos han de ser amplificados mediante sucesivos pases a nuevos lotes de protoplastos hasta reunir una cantidad suficiente para poder inocularlos mecánicamente en cítricos. Mediante este procedimiento se demostró que los viriones obtenidos a partir del clon de cDNA reproducían los síntomas característicos del aislado original: acopamiento de hojas, clorosis nervial y acanaladuras en la madera en lima Mexicana, y SY en pomelo y naranjo amargo (Satyanarayana et al., 2001). Las plantas inoculadas mediante esta técnica contienen una población de CTV originada a partir de una sola molécula del clon infeccioso, y su composición se supone genéticamente homogénea. Por ello constituyen una buena herramienta para el estudio de la variación genética de CTV en distintos huéspedes a lo largo del tiempo. En los capítulos II y III se estudió el efecto de la transmisión por injerto a plantas de la misma variedad y a plantas de distinta especie o variedad en la estructura poblacional de aislados naturales (y por tanto supuestamente heterogéneos) de CTV y su evolución durante un determinado período de tiempo. En este último capítulo se intentó analizar el efecto de la adaptación a un nuevo huésped en la estructura poblacional de un aislado clonal de CTV. Para ello el aislado T36-947 se transmitió por injerto desde su huésped original (lima Mexicana) a plantas de semilla de lima Mexicana, naranjo dulce Pineapple, pomelo Duncan y naranjo amargo Común y se efectuaron pases sucesivos en el mismo huésped. Las tres primeras especies son susceptibles a CTV mientras que el naranjo amargo ofrece una resistencia parcial que retrasa la infección sistémica tras la inoculación. 114 CAPÍTULO IV IV.2. DISEÑO EXPERIMENTAL Lima Mexicana control T36-947 HUÉSPEDES SUSCEPTIBLES PLANTAS POR HUÉSPED PASE I HUÉSPED PARCIALMENTE RESISTENTE Lima Mexicana 1 2 3 4 N. dulce Pineapple 1 2 3 4 Pomelo Duncan 1 2 3 4 N. amargo Común PASE I PASE II PASE II PASE III PASE III PASE IV LINAJE 1 2 3 4 1 2 3 4 PASE IV 1 2 3 4 PASE V PASE VI 1 2 3 4 LINAJE Figura 1: Representación esquemática del diseño experimental. A partir de la lima Mexicana control donde se mantiene el aislado T36-947 (propagada a partir de una yema de la planta original del laboratorio del Dr. W.O Dawson, University of Florida, C.R.E.C., Lake Alfred), se tomaron trozos de corteza joven para inocular por injerto grupos de 4 plantas de semilla de lima Mexicana, naranjo dulce Pineapple, pomelo Duncan y naranjo amargo Común (Linajes 1, 2, 3 y 4 de cada huésped). Una vez comprobada la infección del Pase I de los 4 huéspedes mediante IP-ELISA y transcurridos 6 meses, se injertó un nuevo lote de 12 plantas (Pase II: 4 plantas por cada huésped) a partir de cada una de las plantas del Pase I, y así sucesivamente cada 6 meses hasta transcurridos 24 meses del inicio del experimento se obtuvieron las plantas infectadas de los Pases II, III y IV. Como las primeras plantas inoculadas de naranjo amargo mostraban una distribución aparentemente errática del virus en los nuevos brotes, a partir del Pase I la infección en las plantas de naranjo amargo se detectó mediante ELISA indirecto en microplacas, y en ocasiones mediante RT-PCR. Además en este huésped el análisis se prolongó durante 12 meses más que en los susceptibles (Pases V y VI). Para lima, naranjo dulce y pomelo se analizó la población de los genes p20 y p23 en cada planta de cada uno de los 4 pases a partir de una mezcla de hojas jóvenes de la última brotación, mientras que para el naranjo amargo sólo se analizó la población de p20 a partir de corteza de ramas jóvenes. También se analizó la población de estos genes en la lima control T36-947 como término de comparación al inicio y a los 24 meses post-inoculación. El código utilizado para las muestras 115 CAPÍTULO IV incluye, junto con el código del huésped (C= lima control, L= lima Mexicana inoculada, D= naranjo dulce Pineapple, P= pomelo Duncan y A= naranjo amargo Común), el número del linaje (1, 2, 3 y 4), y el número del Pase (I, II, III, IV, V y VI). Las muestras de plantas que se analizaron por segunda vez a los 24 meses se indicaron añadiendo al final 24 (por ejemplo, la muestra P3I24 corresponde al análisis de la planta 3, pase I de pomelo Duncan que se hizo a los 24 meses de la inoculación). IV.3. RESULTADOS IV.3.1. Análisis de SSCP de las poblaciones virales en los huéspedes susceptibles Una vez comprobada la infección mediante IP-ELISA de todas las plantas, se amplificó un fragmento del gen p20 y otro de p23 con los mismos cebadores utilizados en los capítulos I, II, y III, obteniéndose fragmentos únicos de DNA de 483 nt para p20 y 372 nt para p23, que no se obtenían a partir de plantas no inoculadas. Se realizó el análisis de SSCP de estos productos de RT-PCR y todos los perfiles presentaron solo dos bandas (Figura 2, sólo se muestra la imagen para el gen p20 ya que los resultados para p23 fueron muy similares). Para los dos genes todas las plantas analizadas a lo largo del experimento mostraron el mismo perfil de SSCP, que además coincide con los correspondientes perfiles de la planta control, excepto en 3 poblaciones del gen p23 (Tabla 2: D4II, D4I24 y P3IV) que presentaron un perfil diferente al mayoritario para este gen. Lima control Lima control a los 24 meses Lima Mexicana Linajes Pase I Pase II Pase III Pase IV 1 2 3 4 1 Pineapple 2 3 4 1 Pomelo 2 3 4 L4I a los 24 meses D4I a los 24 meses P3I a los 24 meses 116 CAPÍTULO IV Figura 2: Análisis de SSCP de la población del gen p20 en plantas de lima Mexicana, naranjo dulce Pineapple y pomelo Duncan inoculadas con el aislado T36-947 (lima control) y en pases sucesivos a los 6 (Pase I), 12 (Pase II), 18 (Pase III) y 24 (Pase IV) meses de la inoculación. De las poblaciones destacadas con fondo en gris y de la población control se analizaron entre 20 y 106 clones al azar. También se analizaron la lima control y las plantas L4I, D4I y P3I a los 24 meses. IV.3.2. Examen de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas de los huéspedes susceptibles mediante análisis de los haplotipos Dada la homogeneidad de las poblaciones de p20 y p23 en las distintas plantas, salvo las tres excepciones indicadas, para estudiar la variabilidad genética y la evolución a lo largo de todo el experimento, se seleccionó de cada huésped un linaje y de cada una de las plantas inoculadas en los cuatro pases se analizaron al menos 20 clones al azar de las poblaciones amplificadas de cada gen. Además, para evaluar la variabilidad intra-huésped se analizaron clones de las 4 plantas de lima Mexicana del primer pase, y también de la planta control de lima. Al final del experimento, cuando se analizó el pase IV (a los 24 meses de la primera inoculación), se analizaron de nuevo clones de la planta control y de la planta del Pase I de cada uno de los tres huéspedes (Figura 2, poblaciones señaladas con fondo gris) para evaluar los cambios ocurridos en la población viral de una planta por el paso del tiempo. Se analizaron un total de 567 clones para el gen p20 y 503 para el gen p23 (entre 20 y 40 clones de cada una de las muestras seleccionadas y entre 40 y 106 clones de la planta control) amplificándolos mediante PCR con los mismos cebadores indicados previamente y obteniendo su perfil de SSCP en las mismas condiciones descritas (Figura 2 y Tablas 1 y 2). Se observó una gran homogeneidad en los perfiles de SSCP de todos los clones analizados, coincidiendo el perfil del haplotipo más frecuente con las bandas de DNA predominantes en el perfil de SSCP de la población analizada, y también con el de la planta control salvo en las tres poblaciones de p23 anteriormente indicadas que mostraron un perfil poblacional diferente al resto de muestras. En las Tablas 1 y 2 se muestra la frecuencia de los haplotipos presentes en cada población analizada y en la planta control. Se repite en todas las poblaciones un patrón de distribución característico, que consiste en un haplotipo muy frecuente o mayoritario (A1 para p20 y B1 para p23) y varios haplotipos minoritarios generalmente representados por un solo clon. En p23 se encontraron 2 haplotipos (B19 y B21) diferentes del mayoritario (B1): B19 aparecía como mayoritario en 2 de las poblaciones cuyo perfil de SSCP difería del de la lima control (D4I24 y P3IV) y B21 en la tercera (D4II). Estos nuevos haplotipos no se encontraron en la población de la planta control. 117 CAPÍTULO IV Tabla 1: Haplotipos de p20 detectados mediante análisis de SSCP de clones y frecuencia de los mismos en la lima control T36-947 (C) y en cada una de las plantas seleccionadas de cada huésped en los distintos pases. Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados para cada haplotipo (H) y población: C= lima control, L= lima Mexicana, D= naranjo dulce Pineapple y P= pomelo Duncan, en los sucesivos Pases (I, II, III y IV), y analizados 24 meses más tarde (24). Los haplotipos diferentes al mayoritario (números marrones) diferían de éste en uno (números negros) o dos (números azules) nucleótidos. Junto con los clones secuenciados del haplotipo A1 se muestran en negro los clones considerados A1 por su perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. L3I 24(5) 33(5) 19(5) 20(5+1) 20(5) 20(5) 20(5) 20(5) 21(5) 18(5) 20(5+1) H C C24 L1I L2I L4I L4I24 L4II L4III L4IV D4I D4I24 D4II D4III D4IV P3I 20(5) P3I24 19(5) P3II 33(6) P3III 34(7) P3IV 19(5) 36(6) 22(5) 18(5) 101(6+1+1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 25(6) 34(6) 20(6) 20(6) 20(5) 20(5) 20(5) 20(5) 23(7) 20(7) 20(6) 20(5) 20(6) 37(10) 40(13) A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29 A30 Total 106(13) 40(10) 22(5) 20(7) 1(1) 20(6) 118 CAPITULO IV Tabla 2: Haplotipos de p23 detectados mediante análisis de SSCP de clones y frecuencia de los mismos en la lima control T36-947 (C) y en cada una de las plantas seleccionadas de cada huésped en los distintos pases. Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados para cada haplotipo (H) y población: C= lima control, L= lima Mexicana, D= naranjo dulce Pineapple y P= pomelo Duncan, en los sucesivos Pases (I, II, III y IV), y analizados 24 meses más tarde (24). Los haplotipos diferentes al mayoritario (números marrones) diferían de éste en uno (números negros), dos (números azules) o tres (números rojos) nucleótidos. Junto con los clones secuenciados del haplotipo B1 se muestran en negro los clones considerados B1 por su perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. H C C24 L1I L2I L3I L4I24 L4I L4II L4III L4IV D4I D4I24 D4II D4III D4IV P3I P3I24 P3II P3III P3IV 20(5) 19(5) 24(6) 18(5) 20(5) 22(5) 27(6) 19(5) 15(5) 20(5) 25(5) 20(5) 18(6) 66(20+1+1+1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 39(20) 18(7) 20(9+1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 19(5) 1(1) 20(6) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 2(2) 20(10) 20(5) 20(6) 24(6) 20(7) 20(5) 24(7) 30(9) 20(6) 20(6) 20(6) 20(10) 20(5) 28(8) 20(5) 20(8) 1(1) 1(1) 24(5) B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B21 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 Total 72(29) 40(21) 20(9) 1(1) 25(6) 119 CAPÍTULO IV IV.3.3. Estimación de la variabilidad genética de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas de los huéspedes susceptibles mediante análisis de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas IV.3.3.1. Relaciones filogenéticas entre las variantes de secuencias Para cuantificar la variabilidad genética de ambos genes y establecer relaciones filogenéticas entre los distintos haplotipos encontrados se secuenciaron casi todos los clones que presentaban un perfil diferente al mayoritario y entre 5 y 20 clones por planta de los que presentaban el perfil mayoritario. Se secuenciaron 139 clones para p20 y 174 para p23. De los 537 clones de p20 considerados iguales por su perfil de SSCP se secuenciaron 109, de los que 105 mostraron la secuencia de T36-947 y 4 mostraron algún cambio. Los 30 clones de p20 considerados diferentes por su perfil de SSCP mostraron secuencias diferentes. Así pues, en total se obtuvieron 34 clones diferentes: 30 correspondientes a haplotipos con perfil de SSCP diferente y 4 correspondientes al haplotipo mayoritario A1 que tenían secuencia diferente (marcados en color negro en el haplotipo A1). A su vez de los 410 clones de p23 con el mismo perfil de SSCP se secuenciaron 128, 124 de los cuales mostraron la secuencia de T36-947 y 4 mostraron algún cambio. De los 93 clones de p23 con haplotipos diferentes al mayoritario se secuenciaron 46 y todos fueron diferentes. En total se obtuvieron 50 clones diferentes: 46 correspondientes a haplotipos con perfil de SSCP diferente y 4 correspondientes al haplotipo mayoritario B1 que tenían secuencia diferente (marcados en color negro en el haplotipo B1). Las secuencias de p20 y p23 que mostraban diferencias con respecto a las características de T36-947 se alinearon junto con las homólogas de los 8 aislados de comparación utilizados en la tesis. En los apéndices A1IV y A2IV se muestran todos los cambios nucleotídicos y aminoacídicos detectados en las distintas variantes de secuencia (resumidos en la línea Cambios) con respecto a la secuencia de T36-947 y a las de los aislados de comparación. El análisis filogenético de las secuencias nucleotídicas usando el método de neighbor joining con un análisis de re-muestro (bootstrap) con 1000 réplicas dio lugar a dos árboles con raíz que se muestran en la Figura 3. Se observa para ambos genes poca variabilidad y una clara separación de las secuencias obtenidas de las del resto de los aislados, excepto T36 y Qaha. 120 CAPITULO IV 65 C1.2 C1.24 D4IV.1 P3III.5 C1.4b L4II.8 C17.24 P3II.8 P3II.10 D4I.7.24 C4.3 P3III.24 C4.2 P3III.2 D4III.4 C31.24 65 P3III.1 L4I.2.24 L2I.3 L4I.18 P3II.4 D4III.18 63 P3I.6.24 C3.6b L3I.6 Qaha P3IV.4 T36 L2I.11 C1.7 C3.2 19 C19.24 10 9 P3III.15 18 P3III.2 D4IV.9 29 P3II.3 35 100 37 31 L1I.14 C4.f L1I.16 Qaha D3IV.j D3IV.18 C3.5 P3III.28 x2 D3I.23 54 P3IV.1 C4.o 41 P3IV.12 x5 50 D3I.1.24 x5 D3II.2 x6 D3I.6.24 66 L3IV.15 D3IV.i C1.a 63 L2I.8 P3I.6.24 D3I.25 66 D3IV.a C2.6 D3IV.b C2.a D3I.e P3I.7.24 C2.b L3II.17 L3IV.12 C2.k P3I.26.24 T36 D3III.17 L3II.9 L4I.11 C.7.24 C1.6 T36-947 0.01 66 93 T318A NUagA 96 89 VT 100 T385 T30 A: gen p20 B: gen p23 100 100 VT T388 90 T318A 94 SY568R 87 NUagA 96 T30 T385 T36-947 0.01 Figura 3: Árbol filogenético con raíz obtenido por el método neighbor joining con las variantes de secuencia de los genes p20 (A) y p23 (B), detectadas en las plantas de distintas especies susceptibles inoculadas con el aislado T36-947 en pases sucesivos y a los 24 meses postinoculación (24). El número a continuación del código de la muestra indica el número del clon. Las secuencias indicadas en rojo corresponden a aislados de referencia y el aislado resaltado en verde es el aislado clonal T36-947. Los valores de los nodos se obtuvieron mediante re-muestreo con 1000 réplicas. Cuando la secuencia aparece más de una vez se indica su frecuencia (x número de veces). IV.3.3.2. Análisis de la variabilidad nucleotídica y aminoacídica de p20 y p23 en las poblaciones seleccionadas El análisis de las 34 secuencias diferentes que se obtuvieron del gen p20 mostró que 30 de ellas presentaban 1 cambio nucleotídico con respecto a la secuencia característica de 947 y 4 presentaban 2 cambios (Tabla 1, haplotipos indicados en letras de color negro y azul respectivamente). El número total de posiciones polimórficas fue 38, lo que representa el 7,8% de las posiciones en el alineamiento, de las cuales el 92% eran transiciones. 121 CAPÍTULO IV De las 50 variantes de secuencia que se detectaron del gen p23, también la mayoría (37) presentaban 1 solo cambio nucleotídico, 12 presentaban 2 cambios y 1 presentaba 3 (Tabla 2, haplotipos indicados con números de color negro, azul y rojo, respectivamente). El número total de posiciones polimórficas fue 64 (17% de las posiciones del alineamiento) y el 95% fueron transiciones. Para p20 la mayoría de los cambios fueron únicos y sólo 4 fueron compartidos entre las secuencias obtenidas. De los 38 cambios detectados sólo 6 están presentes en alguna de las 8 secuencias de los aislados de CTV utilizadas para comparación en el alineamiento múltiple. Para p23 casi la mitad de los cambios detectados (30) fueron compartidos (debido a la frecuencia del cambio presente en el haplotipo B19, que también está presente aunque no es el único en B20, B21 y B30), y 24 de ellos están presentes en otras secuencias de CTV. El cambio de B19, que se repite 18 veces, está presente en la secuencia del aislado T30. La mayoría de las mutaciones puntuales que encontramos para ambos genes se encuentran distribuidas al azar a lo largo de la secuencia, excepto el cambio nucleotídico presente en los haplotipos B19, B20, B21 y B30 de p23 que se repite 18 veces en las poblaciones analizadas. Esta mutación es una transición T376C que afecta a la primera base del codón pero no da lugar a ningún cambio de aminoácido. El número de posiciones aminoacídicas polimórficas encontradas en p20 (22 de un total de 161 residuos) representan el 13,6% del total. Todas son únicas y sólo 3 de ellas coinciden con la secuencia de p20 de otros aislados de CTV. Para p23 el 27,4% de las posiciones aminoacídicas fueron polimórficas (34 de los 124 residuos), con 11 cambios compartidos y 23 únicos. De todos los cambios aminoacídicos observados sólo 2 se hallan en las secuencias de otros aislados utilizadas en los alineamientos. De los 22 cambios aminoacídicos observados en p20, 10 pertenecen al mismo grupo y 12 supusieron un cambio de grupo, mientras que de los 34 observados en p23 sólo 7 pertenecieron al mismo grupo y el resto supusieron un cambio de grupo. IV.3.3.3. Variación genética dentro de y entre las poblaciones Con el fin de evaluar la fiabilidad del análisis de SSCP para seleccionar variantes de secuencia, se calculó la distancia nucleotídica entre todos los pares de clones con el mismo perfil de SSCP para cada gen. La diversidad nucleotídica media entre clones con el mismo haplotipo fue de 0.00014±0.00008 para p20 y de 0.00024±0.00010 para p23. Para evaluar la variabilidad intra-huésped se calculó la diversidad genética en cada una de las 4 plantas del primer pase de lima Mexicana usando las distancias nucleotídicas entre los haplotipos detectados y su frecuencia en cada población (determinada por el análisis de SSCP). Esta osciló entre 0 y 0.00055 para p20 y entre 0.00030 y 0.00060 para p23. De igual forma se calculó la diversidad genética dentro de cada planta de los linajes seleccionados y de la planta control. Los valores de diversidad intrapoblacional oscilaron entre 0 y 0.00062 para p20 y entre 0 y 0.00161 para p23 (Figura 4). Para p20 el valor máximo lo encontramos en la población P3III y para p23 en la D4IV. Aunque en p23 encontramos valores ligeramente superiores, en general todos fueron muy bajos y homogéneos. 122 CAPITULO IV 0,0007 0,0006 0,0005 0,0004 0,0003 0,0002 0,0001 0 I II III IV A lima pomelo dulce control 0,002 0,0015 0,001 0,0005 0 I II III IV B lima pomelo dulce control Figura 4: Diversidad nucleotídica de p20 (A) y p23 (B) en la planta control, y en las plantas de cada uno de los linajes seleccionados en los tres huéspedes (lima, naranjo dulce y pomelo) a lo largo de los 4 pases sucesivos (I, II, III y IV). El efecto de distintos factores en la variabilidad genética de las poblaciones se estudió mediante análisis de la varianza molecular (AMOVA) jerarquizando de distintas formas los factores de variación. En primer lugar se agruparon los individuos inoculados con el mismo aislado (sin considerar la especie, el pase o el tiempo desde la inoculación) y se analizó para cada gen la variación entre plantas y dentro de cada planta. Los dos genes presentaron un comportamiento diferente: mientras en p20 la variación dentro de plantas fue la que más contribuía a la variación total, en p23 la mayor contribución era la variación entre plantas, siendo ésta la única significativa en el análisis (Tablas 3 y 4). Tabla 3: AMOVA para el gen p20 agrupando todas las plantas inoculadas con el aislado de CTV T36-947. Fuente de variación Entre plantas del mismo grupo Dentro de plantas Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 19 545 564 1.139 36.777 37.917 -0.00027 Va 0.06748 Vb 0.06721 -0.41 100.41 -0.00405 123 CAPÍTULO IV Tabla 4: AMOVA para el gen p23 agrupando todas las plantas inoculadas con el aislado de CTV T36-947. Fuente de variación Entre plantas del mismo grupo Dentro de plantas Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 19 483 502 77.212 38.495 115.708 0.16028 Va 0.07970 Vb 0.23998 66.79 33.21 0.66788‫٭‬ Para examinar el posible efecto de las especies inoculadas y del tiempo de permanencia de CTV en cada especie, para cada gen se agruparon los datos según el huésped o el pase analizado, considerando el tipo y frecuencia de haplotipos detectados en cada grupo y estimando la probabilidad de que esa distribución fuese al azar. En el caso de p20 (Tablas 5 y 7) el análisis AMOVA mostró que la variación entre grupos no era significativa, se hiciesen éstos en función del huésped (Tabla 5) o en función del pase (Tabla 7). Aunque la variación dentro de plantas o entre plantas del mismo grupo no resultó significativa, era la variación dentro de plantas la que más contribuía a la variación total. Estos datos indican que el gen p20 es estable y que ni el factor huésped ni el factor tiempo de permanencia en cada huésped influyen significativamente en la estructura de la población. Para el gen p23 (Tablas 6 y 8), aunque la variación entre grupos sí resultó significativa, fue la variación entre plantas del mismo grupo la que más contribuía a la variación total. Tablas 5: AMOVA para el p20 agrupando las plantas según el huésped (grupos: control, lima, naranjo dulce y pomelo). Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 3 0.225 0.00017 Va 0.25 -0.00610 16 545 564 0.915 36.777 37.917 -0.00041 Vb 0.06748 Vc 0.06724 -0.61 100.35 -0.00354 0.00254 124 CAPITULO IV Tablas 6: AMOVA para el p23 agrupando las plantas según el huésped (grupos: control, lima, naranjo dulce y pomelo). Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 3 16 483 502 14.773 62.440 38.495 115.708 -0.00333 Va 0.16290 Vb 0.07970 Vc 0.23928 -1.39 68.08 33.31 0.67148‫٭‬ 0.66691‫٭‬ -0.01390 Tabla 7: AMOVA para el p20 agrupando las plantas según el pase analizado (grupos: control, pases I, II, III y IV). Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 4 15 545 564 0.308 0.832 36.777 37.917 0.00029 Va -0.00051 Vb 0.06748 Vc 0.06725 0.43 -0.77 100.34 -0.00768 -0.00339 0.00426 Tabla 8: AMOVA para el p23 agrupando las plantas según el pase analizado (grupos: control, pases I, II, III y IV). Fuente de variación Entre grupos Entre árboles del mismo grupo Dentro de árboles Total Grados de libertad Suma de cuadrados Componentes de la varianza Porcentaje de variación F 4 15 483 502 15.657 61.555 38.495 115.708 -0.02063 Va 0.17686 Vb 0.7970 Vc 0.23593 -8.74 74.96 33.78 0.68935‫٭‬ 0.66219‫٭‬ -0.08744 El examen de la diversidad nucleotídica media agrupando los datos según el huésped o según el pase del análisis (Tablas 9 y 10) mostró gran estabilidad de la población de CTV en estos huéspedes susceptibles. 125 CAPÍTULO IV . Tabla 9: Diversidad nucleotídica de p20 y p23 en función del huésped analizado y error estándar (SE) usando re-muestreo con 1000 réplicas. p20 C L D P C 0.00038 (0.00010) L 0.00016 (0.00006) D P p23 C L C 0.00062 (0.00017) L 0.00026 (0.00008) D P 0.00027 (0.00006) 0.00044 (0.00009) 0.00029 (0.00007) 0.00018 (0.00005) 0.00020 (0.00019) D 0.00040 (0.00011) 0.00205 (0.00107) 0.00186 (0.00086) 0.00260 (0.00140) 0.00039 (0.00008) 0.00028 (0.00007) 0.00030 (0.00007) P 0.00110 (0.00059) 0.00091 (0.00068) 0.00209 (0.00100) 0.00130 (0.00093) La diversidad nucleotídica que se observó para ambos genes en los distintos huéspedes fue generalmente baja. Para p20 los valores de diversidad dentro de cada huésped y entre huéspedes fueron similares al de la planta control, mientras que para p23 estos valores fueron ligeramente superiores para naranjo dulce y pomelo (Tabla 9), lo que probablemente está relacionado con el incremento en la frecuencia de los haplotipos B19 y B21 en estos huéspedes. Cuando se agruparon los datos por pases no se observó una tendencia clara en los datos de diversidad en función del tiempo de permanencia de CTV en cada huésped (Tabla 10). Para cada uno de los genes los valores de diversidad intra- e inter-poblacionales fueron generalmente del mismo orden. De nuevo, los valores ligeramente superiores que se observan para los pases II y IV en p23 están probablemente relacionados con la aparición en estos pases de los haplotipos B19 y B21. Tabla 10: Diversidad nucleotídica de p20 y p23 en función del pase analizado y error estándar (SE) usando re-muestreo con 1000 réplicas. p20 C I II III IV p23 C I II III IV C 0.00036 (0.00010) I 0.00015 (0.00011) II III IV 0.00025 (0.00018) 0.00032 (0.00013) 0.00021 (0.00014) 0.00027 (0.00018) 0.00038 (0.00024) 0.00028 (0.00025) 0.00034 (0.00012) 0.00041 (0.00030) 0.00032 (0.00013) 0.00022 (0.00020) 0.00028 (0.00022) 0.00035 (0.00012) 0.00029 (0.00010) C 0.00082 (0.00024) I 0.00029 (0.00011) II III IV 0.00056 (0.00030) 0.00229 (0.00150) 0.00203 (0.00030) 0.00261 (0.00168) 0.00054 (0.00030) 0.00028 (0.00018) 0.00202 (0.00100) 0.00027 (0.00018) 0.00133 (0.00100) 0.00106 (0.00090) 0.00236 (0.00130) 0.00105 (0.00080) 0.00151 (0.00100) 126 CAPITULO IV Para examinar el efecto del factor tiempo en la variación de la diversidad nucleotídica intrapoblacional de las plantas seleccionadas se comparó la diversidad al inicio del experimento y 24 meses después del primer pase en dos condiciones diferentes: una comparando la planta control y las plantas L4I, P3I y D4I del primer pase en los análisis efectuados al principio y a los 24 meses (Figura 5), y la segunda comparando éstas mismas plantas en el primer y cuarto pase (I y IV) (Figura 6). En el segundo caso las poblaciones pasan por 3 cuellos de botella que no ocurren en el primero. 0,0004 0,00035 0,0003 0,00025 0,0002 0,00015 0,0001 0,00005 0 I 24m A lima pomelo dulce control 0,0009 0,0008 0,0007 0,0006 0,0005 0,0004 0,0003 0,0002 0,0001 0 I 24m B lima pomelo dulce control Figura 5: Diversidad nucleotídica de p20 (A) y p23 (B) en la planta control y en la primera planta de cada linaje seleccionado en los tres huéspedes (lima, naranjo dulce y pomelo) a dos tiempos diferentes: a los 6 meses de la inoculación del primer pase (I) y transcurridos 24 meses (24m) en esas mismas plantas. En el primer análisis observamos que todos los valores de diversidad de p20 excepto el de la lima control aumentaban desde el tiempo inicial hasta los 24 meses después, y todos los de p23 excepto el de pomelo disminuían. Sin embargo, cuando comparamos el primer y el cuarto pase los valores de diversidad de ambos genes aumentan excepto el de p20 en lima. No obstante, la cuantía de estas variaciones es reducida. 0,0005 0,0004 0,0003 0,0002 0,0001 0 I 0,0016 0,0014 0,0012 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0 I IV A lima pomelo dulce control IV B lima pomelo dulce control Figura 6: Diversidad nucleotídica de p20 (A) y p23 (B) en la planta control y dentro de la primera (I) y última (IV) plantas de cada uno de los linajes seleccionados para los tres huéspedes (lima, naranjo dulce y pomelo). 127 CAPÍTULO IV La presión de selección sobre p20 y p23 se estimó en las plantas seleccionadas de cada huésped y pase mediante el cociente entre los valores de diversidad nucleotídica en las posiciones no sinónimas y en las sinónimas (dNS/dS). Sin embargo, en 10 de las poblaciones de p20 y en 12 de p23 el valor de dS era cero y el cociente dNS/dS no aportaba ninguna información (Tabla 11). Por otra parte, aunque el número de cambios nucleotídicos en las secuencias era muy pequeño muchos de esos cambios son no sinónimos, lo que da lugar a cocientes superiores a 1 que pueden dar una idea equivocada sobre la presión de selección de las poblaciones. Este fue el caso de dos poblaciones de pomelo para p20, dos de naranjo dulce para p23 y de la propia población control (Tabla 11, poblaciones marcadas en rojo). Tabla 11: Sustituciones no sinónimas por sitio no sinónimo (dNS), sustituciones sinónimas por sitio sinónimo (dS) y relación media dNS/dS para los genes p20 y p23 en cada una de las plantas analizadas. SE, error estándar usando re-muestreo con 1000 réplicas. En rojo se indican los valores dNS/dS>1. p20 C C24 L1I L2I L3I L4I L4II L4III L4IV L4I24 D4I D4II D4III D4IV D4I24 P3I P3II P3III P3IV P3I24 dNS 0.00024(0.00011) 0.00033(0.00028) 0 0.00033(0.00033) 0.00052(0.00036) 0.00019(0.00019) 0 0 0 0.00025(0.00025) 0 0 0.00036(0.00024) 0.00033(0.00033) 0 0 0.00049(0.00040) 0.00069(0.00058) 0.00033(0.00027) 0 dS 0.00074(0.00036) 0.00059(0.00055) dNS/dS 0.3 0.5 0.5 0 0.7 0 1.4 2.1 0.5 0 0 0.00058(0.00057) 0 0 0.00058(0.00058) 0 0 0 0 0 0.00051(0.00050) 0 0.00058(0.00058) 0 0.00033(0.00033) 0.00032(0.00032) 0.00059(0.00051) 0.00059(0.00050) p23 C C24 L1I L2I L3I L4I L4II L4III L4IV L4I24 D4I D4II D4III D4IV D4I24 P3I P3II P3III P3IV P3I24 dNS 0.00099(0.00035) 0 0 0.00042(0.00041) 0 0 0.00085(0.00061) 0 0.00045(0.00030) 0 0.00056(0.00039) 0 0 0.002(0.00092) 0.00042(0.00041) dS 0.00043(0.00030) 0.00076(0.00053) 0.0015(0.00104) 0 0 0.00076(0.00079) 0 0 0.00062(0.00062) 0 0.00051(0.00050) 0 0.00076(0.00079) 0.00072(0.00074) 0 0 0 0 0 0 dNS/dS 2.3 0 0 0 0.7 1.09 0 2.7 - 0 0 0.0008(0.00077) 0.00034(0.00034) 0.00144(0.00062) En la población control y en todas las poblaciones seleccionadas se comparó para ambos genes la distribución de haplotipos observados y esperados bajo un modelo de evolución neutral con el test de Ewens-Watterson, excluyendo del análisis las poblaciones donde se había encontrado un solo haplotipo. La comparación de los valores de homocigosidad esperados y observados para los dos genes en la planta donante y en las demás poblaciones analizadas, mostró que todos difieren significativamente de la neutralidad (Tabla 12). En general los valores de homocigosidad observados en las plantas analizadas fueron del mismo orden o incluso superiores que en la población control. 128 CAPITULO IV Tabla 12: Homocigosidad observada y esperada para los genes p20 y p23 según el modelo neutral de infinitos alelos y probabilidad (P) de que ambas sean diferentes en las poblaciones con más de un haplotipo (re-muestreo con 10.000 distribuciones aleatorias). p20 C C24 L2I L3I L4I L4I24 L4II P3II P3III P3IV P3I24 D4III D4IV D4I24 Observada 0.87291 0.81250 0.815 0.9232 0.94291 0.905 0.905 0.79839 0.72625 0.905 0.905 0.815 0.82313 0.905 Esperada 0.33736 0.42053 0.56035 0.74554 0.7638 0.73069 0.73447 0.41384 0.3069 0.73560 0.734 0.55964 0.56315 0.7334 P 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 p23 C C24 L1I L2I L4I L4II L4IV P3III P3IV P3I24 D4I D4III D4IV D4I24 Observada 0.76736 0.95125 0.815 0.905 0.905 0.815 0.84375 0.82 0.9232 0.80102 0.81333 0.905 0.575 0.905 Esperada 0.24916 0.77407 0.55959 0.73231 0.7332 0.55971 0.57873 0.73077 0.7456 0.47039 0.47679 0.73402 0.29354 0.73316 P 1 1 1 1 1 1 1 0.7088 1 1 1 1 1 1 IV.3.4. Análisis de SSCP de las poblaciones virales en el huésped parcialmente resistente naranjo amargo Las 4 plantas de naranjo amargo inoculadas en el primer pase dieron reacción positiva a CTV mediante IP-ELISA mientras que las de pases sucesivos no dieron señal alguna. A partir del Pase II se intentó detectar la infección mediante ELISA indirecto en microplacas, obteniéndose puntualmente alguna reacción positiva, pero en la mayoría de las plantas la detección del virus sólo fue posible mediante RT-PCR (Figura 7). Una vez comprobada la infección se amplificó un fragmento del gen p20 con los mismos cebadores utilizados para los huéspedes susceptibles obteniéndose un fragmento único de DNA de 483 nt que no se observaba con extractos similares de plantas sanas. El análisis de SSCP de estos productos de RT-PCR mostró que las 4 plantas analizadas en los pases I, III y VI, 3 de las del Pase V y la planta 3 del Pase IV, tenían el mismo perfil de SSCP que la lima control (Figura 7). La planta 2 del pase V aunque mostraba básicamente el perfil de la lima control presentaba una banda inferior más débil, mientras que todas las plantas del pase II y 3 del pase IV mostraban perfiles claramente diferentes al de la lima control. Los perfiles de estas plantas del pase IV eran iguales entre sí y consistían en dos bandas muy intensas y una intermedia más débil. Las plantas del pase II presentaban un perfil distinto a las del pase IV y el de tres de ellas era coincidente, mientras que el de la cuarta era distinto y parecía una mezcla de variantes. Frente a la homogeneidad encontrada en los huéspedes susceptibles, se observaron cambios significativos en los perfiles de SSCP en los diferentes pases. Para estudiar la variabilidad genética y observar la evolución a lo largo de todo el experimento, se seleccionaron y analizaron las plantas de los 4 linajes a lo largo de los 6 pases en comparación con la planta lima control anteriormente analizada (Figura 7 poblaciones señaladas con fondo gris). 129 CAPÍTULO IV Lima control p20 Linajes Pase I Pase II Pase III Pase IV Pase V Pase VI Naranjo Amargo común 1 2 3 4 IP-ELISA + IP-ELISA - Figura 7: Análisis de SSCP de la población del gen p20 en la planta de lima control, y en las de naranjo amargo inoculadas con el aislado T36-947 (lima control) en pases sucesivos a los 6 (Pase I), 12 (Pase II), 18 (Pase III), 24 (Pase IV), 30 (Pase V) y 36 (Pase VI) meses de la primera inoculación. De todas las poblaciones destacadas con el fondo en gris y de la población control se analizaron entre 20 y 106 clones al azar. IV.3.5. Estimación de la variabilidad genética de p20 en las poblaciones seleccionadas del huésped parcialmente resistente mediante análisis de los haplotipos Se analizaron un total de 510 clones para el gen p20 en el huésped parcialmente resistente: 120 para el Linaje 1, 144 para el 2, 126 para el 3 y 120 para el 4 (entre 20 y 41 clones de cada una de las muestras seleccionadas), además de los 106 clones de la lima control, amplificándolos mediante PCR con los mismos cebadores y obteniendo su perfil de SSCP en las mismas condiciones que para los huéspedes susceptibles (Tabla 13). Se observaron diferencias en los perfiles de SSCP de los clones analizados, coincidiendo el perfil del haplotipo más frecuente con las bandas de DNA predominantes en el perfil de SSCP del correspondiente producto de PCR de la población analizada, pero sólo en determinadas poblaciones el haplotipo más frecuente coincidía con el de la planta control. Ocho de las poblaciones mostraron un perfil poblacional diferente al resto de muestras y al de la población control. En la Tabla 13 se muestra la frecuencia de los haplotipos presentes en cada linaje a lo largo de los 6 pases y en la planta control. Se repite en todas las poblaciones un patrón de distribución característico, que consiste en un haplotipo muy frecuente o mayoritario (generalmente A1 para p20 aunque aparecen H1 y H2) y varios haplotipos minoritarios representados por 1 o 2 clones. En todos los linajes encontramos entre 2 y 3 plantas que presentan un haplotipo mayoritario diferente a A1: H1 o H2, que no aparece en la población control. Estas poblaciones presentaban un perfil de SSCP diferente a la planta control y al resto de plantas analizadas. 130 CAPITULO IV Tabla 13: Haplotipos de p20 detectados mediante análisis de SSCP de clones y frecuencia de los mismos en la lima control T36-947 (C) y en cada una de las plantas de naranjo amargo de los distintos pases. Entre paréntesis se indica el número de clones secuenciados para cada haplotipo (H) y población: C= lima control, A1= linaje 1, A2= linaje 2, A3= linaje 3 y A4= linaje 4 en los sucesivos pases (I, II, III, IV, V y VI). Todos los haplotipos diferentes a alguna de las 3 secuencias mayoritarias (A1, H1 y H2) indicados con números en negro difieren de éstas en un sólo cambio nucleotídico, en azul en dos, en rojo en tres, en rosa en cuatro, en blanco en cinco, en azul claro en seis, en morado en siete, en amarillo en nueve y en verde en diez. Los haplotipos H1 y H2 se muestran en naranja y verde oscuro y se diferencian del mayoritario A1 en 43 y 59 nucleótidos respectivamente. Las secuencias marcadas con una R son recombinantes y las marcadas con ‫ ٭‬representan secuencias intermedias en los árboles filogenéticos posteriores (Figura 14). El fondo gris indica que la variación en las secuencias es con respecto al haplotipo A1, en naranja con respecto a H1 y en verde con respecto a H2. Junto con los clones secuenciados del haplotipo A1 se muestran en negro los clones considerados A1 por su perfil de SSCP que mostraron una secuencia diferente. Todos diferían en un solo cambio nucleotídico. C 20(5) 19(8+1) 18(5) A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 99(6) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 26(8) A1I A1II A1III A1IV A1V A1VI H C A3I A3II A3III 20(5) A3IV 20(5+1) A3V 17(10) A3VI 19(5) 99(6) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 18(5) 1(1) 1(1) 1(1)‫٭‬ 20(5) 20(7) 20(10) 2(2) 20(7) 20(5) 2(2) 17(5) 17(5) 1(1) 1(1) 1(1)‫٭‬ 1(1)‫٭‬ 1(1) 1(1)‫٭‬ 106(13) 26(8) 20(8) 20(5) 20(6) 20(13) 1(1)‫٭‬ 20(6) H A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 1(1)‫٭‬ Total 106(13) 20(5) 20(8) H1 H2 H34 H35 H36 H37 H38 H39 Total 131 CAPÍTULO IV A2IV 11(8) 18(5+1) H C A2I A2II A2III A2V A2VI 23(6) 25(10) 16(5) A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 99(6) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) H 20(6) 18(5) 15(5) 18(5) A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 16(9) 16(5) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1)‫٭‬ 1(1) 1(1) 2(2)‫٭‬ 1(1)‫٭‬ 1(1)‫٭‬ 1(1) 1(1) 1(1) 1(1)‫٭‬ 1(1) 99(6) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) C A4I A4II A4III A4IV A4V A4VI 18(5+1+1) 4(4) 1(1)‫٭‬ 2(2)‫٭‬ 1(1)‫٭‬ 1(1)‫٭‬ 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1)‫٭‬ 1(1)R 1(1)R 1(1)R 2(2)‫٭‬ 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1(1)‫٭‬ 1(1)R 1(1)R 1(1)R 1(1)‫٭‬ 1(1) 1(1)‫٭‬ 106(13) 20(6) 20(13) 20(7) 20(9) 20(10) 20(9) H1 H2 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22 H23 H24 H25 H26 H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 Total 20(7) 20(17) 1(1) 1(1) 20(8) 106(13) 23(6) 41(26) 20(9) H1 H2 H40 H41 H42 H43 H44 H45 H46 H47 H48 H49 H50 H51 H52 H53 H54 Total 132 CAPÍTULO IV IV.3.6. Estimación de la variabilidad genética de p20 en las poblaciones seleccionadas mediante análisis de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas IV.3.6.1. Relaciones filogenéticas entre las variantes de secuencia Siguiendo la metodología utilizada con los huéspedes susceptibles, a partir de las plantas inoculadas con T36-947 se secuenciaron un total de 215 clones de p20. De los 345 clones de p20 del haplotipo A1 detectados en los cuatro linajes de naranjo amargo se secuenciaron 118, de los que 113 mostraron la misma secuencia y 5 mostraron algún cambio. De los 165 clones de p20 que mostraron un haplotipo diferente al A1 en el análisis de SSCP se secuenciaron 97 y todos mostraron secuencias diferentes a la del haplotipo A1, por lo que se obtuvo un total de 102 secuencias incluyendo las cinco diferentes del haplotipo A1. Todas las secuencias de p20 obtenidas se analizaron y alinearon junto con las homólogas de los 8 aislados de comparación (T318A, SY568R, NUagA, T385, T30, VT, T36 y Qaha) utilizadas en otros capítulos y en el estudio con huéspedes susceptibles de este capítulo. En los apéndices A3IV se muestran todos los cambios nucleotídicos y aminoacídicos detectados en las distintas variantes de secuencia (resumidos en la línea Cambios) con respecto a la secuencia de T36-947 y a las de los aislados de comparación. Un primer análisis filogenético de todas las secuencias obtenidas por el método neighbor joining dio lugar a un árbol con raíz (figura no mostrada), en el que se observaban 3 grupos bien definidos, uno en torno a la secuencia parental de T36-947 (haplotipo A1), otro en torno a la secuencia de p20 del aislado T388 (haplotipo H1) y un tercero en torno a la secuencia de p20 del aislado T385 (haplotipo H2), junto con una serie de haplotipos minoritarios algunos de ellos alejados filogenéticamente de la secuencia parental. El número de cambios nucleotídicos entre A1 y H1 era de 43, 59 entre A1 y H2 y 35 entre H1 y H2. Como consecuencia de este resultado se analizó la distribución de los haplotipos encontrados en cada uno de los 4 linajes de naranjo amargo (Figura 8). Observamos que junto con un gran porcentaje de secuencias tipo T36-947 (A1), en todos ellos encontramos en mayor o menor medida secuencias tipo T388 (H1) y T385 (H2) junto con un número variable de secuencias minoritarias representadas por 1 o 2 clones. 133 CAPÍTULO IV A1(x78) Linaje 1 H1(x17) H2(x18) H3(x1) H4(x1) H5(x1) H6(x1) H7(x1) H8(x2) Linaje 2 A1(x92) H1(x4) H2(x18) H9(x1) H10(x2) H11(x1) H12(x1) H13(x1) H14(x1) H15(x1) H16(x1) H17(x1) H18(x2) H19(x1) H20(x2) H21(x1) H22(x1) H23(x1) H24(x1) H25(x1) H26(x1) H27(x1) H28(x1) H29(x1) H30(x1) H31(x1) H32(x1) H33(x1) H34(x1) H35(x1) A1(x101) Linaje 4 Linaje 3 H1(x17) H2(x1) H36(x1) H37(x1) H38(x1) H39(x1) H40(x1) H41(x1) H42(x1) A1(x69) H1(x17) H2(x16) H43(x1) H44(x1) H45(x1) H46(x1) H47(x1) H48(x1) H49(x1) H50(x1) H51(x1) H52(x1) H53(x1) H54(x1) H55(x1) H56(x1) H57(x1) H58(x1) H59(x1) H60(x1) Figura 8: Distribución y frecuencia (entre paréntesis) de los distintos haplotipos encontrados en cada uno de los 4 linajes de naranjo amargo. A continuación se analizó el patrón de distribución de los 3 haplotipos más frecuentes (A1, H1 y H2) en los distintos pases de cada linaje, tomando exclusivamente las secuencias que mostraban 100% de identidad con la secuencia parental T36-947 y con las secuencias tipo T388 y T385 (Figura 9). 134 CAPÍTULO IV Linaje 1 25 20 15 10 5 0 I II III IV V VI Linaje 2 30 25 20 15 10 5 0 I II III IV V VI A1-T36 H1-T388 H2-T385 pases pases Linaje 4 25 Linaje 3 30 25 20 15 10 5 0 I II III IV V VI 20 15 10 5 0 I II A1-T36 H1-T388 H2-T385 III IV V VI pases pases Figura 9: Patrón de distribución y frecuencia de las secuencias tipo T36-947, T388 y T385 en los distintos pases de los cuatros linajes de naranjo amargo. En los linajes 1 y 4 observamos un comportamiento muy similar, con un pico de secuencias tipo T388 en el pase II, otro de T385 en el pase IV y en el resto una predominancia de las secuencias tipo T36-947. El linaje 2 presenta un pico de secuencias tipo T385 en el pase IV, y en el resto una predominancia de T36-947, aunque en el pase II se observan secuencias tipo T388. En el linaje 3 hay un pico de secuencias tipo T388 en el pase II y en el resto predominancia de T36-947 aunque se observan secuencias tipo T385 en el pase V. IV.3.6.2. Variación genética y presiones selectivas en los cuatro linajes del huésped parcialmente resistente Se calculó la diversidad genética dentro de la población de la planta donante y de cada una de las plantas analizadas en los 4 linajes usando la distancia nucleotídica entre los haplotipos y su frecuencia en cada población (determinada por el análisis de SSCP) (Tabla 14). Algunas poblaciones mostraron valores de diversidad genética intrapoblacional de p20 entre 0 y 0.00155, muy similares o ligeramente superiores a los encontrados en los huéspedes susceptibles y en la planta donante, aunque en algunos casos el haplotipo mayoritario no fuese A1 sino H1 o H2. Sin embargo, cinco de las poblaciones presentaron valores de diversidad muy superiores (entre 0.01081 y 0.048), siendo el valor máximo el de la población A2II. Este aumento en la diversidad se debe a la presencia de los 3 haplotipos A1, H1 y H2, alejados filogenéticamente, que presentan distancias nucleotídicas entre ellos muy altas [0.09 entre H1 (T388) y A1 (T36-947), 0.1 entre H2 (T385) y A1 (T36-947) y 0.08 entre H1 (T388) y H2 (T385)]. 135 CAPÍTULO IV Tabla 14: Diversidad nucleotídica de p20 en la planta control y en cada una de las plantas de los 6 pases sucesivos (I, II, III, IV, V y VI) en naranjo amargo. Con fondo gris se resaltan los valores inferiores y en caracteres de color rojo los más altos. Linaje Pase I Pase II Pase III Pase IV Pase V Pase VI 1 0 0.02506 (0.00324) 2 0 0.048 (0.005) 3 0 0.00125 (0.00075) 4 0 0.00104 (0.00080) 0 0.00062 (0.00036) 0.00155 (0.00080) 0 0 0.00104 (0.00080) 0.00041 (0.00035) 0.00104 (0.00080) 0.04606 (0.00578) 0.00021 (0.00020) 0.02807 (0.00389) 0.01081 (0.0097) 0.00104 (0.00080) 0.00039 (0.00028) 0.00083 (0.00067) 0.00125 (0.00075) La distancia nucleotídica media calculada para cada linaje presentó valores muy similares a los valores de diversidad nucleotídica intrapoblacional, con valores muy alejados de los obtenidos en los huéspedes susceptibles. El valor máximo (0.05200±0.00575) se obtuvo de nuevo en el linaje 2 (Tabla 15). Para evaluar las presiones de selección en esta región, se analizaron codones individuales usando el método FEL (Tabla 15). Debido a que las estimas de los valores de dNS y dS son muy sensibles a la presencia de secuencias recombinantes, se realizó un análisis preliminar de la recombinación en los cuatro linajes mediante la herramienta GARD y se encontraron 6 señales significativas de recombinación en p20: 2 en la población A1II en las posiciones 300 y 303, 1 en A2II en la posición 306, 2 en A2V en 159 y 331 y por último 1 en A3V en la posición 402. Teniendo en cuenta este resultado se calculó el número de codones seleccionados negativamente y la media de los valores normalizados de dNS-dS para cada linaje con un nivel de significación de 0.01 (Tabla 15). El número total de codones bajo selección purificadora fue de 91, oscilando entre 22 y 24 en los distintos linajes, lo que supone entre 13 y 15% del total de codones analizados. Al estudiar la intensidad de la selección negativa mediante el análisis del valor medio normalizado de dNS-dS observamos que todos los valores son negativos y que los linajes 1 y 4 presentan valores parecidos, mientras que los linajes 2 y 3 presentan los valores máximo y mínimo. Tabla 15: Distancia nucleotídica y frecuencia e intensidad de la selección negativa a nivel de aminoácidos en los diferentes linajes de naranjo amargo. Distancia nucleotídica media ± SE Linaje 1 Linaje 2 Linaje 3 Linaje 4 0.04997±0.00575 0.05200±0.00575 0.02529±0.00356 0.04913±0.00555 Número de codones seleccionados negativamente 23 24 22 22 dNS-dS -36.565 -15.625 -47.45 -25.772 136 CAPÍTULO IV SE: error estándar estimado mediante re-muestreo con 1000 réplicas. dNS-dS: Media de los valores normalizados de la diferencia entre las substituciones no sinónimas y sinónimas de los codones seleccionados estimados por el método FEL. Para profundizar en el análisis de las presiones de selección que actúan a nivel aminoacídico en los cuatro linajes, se estimaron los valores (w) de la relación entre dNS y dS específicos por rama con la herramienta GA-Brach, que utiliza un algoritmo genético que identifica modelos con número variable de categorías de w por linaje, que se adapta mejor a los datos con respecto a modelos de categorías fijas de w (todos los linajes con el mismo w) o totalmente saturados (cada linaje evolucionado con diferentes w). Aunque los valores de w y la proporción de ramas asociada a cada valor varía en los cuatro linajes (Tabla 16), podemos observar que para los linajes 1, 3 y 4 entre el 87 y el 97% de los valores de w son inferiores a 0.1, lo que indica una selección negativa intensa, mientras que en el linaje 2 el 51% de los valores se sitúa entre 0.1 y 0.2, indicando una selección negativa moderada. En todos los linajes hay entre 3 y 13% de valores superiores a 1 que indican selección positiva. Tabla 16: Análisis específico por linaje de las presiones de selección en el gen p20 de CTV en naranjo amargo w >1 0.1-0.199 0.01-0.099 0.013 (40) 0.099 (53) Linaje 1 10.000 (7) Linaje 2 10.000 (8) 0.117 (51) 0.017 (41) Linaje 3 10.000 (3) Linaje 4 10.000 (13) 0.015 (41) 0.098 (56) 0.017 (46) 0.076 (41) w: Categorías de valores dNS/dS para los dos tipos de sustituciones a lo largo de cada linaje. La proporción de tramos (%) asignados a cada categoría se pone entre paréntesis. 137 CAPÍTULO IV IV.3.6.3. Análisis de los posibles eventos de recombinación en el huésped parcialmente resistente Cuando se analizaron las secuencias minoritarias obtenidas en los cuatro linajes se observó la posible naturaleza recombinante de alguna de ellas, por lo que se realizó un análisis preliminar utilizando la herramienta GARD, que identifica puntos de recombinación cuando la verosimilitud de los árboles generados por los alineamientos partidos en esos puntos, es mayor que la del árbol generado por el alineamiento completo. Se identificaron un total de 11 puntos en todas las poblaciones de los cuatro linajes, 3 en el linaje 1 (2 en las población A1II y 1 en A1V), 3 en el linaje 2 (1 en A2II y 2 en A2V), 3 en el linaje 3 (1 en A3II, 1 en A3V y otro en A3VI), y por último 2 en el linaje 4 (1 en A4IV y otro en A4V). Como GARD no requiere diferencias en las topologías para determinar puntos de recombinación, un modelo que contiene particiones podría confundirse con uno no partido si ambos comparten la misma topología por un mejor ajuste de las longitudes de rama. Para ensayar las diferentes topologías, los árboles de máxima verosimilitud de las regiones no recombinantes definidas por GARD (con un modelo de sustitución HKY85) se sometieron al test de topologías de Kishino & Hasegawa (1989) que actualmente incorpora la herramienta GARD y que estima la significación de los puntos predichos en la prueba previa. Este análisis confirmó que de los 11 puntos potenciales de recombinación sólo los 6 detallados en el apartado anterior fueron estadísticamente significativos (p<0.01). La identificación y el análisis de la extensión y posibles parentales de las secuencias recombinantes presentes en las poblaciones de los cuatro linajes de naranjo amargo se realizó con el programa RDP3 que contiene varios métodos de identificación de recombinación (Martín et al., 2005), usando los parámetros por defecto de los métodos GENECONV, BOOTSCAN, MAXCHI, CHIMAERA, SISCAN, 3SEQ y RDP. Se detectaron un total de 9 eventos de recombinación por al menos uno de los métodos, pero sólo fueron aceptados los predichos por al menos cuatro de los métodos y en los que además la asignación de las secuencias parentales fuese coherente (Figura 10). Población A2V Población A2II A1: T36 H1: T388 R1 R2 H17: A2II.20b H18: A2II.22b T36/A2II.9 H30: A2V.11b A2II.4/T36 H28: A2V.7b H29: A2V.5b A2V.15/T385 R4 A2V.15/T385 R5 T385/ A2V.9 A1: T36 H1: T388 H2: T385 R3 Figura 10: Hipótesis de recombinación generadas por al menos cuatro de los algoritmos del programa RDP3. Arriba de cada caja representativa de las secuencias recombinantes (R1 a R5) se indican el número de haplotipo y clon correspondiente y debajo los posibles parentales manteniendo el código de colores según el tipo de secuencia. También se representan las secuencias tipo A1, H1 y H2. 138 CAPÍTULO IV Los análisis para la detección de recombinantes se realizaron para cada población por separado, introduciendo en cada análisis las secuencias minoritarias que aparecían en la población junto con las secuencias mayoritarias (generalmente A1, H1 y/o H2). Si en alguna población se sospechaba que el evento de recombinación sucedía entre alguno de estos parentales aunque no se hubiese localizado en la población se añadía en el análisis. Bajo estas premisas se detectaron 5 eventos de recombinación, todos ellos en el linaje 2, poblaciones A2II y A2V (Figura 10 y Tabla 13). La secuencia recombinante 1 de la Figura 10 (A2II.20b, correspondiente al haplotipo H17 de la Tabla 13) se repite en ambas poblaciones, por lo que el número total de secuencias recombinantes fue 6. Las poblaciones que incluyen las secuencias recombinantes coinciden con las poblaciones donde se encontraron SSCP poblacionales más complejos. Como se indica en la Figura 10, las secuencias recombinantes 1 (H17: A2II.20b) y 2 (H18: A2II.22b) de la población A2II, parecen combinaciones de secuencias tipo T36 y tipo T388: la primera incluye 25 cambios nucleotídicos con respecto a la secuencia T36-947 y la segunda 19. Las otras secuencias recombinantes (H28: A2V.7b, H29: A2V.5b y H30: A2V. 11b) aparecen en la población A2V y parecen combinaciones de secuencias tipo T36 y tipo T385: la primera incluye 24 cambios nucleotídicos con respecto a la secuencia T36-947, la segunda 13 y la tercera 42. IV.3.6.4. Análisis de las secuencias minoritarias en el huésped parcialmente resistente Una vez analizadas las secuencias mayoritarias (A1, H1 y H2) y las secuencias recombinantes presentes en los 4 linajes, analizamos la frecuencia y tipo de las secuencias minoritarias presentes en todas las poblaciones. En el linaje 1 encontramos en total 7 secuencias minoritarias, dos de las cuales (H4 y H5) son variantes de secuencia de H2 (T385) que difieren de ésta en 1 y 2 nucleótidos, respectivamente. Estos cambios tampoco coinciden con las secuencias de A1 y H1 (T36-947 y T388). Las 5 restantes son variantes de secuencia de A1 (T36-947) y 3 de ellas (la variante del haplotipo A1 hallada en la población A1V, y H7 que se repite dos veces) sólo difieren de ésta en un nucleótido que tampoco coincide con las secuencias de H1 o H2 (Tabla 13). Sin embargo, las dos restantes (H3 y H6) varían con respecto a la secuencia de T36-947 en 2 y 10 nucleótidos, respectivamente: H3 presenta los cambios T300C y C303T que coinciden con las correspondientes posiciones en las secuencias de T388 y T385, mientras que de los 10 cambios de H6, G460A, T489C, T492C y G498A están presentes en la secuencia de T385, T496G está presente en T388, G389A está presente en ambas y los cuatro restantes no coinciden con las secuencias de T388 o T385 (Figura 11). A estas variantes de secuencia que no son identificadas como secuencias recombinantes, pero presentan un número variable de cambios en común con respecto a las secuencias de T36-947, T388 y/o T385 las denominamos secuencias intermedias (Tabla 13 y Figura 15). Los cambios en la variante intermedia H3 de T36-947 se corresponden con los dos únicos cambios que en esa zona presentan los aislados T385 y T388 con respecto a T36-947 (cambios consecutivos). También los cambios en las posiciones 489, 492, 496 y 498 (Figura 11) de la variante H6 se corresponden con cambios consecutivos que en esa zona presentan los aislados 139 CAPÍTULO IV T385 o T388, mientras que entre las posiciones 389 y 460 hay otros cambios en T388 o T385 (cambios no consecutivos). C T H3: A1II.14 300 303 C 127 A 389 C A C C C G A C H6: A1V.17 454 460 486 489 492 496 498 504 A1: T36-947 H1: T388 H2: T385 Figura 11: Representación esquemática de las secuencias intermedias (H3 y H6) localizadas en el linaje 1. El color marrón del rectángulo indica su pertenencia al tipo A1 (T36-947), naranja a H1 (T388) y verde a H2 (T385). Los semicírculos o círculos naranja indican posiciones que coinciden con las del tipo H1 (T388), los verdes posiciones que coinciden con las del tipo H2 (T385) y los rectángulos pequeños amarillos cambios nucleotídicos que no coinciden con las secuencias mayoritarias A1, H1 o H2. A la derecha de la figura se muestra un recordatorio del código de colores. En el linaje 2, excluyendo las secuencias recombinantes se encontraron 24 secuencias minoritarias: dos de ellas variantes de secuencia de H2 (T385), doce variantes de A1 (T36-947) y diez variantes de H1 (T388) (Tabla 13). Las dos variantes de H2 (H22 y H23) diferían de ésta en uno y cuatro nucleótidos, que no coinciden con las secuencias de T36 o T388. Ocho de las variantes de A1 (H20, H21, H24, H25, H26, H32, H33 y la que presentó el haplotipo A1) diferían en uno o dos nucleótidos, que no se hallan en las secuencias de T385 o T388, la variante H27 presentaba el cambio G306T que se halla en T385, la variante H19 (detectada 2 veces) presentaba el cambio T385C que se halla en T385 y T388, y la variante H16 presentaba los cambios A52G, T57A, A72G, T93C y G94A que también se hallan en T385 y T388 (Figura 12). Finalmente, cuatro de las 10 variantes de H1 (H12, H13, H14 y H15) diferían de ésta en uno o dos nucleótidos que tampoco se hallan en las secuencias de A1 o H2; la variante H8 presentaba los cambios T363C y A480G que coinciden con las posiciones correspondientes de T36-947 y T385 y otros dos que no coinciden con ninguna de estas referencias; la variante H9 presentaba los cambios C201T, T363C y A480G que también se hallan en T36 y T385, el cambio T303C que coincide sólo con T36-947 y otros dos que no coinciden con ninguna de las dos referencias; la variante H11 presentaba los mismos cambios que H9 más un cambio A94G que coincide con la secuencia de T36-947, y la variante H10 tenía cuatro cambios que también estaban en H9 y H11; por último, la variante H31 incluía los cambios G52A, A57T, G72A, C93T, A94G, T120C, G141A y G159A que coinciden con la secuencia de T36-947 y el cambio A144G que también se halla en T385 y T36-947. A diferencia de las demás variantes que tienen sus cambios distribuídos a lo largo de la secuencia, los nueve cambios de H31 se hallan concentrados en un segmento de menos de 100 nucleótidos y corresponden a cambios consecutivos en T36-947 (Figura 12). Figura 12: Representación esquemática de las secuencias intermedias (H8, H9, H10, H11, H16, H19, H27 y H31) localizadas en el linaje 2. Los rectángulos de color naranja indican variantes de secuencia de H1 (T388) y los de color marrón variantes de A1 (T36-947). Los semicírculos o círculos de color marrón indican posiciones que coinciden con las del tipo A1 (T36-947), los de color naranja posiciones que coinciden con las del tipo H1 (T388), los 140 CAPÍTULO IV verdes posiciones que coinciden el tipo H2 (T385) y los rectángulos pequeños amarillos cambios nucleotídicos que no coinciden con las secuencias mayoritarias A1, H1 o H2. C G A G 72 C 93 A 94 T C G H8: A2II.19 H16: A2II.13 T C 385 T T 52 57 T 258 T C 303 C 363 409 412 480 C T G 363 409 C 480 H19: A2III.1 A2III.12 H27: A2V.18 201 T 201 H9: A2II.t A2II.5b H10: A2II.14 224 306 258 303 T 258 C 303 363 C 363 T 409 G A T A T G C A G A H31: A2V.13 52 57 72 93 94 120 141 144 159 G 94 T 201 H11: A2II.5 480 En el linaje 3 se encontraron siete secuencias minoritarias: 3 eran variantes de secuencia de H1 (T388) y cuatro de A1 (T36-947). De las tres variantes de H1, una (H34) difería de ésta en un nucleótido que no coincide con las secuencias de A1 y H2 (T385); la variante H35 presentaba el cambio C54T que coincide con T385, y la variante H36 presentaba los cambios T492C, que coincide con T385, G496T que coincide con T36-947, y A495G que coincide con ambas referencias. De las cuatro variantes de A1, dos de ellas (la variante con haplotipo A1 y H37) contenían cambios que no coinciden con las otras secuencias de referencia; la variante H38 presentaba los cambios A52G, T57A y A72G que coinciden con las referencias T388 y T385, y la variante H39 presentaba los cambios G438A, T456C, T468C, G476A, G495A y T496G, dos de los cuales coinciden con T388 y los otros cuatro con T388 y T385 (Figura 13). T 54 C G T G A 57 G H35: A3II.41 52 72 A C C A A G H38: A3V.11 H39: A3VI.9 H36: A3II.49 492 495 496 438 456 468 476 495 496 Figura 13: Representación esquemática de las secuencias intermedias (H35, H36, H38, H39) localizadas en el linaje 3. Colores como en la Figura 12. En el linaje 4 se detectaron 18 secuencias minoritarias: cuatro de ellas eran variantes de H1 (T388) y 14 de A1 (T36-947). Tres de las variantes de H1 (H40, H41 y H42) diferían de ésta en un nucleótido que no coincide con las secuencias de A1 o H2 (T385) y la otra (H43) presentaba los cambios A144G, que coincide con T36-947 y T385, y C171A que coincide con T36-947. Ocho de las 14 variantes de A1 presentaban un cambio que no coincide con las otras secuencias de referencia; las variantes H46 (detectada dos veces), H50 y H59 presentaban el cambio T94A que se halla en T388 y T385, y H59 presentaba además el cambio A52G que también se halla en ambas secuencias de referencia; la variante H55 tenía los cambios T456C, T468C, G480A, G495A y T496G, dos de los cuales se hallan en T388 y los otros tres en T388 y T385; por último, la variante H52 presentaba 5 cambios de los que cuatro coinciden con T385 y uno con T385 y T388. 141 CAPÍTULO IV G 144 A 94 A 94 A 171 G 163 G 163 H43: A4II.8 H46: A4IV.1b A4IV.10 A 462 G A 94 G C C G A H48: A4IV.1 H52: A4V.14 483 489 492 496 498 C C A A G 456 468 480 495 496 H47: A4IV.7 52 H54: A4VI.10 Figura 14: Representación esquemática de las secuencias intermedias (H43, H46, H47, H48, H52, y H54) localizadas en el linaje 4. Colores como en la Figura 12. El análisis filogenético de las secuencias obtenidas en naranjo amargo, excepto las seis recombinantes, por el método neighbor joining con remuestreo de 1000 réplicas dio lugar al árbol filogénetico con raíz que se muestra en la Figura 15. 62 A3II.14 11 A2II.14 A2II.4 6 6 A2II.9 A4II.10 5 A4II.9 19 A2II.10 56 A3II.41 A4II.7 51 T388 (x55) 46 A4II.8 43 91 51 A3II.49 A2II.19 A2II.14 46 A2II.5 52 A2II.t 66 A2II.5b 100 34 66 100 T385 (x56) AIV.4 64 A2IV.6 49 A1IV.3 58 A2IV.2 A3VI.9 A4V.14 A1V.17 29 88 A4IV.1 17 A1II.14 61 13 A2V.14 63 A2V.13 A2III.1 A2III.12 A4V.20 69 A3V.11 43 A2II.13 24 A4VI.10 39 A4IV.7 78 A4IV.1b A4IV.10 A2V.18 65 63 67 A1V.8 A3IV.5 A4V.12 A4VI.15 A2VI.11 A2V.9 A2VI.20 A3V.15 A2V.15 A4III.3 A4VI.9 A2VI.9 A4V.4 A4VI.16 A4III.4 A1VI.4 A1VI.30 A2III.13 A2III.17 T36 (x340) 0.01 142 CAPÍTULO IV Figura 15: Árbol filogenético con raíz obtenido por el método neighbor joining con las variantes de secuencia del gen p20 detectadas en los cuatro linajes de naranjo amargo a lo largo de los seis pases sucesivos, excluyendo las secuencias recombinantes. Las secuencias indicadas en marrón, naranja y verde corresponden a los haplotipos A1 (T36947), H1 (T388) y H2 (T385). Las secuencias en negro son secuencias minoritarias y las secuencias intermedias se indican en blanco sobre fondo azul (linaje 1), gris (linaje 2), morado (linaje 3) o verde (linaje 4), el número a continuación del código de la muestra indica el número del clon. Los valores de los nodos se obtuvieron mediante re-muestreo con 1000 réplicas. Cuando la secuencia aparece más de una vez se indica su frecuencia (x número de veces). En el mismo se observan tres grupos bien definidos en torno a las secuencias T36947, T388 y T385. Mientras las secuencias minoritarias son esencialmente idénticas a cada uno de los tres tipos de referencia, las secuencias intermedias resaltadas sobre fondo azul, morado, verde o gris, según el linaje, se situaron próximas a las ramas del árbol que conectan los tres grupos y podrían ser consideradas pasos intermedios entre un tipo de secuencia y otro. IV.3.7. Análisis de SSCP de las poblaciones virales en el huésped parcialmente resistente tres años después del inicio del experimento Entre la inoculación del pase I a partir de la lima control y la inoculación del pase VI transcurrieron 30 meses (6 meses entre pases). Para comprobar si a lo largo de este período las poblaciones de los distintos pases habían sufrido cambios obvios en su composición, seis meses después del último pase se examinaron de nuevo las 24 plantas de naranjo amargo y la lima control preparando nuevos extractos de dsRNA, amplificando el mismo fragmento del gen p20 y analizando los productos de RT-PCR mediante SSCP. Para identificar los perfiles obtenidos se incluyeron en los geles de electroforesis controles de T36-947, T388 y T385. Los resultados se representan en la Figura 16, en la que se mantiene el código de colores utilizado anteriormente para cada tipo de secuencia. Lima control Linaje Pase I Pase II Pase III Pase IV Pase V Pase VI Figura 16: Análisis de SSCP del gen p20 de las plantas de los cuatro linajes de naranjo amargo (1, 2, 3 y 4) inoculadas con CTV T36-947 en seis pases sucesivos, 36 meses después del inicio del experimento. Los círculos en marrón representan el perfil de p20 de T36-947 y los círculos con dos colores representan una mezcla de perfiles. Los círculos con 1 2 3 4 143 CAPÍTULO IV base marrón y borde en diferente color, representan un perfil predominante de T36-947 junto con un perfil tenue de T388 (borde naranja) o T385 (borde verde). La lima control y 10 de las poblaciones presentaban únicamente el perfil característico de T36-947, una de las poblaciones del pase II presentaba una mezcla de haplotipos de T36-947 y T388, y el resto de poblaciones, aunque presentaban como mayoritario el perfil de T36-947, se podía observar en ellas el perfil de T388 (nueve plantas) o T385 (cuatro plantas). En una repetición de los análisis de SSCP de plantas de los pases II y IV utilizando los extractos o los productos de retrotranscripción preparados en los análisis previos, los perfiles de SSCP coincidían con los obtenidos anteriormente. Es decir, a los 36 meses del inicio del análisis los perfiles poblacionales continuaban mostrando diversidad, pero no siempre coincidían con los del análisis efectuado a los 6 meses de la correspondiente inoculación. De los productos de PCR de las cuatro plantas del pase II y de la lima control se analizaron entre 20 y 25 clones al azar. En la lima control y en las poblaciones de A1II, A3II y A4II (cuyo perfil mayoritario de SSCP era el característico de T36-947) casi todos los clones tenían la secuencia de T36-947 y sólo se detectó una variante de secuencia con 2 cambios nucleotídicos que no coincidían con las secuencias de T388 y/o T385. De la población A2II que mostró un perfil de SSCP poblacional que parecía ser una mezcla de haplotipos se obtuvieron clones de T36-947, clones de H1 (T388) y dos variantes de secuencia de H1 que diferían de ésta en 1 y 3 cambios. Las diversidades nucleotídicas estimadas para estas poblaciones fueron de 0.00025 en la lima control, 0.00042 en A4II, 0 en A1II y A3II y 0.03758 en A2II, valores comparables a los obtenidos con anterioridad excepto el de A1II que se redujo debido a la aparente sustitución de las variantes tipo T388 por las de tipo T36-947. IV.3.8. Estudio de la infectividad de CTV a partir del huésped parcialmente resistente A partir del pase II los ensayos de inmunoimpresión-ELISA y ELISA-indirecto en microplacas dieron en la mayoría de los casos reacción negativa con los extractos de las plantas inoculadas y el virus sólo pudo ser detectado mediante RT-PCR, lo que sugería una distribución errática y/o una disminución en la carga viral. Por esta razón, las amplificaciones en este huésped se realizaron a partir de extractos enriquecidos en dsRNA y no de RNA total como en capítulos anteriores. Asimismo, durante el desarrollo de este trabajo se puso de manifiesto mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real que la acumulación de CTV en naranjo amargo es menor que en otros huéspedes (Ruiz-Ruiz et al., 2007), y utilizando un clon infeccioso que expresa la proteína fluorescente GFP, que su distribución en la planta es irregular (Folimonova et al., 2008), lo que venía a confirmar nuestra hipótesis inicial. Para ver si los pases sucesivos en naranjo amargo podían afectar la infectividad de la población de CTV se efectuaron dos ensayos biológicos: el primero a partir de plantas del pase II a los 6 meses de la inoculación (al mismo tiempo que se efectuaba el pase III), y el segundo, a partir de plantas de los pases II y V a los 5 años de la inoculación del pase II y 3.5 años después de la inoculación del pase V. 144 CAPÍTULO IV En el primer ensayo, trozos de corteza de las plantas A1II, A2II, A3II y A4II del pase II se utilizaron para inocular tres plantas de lima Mexicana por cada planta donante (Figura 16) y 6 meses después se analizaron para CTV mediante observación de síntomas y ELISA en microplaca. Sólo 2 de las 12 limas dieron síntomas y reacción positiva en ELISA. Estas limas presentaron un perfil de SSCP de p20 característico de T36-947. Los síntomas fueron también los característicos del aislado T36 (clorosis nervial, fuerte acopamiento de las hojas y acanaladuras en la madera). 2003 A1II A2II A3II INFECTIVIDAD 2/12 Huésped lima A4II Figura 16: Representación esquemática del análisis de infectividad en lima Mexicana de CTV de las plantas de naranjo amargo del pase II (A1II, A2II, A3II y A4II) a los 6 meses de su inoculación. Los círculos marcan las limas infectadas. Se indican los perfiles de SSCP de p20 de estas limas y de las plantas fuente de inóculo. En el segundo experimento, efectuado a los 5 años de la inoculación del pase II, a partir de cada una de las plantas de este pase se inocularon por injerto 3 plantas de lima Mexicana, 3 de naranjo dulce y 3 de naranjo amargo (Figura 17), y a partir de cada planta del pase V se inocularon de forma similar 3 plantas de lima y 3 de naranjo dulce. En este caso no se inoculó a naranjo amargo porque estaba relativamente reciente la inoculación del pase 6 en la que todas las plantas habían resultado infectadas (Figura 18). El análisis ELISA a los 6 meses post-inoculación puso de manifiesto que ninguna planta de lima o de naranjo dulce inoculadas a partir del pase II o del pase V estaba infectada, mientras que las 12 plantas de naranjo amargo inoculadas a partir de plantas del pase II estaban infectadas, según se demostró mediante RT-PCR, como anteriormente se había demostrado con las plantas del pase VI. El análisis de SSCP de p20 y la secuenciación de los productos de RT-PCR obtenidos mostraron que 8 de las 12 plantas de naranjo amargo inoculadas a partir del pase II daban la secuencia consenso del aislado T388 y las otras 4 daban la secuencia del aislado T36-947 (Figura 17). 145 CAPÍTULO IV 2007 A1II A2II A3II A4II A1II A2II A3II A4II A1II A2II A3II A4II Huésped lima INFECTIVIDAD 0/12 Huésped dulce INFECTIVIDAD 0/12 Huésped parcialmente resistente amargo INFECTIVIDAD 12/12 A1II A2II A3II A4II 1 2 3 Figura 17: Representación esquemática del análisis de infectividad de las plantas de naranjo amargo del pase II (A1II, A2II, A3II y A4II) en lima Mexicana, naranjo dulce y naranjo amargo a los 5 años post-inoculación. Los círculos marcan las plantas infectadas. Se indican los perfiles de SSCP de p20 de las plantas fuente de inóculo y en la tabla inferior la secuencia consenso de p20 de las plantas de naranjo amargo infectadas: los círculos naranja indican la secuencia de T388 y los marrones la secuencia de T36-947. Para comprobar si la ausencia de infección en las plantas de lima o de naranjo dulce inoculadas a partir de los naranjos amargos de los pases II y V podía ser debida a una carga viral demasiado baja en los trozos de corteza inoculada que impidiese el paso de CTV al nuevo huésped, se propagaron yemas de lima Mexicana sobre cada una de las plantas de naranjo amargo inoculadas a partir del pase II. Al suponer los nuevos brotes de lima un sumidero y un tejido susceptible a CTV, hubiera sido de esperar que el virus transportado por los tubos del floema hubiese producido una infección normal y sintomática. Sin embargo, las nuevas copas de lima nunca mostraron síntomas y el análisis ELISA efectuado a los 5 meses de la propagación mostró reacción negativa a CTV. 146 CAPÍTULO IV 2007 A1V A2V A3V A4V A1V A2V A3V A4V A1V A2V A3V A4V 2005 A1VI A2VI A3VI A4VI Huésped parcialmente resistente amargo INFECTIVIDAD 4/4 Huésped lima INFECTIVIDAD 0/12 Huésped dulce INFECTIVIDAD 0/12 Figura 18: Representación esquemática del análisis de infectividad de las plantas de naranjo amargo del pase V (A1V, A2V, A3V y A4V) en lima Mexicana y naranjo dulce a los 3.5 años de la inoculación de éstas. Se incluye además los resultados del pase VI a naranjo amargo efectuado anteriormente. Se indican los perfiles de SSCP de p20 de las plantas fuente de inóculo y de las del pase VI. Estos análisis indican i) que los pases sucesivos de CTV T36-947 por naranjo amargo reducen la infectividad del virus al menos en algunos huéspedes, y ii) que las plantas del pase II efectivamente contenían variantes de secuencia muy distantes de T36-947, ya que 5 años después seguimos encontrando variantes tipo T388. IV.4. DISCUSIÓN En los capítulos anteriores se analizaron los efectos de diferentes factores capaces de alterar las poblaciones de CTV en dos aislados naturales del virus (T388 y T385) de diferentes características, pero ambos con una población que se suponía heterogénea. En este capítulo se analizó el efecto del cambio de huésped transmitiendo por injerto un aislado obtenido a partir de un clon infeccioso del genoma completo del aislado T36 de Florida, denominado T36-947, supuestamente con una población viral homogénea. La planta utilizada como fuente de inóculo de T36-947 fue una propagación de la lima original infectada con viriones de protoplastos en el laboratorio del Dr. W.O. Dawson (Satyanarayana et al., 1999, 2001), 2-3 años antes de iniciar este experimento. Aunque algunos análisis de amplificación del extremo 5’-UTR (Ayllón et al., 2001) o de perfiles de SSCP no habían mostrado indicios de diversificación, la estructura de la nueva población viral no había sido estudiada en detalle. El aislado T36-947 se inoculó mediante injerto en plantas de semilla de cuatro especies con distinta susceptibilidad a CTV: lima Mexicana, que es muy susceptible y acumula niveles altos de virus, naranjo dulce Pinneaple y pomelo Duncan, que 147 CAPÍTULO IV son susceptibles pero acumulan el aislado T36 algo menos que la lima, y naranjo amargo, que presenta una resistencia inicial a la infección y acumula menos virus que los demás huéspedes (Ruiz-Ruiz et al., 2007). La susceptibilidad diferencial de estos huéspedes, basada en ensayos previos de infectividad en invernadero (datos no publicados del laboratorio), se vio confirmada durante la realización de este trabajo por datos basados en RT-PCR cuantitativa en tiempo real y en las pautas de distribución observadas mediante IP-ELISA (Comellas, 2009) o con un clon recombinante de CTV que expresa la proteína fluorescente GFP (Folimonova et al., 2008). Este último trabajo pone de manifiesto que el movimiento célula a célula es más restringido en naranjo dulce y pomelo que en lima y es prácticamente inexistente en naranjo amargo. Se efectuaron pases sucesivos durante al menos dos años manteniendo en cada huésped cuatro linajes separados, que es la metodología usual en experimentos de evolución con otros sistemas virus/huésped, para mantener durante tiempo suficiente la presión de selección. Los injertos a nuevos lotes de plantas se hicieron cada 6 meses para dar tiempo a la infección sistémica de las nuevas plantas donantes, y los análisis de las poblaciones virales se hicieron a los 6 meses de la inoculación, y en el caso de lima donante inicial y las plantas del primer pase, se repitieron además al final del experimento (a los 24 meses) para detectar posibles cambios ocurridos en la población con el paso del tiempo. Los análisis poblacionales de los genes p20 y p23 en los huéspedes susceptibles se efectuaron a partir de RNA total de una mezcla de hojas para minimizar el posible efecto de la distribución irregular de variantes de secuencia en la planta infectada (D’Urso et al., 2000), mientras que en el huésped parcialmente resistente el análisis se centró en p20 y hubo de efectuarse a partir de extractos de corteza ricos en dsRNA debido al bajo título viral de estas plantas, que se puso en evidencia por la imposibilidad de detectar el virus mediante IP-ELISA o ELISA indirecto en microplacas. El análisis mediante SSCP de los productos de RT-PCR de p20 y p23 de la lima control y de todas las plantas inoculadas de los huéspedes susceptibles mostró que, salvo en unas pocas plantas para el gen p23, la estructura poblacional de CTV en éstas era similar a la de la lima control. Más aún, el análisis de clones al azar de las cuatro limas inoculadas en el primer pase mostraba un estructura poblacional indistinguible en estas limas y en la lima donante. Debido a esta homogeneidad sólo se analizó en detalle la población de uno de los linajes de cada huésped susceptible. Sin embargo, el análisis mediante SSCP de los productos de RT-PCR de p20 de las plantas de naranjo amargo mostró en algunas de sus poblaciones un perfil diferente al resto de huéspedes y al parental que sugerían la aparición de nuevas variantes de secuencia, que en algunos casos parecían predominantes. Por ello se amplió el análisis con 2 pases sucesivos adicionales y se analizaron en detalle todas las plantas de los 4 linajes a lo largo de los 6 pases. La repetición del análisis de SSCP en todas las plantas de este huésped al final del experimento, junto con un nuevo análisis de los extractos originales de las plantas de los pases II y IV mostró la reproducibilidad de los resultados y confirmó la presencia de variantes de secuencia de p20 filogenéticamente alejadas en dichas plantas. De cada población seleccionada se analizaron mediante SSCP entre 20 y 106 clones al azar de cada gen para caracterizar los haplotipos presentes y estimar su 148 CAPÍTULO IV frecuencia en la población. A su vez, para estudiar la diversidad genética se secuenciaron entre 5 y 20 clones del perfil mayoritario en cada población y casi todos los clones que presentaban un perfil de SSCP diferente. La diversidad nucleotídica entre todos los clones con el mismo haplotipo de p20 o de p23 en los huéspedes susceptibles fue de 0.00014 ± 0.00008 y 0.00024 ± 0.00010, valores generalmente inferiores a la distancia nucleotídica media entre clones con distinto haplotipo, lo que confirmó la idoneidad del análisis de SSCP para la identificación de variantes de secuencia. Aunque algunas de las mutaciones detectadas podrían ser errores introducidos por la retrotranscriptasa SuperScript o por la Taq polimerasa durante la RT-PCR (Bracho et al., 1998), la gran homogeneidad encontrada en los huéspedes susceptibles analizados hace pensar que la pequeña variabilidad potencialmente generada en estas poblaciones por las enzimas no alteraría las conclusiones del estudio. Además, en dos de las poblaciones (P3II y P3III) se comparó la amplificación con Taq polimerasa y con Pfu Hotstart DNA polymerase (Stratagene), dotada de prueba de lectura, usando el mismo cDNA de p20 y analizando en cada caso entre 30 y 40 clones del producto amplificado. Los resultados mostraron que en poblaciones tan homogéneas el uso de Taq polimerasa no suponía un cambio significativo en la diversidad genética observada. En la población parental y en la mayoría de las plantas analizadas de huéspedes susceptibles la estructura de la población de CTV fue la característica de las cuasiespecies virales, con un haplotipo predominante y entre 1 y 6 variantes de secuencia que diferían de 1 a 3 nucleótidos con respecto a la secuencia mayoritaria. La mayoría de los haplotipos minoritarios detectados aparecían sólo en alguna población o sólo en alguno de los análisis y aparentemente no llegan a fijarse en la población como efecto de la selección estabilizadora, ya que no deben proporcionar ningún beneficio al conjunto de la misma. Sin embargo, en 1 planta de pomelo y en 2 de naranjo dulce (P3IV, D4II y D4I24) se detectaron dos haplotipos mayoritarios de p20 (B19 y B21) que diferían en 1 y 2 nucleótidos respectivamente del haplotipo mayoritario en la población parental y en el resto de plantas. Los haplotipos B19 y B21 no se detectaron en la población de la planta control, y aunque apenas suponen cambio en la homogeneidad genética observada, resulta curioso que, al igual que en el capítulo anterior, sean de nuevo el naranjo dulce y el pomelo las especies que presentan diferencias con respecto a la población parental. La composición de la población de p20 en el huésped parcialmente resistente fue diferente a las de los huéspedes susceptibles y la lima control. Aunque en todas las plantas analizadas se mantenía la estructura característica de las cuasiespecies virales, en cada linaje aparecían 1 o 2 poblaciones cuyo haplotipo mayoritario era diferente al del resto de las poblaciones y al de la planta control. Estos haplotipos (H1 y H2) presentaban un elevado número de cambios nucleotídicos con respecto al mayoritario del resto de poblaciones. Los análisis filogenéticos pusieron de manifiesto que los haplotipos H1 y H2 se agrupaban con la secuencia de los aislados naturales T388 y T385, respectivamente. Es decir, en determinadas poblaciones del huésped naranjo amargo aparecían secuencias muy alejadas filogenéticamente de la secuencia parental que además presentaban una alta identidad (en ocasiones del 100%) con las secuencias de otros aislados naturales 149 CAPÍTULO IV de CTV. La acumulación de mutaciones para evadir presiones selectivas como las causadas por tratamientos antivirales ha sido observada en distintos virus animales y humanos (Cuevas et al., 2005, 2008; Torres-Puente et al., 2007, 2008). También se han observado mutaciones en el proceso de adaptación de virus de plantas a un nuevo huésped (Agudelo-Romero et al., 2008). Es posible que los pases continuados de CTV en naranjo amargo, un huésped parcialmente resistente que limita severamente el movimiento célula a célula, diesen lugar a la acumulación de mutaciones para adaptarse mejor a la nueva situación. Sin embargo, las mutaciones en una zona del genoma viral tienen con frecuencia efectos epistáticos en otras zonas del genoma que dan lugar a mutaciones compensatorias para mejorar la eficiencia biológica del primer mutante (Sanjuán y Elena, 2006). En un virus con un tamaño de genoma tan grande como CTV es probable que las interacciones epistáticas sean particularmente relevantes y que en una zona del genoma no todas las mutaciones sean viables o proporcionen un mínimo de eficiencia biológica, sino que su variabilidad genética se ciña al modelo de paisajes adaptativos de Wright (1931), en el que hay picos de eficiencia biológica separados por valles de escasa eficiencia. En esta situación sólo algunos genotipos serían eficientes y tendrían posibilidad de subsistir. Los análisis previos de variabilidad de CTV en aislados naturales indican que éstos tienden a agruparse en torno a unos cuantos genotipos, incluyendo T36, T388 y T385 (Albiach-Martí et al., 2000c; Sambade et al., 2003; Martín et al. 2009). En un estudio previo en el que se efectuaron pases seriados de una población clonal del viroide del mosaico latente del melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) en su huésped natural también se observó la aparición de distintas variantes de secuencia que se agrupaban en torno a genotipos naturales previamente identificados (Ambrós et al., 1999). Las poblaciones de p20 y p23, tanto en el aislado parental como en las plantas inoculadas de los huéspedes susceptibles, presentaban una estructura poblacional significativamente separada de la neutralidad, que sugiere la acción de una selección direccional. Estos ensayos no se realizaron en el huésped naranjo amargo ya que la obtención de resultados tan dispares al resto de los huéspedes hacía necesarios otro tipo de análisis. El análisis AMOVA basado en las distancias genéticas intrapoblacionales de la planta control y de los huéspedes susceptibles infectados con el aislado T36-947 mostró que la variación entre plantas fue estadísticamente significativa sólo para el gen p23, mientras que no lo era la variación dentro de plantas, pese a que esta última es el factor que más contribuye a la variación total de p20. Cuando se agruparon los datos en función de los pases (tiempo transcurrido en cada huésped) o por tipo de huésped, el análisis AMOVA mostró que para p20 ninguno de los factores tenía un efecto significativo, mientras que para p23 lo tenían la variación entre plantas del mismo grupo y dentro de plantas. Esto indica que ni el tiempo de infección ni el tipo de huésped son factores importantes en la modulación de la estructura de las poblaciones de ambos genes, si bien el comportamiento de p20 y p23 difieren en cuanto a la variación entre plantas y dentro de cada planta. Aunque no se ha realizado este análisis para el huésped amargo los datos obtenidos 150 CAPÍTULO IV evidenciaron un comportamiento de la población totalmente distinto en este huésped, al menos para p20. Los valores de diversidad nucleotídica intrapoblacional en los huéspedes susceptibles oscilaron entre 0 y 0.00062 para p20 y entre 0 y 0.00161 para p23, mientras que la diversidad media estimada en estos huéspedes fue de 0.00028 ± 0.00020 para p20 y de 0.00124 ± 0.00112 para p23. Estos valores fueron más bajos que los estimados en otros virus de plantas (García-Arenal et al., 2001) y en otros análisis de diversidad de p20 en distintos aislados de CTV (Rubio et al., 2001; Ayllón et al., 2006) como era de esperar por el hecho de haber utilizado una población clonal obtenida recientemente. La frecuencia de mutación observada en pases seriados de una población clonal de un tobamovirus (Kyuri green mottle mosaic virus, KGMMV) en dos huéspedes sistémicos fue también baja (entre 0 y 3.44 x 10-3) y las poblaciones mantenían una estructura de cuasispecies (Kim et al., 2005). La aparición de variantes de secuencias tan diversas en el huésped naranjo amargo se vio reflejada en valores de diversidad nucleotídica intrapoblacional que oscilaron entre 0 y 0.048, y entre 0.02 y 0.05 si agrupamos los datos por linajes. Valores muy similares de diversidad de p20 (en torno a 0.05-0.06) se encontraron en distintos aislados naturales de España y California (Rubio et al., 2001), en los que se encontraron casos de probables infecciones múltiples y secuencias recombinantes. En los huéspedes susceptibles la comparación de las secuencias nucleotídicas de los distintos haplotipos de p20 y p23 puso de manifiesto que la diferencia máxima entre clones de cada gen era de 3 nucleótidos y que la distribución de los cambios nucleotídicos a lo largo de los dos genes era aleatoria. De los cambios nucleotídicos detectados en p20 en las plantas infectadas, sólo una fracción menor fue compartida con otros clones, mientras que esta proporción fue mayor para p23, si bien la mayoría de los cambios compartidos correspondían a dos variantes de secuencia presentes con frecuencia media o alta en varias poblaciones. A nivel aminoacídico la mayoría de los cambios observados en ambos genes correspondieron a cambios únicos. Es decir, los cambios ocurridos en los huéspedes susceptibles parecen al azar y sin separarse apenas de la secuencia maestra, como cabría esperar en una cuasiespecie viral. Por el contrario, en el huésped naranjo amargo los distintos haplotipos de p20 dentro de una misma población diferían hasta en 59 nucleótidos, lo que claramente sugiere una evolución adaptativa rápida a las nuevas condiciones, en este caso un huésped poco favorable. A la vista de estos resultados resulta tentador especular si el uso masivo del patrón naranjo amargo en todo el mundo pudo contribuir a generar una parte significativa de la diversidad genética de CTV e incluso a la emergencia de algunos de los genotipos predominantes actualmente. Las relaciones filogenéticas, entre los clones de ambos genes detectados en las plantas de los huéspedes susceptibles dieron lugar a árboles con raíz de morfología similar, en los que todas las variantes de secuencia se agrupaban estrechamente con las secuencias de T36-947, lo que es coherente con la baja diversidad genética observada en todas las poblaciones. Sin embargo análisis similares de los clones de p20 detectados en naranjo amargo evidenciaron la presencia de tres grupos de secuencias (tipos T36-947, T388 y T385) y de un conjunto de secuencias 151 CAPÍTULO IV minoritarias que se sitúan entre los genotipos principales, que avalan la idea de una evolución entre el genotipo original T36-947 y los otros dos detectados para intentar adaptarse mejor al huésped naranjo amargo. Estos tres genotipos podrían representar picos de eficiencia biológica en un paisaje adaptativo (Wright, 1931). La identificación y caracterización de eventos de recombinación en distintos clones mostró además la presencia de 6 secuencias recombinantes que incluían a los genotipos T36-947, T388 y T385 como parentales. La presencia de estos recombinantes es una prueba adicional de la presencia y replicación de más de un genotipo en una misma célula de naranjo amargo. Como ya se ha indicado, pases seriados de una población clonal del viroide del mosaico latente del melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) en melocotonero dieron lugar a la aparición de variantes de secuencia que se agrupaban en torno a genotipos naturales previamente identificados (Ambrós et al., 1999). También en este caso se observaron variantes intermedias entre los genotipos conocidos que sugerían la evolución entre ellos. La presión selectiva que actúa sobre una región codificante se estima frecuentemente mediante el cociente entre los valores de diversidad nucleotídica en las posiciones no sinónimas y en las sinónimas (dNS/dS), pero este cociente es poco informativo cuando la variabilidad es escasa (Marco y Aranda, 2005). Este fue el caso en 2 poblaciones del gen p20, en 2 de p23 y en la población control en las que con tres o menos sustituciones por clon el número de cambios no sinónimos fue superior al de sinónimos, resultando el cociente dNS/dS superior a la unidad. El análisis de la presión de selección por codones individuales proporciona una idea más precisa de las fuerzas selectivas que actúan en cada región del genoma, algunas de las cuales podrían quedar enmascaradas en el cociente dNS/dS. Este análisis sugirió que la mayoría de los codones de p20 en el huésped naranjo amargo estaban sujetos a selección purificadora y no se encontró ningún codón con selección positiva. La medida de ésta selección purificadora como la diferencia normalizada dNS-dS mostró valores similares en los cuatro linajes, presentando el linaje 2 los valores inferiores, lo que indica que en este linaje había más substituciones no sinónimas. Finalmente, el análisis de la presión de selección por rama en este mismo huésped mostró un comportamiento similar para todos los linajes con el mayor porcentaje de las ramas sometidas a selección negativa, si bien en el linaje 2 la presión selectiva era algo menor en un porcentaje importante de las ramas. Todos los linajes incluyeron también algunas ramas evolucionadas bajo presión positiva. En la secuencia de p20, las posiciones relacionadas con su función como supresor del silenciamiento (I38, Y113, R130, L137, S141 y L159), que se encuentran estrictamente conservadas entre los closterovirus (Reed et al., 2003), permanecieron generalmente invariables en las variantes de secuencia encontradas en este trabajo. Las únicas excepciones fueron: la posición R130 que en dos variantes de secuencia de los huéspedes susceptibles fue W130 y G130, y en el caso del huésped amargo K130 y P137. Asimismo, el dominio de unión a RNA de p23, que incluye varios residuos básicos entre las posiciones 50 y 67 y un motivo de dedo de Zinc entre las posiciones 68 y 86, importantes para su función biológica 152 CAPÍTULO IV (López et al., 2000; Satyanarayana et al., 2002b), se hallaban conservados en todas las variantes de secuencia encontradas en todos los huéspedes. El análisis de infectividad realizado a partir de las plantas de naranjo amargo del pase II puso de manifiesto una reducción de la capacidad de infección o movimiento del virus desde el naranjo amargo a la lima Mexicana, probablemente asociados con el bajo título viral en el huésped donante, que no permitía la detección por ELISA. Sin embargo, el perfil de SSCP de p20 de las plantas de lima era indistinguible del observado para la lima donante, mientras que en las plantas de naranjo amargo había sido diferente. Un fenómeno similar se observó en poblaciones del viroide de la exocortis de los cítricos (Citrus exocortis viroid, CEVd): mientras que el pase de cidro Etrog (C. medica L.) a P. trifoliata no alteraba la estructura de la población viroidal, el pase a naranjo amargo daba lugar a una población de composición muy distinta, que al ser pasada de nuevo a cidro recuperaba su composición original (Bernad et al., 2009). El análisis de infectividad llevado a cabo con plantas de naranjo amargo de los pases II y V a los 5 años del comienzo del experimento mostró una pérdida total de la capacidad infectiva del virus en lima y naranjo dulce. La pérdida de eficacia biológica de un virus de plantas en su huésped original tras el proceso de adaptación a un nuevo huésped ha sido observada previamente (Agudelo-Romero et al., 2008). Lo más sorprendente, sin embargo, fue la ausencia de CTV en brotes de lima Mexicana propagada sobre los naranjos amargos inoculados a partir de plantas del pase II, pese a que en estas plantas se detectó CTV mediante amplificación de p20. La secuencia consenso en dichas plantas demostró de nuevo la presencia de variantes de secuencia tipo T388. Aunque no hay una explicación obvia para este resultado, la formación de conexiones vasculares entre el patrón naranjo amargo y la copa de lima hacen difícil pensar que esta ausencia de infección en un huésped tan susceptible como la lima Mexicana sea debida al bajo título viral en el naranjo amargo, especialmente considerando que el virus puede transmitirse por injerto a nuevas plantas de naranjo amargo. El movimiento célula a célula de CTV en naranjo amargo está muy limitado y la infección queda restringida a células aisladas (Folimonova et al., 2008), pero no el movimiento a larga distancia, como lo prueba el hecho de que el virus pueda transmitirse en pases seriados tomando el inóculo de los brotes nuevos. Tampoco resulta verosímil que los cambios en la composición de la población viral pudiesen haber alterado la gama de huéspedes, ya que la lima Mexicana se ha mostrado susceptible a todos los aislados de CTV con los que se ha ensayado, incluyendo los genotipos T36-947, T388 y T385. Sólo cabe especular que el bajo título viral en combinación con algún factor que dificulte el movimiento desde el floema del naranjo amargo al de otros huéspedes de cómo resultado esta drástica pérdida de infectividad. En resumen, mientras la población clonal T36-947 resulta muy estable en los huéspedes susceptibles, en el naranjo amargo resulta muy inestable y genera una evolución rápida hacia variantes de secuencia muy distantes de la original, pero que corresponden a genotipos conocidos en la naturaleza. Esta evolución, que va acompañada de una pérdida de infectividad en huéspedes más susceptibles, parece una adaptación al naranjo amargo en la que habría determinados picos de eficiencia biológica. El hecho de que el naranjo amargo fuese durante décadas casi 153 CAPÍTULO IV el único patrón utilizado en el cultivo de los cítricos justificaría que los tres genotipos hallados en nuestros pases surgiesen también en distintas áreas citrícolas. 154 DISCUSIÓN GENERAL 155 DISCUSIÓN GENERAL Los aislados de CTV están formados generalmente por una mezcla de variantes de secuencia, en ocasiones alejadas filogenéticamente, que se generan mediante procesos de mutación y recombinación. Su frecuencia en la población viral es el resultado de distintas presiones selectivas y de fenómenos de migración y deriva genética, estos últimos generalmente asociados a los procesos de transmisión por pulgón o injerto. El proceso de transmisión de CTV por pulgón supone un cuello de botella que reduce el tamaño efectivo de la población y puede alterar la composición de ésta por fenómenos de deriva genética (Albiach-Martí et al., 2000b; D’Urso et al., 2000; Nolasco et al., 2008). Estos fenómenos serían más evidentes cuanto más intensa fuese la reducción del tamaño poblacional, es decir, utilizando un número reducido de pulgones para evitar que la inoculación por múltiples individuos pudiese compensar en parte la reducción poblacional que cada uno de ellos efectúa. Por eso, aunque las transmisiones experimentales de CTV con Aphis gossypii suelen hacerse con al menos 200 pulgones por planta receptora para conseguir eficiencias de transmisión superiores al 50% (Hermoso de Mendoza et al., 1984, 1988a,b; Ballester-Olmos et al., 1993; Sambade et al., 2007), para evaluar la importancia de la deriva genética en nuestras condiciones, se ensayó la transmisión de los aislados T388 y T385 con un número mínimo de pulgones. Pese a que el aislado T385 es transmisible por A. gossypii (Moreno et al., 1993b), los numerosos ensayos de transmisión a lima Mexicana o naranjo dulce utilizando 1, 10 o incluso hasta 50 pulgones por planta receptora, fueron infructuosos, lo que sugiere baja eficiencia de transmisión, que también ha sido observada con el aislado T30 de Florida con el que T385 presenta una identidad nucleotídica de más de 99% (Albiach-Martí et al., 2000c). También el aislado T388 se transmitió con baja eficiencia (Hermoso de Mendoza et al., 1988b) y fue necesario utilizar 10 pulgones por planta receptora para lograr algunas infecciones. El análisis de las secuencias consenso de los genes p33, p27, p25, p18, p13, p20 y p23 de las plantas infectadas con T388, mostró que no había diferencia entre las secuencias de la planta del aislado de colección, las donantes y las infectadas por los pulgones, excepto el cambio de un nucleótido en la secuencia de p33. La estabilidad y homogeneidad en la estructura genética del aislado T388 observadas en estos experimentos contrastan en parte con resultados previos obtenidos en el laboratorio en los que se observaron diversas variantes de secuencia de p18 y p20 en el aislado T388 de la colección (Ayllón et al., 1999b), si bien al analizar las secuencias de éstas variantes se observaron valores relativamente bajos de diversidad nucleotídica (0.0352 ± 0.0057 para p18 y 0.0023 ± 0.0003 para p20) (Ayllón et al., 2006). La menor diversidad nucleotídica de p20 observada en este trabajo (0.00046 ± 0.00022), al analizar el mismo aislado de CTV unos diez años después, podría ser debida a una reducción en la frecuencia de algunas variantes de secuencia detectadas en el primer análisis como resultado de una estabilización progresiva de la población viral. La inoculación por injerto es la metodología habitual para la transmisión de virus de cítricos. Ésta también supone un cuello de botella que puede reducir el tamaño efectivo de la población y dar lugar a un efecto fundador al establecerse en la planta sana una nueva población que no representa necesariamente la original. Análisis previos de varios aislados obtenidos mediante transmisión por injerto a distintos 156 DISCUSIÓN GENERAL huéspedes pusieron de manifiesto diferencias en la estructura poblacional de los genes p18 y p20 (Ayllón et al., 1999b, 2006), que indicaban que la transmisión por injerto puede moldear las poblaciones de CTV. Sin embargo, al incluir estos experimentos un proceso de transmisión por injerto junto con un cambio de huésped los cambios poblacionales observados podían ser debidos a cualquiera de los dos factores o a una interacción entre ambos. Una vez comprobado que la transmisión por pulgón del aislado T388 en nuestras condiciones no afectaba la variabilidad del mismo se intentó analizar el posible efecto de la transmisión por injerto en su estructura poblacional. Para ello se transmitió a plantas sanas de cítricos de la misma variedad utilizando como inóculo 1, 2, 4 o 6 trozos de corteza de la planta donante, asumiendo una proporcionalidad entre el número de éstos y el tamaño efectivo de la población, ya que en el sistema CTV-cítricos no es posible estimar éste de forma fiable como se ha hecho en otros sistemas virus-planta (Sacristán et al., 2003). Como primera etapa en la caracterización de las poblaciones de los genes p20 y p23 se utilizó la comparación de los perfiles de SSCP de los productos de RT-PCR obtenidos con cebadores apropiados, que generalmente permite detectar variantes de secuencia que supongan al menos un 10% de la población total (Rubio et al., 2000). Para análisis posteriores de la variación genética se clonaron estos productos, se analizaron mediante SSCP al menos 20 clones por población y gen y se secuenciaron todos los clones con perfil de SSCP diferente y varios de los que mostraban el mismo perfil. Las diferencias de secuencia entre clones y la frecuencia de los mismos en cada población se utilizaron para analizar la diversidad nucleotídica, como se ha efectuado en trabajos anteriores (Rubio et al., 2000; Sambade et al., 2003; Ayllón et al., 2006; Vives et al., 2002; Martín et al., 2006, 2009). El análisis inicial de los productos de RT-PCR no detectó diferencias entre la planta donante y las inoculadas con distinto número de injertos para p20 y sólo dos de las poblaciones mostraron diferencias para p23. El análisis detallado de la población de plantas inoculadas con 1 o con 6 trozos de corteza, que representaban los dos extremos del tratamiento, mostró en la mayoría de los individuos analizados una estructura característica de las cuasiespecies virales, con un haplotipo predominante y algunas variantes de secuencia que diferían de ésta en 1 a 3 nucleótidos. La mayoría de los haplotipos minoritarios aparecían sólo en alguna población o sólo en alguno de los análisis y aparentemente no llegan a fijarse en la población como efecto de la selección estabilizadora. Sin embargo, para cada uno de los genes se detectó un haplotipo que difería en un solo nucleótido del mayoritario y que se repetía en distintas poblaciones (B1 de p20 y Q1 de p23), llegando en algún caso a convertirse en el haplotipo mayoritario. Ninguno de estos haplotipos fue detectado en la población de la planta donante, si bien es posible que existiesen en muy baja frecuencia. La estructura de una de las poblaciones en las que aparecía el haplotipo B1 no difería significativamente de la esperada bajo selección neutral, lo que sugiere en este caso una pérdida de adaptación del haplotipo mayoritario. En el caso de p23 esta situación se repitió en 8 de las 14 poblaciones en las que aparecía el haplotipo Q1, lo que sugiere que la eficiencia de éste sería comparable a la del mayoritario. Sin embargo la aparición y frecuencia de Q1 no parece el resultado directo de una deriva genética por reducción del tamaño poblacional, ya que este haplotipo era más frecuente en las plantas inoculadas con 157 DISCUSIÓN GENERAL seis injertos. No se encontró una variación significativa de la diversidad genética entre la planta donante y las inoculadas con uno o con seis injertos o analizadas a distintos tiempos post-inoculación y los análisis AMOVA indicaron que estos factores no afectan significativamente la estructura de la población, por lo que puede considerarse que todas las plantas analizadas contienen una única población. Los análisis filogenéticos mostraron que todas las variantes de secuencia de ambos genes se agrupaban estrechamente con la secuencia tipo de T388. La distribución de los cambios a lo largo de la secuencia fue aleatoria y las posiciones conservadas en distintos aislados permanecieron invariables en las variantes de secuencia encontradas. Una vez comprobado que la inoculación por injerto a plantas sanas de cítricos de la misma variedad no afectaba de forma sustancial la estructura y diversidad genética de la población viral se estudió si la transmisión por injerto a diferentes especies y variedades comerciales de cítricos propagadas sobre citrange Carrizo, tal y como se hace en campo, podía inducir cambios en ésta. Para ello se utilizaron los aislados T388 y T385 y se analizaron los genes p20 y p23 cada 6 meses a lo largo de 2 años desde la inoculación, siguiendo la misma metodología de búsqueda de haplotipos mediante SSCP y secuenciación posterior de los mismos. De nuevo la estructura poblacional de p20 y p23 en las plantas donantes e inoculadas era generalmente muy similar, por lo que se analizó en detalle la población de una planta de cada variedad al inicio y final del experimento, más la de aquellas que mostraron alguna diferencia en el análisis inicial de SSCP. La estructura de la población de ambos genes en la mayoría de las plantas inoculadas con el aislado T388 fue la característica de las cuasiespecies virales, con una secuencia predominante y algunas variantes que diferían de ésta en 1 a 4 nucleótidos. La mayoría de los haplotipos minoritarios aparentemente no llegan a fijarse en la población como efecto de la selección estabilizadora, si bien en pomelo Star Ruby aparecieron para ambos genes haplotipos mayoritarios que diferían en un solo nucleótido de los predominantes en otras variedades. La estructura de la población en las plantas inoculadas con el aislado T385 fue similar a la de las inoculadas con T388, si bien el número de variantes minoritarias era algo mayor y alguna de ellas difería en 5 nucleótidos de la secuencia mayoritaria. La mayoría de los haplotipos minoritarios de p20 sólo aparecían en alguna población sin llegar a fijarse, pero en contraste con T388, uno de los haplotipos minoritarios de la población donante se encontró en varias plantas inoculadas y llegó a ser el haplotipo mayoritario en un naranjo Berna. También un haplotipo de p23 minoritario en la población donante se convirtió en mayoritario en esta misma variedad, y otro minoritario detectado en Berna pero no en la población donante de T385, se convirtió en mayoritario en una de las poblaciones de pomelo Star Ruby. Estos cambios en la frecuencia de algunos haplotipos no suponen una alteración apreciable de la diversidad genética de la población, ya que se trata de variantes de secuencia genéticamente muy próximas, pero la sustitución de una variante de secuencia por otra podría responder a una mejor adaptación de la variante seleccionada a las condiciones específicas del huésped. 158 DISCUSIÓN GENERAL Los análisis AMOVA indicaron que el tiempo de infección no es un factor importante en la modulación de la estructura poblacional de T388 o T385 como tampoco lo es la variedad en las plantas inoculadas con T388, pero sí lo es en las inoculadas con T385. Esta diferencia de comportamiento entre aislados podría estar relacionada con la composición de la población viral de la planta donante o con diferencias en las interacciones entre factores virales y del huésped, dependiendo de las variantes de secuencia inoculadas en cada caso. La comparación de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de los distintos haplotipos de p20 y p23 de ambos aislados mostró que para ambos genes la distribución de los cambios a lo largo de la secuencia es aleatoria, manteniéndose invariables las posiciones conservadas en distintos aislados de CTV. Los análisis filogenéticos mostraron que todas las variantes de secuencia de ambos genes se agrupaban estrechamente con las secuencias predominantes en las plantas donantes de T388 y T385. Es decir, aunque la estructura poblacional de algunas de las plantas inoculadas fuese diferente a la de las plantas donantes o a la del resto de las plantas inoculadas, este cambio no comportaba en ningún caso diferencias genéticas significativas debido a la similitud de las variantes de secuencia detectadas en las poblaciones. Pese a ello, las variaciones observadas en pomelo Star Ruby inoculado con cualquiera de los aislados y en naranjo dulce Berna inoculado con T385 sugieren que el cambio a un nuevo huésped de distinta especie o variedad puede alterar la estructura de la población viral dependiendo del aislado inoculado. Los análisis anteriores de los efectos de la transmisión por pulgón o por injerto a un huésped de la misma o de distinta variedad se efectuaron con aislados naturales de CTV cuya población viral es más o menos heterogénea, y al igual que otras cuasiespecies virales, posiblemente contienen memoria molecular de su pasado evolutivo en forma de genomas minoritarios que en otro tiempo pudieron ser predominantes (Domingo et al., 2002; Briones et al., 2003, 2006). La disponibilidad del aislado clonal T36-947 de CTV, obtenido a partir de un clon infeccioso del genoma completo del aislado T36 de Florida (Satyanarayana et al., 1999, 2001) era una excelente herramienta para el estudio de la variación genética de novo en distintos huéspedes a lo largo del tiempo. Para ello se efectuaron pases sucesivos por injerto del aislado T36-947 desde su huésped original (lima Mexicana) a plantas de semilla de lima Mexicana, que es muy susceptible y acumula niveles altos de virus, naranjo dulce Pineapple y pomelo Duncan, que son susceptibles pero acumulan el aislado T36 algo menos que la lima, y naranjo amargo Común que presenta una resistencia inicial a la infección y acumula menos virus que los demás huéspedes (Ruiz-Ruiz et al., 2007). El análisis primario de las poblaciones virales mediante SSCP de los productos de amplificación mostró diferencias de comportamiento entre los huéspedes susceptibles y el naranjo amargo. En los primeros los perfiles de SSCP de las plantas inoculadas eran idénticos a los de la lima control excepto diferencias mínimas en unas pocas plantas para el gen p23, por lo que se analizó en detalle la población de uno de los linajes de cada huésped. Por el contrario, algunas plantas de naranjo amargo mostraron perfiles de SSCP de p20 diferentes al de los demás 159 DISCUSIÓN GENERAL huéspedes y al de la lima control, indicando la aparición de nuevas variantes de secuencia que en algunos casos parecían predominantes. Por ello se amplió el análisis con 2 pases sucesivos adicionales y se analizaron en detalle todas las plantas de los 4 linajes a lo largo de los 6 pases. La repetición del análisis de SSCP en todas las plantas de este huésped al final del experimento, junto con un nuevo análisis de algunos de los extractos originales mostró la reproducibilidad de los resultados y confirmó la presencia de variantes de secuencia de p20 filogenéticamente alejadas en dichas plantas. En la población parental y en la mayoría de las plantas analizadas de huéspedes susceptibles la población de CTV presentaba un haplotipo predominante y unas pocas variantes de secuencia que diferían de éste en 1 a 3 nucleótidos. La mayoría de estos haplotipos minoritarios sólo aparecían en alguna población o en alguno de los análisis sin llegar a fijarse, pero en 1 planta de pomelo y en 2 de naranjo dulce se detectaron dos haplotipos mayoritarios de p23 que diferían en 1 y 2 nucleótidos, respectivamente, del haplotipo mayoritario general. Estos dos haplotipos, que no se detectaron en la población de la planta control, apenas suponen cambio en la homogeneidad genética observada, pero resultó curioso que fuesen de nuevo el naranjo dulce y el pomelo las especies que presentaban diferencias con respecto a la población parental. Como era de esperar la composición de la población de p20 en naranjo amargo fue diferente a las de los huéspedes susceptibles y la lima control. Aunque en las plantas analizadas se mantenía generalmente la estructura característica de las cuasiespecies virales, en cada linaje aparecían 1 o 2 poblaciones cuyo haplotipo mayoritario era diferente al del resto de las poblaciones y al de la planta control. Estos nuevos haplotipos presentaban un elevado número de cambios nucleotídicos con respecto al predominante en el resto de poblaciones y los análisis filogenéticos pusieron de manifiesto que se agrupaban con la secuencia de los aislados naturales T388 y T385. Es posible que los pases continuados en naranjo amargo, un huésped parcialmente resistente que limita el movimiento célula a célula de CTV, diesen lugar a la acumulación de mutaciones para adaptarse mejor a la nueva situación. Las mutaciones en una zona del genoma viral tienen con frecuencia efectos epistáticos en otras zonas del genoma que dan lugar a la fijación de mutaciones compensatorias para mejorar la eficiencia biológica del primer mutante (Sanjuán y Elena, 2006). En un virus con un tamaño de genoma tan grande como CTV es probable que las interacciones epistáticas sean particularmente relevantes y que en una zona del genoma no todas las mutaciones sean viables o proporcionen un mínimo de eficiencia biológica, sino que su variabilidad genética se ciña al modelo de paisajes adaptativos de Wright (1931), en el que hay picos de eficiencia biológica separados por valles de escasa eficiencia. En esta situación sólo algunos genotipos tendrían posibilidad de subsistir. Los análisis previos de variabilidad de CTV en aislados naturales indican que éstos tienden a agruparse en torno a unos cuantos genotipos, incluyendo T36, T388 y T385 (Albiach-Martí et al., 2000c; Sambade et al., 2003; Martín et al. 2009). Los valores de diversidad nucleotídica intrapoblacional en los huéspedes susceptibles fueron más bajos que los estimados en otros virus de plantas (GarcíaArenal et al., 2001) y en otros análisis de diversidad de p20 en distintos aislados de CTV (Rubio et al., 2001; Ayllón et al., 2006) como era de esperar por el hecho de 160 DISCUSIÓN GENERAL haber utilizado una población clonal obtenida recientemente. La aparición de variantes de secuencias tan diversas en el huésped naranjo amargo se vio reflejada en valores de diversidad nucleotídica intrapoblacional muy superiores y similares a los obtenidos en distintos aislados naturales de España y California en los que se encontraron casos de probables infecciones múltiples y secuencias recombinantes (Rubio et al., 2001). La comparación de las secuencias nucleotídicas de los distintos haplotipos observados en los huéspedes susceptibles puso de manifiesto que los cambios ocurridos para ambos genes parecen al azar y sin separarse apenas de la secuencia maestra, como cabría esperar en una cuasiespecie viral. En los análisis filogenéticos estas variantes de secuencia se agrupaban estrechamente con la secuencia de T36-947, lo que es coherente con la baja diversidad genética observada en todas las poblaciones. Por el contrario, en naranjo amargo los distintos haplotipos de p20 de una misma población diferían hasta en 59 nucleótidos, lo que sugiere una evolución adaptativa rápida a las nuevas condiciones de un huésped poco favorable. En los análisis filogenéticos las variantes detectadas en este huésped formaban tres grupos en torno a las secuencias tipo T36-947, T388 y T385, más un conjunto de secuencias minoritarias que se situaban entre los genotipos principales, que avalan la idea de una evolución entre el genotipo original T36-947 y los otros dos detectados. Estos tres genotipos podrían representar picos de eficiencia biológica en un paisaje adaptativo (Wright, 1931). La detección de secuencias recombinantes que incluían a los genotipos T36947, T388 y T385 como parentales es una evidencia adicional de la presencia y replicación de más de un genotipo en una misma célula de naranjo amargo. Los ensayos de infectividad a partir de las plantas de naranjo amargo pusieron de manifiesto i) una reducción de la capacidad de infección o movimiento del virus a lima Mexicana a partir del segundo pase, probablemente asociada con el bajo título viral en naranjo amargo, y ii) la pérdida total de la capacidad infectiva del virus en lima y naranjo dulce cinco años más tarde. Lo más sorprendente, sin embargo, fue la ausencia de CTV en brotes de lima Mexicana propagada sobre plantas de naranjo amargo en las que se había detectado la presencia de CTV mediante amplificación de p20. Sólo cabe especular que el bajo título viral en combinación con algún factor que dificulte el movimiento desde el floema del naranjo amargo al de otros huéspedes diese como resultado esta drástica pérdida de infectividad. En resumen, las poblaciones virales de los aislados naturales analizados resultaron generalmente estables en los procesos de transmisión por pulgón o por injerto a un nuevo huésped de la misma o de distinta variedad. Por otra parte, la población clonal T36-947 resulta muy estable en los huéspedes susceptibles, pero en naranjo amargo resulta muy inestable y genera una evolución rápida hacia variantes de secuencia muy distantes de la original, correspondientes a genotipos conocidos en la naturaleza. Esta evolución, que va acompañada de una pérdida de infectividad en huéspedes más susceptibles, parece una adaptación al naranjo amargo en la que habría determinados picos de eficiencia biológica. El hecho de que el naranjo amargo fuese durante décadas casi el único patrón utilizado en el cultivo de los 161 DISCUSIÓN GENERAL cítricos justificaría que los tres genotipos hallados en este trabajo surgiesen también en distintas áreas citrícolas. 162 CONCLUSIONES GENERALES 163 CONCLUSIONES GENERALES 1. La transmisión por pulgón del aislado virulento de CTV T388 ocurrió con una eficiencia igual o inferior al 10% y utilizando al menos 10 pulgones por planta receptora, mientras que el aislado avirulento T385 no pudo transmitirse ni siquiera con 50 pulgones /planta. 2. En las plantas infectadas por los pulgones con el aislado T388 las secuencias consenso de los genes p33, p27, p25, p18, p13, p20 y p23 fueron idénticas a las de las plantas donantes y el aislado de colección, salvo un cambio nucleotídico en p33 en una de las plantas receptoras, y los síntomas inducidos por todas ellas en lima Mexicana fueron indistinguibles. 3. La transmisión por injerto del aislado T388 de CTV a plantas de la misma variedad en general no alteró de forma apreciable la estructura poblacional ni la diversidad nucleotídica de los genes p20 y p23 con independencia del número de injertos utilizado (1 a 6) o del tiempo transcurrido desde la inoculación. 4. Las nuevas variantes de secuencia de p20 y p23 detectadas en las plantas inoculadas con CTV T388 sólo difieren en 1 a 3 nucleótidos de la variante mayoritaria y generalmente no llegan a fijarse en la población viral, si bien dos de estas variantes (una de cada gen) llegaron a predominar en algunas poblaciones, sugiriendo que podían ser tan eficientes como la variante mayoritaria de la planta donante. 5. La transmisión por injerto de los aislados de CTV T388 (virulento) y T385 (avirulento) a diversas variedades comerciales injertadas sobre patrón citrange Carrizo tampoco alteró de forma apreciable la diversidad nucleotídica de los genes p20 y p23, si bien la estructura poblacional de estos genes se vio alterada en plantas de naranjo Berna inoculadas con T385 y en plantas de pomelo inoculadas con cualquiera de los aislados. 6. Esta alteración poblacional en algunas combinaciones aislado/huésped/gen fue debida a la aparición de nuevas variantes de secuencia que diferían en 1 a 5 nucleótidos de las variantes mayoritarias y que en ocasiones llegaban a predominar en la población, indicando una mejor adaptación de la variante seleccionada a las condiciones específicas del huésped. 7. La transmisión y pases sucesivos por injerto de un aislado de CTV de origen clonal (T36-947) en huéspedes de distinta susceptibilidad al virus permitió analizar el efecto de la adaptación a estos huéspedes en su estructura poblacional y evolución. 8. En la planta donante de T36-947 (lima Mexicana) y en la mayoría de las plantas de lima Mexicana, naranjo dulce y pomelo en las que se efectuaron los pases sucesivos de este aislado clonal, la población viral de p20 estaba constituida por una variante de secuencia predominante, característica del genotipo T36, y entre 1 y 6 variantes de secuencia que diferían de 1 a 3 164 CONCLUSIONES GENERALES nucleótidos con respecto a la secuencia predominante. La mayoría de estas variantes minoritarias no llegan a fijarse en la población viral como efecto de la selección estabilizadora, pero dos de ellas se convirtieron en la secuencia mayoritaria en algunas plantas de naranjo dulce o pomelo, indicando que en estos huéspedes deben ser tan eficientes como la secuencia original de T36-947. 9. Los pases sucesivos de CTV T36-947 en el huésped naranjo amargo, que es parcialmente resistente a CTV, dio lugar a cambios importantes en la población viral con un incremento de la diversidad nucleotídica intrapoblacional debido a la aparición de variantes de secuencia muy divergentes de la de T36-947, que sugieren una evolución adaptativa rápida a las condiciones de un huésped poco favorable. 10. La mayoría de las nuevas variantes de secuencia divergentes del genotipo T36 presentaban una estrecha relación filogenética con la secuencia predominante de los genotipos naturales T388 y T385, lo que sugiere que la evolución de CTV podría seguir el modelo de paisajes adaptativos de Wright, en el que los tres genotipos hallados representarían picos de eficiencia biológica. 11. La detección en distintas plantas de naranjo amargo de secuencias minoritarias cuya posición filogenética se sitúa entre los tres genotipos principales avala la idea de una evolución entre el genotipo original T36-947 y los otros dos detectados para intentar adaptarse al huésped. Asimismo, la detección de secuencias recombinantes que incluyen a los genotipos T36947, T388 y T385 como parentales apoya la presencia y replicación de más de un genotipo en una misma célula de naranjo amargo. 12. Las inoculaciones a huéspedes susceptibles como el naranjo dulce o la lima Mexicana pusieron de manifiesto la progresiva pérdida de infectividad de la población viral mantenida en naranjo amargo, debido en parte al bajo título viral de CTV en este huésped. La incapacidad de moverse a lima Mexicana propagada sobre plantas de naranjo amargo infectadas, sugiere la posibilidad de que algún factor del huésped pudiese dificultar el paso desde el floema del naranjo amargo al de lima Mexicana. 165 BIBLIOGRAFÍA 166 Agranovsky AA (1996) Principles of molecular organization, expression and evolution of closterovirus: over the barriers. Adv Virus Res 17: 119-158. Agudelo-Romero P, de la Iglesia F, Elena SF (2008) The pleiotropic cost of hostspecialization in Tobacco etch potyvirus. Infection Genetics and Evolution 8: 806814. Albertini D, Vogel R, Bové C, Bové JM (1988) Transmission and preliminary characterization of citrus tristeza virus strain K. 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A2II: Alineamiento de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del gen p23 (372 nt y 124 aa) del aislado de CTV T388 y de todos los cambios encontrados en variantes de secuencia minoritarias de la planta donante y de las inoculadas con x1 o x6 injertos a distintos tiempos postinoculación (línea CAMBIOS), en comparación con los distintos aislados de referencia. AAA ... ... ... ... G.. G.. ... ... G.. ACC G.. ... ... ... .A. .A. ... C.. C.. GTA ... ... ... ... ... ... ... ..G ..G AGT .T. ... ... ... .AA .AA ... ... ... TCG ... ... ... ..A ... ... .T. ... ... GAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... GCG ... ... ... ... ... ... ... ... ... GAT ..C ... ... ... ... ... ... ... ... CGC ... ... ... ... ... ... ... ... ... TTG ... ... ... ... ... ... ... ... ... GAA ... ... ... ... ..G ... ... ..T ..T TTT ... ... ... ... ... ... ... ... ... TTA ... ... ... ... ... ... ... ... ... CGG ..A ... ... ... ..T ..T ... .A. .A. AAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... 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A2III: Alineamiento de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del gen p23 (372 nt y 124 aa) del aislado de CTV T388 y de todos los cambios encontrados en variantes de secuencia minoritarias de la planta donante y de las inoculadas de distintas variedades y a distintos tiempos postinoculación (línea CAMBIOS), en comparación con los distintos aislados de referencia. AAA .G. ... ... ... ... G.. G.. ... ... G.. AGA ..G ... ... ..G ..G .AG .AG ..G .AG .AG AGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... CAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... TTA .C. ... ... ... ... ..G ..G ... ..G ..G GCG ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ..T GTT ... ... ... ... ... ..C ..C ... A.. A.. GAT .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ACT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... GAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... CGT ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... AAG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... TGT C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... AAC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 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TKERQLAVDL .....S..G. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......I.. .......I.. 195 APÉNDICES A3III: Alineamiento de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del gen p20 (483 nt y 161 aa) del aislado de CTV T385 y de todos los cambios encontrados en variantes de secuencia minoritarias de la planta donante y de las inoculadas de distintas variedades y a distintos tiempos postinoculación (línea CAMBIOS), en comparación con los distintos aislados de referencia. CAG ... ... ... ... ... ... ... .T. .T. TGT C.C ... ... ... ... ... ... ... ... CGG .A. ... ... ... ... ... ... ... ... AAC ... .G. .G. .G. .G. ... .GT .GT .GT TGA ... ... ... ... ... ... ... ... ... AGT ... .A. .A. .A. .A. ... .A. G.. G.. TGG ... .A. .A. .A. .A. ... .A. ... ... TGG ... ... ... ... ... .A. ... ... ... TTA ... ... ... ... ... ... ... ... ... AAG ... ... ... ... ... ... .G. .G. .G. CTG ... .G. .G. .G. .G. ... .G. .G. .G. TGC ..T .A. .A. .A. .A. ... .A. .A. .A. 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GTA ... ... ... ... ... ... ..G ..G AAA ..G .GT .GT .GT ... .GT .GT .GT TCG .T. ... ... ..A ... .T. ... ... GAA ... ... ... ... ... ... ... ... GCG ... ... ... ... ... ... ... ... GAT ... ... ... ... ... ... ... ... CGC ... ... ... ... ... ... ... ... TTG ... ... ... ... ... ... ... ... GAA A.T ... ... ... ..G ... ..T ..T TTT ... ... ... ... ... ... ... ... TTA ... ... ... ... ... ... ... ... CGT T.G ..G ..G ..G ... ..G .AG .AG AAA ... ... ... ... ... ... ... ... ATG ... ... ... ... ... ... ... ... AAT ... ... ... ... ... ... ... ... CCC .T. ... ... ... ... ... ... ... TTT ..C ..C ..C ..C ... ... A.. A.. ATT ... ... ... ... ... ... ... ... GTT A.C A.C A.C A.C ... A.C A.C A.C GAC ... ... ... ... ... ... ..T ..T GCT ..C ... ... ... ... ... ... ... CTG ... T.. T.. T.. ... T.. T.. T.. GTG ..A A.A A.A A.A ... A.A A.A A.A CGG ... ... ... ... ... ... ... ... AAA .G. ... ... ... ... ... ..G ..G ACC ... .AT .AT .AT ... ..T .AT .AT AAT ... .G. ... .G. ... .G. .G. .G. 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A.C A.C A.C ... ..C ..C ..C 196 APÉNDICES #T385 #CAMBIOS #T318A #SY568R #NUagA #T30 #VT #T36 #Qaha GAA ... ... ... ..G ... ... ... ... AGG ... ... ... ... ... ... ... ... CAA ... ... ... ... ... ... ... ... TTG ... ..A ..A ..A ... ..A ... ... GCG ... ... ... ... ... ... ..T ..T GTC ... ..T ..T ..T ... ..T A.T A.T GAT .G. ... ... ... ... ... ... ... GTG ... ... ... ... ... ... ... ... GAT ... ... ... ... ... ... ... ... TGT ... ... ... ... ... ... ..C ..C GGT ... ... ... ... ... ... ... ... AGA ... ... ... ... ... ... ... ... AAA ... ... ... ... ... ... ... ... CAC ... ... ... ... ... ... ... ... GAC ... ..T ..T ..T ... ..T ..T ..T AAG ... ... ... ... ... ... ... ... GCG ... ..A ..A ..A ... ..A .G. .G. CTC ... TCG TCG TCG ... TCG T.G T.G AAG ... .GA .G. .G. ... .G. ... ... ACT G.. ... ... ... ... ... ... ... GAA ... ... ... ... ... ... ... ... CGT ... ... ... ... ... ... ... ... AAG ... ... ... ... ... ... ... ... TGT ... ... ... ... ... ... ... ... AAC .G. ... ... ... ... ... ... ... 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AIELVLY ....... ....... ..D..M. ..D..MH ..D..MH .....S. ..D..MH ..D..M. ..D..M. TKERQLAVDL .R......G. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......I.. .......I.. A1IV: Alineamiento de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del gen p20 (483 nt y 161 aa) del aislado clonal T39-947 y de todos los cambios encontrados en variantes de secuencia minoritarias de la planta donante y de las inoculadas de huéspedes susceptibles (línea CAMBIOS), en comparación con las de aislados de referencia. CTG ... ... .A. .A. .A. .A. .A. .A. .A. ... ... TGT ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... CGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... AGT ... ... ..C ..C ..C ..C .AC .AC ... ... ... TGA ..T ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... GGT ..C ... AA. AA. AA. AA. A.. A.. AA. ... ... TGG ... ... .A. .A. .A. .A. ... ... .A. ... ... TGG ..A ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... TTA C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 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FAAYGILLQK .......... .......... .......... .......... .......... .......... .T........ .T........ .......... .......... .......... GTVSTV ...... ...... ...A.. ...A.. ...A.. ...A.. ...A.. ...A.. ...A.. ...... ...... A2IV: Alineamiento de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del gen p23 (372 nt y 124 aa) del aislado clonal T39-947 y de todos los cambios encontrados en variantes de secuencia minoritarias de la planta donante y de las inoculadas de huéspedes susceptibles (línea CAMBIOS), en comparación con las de aislados de referencia. ACC ... ... .A. .A. .A. .A. .AA .AA .A. ... ... GAC ... ... A.. A.. ... ... ... ... ... ... ... ATT G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... GGC ... ... A.. A.. A.. A.. ... ... A.. ... ... TAT ... ... GG. GG. GG. GG. GG. GG. GG. ... ... TGA ..T ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ACG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... TAA C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... GGT ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... 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C.. ... ... ... ... ... ... ... #T36-947 #CAMBIOS #CAMBIOS #T388 #T318A #SY568R #NUagA #T30 #T385 #VT #T36 #Qaha DESNTATTDV .G.S.T.A.. ...H...... ......S.EI ......S.EI ......S.EI ......S.EI ......S.K. ......S.K. ......S.E. .......... .......... KPVSSEADRL ...GL....S .......... .T........ .T........ .T........ .T........ EN.K...... EN.K...... .T..L..... .......... E......... DFLQKMNPII ......S.V. .......... E..R....F. E..R....F. E..R....F. E..R....F. E..R....F. E..R....F. E..R....F. .......... .......... IDALIRKNSY .......... .......... .......... .......... ........N. .......... V...V..TN. V...V..TN. .......T.. .......... .......... QGARFRARII .........V .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... GVCVDCG ....... ....... ....... ....... ....... ....... ....... ....... ....... ....... ....... 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TKERQLAIDL ..G......S .......... .......V.. .......V.. .......V.. .......V.. .......V.. .......V.. .......V.. .......... .......... 198 APÉNDICES A3IV: Alineamiento de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del gen p20 (483 nt y 161 aa) del aislado clonal T39-947 y de todos los cambios encontrados en variantes de secuencia minoritarias de la planta donante y de las inoculadas de naranjo amargo (línea CAMBIOS), en comparación con las de aislados de referencia. CTG .A. .C. .A. .A. .A. .A. .A. .A. .A. ... ... AGT GAC ... ... ... ... ... .A. .A. ... ... ... TCG CT. ... .T. ... ... .T. ... ... ... ... ... AAT .GA ... .G. .G. .G. .G. ..A ..A .G. ... ... CCG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... TAA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... TGA .TC ... ..C ..C ..C ..C ..C ..C ..C ... ... GGA .A. ... .A. .A. .A. .A. .A. .A. .A. ... ... CGG ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... AGT .AC ... ..C ..C ..C ..C .AC .AC ... ... ... 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