ESTRUCTURACIÓ DE LA RESPOSTA B A LES MALALTIES AUTOIM M UNITÀRIES DE LA TIROIDE MEMÒRIA DE LA TESI PRESENTADA PER A OBTENIR EL GRAU DE DOCTOR EN CIÈNCIES BIOLÒGIQUES PER LA UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA. BELLATERRA, GENER 2004 Ma del Pilar Armengol i Barnils 2. HIPÒTESI i OBJECTIU 2. HIPÓTESI I OBJECTIUS 2. HIPÒTESI GENERAL A les tiroides afectades per fenòmens d'autoimmunitat s'hi estructuren fol·licles limfoides ectòpics en els que es produeixen errades en els mecanismes de tolerància B perifèrica que desenvoquen en l'expansió local de cèl·lules B autoreactives. La manca d'eliminaciótotal o parcial d'aquestes cèl·lules i l'existència de cèl·lules T autoreactives de baixa afinitat un cop iniciada la resposta contra determinats autoantígens, contribueixen a la cronificació in situ del procés autoimmunitari. 2.1 Hipòtesis concretes i objectius Hipòtesi 1 A les tiroides de malalts amb autoimmunitat tiroïdal s'organitzen fol·licles limfoides ectòpics funcionals en els que es generen cèl·lules B autoreactives específiques d'antígens tiroïdals. Objectiu 1 1.1 Demostrar que el teixit limfoide que s'organitza a les tiroides de pacients amb malaltia de Graves-Basedow i de tiroïditis de Hashimoto té una composició i una distribució cel·lulars similar a la dels fol·licles limfoides dels teixits limfoides secundaris. 1.2 Estudiar el tipus de cèl·lules B (B-l o B-2) que constitueixen l'infiltrat limfocitari tiroïdal en general i els fol·licles limfoides intratiroïdals en particular. 1.3 Demostrar que en els fol·licles limfoides ectòpics intratiroïdals tenen lloc processos típics de reacció de centre germinal com proliferació de centroblastes, reordenaments secundaris dels gens de les immunoglobulines, mort cel·lular programada de centròcits, canvi d'isotip. 1.4 Demostrar que, de forma similar als fol·licles limfoides secundaris dels ganglis limfàtics, els centres germinals intratiroïdals són oligoclonals, és a dir, deriven de la proliferació d'un nombre inicial de cèl·lules B molt réduit. Hipòtesi 2 Les cèl·lules B originades als fol·licles limfoides intratiroïdals són les responsables del manteniment de la resposta humoral contra els autoantígens descrits en les malalties autoimmunitàries de la tiroide (tiroglobulina, peroxidasa tiroïdal i receptor de la tirotropina). L'adquisició de característiques de resposta dirigida per antigen (antigendriven) pròpia dels malalts, seria un procés que es donaria als centres germinals intratiroïdals. Objectiu 2 2.1 Fer una anàlisi de la reactivitat de les cèl·lules B dels fol·licles limfoides contra els principals autoantígens tiroïdals (tiroglobulina, peroxidasa tiroïdal i receptor de la tirotropina) en el que s'estudii la proporció i la distribució de les cèl·lules B autoreactives i en el que s'investigui l'especificitat contra antigens tiroïdals no caracteritzats. 2.2 Demostrar que els reordenaments de les immunoglobulines que produeixen els limfòcits B a la tiroide presenten característiques pròpies de direcció per antigen via hipermutació somàtica i maduració per afinitat. Hipòtesi 3 La deleció de les cèl·lules B autoreactives no tindria lloc degut a un defecte en els mecanismes de tolerització propis dels fol·licles limfoides canònics. 61 2. HIPÓTESI I OBJECTIUS Objectiu 3 Estudiar el nivell d'apoptosi deis fol·licles limfoides a l'òrgan diana i algunes molècules involucrades en aquest procés per comparació amb els que tenen lloc a teixits limfoides secundaris com gangli limfàtic o amígdala palatina. Hipòtesi 4 En el manteniment de les respostes autoimmunitàries tiroïdals, la col·laboració dels limfòcits T autoreactius de baixa afinitat amb les cèl·lules B d'alta afinitat explicaria l'evolució lenta de la malaltia. Objectiu 4 Estudiar si es produeixen reordenaments secundaris, dels gens del TCR a les cèl·lules T que formen part dels fol·licles limfoides intratiroïdals. Hipòtesi 5 El patró d'expressió de les quimiocines i citocines que dirigeixen l'arribada, l'estructuració final i el manteniment dels fol·licles limfoides terciaris a nivell de tiroide és similar o igual al que s'ha descrit pels fol·licles limfoides secundaris en gangli limfàtic o amígdala palatina. Objectiu 5 5.1 Determinar al patró d'expressió de les principals quimiocines i citocines (CXCL12, CXCL13, CCL21, CCL22, LTa, LTß) involucrades en la formació dels centres germinals. 5.2 Estudiar la possible regulació de l'expressió de les esmentades quimiocines i citocines per citocines pro-inflamàtories presents en l'infiltrat de les tiroides amb autoimmunitat tiroïdal. 5.3 Determinar la capacitat dels tiròcits i d'altres tipus cel·lulars de produir quimiocines i de contribuir activament a l'organizació dels fol·licles limfoides intratiroïdals. Demostrar la seva funcionalitat a través de la capacitat quimiotàctica. 5.4 Comparar el patró d'expresió a nivell qualitatiu i quantitatiu d'algunes quimiciones i citocines entre el teixit tiroïdal de malalts amb tiroïditis de Hashimoto i de GravesBasedow que continguin centres germinals ectòpics amb aqueslls que no en continguin i amb els teixits control corresponents. 5.5 Identificar els tipus cel·lulars responsables de l'expressió o síntesi de les quimiocines detectades. 5.6 Establir, mitjançant una anàlisi multifactorial, el pes específic de cada factor quimiotàctic en el desenvolupament del centres germinals ectòpics. Hipòtesi 6 El patró d'expressió dels receptors de quimiocines i de receptors de citocines presents a l'infiltrat tiroïdal és similar o igual al que s'ha descrit pels fol·licles limfoides secundaris en gangli limfàtic o amígdala palatina. Objectiu 6 6.1 Determinar al patró d'expressió en els leucòcits dels principals receptors de quimiocines i de citocines (CXCR4, CXCR5, CCR7, LTßR) involucrats en l'arribada i estructuració final dels centres germinals. 62 2.HIPÓTESI I OBJECTIUS Hipòtesi 7 L'arribada selectiva i posterior acumulació a la tiroide de limfòcits infiltrants que expressen un determinat receptor de quimiocines repercuteix en un biaix en l'expressió dels receptors de quimiocines en les poblacions limfocitàries perifèriques. Objectiu 7 7.1 Determinar el patró d'expressió dels principals receptors de quimiocines en els leucòcits de sang perifèrica de malalts amb autoimmunitat tiroïdal involucrats en l'arribada i estructuració final dels centres germinals. 7.2 Comparar el patró d'expressió dels principals receptors de quimiocines en els leucòcits de sang perifèrica de malalts amb autoimmunitat tiroïdal amb controls sans. 63 3. PROTOCOLS 3. PROTOCOLS 3.1 MOSTRES Les tiroides, sang i sérum utilitzats en aquest estudi provenen de pacients amb malaltia de Graves-Basedow, tiroïditis de Hashimoto i goll multinodular. Com a teixits de referència també s'ha usat teixit tiroïdal procedent d'intervencions quirúrgiques cervicals a pacients amb neoplàsies de laringe. El diagnòstic clínic s'ha fet en base als paràmetres clínics habituals: a) determinació per radioimmunoassaig dels nivells plasmàtics de T3, T4, T4 lliure i TSH i b) detecció d'autoanticossos tiroïdals sèries (els anticossos antimicrosoma (peroxidasa tiroïdal o TPO) i anti-tiroglobulina (Tg) s'han determinat per ELISA (Immunowell, San Diego, CA) i els anticossos anti-receptor de la tirotropina mitjançant RIA (Brahms Diagnostica, Berlin, Alemania). Els diagnòstics clínics han estat confirmats amb l'anàlisi histopatològica de les glàndules. Excepte dos, els pacients amb hipertiroïdisme havien estat tractats amb carbimazol i/o propanolol i presentaven una funció tiroïdal normal en el moment de l'operació. Les dades clíniques corresponents als pacients que formen part de l'estudi es llisten a la taula VIII. Les tiroides incloses a l'estudi s'han seleccionat en funció dels títols d'autoanticossos al sèrum i del grau d'infiltració limfocitària de la glàndula, que s'han usat com a indicadors d'un procés autoimmunitari actiu. A més dels esmentats teixits, s'han utilitzat mostres de timus humans (TMB), amígdala palatina (PT) i nòduls limfàtics (LN; un dels quals correspon a un dels malalts de tiroïditis de Hashimoto) com a teixits limfoides primaris i secundaris de referència. 3.2. PROCESSAMENT DEL TEIXIT 3.2.1 Obtenció de blocs de congelació El teixit es mostreja de forma que els blocs siguin representatius del total de la glàndula i es talla en blocs d'aprox. 0,5cm3 que es dipositen submergits en isopentà refredat prèviament en un bany d'acetona amb gel sec. Els blocs es conserven a -70°C. 3.2.2 Obtenció de blocs parafinats El teixit es talla en blocs d'aprox. icm3 i es dipositen submergits en 200ml de formol durant 12-48 hores. Després de deshidratació gradual en banys amb concentracions creixents d'alcohols, s'inclouen en parafina i es mantenen a T.A. fins que s'han d'utilitzar. 3.2.5 Obtenció de limfòcits infiltrants i cèl·lules fol·liculars tiroïdals 3.2.3,1 Digestió enzimàtica del teixit i càlcul del percentatge d'infiltració limfocitàría I/ Digestió. Es pesa el teixit després d'haver-ne eliminat el greix i el teixit conjuntiu i es talla en blocs d'aprox. 3mm3. Els fragments es renten durant 5min amb medi HBSS (Hank's balanced salt solution; Life Technologies, Gaithersburg, USA) suplementat amb L-glutamina 2mM (Sigma Chemical Co., St Louis, USA), estreptomicina 0,lmg/ml (CEPA, Espanya) i penicil·lina lOOU/ml (Laboratorios Normon, Espanya), es recuperen i s'afegeixen a la solució de digestió preparada amb medi RPMI 1640 (Life Technologies) suplementat amb tripsina 2,5mg/ml (Sigma), col·lagenasa 0,2mg/ml tipus P (act. esp 2,7U/mg; Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) i DNAsa 0,05mg/ml (Sigma). Es realitzen digestions consecutives de 10min cadascuna a 37°C en agitació contínua i cada 10min es recull el material digerit en medi RPMI complet suplementat amb L-glutamina 2mM, gentamicina 40^g/ml, penicil·lina 100U/ml i 10% FCS a 4°C per tal d'inactivar els enzims i es filtra amb una malla de niló de 500|j.m de diàmetre de porus. Posteriorment es fan dos rentals per centrifugado de 10min a 500g i el material digerit es manté a 4°C fins que s'ha fet un recompte cel·lular (amb blau tripa) i una valoració de la viabilitat 64 3. PROTOCOLS (taronja d'acridina i bromur d'etidi). A la suspensió de material no digerit s'hi afegeix solució de digestió nova i el procés es repeteix fins que s'aconsegueix una digestió total del teixit, és a dir, una suspensió cel·lular formada principalment per cèl·lules fol·liculars tiroïdals (TFCs), limfòcits infiltrants (ITLs), macròfags, cèl·lules endotelials (END) i cèl·lules dendrítiques (DCs). Les cèl·lules amb una viabilitat superior al 80% i a una concentració aproximada de 5xl06 cels. per ml es criopreserven en vapors de N2 líquid en sèrum boví fetal (FCS) que conté un 10% DMSO (dimetil sulfòxid), prèviament refredat a 4°C o bé s'utilitzen directament en funció dels requeriments de l'experiment. 2/ El càlcul del percentatge d'infiltració limfocitària de cada tiroide (respecte del total cel·lular) s'ha establert mitjançant anàlisi per citometria de fluxe d'una mostra de la suspensió cel·lular tenyida utilitzant la barreja comercial d'anticossos anti-CD45FITC/anti-CD14-PE (Beckton Dickinson, San José, USA). 3.2.3.2 Separació de limfòcits infiltrants i de .cèl·lules fol·liculars tiroïdals per adherència En base a la capacitat de les cèl·lules epitelials d'adherir-se al plàstic, la suspensió cel·lular producte de la digestió mecànica/enzimàtica es cultiva en medi RPMI complet durant 16-24 hores en atmosfera de CO2 (5%) a 37°C. Passat aquest temps, es recuperen els limfòcits del sobrenedant del cultiu i es purifiquen mitjançant un gradient de Ficoll (Ficoll Hypaque Lymphoprep; Pharmacia Biotech, Uppsala, Suècia) per eliminar restes cel·lulars, eritròcits i altres cèl·lules limfoblàstiques. Les cèl·lules epitelials tiroïdals que queden adherides al flascó (que representen el 90-95% del total de cèl·lules adherides) es recuperen utilitzant una solució de 0,25mg/ml de tripsina i 0,05M d'EDTA (Sigma) en medi RPMI. Ambdós tipus cel·lulars s'usen directament o es criopreserven com ITLs (limfòcits intratiroïdals) i TFCs (cèl·lules fol·liculars tiroïdals) purificades. Quan el cultiu cel·lular pot modificar l'expressió de molècules d'interès (com quimiocines, receptors de quimiocines, molècules d'adhesió i d'altres), els limfòcits intratiroïdals s'obtenen per gradient de densitat de Ficoll directament de la suspensió cel·lular provinent de la digestió. En aquests casos, els tiròcits que resten a la zona de més densitat (zona del ficoll) es rebutgen. 3.3 PROCESSAMENT DE LES MOSTRES DE SANG PERIFÈRICA De cada pacient (tant malalts com controls) s'obtenen dues mostres de sang perifèrica en el moment de la intervenció o poques hores després per a determinar els nivells d'autoanticossos i per separar limfòcits de sang perifèrica (PBLs). 3.3.1 Obtenció del sèrum Se separa per centrifugació a 1200g durant lOmin a partir de 3-5ml de sang sense anticoagulant i es conserva a -20°C. Es fa servir per repetir la determinació d'autoanticossos (en els pacients amb autoimmunitat) o per fer-la per primer cop (en cas de pacients sense autoimmunitat tiroïdal coneguda) per s'uniformitzar els resultats donat que les mostres utilitzades provenen de diferents centres. 3.3.2 Obtenció dels limfòcits de sang perifèrica o PBLs A partir de 20ml de sang perifèrica recollida en tub estèril amb heparina sódica, es prepara una dilució amb un volum igual de sèrum fisiològic i se separen els limfòcits per gradient de Ficoll centrifugant 30min a 600g a T.A. Les cèl·lules recuperades de la interfase es renten dos cops per centrifugació amb medi RPMI complet i es criopreserven en vapors de N2 líquid amb una solució de FCS i 10% DMSO fins que s'utilitzen. 65 3. PROTOCOLS mostra GD228 GD2S5 GD2S7 GD2S8 GD278 GD373 GD378 GD381 GD389 GD390 GD391 GD393 GD394 GD403 GD412 GD413 r GD416 GD417 GD421 , GD423 GD424 GD425 GD426 GD427 GD429 GD430 GD452 GD451 GD431 GD443 GD449 GD448 HT290 HT384 HT385 HT444 HT447 BL JC RP API AP2 sexe D D D D D H D D D D H D D D D D D D D D D D H D H D D D D D D D D D D D D D D D D H H H D H D D D D D D D D D D D edat 62 30 21 16 39 69 25 46 35 37 45 50 50 22 26 44 25 35 32 34 32 26 42 51 29 33 23 33 34 51 35 26 29 51 21 67 45 38 45 61 39 35 53 63 ND 49 63 39 60 62 56 41 37 57 62 49 45 aTg neg neg 598,0 neg neg oTPO neg 25,0 1155,0 neg neg 172,1 177,3 162,8 66,8 28,3 ND 39,2 152,3 48,1 143,6 neg aTSHR 80,0 20,0 67,0 118,0 16,0 178,0 1,0 ND nomencl. GDI GD8 GD2 GD19 GD4 37,5 8,4 35,0 neg 36,0 239,0 37,2 56,4 neg 179,0 70,0 neg neg 1265,0 25,0 42,0 43,5 550,0 124,3 39,4 40,5 25,0 945,0 53,0 neg ND 62,0 38,0 neg 8,8 20,6 neg 75,0 23,3 15,5 4,1 4,0 GD10 GD20 GD21 GD22 GD23 GD24 GD25 GD26 GDIS GD27 GD28 GD29 GD30 GD31 GD7 28,0 1001,0 1001,0 7000,0 190,0 neg neg ND neg neg neg neg neg 584,0 ND 774,0 ND neg ND ND ND ND ND 85,9 14,9 neg GDIS GDI? GD14 GDI 3 GD32 GD6 GD3 CDS GD9 46,0 ND ND neg neg neg 10,1 28,0 33,0 neg neg 120,0 766,0 ND 1,14 40,1 neg ND neg ND neg ND ND ND ND ND 1,2 GD11 GD12 GD16 HT5 HT2 HT1 HT3 HT4 HT5 HT6 HT7 HT8 HT9 105000 ND 85,1 ND ND ND ND ND MNG364* HD1 HD2 MNG359 MNG360 MNG361 MNG362 MNG376 MNG379 MNG395 MNG396 MNG399 MNG409 MNG419 MNG420 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg MNG9 neg neg neg 2,5 7,0 1,6 1,4 1,2 37,9 neg neg 27,5 36,0 neg 36,0 45,9 41,0 23,0 neg neg neg 1,2 neg neg neg MNG2 MNG7 MNG8 MNG3 MNG4 MNG10 MNG5 MNG11 MNG1 MNG12 MNG13 MNG6 66 3. PROTOCOLS Taula VIH. Dades clíniques dels pacients inclosos a l'estudi que inclouen l'edat (anys), el sexe i els títols d'autoanticossos sèries: a-Tg: anti-tiroglobulina, valors normals entre 67 i 115U/ml; a-TPO: anti-peroxidasa tiroïdal, valors normals entre 42 i 100U/ml; a-TSHR: anti-receptor de la tirotropina, valors normals <1,5 U/1, GD, malaltia de Graves-Basedow; HT, tiroïditis de Hashimoto; MIMG, goll multinodular; HD, donant sa; neg, valors inferiors al límit de detecció; ND, no determinat. 3.4 PRODUCCIÓ DE LÍNIES LIMFOBLÀSTIQUES TRANSFORMADES AMB EL VIRUS D'EPSTEIN BARR Les línies limfoblàstiques s'obtenen transformant PBLs o ITLs dels pacients estudiats amb el virus d'Epstein Barr (EBV). El virus s'obté del sobrenedant del cultiu de la línia cel·lular B95.8 (marmoset cell line) crescuda fins a la saturació durant 8-10 dies en medi RPMI complet a 37°C i en atmosfera rica en CO2 (5%). El-sobrenedant del cultiu se centrifuga, es filtra amb un filtre de 0,45]xm de porus i es manté a -70°C o es fa servir directament per la transformació. Transformació: es fa en un tub cònic (per afavorir el màxim contacte cel·lular) en el que hi ha un "pellet" o botó cel·lular d'aproximadament IÓ7 PBLs o 105 ITLs i sobre el que s'aplica Iml de l'esmentat sobrenedant. S'incuba durant Ih a 37°C en atmosfera de CO2 (5%) i sense ressupendre el pellet, s'hi afegien 9ml de medi RPMI complet suplemental amb 20% FCS i 4ng/ml de dclosporina A purificada. Es cultiva durant 3 setmanes canviant el medi cada 7 dies i evitant ressuspendre el botó cel·lular. La tercera setmana es ressuspèn el pellet i es cultiva en placa de 24 pous per tal d'expandir la. línia que, a partir d'aquest moment, es cultiva en medi RPMI complet suplementat amb 10% de FCS. Les línies obtingudes s'han anomenat amb el número de la glàndula seguit del sufix "ITLs" o "PBLs" segons la seva procedència. 3.5 ALTRES LÍNIES CEL·LULARS Línia HT93. Generada per transfecció de cèl·lules fol·liculars tiroïdals humanes amb el plàsmid pX-8 que conté la regió antigènica del virus SV40458. Aquestes cèl·lules immortalitzades mantenen característiques de cèl·lules epitelials però han perdut la capacitat de sintetitzar tiroglobulina. Produeixen poc AMPc en resposta a l'estímul de la TSH mentre que hiperexpressen HLA de classe I I expressen HLA classe II sota estímuls de citocines. Creixen en monocapa en medi RPMI complet. Línia DAP3. Línia cel·lular de fibroblastes murins459 que creixen en monocapa en medi RPMI complet. S'han usat per cotransfectar-les amb la parella de vectors pSVL i pSVL.TSHR i utilitzar-les com a substráete per cribatge dels sobrenedants de les línies de limfòcits intratiroïdals fussionades amb F3B6. Línia 300.19. Línia murina de cèl·lules pre-B460 que creixen en suspensió en medi RPMI complet suplementat amb 10% sèrum boví fetal i amb 55^iM 2ß-mercaptoetanol. S'han usat per transfectar-les amb la construcció pcDNAB.TSHR i utilitzar-les com a substráete per cribatge dels sobrenedants de les línies de limfòcits intratiroïdals fusionades amb F3B6. Línia F3.B6. Línia mielomatosa heterohíbrida humà-murí451 que no és capaç de secretar anticossos i que es cultiva en medi RPMI/Glutamax (Life Technologies) complet que conté un 20% de sèrum boví fetal, suplementada amb 50mg/ml gentamicina i una dilució 1/25 de 8-azaguanina (Sigma) per mantenir les cèl·lules sensibles a HAT. S'ha utilitzat en la fussió del limfòcits intratiroïdals per obtenir cèl·lules en creixement continuat. Daudi. Línia cel·lular llmfoblàstica derivada d'un limfoma de Burkitt que expressa IgM de superfície, és negativa per ß-2-microglobulina i positiva per EBV. S'ha expandit en medi 67 3. PROTOCOLS RPMI 1640 suplementat amb (2mM L-glutamine, l,5g/L bicarbonat sòdic, 4,5g/L glucosa, lOmM HEPES i l,OmM piruvat sòdic) amb 10% de serum boví fetal. S'ha fet servir en l'estandardització de l'amplificació del CDR3. Namalwa. Línia cel·lular limfoblàstica derivada d'un limfoma de Burkitt que expressa IgMk de superfície, i que s'ha mantingut en cultiu amb medi RPMI 1640 amb 2mM Lglutamina, l,5g/L bicarbonat sòdic, 4,5g/L glucosa, lOmM HEPES, ImM piruvat sòdic i 7,5% de sèrum boví fetal. S'ha fet servir en l'estandardització de l'amplificació del CDR3. Ramos. Línia cel·lular limfoblàstica derivada d'un limfoma de Burkitt que expressa IgMI de superfície i secretada, és negativa per EBV, IL-4R positiva i CD23 positiva. S'ha expandit en medi RPMI 1640 suplementat amb (2mM L-glutamine, l,5g/L bicarbonat sòdic, 4,5g/L glucosa, lOmM HEPES i l,OmM piruvat sòdic) amb 10% de sèrum boví fetal. S'ha fet servir en l'estandardització de l'amplificació del CDR3. 3.6 OBTENCIÓ i CRIBATGE DE LÍNIES i CLONS DE CÈL·LULES B Les línies i clons procedents de quatre tiroides s'han obtingut per fusió de F3B6 amb una quantitat variable d'ITLs (4,5 x 106 del GD431, 9 x 106 del GD426, 1,5 x 106 de I'HT385, 9 x 106 del GD429) obtinguts segons l'apartat 2.3.2. En el cas de GD431 s'ha fet una fusió alternativa afegint 6 x 106 PBLs autòlegs irradiáis obtinguts segons l'apartat 3.2. 3.6.1 Fusions i obtenció de línies Rentat de les cèl·lules. Les cèl·lules F3B6 es mantenen en cultiu continuat amb medi complet selectiu RPMI/Glutamax (apartat 5), es recuperen per rentat enèrgic del flascó i es ressuspenen en medi RPMI sense suplementar. Els ITLs es recuperen i ressuspenen de la mateixa manera. Els dos tipus cel·lulars es barregen seguint les proporcions nITLs + 2nF3B6 en un tub de 50ml, se centrifuguen a 600g per tal de no compactar excessivament el botó cel·lular i s'elimina el sobrenedant. Fusió. S'afegeix Iml de PEG 50% pre-escalfat a 42°C i es barreja amb les cèl·lules durant 2min amb moviment de rotació manual a 37°C. Es dilueix el PEG amb 2ml d'RPMI barrejant durant 2min (a raó de lml/60") i posteriorment s'afegeixen 10ml d'RPMI en 5' (lml/30") i 10ml més d'RPMI en 2min (lml/10"). Es renten les cèl·lules durant 5min a T.A. a 700g i es ressuspenen en medi selectiu RPMI que conté HAT (GibcoBRL Products, Cheshire, UK) a raó de IÓ5 cèl·lules totals/ml de medi. En el cas que s'utilitzin PBLs com a cèl·lules "feeders" irradiades, s'afegeixen en aquest moment a la mateixa concentració. Les cèl·lules se sembren en plaques de 96 pouets de fons pla a raó de 170nl/pou i es cultiven a 37°C en una atmosfera amb 5% CO2 durant 7-10 dies. 3.6.2 Críbatge de les línies. ELISA per Igs, Tg i TPO Donat que l'interès del treball no és l'obtenció de monoclonals sinó l'estudi de l'especificitat antigènica de les cèl·lules B infiltrants de la tiroide, per evitar d'obtenir un patró esbiaixat per sobrecreixement de determinades cèl·lules en detriment d'altres, al cap de 7 dies d'efectuada la fusió es prenen mostres de sobrenedant de cultiu dels pouets en els que s'ha detectat creixement actiu. Aquests s'utilitzen per quantificar la concentració d'Igs totals (IgG, IgM i IgA) mitjançant l'ELISA dissenyat al nostre laboratori i la secreció d'anticossos anti-Tg i anti-TPO utilitzant un kit comercial modificat. Els protocols es detallen als apartats 4.14.1 i 4.14.2 respectivament. Es consideren línies secretores aquelles que produeixen més de 5ng/ml d'Igs i que són positives per anticossos contra qualsevol dels dos autoantígens considerats (Tg I TPO). Les línies cel·lulars en creixement que produeixen menys d'aquesta quantitat no s'expandeixen i es criopreserven en "bulk" per tal d'estudiar-les posteriorment. 68 3. PROTOCOLS 3.6.3 Clonatge Les línies de cèl·lules B considerades d'interès es clonen per dilució límit. Per a això es recullen les cèl·lules provinents de cada línia i es fa un recompte i un càlcul de la viabilitat cel·lular per dilució a la meitat amb una solució de taronja d'acridina i bromur d'etidi. Les cèl·lules es ressuspenen en medi de cultiu complet i se sembren en plaques de 96 pouets amb fons pla a raó de 3, 1 i 0,3 cèl·lules per pouet i es mantenen en cultiu a durant 5-7 dies. Es consideren clonáis quan, després de cultiu durant 15 dies, el percentatge de pouets amb creixement cel·lular visible en la placa d'l cèl·lula per pouet no supera el 30% del total de la placa. 3.6.4 Críbatge dels dons Es fa per ELISA de forma similar al cribatge de les línies però utilitzant com a substráete el sobrenedant dels pouets quan assoleixen un 50-60% de confluència. Els clons que secreten Igs i/o que alliberen al sobrenedant anticossos contra Tg o TPO s'expandeixen i es mantenen en cultiu continuat a una concentració de 1,5 x 106 cèl·lules/ml. Quan assoleixen el 60-70% de confluència, es va recollint sobrenedant i es conserva a -70°C per tal d'anar monitoritzant el manteniment de la seva capacitat de secreció dels anticossos desitjats. 3.7 ANTIGENS S'utilitzen per a la detecció de cèl·lules B amb receptors específics d'antígens tiroïdals sobre seccions de tiroides que continguin centres germinals (apartat 3.11). I/ Tíroglobulina i peroxidasa tiroïdal. Les proteïnes humanes purificades (biotinilades o sense conjugar) són una donació de B. Leistler (Pharmacia&Upjohn, Freiburg, Alemania). S'han obtingut a les següents concentracions: Tg-Bio 3,2mg/ml; Tg-sense conjugar 2,67mg/ml; TPO-Bio 2,0mg/ml; TPO-sense conjugar 2,3mg/ml i s'han mantingut en PBS amb un 0,05% NaN3 a 4°C fins a utilitzar-les. 2/ Receptor de la tirotropína. S'ha obtingut del laboratori de B. Rapoport i S. MacLahan com a proteïna humana purificada amb una cua de cinc histidines (TSHR-289 o forma activa) que és reconeguda pels autoanticossos humans i altament sensible a la temperatura. És reconeguda per un anticòs de ratolí contra histidines conjugat amb biotina. També s'ha obtingut la proteïna sense conjugar (forma inactiva no marcada) que no és reconeguda per anticossos humans. La concentració proteica d'ambdós antigens és 3.8 ESTIMULACIONS AMB CITOCINES Les monocapes de tiròcits i de la línia cel·lular HT93 es mantenen en cultiu amb medi complet suplementat amb 10% de sèrum boví fetal (FCS) fins que 2 hores abans d'iniciar l'estimulació es disminueix la concentració de FCS al 2%. Els cultius s'estimulen amb 200IU/ml d'IL-lß humana recombinant (Dako, Glostrup, Denmark), 500IU/ml d'IFNy humà recombinant (Dako) o 500IU/ml de TNFa humà recombinant (Dr. GR Adolph, Vienna, Austria). 3.9 TlNCIÓ PER IMMUNOFLUORECÈNCIA I IMMUNOHISTOQUÍMICA I ANÀLISI DE LES IMATGES 3.9.1 Anticossos Són els que figuren a continuaciuó a la taula IX. 69 3. PROTOCOLS Taula IX. Llistat d'anticossos utilitzats. DUMC, Duke University Medical Center; HCPB, Hospital Clínic Provincial de Barcelona; LIR, Laboratory for Immunological Research; RFH, Royal Free Hospital; IGR, Institute Gustave Roussy. especifícitat Bcl-2 CCL21 CCR7 CD 19 CD19-FITC CD19-RPECy5 CD 154 CD20 CD20 CD21L CD23 CD23-RPE CD3 CD3 anticòs Bcl-2- 100 6Ckine 2H4 A3B1 Leu-12 HD37 CD 154 93-1B3 L26 7D6 procedència Zymed Laboratories, San Fco, CA R&D Systems, MN, USA Pharmingen, San Diego, USA R Vilella, HCPB, BCN Becton Dickinson, San José, USA Dato, Glostrup, Dinamarca De-Cheng Shen, Xina R Vilella, HCPB, BCN Dako, Glostrup, Dinamarca P Carroñe, LIR, S-P, França Becton Dickinson, San José, USA Labgen P Beverley, Londres, UK R Vilella, HCPB, BCN Pharmingen, San Diego, USA R Vilella, HCPB, BCN M Bofill, RFH, Londres TF Tedder, DUMC, Durham, NC Becton Dickinson, San José, USA Becton Dickinson, San José, USA R Vilella, HCPB, BCN Caltag R Vilella, HCPB, BCN R Vilella, HCPB, BCN R Vilella, HCPB, BCN R Vilella, HCPB, BCN J Wiels, IGR, França R Vilella, HCPB, BCN M Bofill, RFH, Londres TF Tedder, DUMC, Durham, NC Immunotech, Coulter, Florida, USA Pharmingen, San Diego, USA Pharmingen, San Diego, USA Novocastra Labs, Newcastle, UK Pharmingen, San Diego, USA R&D Systems R&D Systems R&D Systems R&D Systems Boehrínger Manheim ATCC R Vilella, HCPB, BCN G. Janossy, RFH, Londres, UK Becton Dickinson, San José, USA Caltag Southern Biotech R Vilella, HCPB, BCN Southern Sigma P Carayon, Marsella, França hoste ratolí cabra ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí rata ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí rata cabra cabra ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí ratolí cabra ratolí ratolí cabra cacahuet humà ratolí isotip IgGl IgG IgM IgG2a IgGl IgG2a IgM IgGl IgG IgGl IgGl IgGl IgGl IgG2a IgM IgG CD3-PerCP CD38 CD4 CD40 CD45RA-FITC, -PE CD45RO-FTTC, -PE CDS Leu-10 M-L233 UCHT1 Crís-7 UCHT1 RM3A5 HB14 IgGl IgGl IgGl IgG2a IgGl IgGl IgGl IgG IgGl IgM IgG IgG2b IgG2b IgGl IgG IgM IgG IgG IgG2a IgG2b IgGl IgG IgG2b IgG IgG 33-1C6 CDS CD5-PE CD50 CD50 CDS4 CD71 CD77 CD79 CDS 101-1D2 152-2D11 RM4A3 120-2A3 38.13 HM47 HB15 HB15 DX2 CD83 CD83-PE CD95 CD95L citoqueratina 8-18 CLA-1 CXCL12 CXCL13 CXCR4 CXCR5 Cyclins HLA classe I HIA classe II HLA classe II HLA- DR NOK-1 HECA-452 SDF-lct, BLC/BCA-1 12G5 51.505.111 Ki-67 W6/32 Edu-1 RFDR2 L243 hlgD hlgG A1B1 hlgtotal NO NO Mic-18 > _^ hlgD-FITC hlgG-TRITC hlgM hlgs totals-TRITC PNA-FITC TPO TPO IgG ig NO IgGAM IgG 70 3. PROTOCOLS 3.9.2 Protocols de tinció 3.9.2.1 Seccions de criòstat Es duen a terme sobre seccions de congelació de 4^m de gruix (Frigocut, Reichert-Jung, Heidelberg, Alemania) dipositades sobre portaobjectes i assecades durant 30min a T.A. En alguns casos les seccions es poden mantenir a -70°C fins que s'utilitzen i abans de començar la tinció, els portas es tornen a assecar durant 20-30min més a T.A. Tinció indirecta simple i doble: I/ En funció de l'antigen a detectar, algunes seccions es fixen prèviament amb paraformaldèhid (PFA) al 4% durant 15min en fred (CXCL12 i CXCL13) o amb acetona freda (CCL21). 2/ Després de rentar 15min amb PBS+1% BSA, les seccions s'incuben de 30min a 1h a T.A. amb 50nl d'anticòs primari en cambra humida i fosca. En algunes osasions en que l'antigen és soluble, la incubació amb el primer anticòs es fa durant tota la nit a 4°C. 3/ Es fan dos rentats de 5min amb PBS que conté 0,01% BSA en un agitador orbital, s'elimina la resta de tampó i s'afegeixen 50^1 d'anticòs secundari específic d'isotip conjugat amb el fluorocrom (FITC o Rodamina, Molecular Probes, Inc., Eugène, OR) (50jig/ml) o enzim (fosfatasa alcalina, AP o peroxidasa, PO) corresponent durant 3060min. Posteriorment es repeteixen els rentats amb PBS al 0,01% BSA. Quan les tincions són dobles, es repeteixen els passos b-c/ utilitzant un secundari conjugat amb un fluorocrom o enzim alternatiu. En els casos en que és necessària una amplificació del senyal, el segon anticòs s'utilitza conjugat amb biotina, s'inclouen dos rentats i una incubació de 20min a T.A. amb estreptavidina-FITC, -Rho, -PO o -AP. 3.9.2.3 Seccions de parafina I/ Desparafinat i rehidratació gradual. Les seccions de 5^m se submergeixen en xilol durant 20min i en successius banys d'alcohols amb concentracions creixents d'aigua (alcohol absolut, alcohol 90%, alcohol 70%, alcohol 50%) durant 10min cadascun. Un cop rehidratats se submergeixen en PBS lOmin i s'inicia la tinció. 2/ Tinció. Se segueixen els mateixos passos que a l'apartat 3.9.2.1 eliminant la fixació de la secció ja que prèviament ha estat fixat el teixit. 3.9.2.3 Protocols de revelat, muntatge i observació Quan l'anticòs secundari usat es troba conjugat amb un enzim, s'incuben les seccions amb 50-100^1 dels substractes adequats: DMBA+MBTH+H2O2 (Sigma) per la peroxidasa i Fast-Red (Sigma) per la fosfatasa alcalina. La reacció colorimètrica s'atura submergint la preparació en PBS i la secció es contratenyeix per tal d'evidenciar l'estructura tisular. Finalment les preparacions es munten en medi de muntatge que conté glicerol tamponat Fluoprep (BioMerieux SA, Marcy l'Etoile, França) si es tracta d'una secció en la que s'ha d'observar la fluorescencia i se segellen o es munten amb DPX (Merck) si s'han d'observar a la llum visible. Les imatges s'examinen i s'adquireixen en un microscopi Axioplan II (Zeiss, Wetzlar, Alemania) utilitzant llum UV o transmitida, equipat amb una videocàmera i s'analitzen amb el programa Openlab® software (Improvision Ltd, UK). Per tal de comparar millor la distribució de determinades molècules en tincions d'immunofluorescència dobles, les microfotografies de fluorescencia verda i vermella s'han digitalitzat i superposat. Altres imatges han estat deconvolucionades en un sistema de microscopía confocal (Openlab® software) per millorar la resolució. Als peus de figura de l'apartat de resultats s'indica el processament que ha rebut cada imatge i s'inclou una barra groga indicativa d'una mida de lOOjim. 71 3. PROTOCOLS 3.9.2.4 Cèl·lules en suspensió S'aplica a PBLs, ITLs, cèl·lules fol·liculars tiroïdals, clons de cèl·lules B transformades amb el virus d'Epstein barr, clons de cèl·lules B fusionades amb F3B6 i cèl·lules transfectants. L'adquisició i l'anàlisi es realitzen en un citòmetre de flux FACScan equipat amb el programa Cellquest (Becton Dickinson, San José, USA). 3.9.2.4.1 Tinció de superfície. Immunofluorescència directa o indirecta I/ Es ressuspenen entre 105 i 3 x 106 cèl·lules per tub en 50\i\ d'anticòs primari o d'anticòs (o barreja d'anticossos) directament marcat(s) (FITC, PE o PerCP) a la dilució adient i s'incuben 30min a 4°C. S'elimina l'excés d'anticòs i les restes cel·lulars amb dues centrifugacions a 500g durant 5min. 2/ Si la tinció és directa, es ressuspèn el pellet cel·lular amb 200^.1 de PBS i s'analitza directament amb el citòmetre de flux. Si la tinció és indirecta, les cèl·lules es ressuspenen amb 50nl d'anticòs secundari conjugat amb fluorocrom o amb biotina i s'incuben 30min a 4°C a la foscor. Passat aquest temps es fan dos rentats amb PBS, es ressuspenen en PBS i s'analitzen. Quan es tracta de tenyir amb una barreja d'anticossos, alguns del quals són directament marcats i altres no, les cèl·lules s'incuben en primer lloc amb el primari sense conjugar. Després de dos rentats, s'incuben durant 30min a 4°C amb 50nl d'anticòs secundari conjugat i es tornen a rentar. Un cop eliminat l'excés d'anticòs no incorporat, el botó cel·lular s'incuba durant 10min amb 50nl de sèrum normal de ratolí per bloquejar llocs rémanents. Els secundaris s'afegeixen diluits en sèrum normal de ratolí sense rentar. Un cop finalitzada la incubació de 30min a 4°C, es renta com s'ha descrit prèviament, es ressuspèn en PBS i s'analitza al citòmetre. 3.9.2.4.2 Tinció de citoplasma Les cèl·lules (de 2 x 106 a 5 x 106/tub) es renten amb tampó de PBS+1%FCS i es fixen amb paraformaldehid al 4% en PBS durant 20min a 4°C. Després de dos rentats de 10min amb PBS al 2% FCS, s'incuben amb l'anticòs primari durant 30min en fred. Les cèl·lules es renten i s'incuben 30min amb 50^1 de l'anticòs secundari diluït en PBS. Un cop eliminat l'excés d'anticòs no incorporat mitjançant dos rentats, les cèl·lules es ressupenen en PBS i s'analitzen al citofluorímetre. 3.10 IDENTIFICACIÓ i CARACTERITZACIÓ FENOTÍPICA DELS CENTRES GERMINALS La quantitat de mostra de tiroides obtinguda (en pes) és variable, però es calcula que la mitjana del pes dels blocs és d'aprox. 5 grams. Els blocs s'han cribat sistemàticament per detectar la presència de fol·licles limfoides observant 1 de cada 10 seccions de criòstat consecutives tenyides amb hematoxilina i eosina (H/E). Un cop detectats, la seva presència s'ha confirmat per immunofluorescència (IFL) en tinció específica contra aglutinina de cacauet (PNA-FITC, peanut agglutinin) i anti-IgD-FITC (en seccions de criòstat) o amb anti-CD20 (si són seccions de blocs fixats en formalina). La caracterització fenotítica s'ha fet en seccions consecutives de 4[im (de 10 a 80 seccions, en funció de la mida del LF) en les que s'han estudiat per IFL directa o indirecta marcadors fenotípics, molècules d'adhesió, marcadors relacionats amb funció cel·lular (proliferació, reordenaments i d'altres), quimiocines i els corresponents receptors. Els anticossos utilitzats i els protocols de tinció s'han especificat als apartats 3.9.1 i 3.9.2. 3.11 DETECCIÓ DE CÈL·LULES B i PLASMÀTIQUES ESPECÍFIQUES PER TG i TPO S'ha dut a terme sobre seccions de criòstat i en tincions de suspensió de limfòcits intra tiroïdals. 72 3. PROTOCOLS l/ Incubació amb ¡'antigen. Els portas amb les seccions s'assequen durant 30min a T.A. i s'incuben amb 100^1 de PBS que conté: TPO-Bio a lOjig/ml o Tg-Bio a 100ng/ml o la combinació d'ambdós antigens. 2/ Detecció de l'antigen. Després de rentar 2 cops de 15min amb PBS+1% BSA en agitació forta, les seccions s'incuben durant 45min a T.A. amb SOjxl d'estreptavidina-FITC en cambra humida i fosca. 3/ Detecció de les cèl·lules B i plasmàtiques. Es repeteixen els dos rentats i s'afegeixen 50^1 d'anticòs secundari contra-Igs totals humanes-TRITC, contra IgGs-TRITC o contra IgMs-TRITC. S'incuba durant 1 hora a T.A., es repeteixen els rentats de l'anterior apartat i es munten les preparacions en glicerol tamponat. Per tal de demostrar l'especificitat del reconeixement antigen/anticòs, en la tinció s'inclouen preparacions en les que s'ha fet una incubació prèvia amb img/ml de Tg o TPO no conjugats amb biotina com a bloqueig. De cada secció, a més d'estudiar la distribució de les cèl·lules que han reconegut antigen, es fa un recompte del nombre de fol·licles limfoides en els que es detecten cèl·lules tenyides positivament per Tg o TPO i també un recompte aproximat dels percentatge de cèl·lules positives en cada fol·licle limfoide. 3.12 MORFOMETRIA DELS FOL·LICLES LIMFOIDES INTRATIROÏDALS Per tal d'estudiar l'estructura dels fol·licles limfoides intratiroïdals, s'han obtingut seccions de congelació i de parafina tenyides amb H/E de 57 fol·licles limfoides pertanyents a 22 glàndules, de les quals 20 LFs pertanyen a malalts amb GravesBasedow i 37 a malalts amb tiroïditis de Hashimoto. L'estructura ha estat comparada amb la dels fol·licles limfoides presents en alguns òrgans limfoides secundaris (39 LFs presents en nòduls limfàtics reactius i 26 d'amígdala palatina). De cadascun s'ha mesurat l'àrea total del fol·licle limfoide (LF), l'àrea ocupada pel mantell fol·licular (MZ), l'àrea ocupada pel centre germinal (GC), el perímetre del LF i els diàmetres màxim i mínim, utilitzant el programa de morfometria d'Openlab. Els LFs a estudiar s'han triat a l'atzar. 3.13 SEPARACIÓ CEL·LULAR AMB CITÒMETRE DE FLUXE S'ha utilitzat per seleccionar els clons de cèl·lules transfectants que expressen els nivells més alts del domini extracel·lular del TSHR (300.19TSHR i DAP3TSHR) i també per separar limfòcits B i limfòcits T (tant de sang perifèrica com intratiroïdals) per tal de ser usats en els experiments de quimiotaxi en gradients de CXCL12. Els clons dels transfectants se seleccionen utilitzant antisèrums policlonals humans amb títols alts d'autoanticossos contra el TSHR i es detecten amb un anticòs anti-Ig(G+A+M) humanes-FITC. Les cèl·lules T i B se seleccionen per tinció específica contra les molècules CD3 i CD19 respectivament directament conjugades amb -FITC i -PE amb un FACSVantage (BectonDickinson) i la puresa de les cèl·lules obtingudes oscil·la entre un 94 i 99%. 3.14 ELISA 3.14.1 ELISA per detecció d'Igs en sobrenedants I/ Sensibilització de la placa i bloqueig. S'ha dissenyat un ELISA en el que se sensibilitzen els pouets de la placa amb 5ng/ml d'anticòs de conill anti-Ig(G+A+M) humanes (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, USA) diluït en PBS durant tota la nit a T.A. Després de rentar dos cops amb PBS/0,5% tween durant 7min cada rentat, es bloquegen els llocs rémanents durant 2h amb PBS que conté un 2% (w/v) d'albúmina sérica bovina (BSA; Sigma). 73 3. PROTOCOLS 2/ Incubació sobrenedants i recta patró. Es renten els pous 4 cops i s'aplica per duplicat SOfil del sobrenedant de les línies o clons a testar. Com a recta patró es fa servir una barreja d'Igs humanes (9,760[ig/ml IgGs; 2,060(ig/ml IgAs; 0,730pig/ml IgMs; Dade Behring, Deerfield, USA) i com a controls se sembren 2 pous amb medi de cultiu complet i dos més amb PBS+BSA+sèrum normal de conill. Després d'incubar 4 h a T.A. es renten 4 cops amb PBS/tween. 3/ Reconeixement pel segon anticòs i revelat. S'utilitza un anticòs de conill contra Igs humanes biotinat (Jackson) ressuspès en PBS que conté un 2% BSA i un 5% de sèrum normal de conill i s'incuba durant 1 hora a T.A. Després de 4 rentats de 5min cadascun s'incuba amb estreptavidina-PO (Southern Biotechnology, Birmingham, U.S.A.) ressuspesa en PBS/BSA 2% 20min i es tornen a rentar 4 cops. La reacció es revela s'afegint el substráete comercial TMB (Sigma) i es llegeix l'absorvància a 600nm. La reacció s'atura afegint H2S04 2N i es torna a llegir l'absorvància a 450nm. 3.14.2 ELISA per quantificació de Tg / de TPÒ en sobrenedants S'utilitza una modificació dels kits comercials d'Immunowell en els que les plaques d'ELISA han estat prèviament sensibilitzades amb antigen i bloquejades. I/ Incubació sobrenedants i recta patró. S'atemperen les plaques a T.A. durant 20min i s'apliquen a cada pou i per duplicat 50^1 del sobrenedant de les línies o clons a testar. Com a recta patró es fa servir dilucions seriades 1/2 d'un sèrum humà (del mateix kit) amb anticossos anti-Tg o anti-TPO positius a concentració coneguda i com a controls negatius se sembren 2 pous amb medi de cultiu d'hibridomes complet, dos més amb PBS+BSA+sèrum normal de conill i 2 pous més amb el control negatiu del kit comercial. Després d'incubar tota la nit a T.A., es renten 3 cops de Smin amb PBS/0,05% tween. 2/ Reconeixement pel segon anticòs i revelat. S'utilitzen 50^1 d'un anticòs (1/10.000) de conill contra Igs(G+A+M) humanes conjugat amb AP (Jackson) ressuspès en PBS que conté un 2% BSA i un 5% de sèrum normal de conill i s'incuba durant 1 hora a T.A. Després de 3 rentats de 5min, la reacció es revela s'afegint el substráete comercial TMB i es llegeix l'absorvància a 600nm. La reacció s'atura afegint 50^1 de H2S04 2N i es torna a llegir l'absorvància a 450nm. 3.14.3 ELISA per quantificació de CXCL12 en sobrenedants El disseny d'un ELISA per a la determinació dels nivells de CXCL12 en el sobrenedant de cultius de cèl·lules epitelials tiroïdals i de la línia cel·lular tiroïdals HT93 s'ha fet amb la col·laboració de la Dra. T Gallart (Servei d'Immunologia, l'Hospital Clínic de Barcelona). I/ Sensibilització de la placa i bloqueig. La placa se sensibilitza amb 100ng/ml d'anticòs contra el CXCL12ct humà (R&D, Minneapolis, Minnesota) diluit en PBS durant 2 hores a 4°C. Després de rentar la placa dos cops amb PBS/tween 0,05% durant 7min cada rentat, es bloqueja durant tota la nit a 4°C en una solució de PBS amb un 2,5% de BSA. 2/ Incubació sobrenedants i recta patró. S'elimina l'excés de solució de bloqueig rentant tres cops amb PBS/tween 0,05% durant 7min cada rentat i s'apliquen els sobrenedants dels cultius cel·lulars a raó de SOfil/pouet. La recta patró per la quantificació de CXCL12 es fa per dilucions seriades a la meitat de CXCL12a recombinant (PeproTech, Rocky Hill, New Jersey) d'entre 200 i 0,39ng/ml. Les mostres i la recta patró s'incuben a T.A. 4 hores (o tota la nit, si s'escau). 3/ Reconeixement pel segon anticòs i revelat. El CXCL12a soluble es detecta amb un anticòs anti-CXCL12-biotina humà després d'incubar 1 hora a T.A. L'ELISA es revela després de fer dos rentats, incubar 20min a temperatura ambient amb estreptavidina-PO i afegir TMB com a substráete. Les concentracions finals es llegeixen a 450nm i a 600nm després d'aturar la reacció de revelat amb 50(J de 2N d'H2S04. 74 3. PROTOCOLS 3.15 ASSAJOS DE QUIMIOTAXI Els assajos de transmigrado s'han dut a terme en plaques de transwell de 5^m de mida de porus (Corning, Corning, NY), per triplicat o per duplicat en funció del nombre de cèl·lules disponibles. S'han utilitzat limfòcits T i B tant de sang perifèrica com intratiroïdals, separats prèviament per separació cel·lular (sorting, apartat 3.13) en funció de l'expressió de CD3 i CD19 respectivament. 3.15.1 Quimiotaxi amb limfòcits intratiroïdals S'ha dut a terme per tal de demostrar la funcionalitat dels receptors de quimiocines CXCR4 presents en els limfòcits T i B que infiltren les glàndules amb autoimmunitat tiroïdal. El protocol experimental ha estat el següent: s'han dipositat de 3 x 104 a 105 cèl·lules CD3+ o CD19+ ressuspeses en 100^.1 de medi complet amb un 2% de sèrum boví fetal a la cambra superior de la placa de transwell. A la cambra inferior s'hi ha dipositat medi de cultiu amb la mateixa concentració de sèrum boví fetal però que conté concentracions variables de CXCL12 humà (R&D Systems) de 10ng/ml fins a 1000ng/ml. Després d'incubació a 37°C en una atmosfera amb 5% COa durant 4 hores, s'han recuperat les cèl·lules migrades a la cambra inferior i s'han comptat el nombre de cèl·lules utilitzant esferes magnètiques (Flow-CountTM Fluorospheres; Coulter, Miami, FL) seguint les indicacions d'ús. Els experiments s'han repetit tres cops i en cadascun d'ells s'ha inclòs un duplicat en el que no s'ha afegit CXCL12 al medi per tal de calcular la migració espontània i un duplicat en el que les cèl·lules han estat prèviament incubades durant 30min amb 20ng/ml d'anticòs anti-CXCR4 (12G5) per demostrar l'especificitat de la migració via CXCL12. 3.15.2 Quimiotaxi amb limfòcits de sang perifèrica La finalitat d'aquest assaig ha estat demostrar la capacitat de secreció de CXCL12 per part dels tiròcits (i de la línia cel·lular HT93) en cultiu estimulats amb citocines proinflamatòries. Per a això, l'única variació respecte el protocol descrit anteriorment és que la cambra inferior de la placa de transwell s'ha omplert amb el sobrenedant del tiròcits o d'HT93 estimulats amb ILlß, IFNy o TNFcc (a 200, 500 o 500IU/ml respectivament). Donat que la cinètica de producció de CXCL12 per part dels tiròcits i de les HT93 és molt similar i el pic de producció de la quimiocina se situa al voltant de les 6 hores d'estímul, els assajos de quimiotaxi s'han dut a terme amb aquests sobrenedants. En ambdós protocols, els índex de migració s'ha calculat com a quocient entre la mitjana de les cèl·lules que han migrat en cada condició i la mitjana de cèl·lules migrades espontàniament. 3.16 REACCIÓ DE TÚNEL (TDT-MEDIATED oUTP NICK-END LABELING ASSAY) És una tècnica que permet la detecció de cèl·lules apoptòtiques en fase avençada de mort cel·lular programada i que permet distingir aquest fenomen de la necrosi. Es basa en una reacció enzimàtica mediada per l'enzim TdT, que incorpora nucleòtids marcats en l'extrem 3'-hidroxiterminal del DNA genòmic. S'ha realitzat sobre seccions de criòstat de 4jim i de parafina de tiroides que contenen centres germinals usant un kit comercial (In situ cell death detection; Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) i sobre seccions de timus i d'amígdala humans utilitzats com a substrat de referència de la reacció. 3.16.1 Seccions fixades rehidratació i incloses en parafina. Desparafinat i Prèviament a la reacció d'hibridació, les seccions se submergeixen en xilol i en successius banys d'alcohols amb concentracions creixents d'aigua seguint el mateix protocol que a 75 3. PROTOCOLS l'apartat 3.9.2.2. Un cop hidratáis, se submergeixen en PBS lOmin i s'incuben en 200jal de PBS que conté 20>g/ml de proteïnasa K (Sigma) de 5 a 15min (segons el substrat) a T.A. per tal d'eliminar proteïnes i enzims que puguin interferir a la reacció. 3.16.2 Seccions de críòstat. Fixació i permeabilització Les seccions de 4^m s'assequen durant 30min, es fixen en un bany de PBS/ paraformaldehid al 4% a 4°C durant 20min i es renten en agitació intensa durant 20min a T.A. en PBS. La permeabilització es fa amb una solució que conté 0,1% de Tritó X-100/ 0,1% de citrat trisòdic durant 6min en gel i posteriorment s'elimina l'excés de solució rentant dos vegades de 10min en PBS. 3.16.3 Reacció TÚNEL, revelat i contratinció La reacció d'hibridació s'ha fet a 37°C en cambra humida durant 4 hores seguint les instruccions del fabricant en un volum final de SOjo.! que conté la concentració adequada de TdT i dNTPs, un dels quals s'ha substituït per dUTP-FITC. Després de dos rentals de lOmin en agitació intensa a T.A. en PBS, els dUTP-FITC incorporats s'han detectat per incubació durant 30min amb un antisèrum contra FITC conjugat amb fosfatasa alcalina. El substráete cromogènic, compost per Tris-CIH 0,1M pH 8,2, que conté naftol fosfat (Sigma) al 0,02% (w/v)/ 0,2% dietilformamida (v/v) es barreja amb fast-red (Sigma) al 0,1% (w/v) i es filtra directament sobre les seccions. Quan la reacció colorimètrica ha tingut lloc (entre 5 i 15min), es renten les seccions durant 5min en PBS i es contratenyeixen en hematoxilina de Mayer (Merck&Co., U.S.A) durant 30 segons. S'elimina l'excés d'hematoxMina amb aigua que contingui ions i les seccions se submergeixen en PBS 3min fins a muntar-los en medi Fluoprep i observar-los al microscopi amb llum visible. Els controls negatius inclouen tots els apartats anteriors excepte l'addició de TdT a la reacció d'hibridació. S'han considerat cèl·lules apoptòtiques aquelles que presenten un nucli condensat picnòtic amb tinció vermella restringida al nucli i citoplasma blau d'aspecte intacte. S'ha fet un recompte dels nuclis apoptòtics utilitzant el programa Openlab, i s'ha estudiat la seva distribució en funció de la localització al mantell fol·licular (MZ), al centre germinal (GC) o a l'exterior del fol·licle limfoide. Els resultats s'expressen com a nombre de nuclis positius per mm2 i s'han comparat amb els detectats als òrgans limfàtics utilitzats com a referència. 3.17 OBTENCIÓ DE DNA GENÒMIC 3.17.1 Preparació del DNA genòmic El DNA genòmic s'ha preparat a partir de botons cel·lulars congelats en IM2 i conservats a -70°C o de cèl·lules en cultiu. El mètode usat és una modificació del protocol de "salting out" que consisteix a Misar les cèl·lules en solució TEN 8 (0,1M NaCI, lOmM EDTA pH 8,0, 20mM Tris pH 7,5, 12u/mg proteïnasa K) a raó de 500^1 de solució per cada 107 cèl·lules. S'incuba de 2 a 3 hores a 55-60°C fins que el lisat quedi homogeni i es desproteïnitza amb KAc 1,5M agitant vigorosament durant 15 segons. S'afegeix 1 volum de cloroform¡soamilalcohol (49:1), es barreja per inversió, se centrifuga (2500rpm 15min a 4°C) i es recupera la fase aquosa on es troba el DNA. Aquest es precipita amb 2-2,5 volums d'etanol absolut barrejant per inversió fins que s'observa la malla de DNA que es pot recuperar, rentar amb etanol al 70% fred i recuperar per centrifugació (2500rpm 5min a 4°C). S'asseca i es ressuspèn amb un volum adequat d'h^O autoclavada o de TE (lOmM Tris, ImM EDTA). Les mostres de DNA es conserven a -70°C i se'n separa una petita quantitat per calcular la concentració, puresa i integritat. 76 3. PROTOCOLS 3.17,2 Càlcul de la concentració i de la puresa i integritat del DNA La concentració ï la puresa de les preparacions es determina per espectrofotometria amb lectura a 230nm, 260nm, 280nm i 320nm d'una dilució del DNA total obtingut. La concentració (en jig/nl) es calcula amb la fórmula: (A260 x 0,064 - A280 x 0,031) x factor de dilució. El quocient A230/A260 s'utilitza com a índex de lectura de sals i es considera correcte quan està entre 0,4 i 0,6. La relació A260/A280= a 0,8 o superior es fa servir com indicador de la puresa adequada i la lectura a A320 com a presència d'anells aromàtics que interfereixen la lectura a 260nm. La integritat del DNA es comprova mitjançant una electroforesi en gel d'agarosa al 0,8% i es considera no degradat quan la banda és de pes molecular alt i no s'observa bandejat tènue de fons i de pes molecular inferior o la imatge en escala típica de les cèl·lules en apoptosi. 3.18 OBTENCIÓ o'RNA TOTAL i RETROTRANSCRIPCIÓ Els RNAs totals cultius cel·lulars cultiu, blocs de l'homogenització s'han obtingut a partir de diferents substractes cel·lulars (botons de primaris q de línies cel·lulars transformades congelats, monocapes en teixit de congelació, microdisseccions de teixit) que han condicionat i tipus de lisi inicials. 3.18.1 Microdissecció dels f oí-lides lim f oïdes tiroïdals Per tal d'estudiar l'expressió de molècules directament relacionades amb l'estructuració/funció dels fol·licles limfoides canònics (RAGI i RAG2) s'ha fet una extracció d'RNA restringida a aquestes estructures mitjançant una microdissecció de la zona d'interès. Així, a partir de la identificació dels LFs en una secció de congelació de tiroides de 4^m tenyida amb H/E, s'han obtingut entre 4 i 10 seccions consecutives més de 20jim sense tenyir en les que s'han escindit els LFs sota un estereomicroscopi (SV8, Zeiss). Les seccions de tiroides en les que no s'han identificat fol·licles limfoides ectòpics s'han utilitzat com a control negatiu i s'han processat seguint el mateix protocol. 3.18.2 Purificació de l'RNA total El protocol és una modificació que té com a base el mètode de Chomczinsky462. Els botons cel·lulars congelats (de 105 a 106 cèl·lules sense descongelar) es ressuspenen amb una barreja 1:1 de solució desnaturalitzant (isotiocianat de guanidina 4M/ acetat sòdic 50mM pH 4, 0,5% N-lauril sarcosina sódica i 4% de 2ßmercaptoetanol lOOmM) i fenol àcid saturat amb aigua a una relaqó aproximada de 2ml de solució per 107 cèl·lules. S'homogenitzen amb pipeta i es deixen 5min en gel per dissociar els complexes nucleoproteics. S'hi afegeixen 0,2 volums de cloroformisoamilalcohol (49:1) i es barreja per inversió durant 30 segons. S'incuba 15min en gel i tot seguit se centrifuga (10000g 30min a 4°C) i es recupera la fase aquosa on es troba l'RNA. Aquest es precipita amb 1 volum d'isopropanol durant 4 hores a -20°C (o alternativament durant 1 hora a -70°C) i s'obté l'RNA centrifugant a lOOÒOg a 4°C durant 30min. El pellet d'RNA es renta tres vegades amb etanol 75% fred, s'asseca i es ressuspèn amb un volum adequat d'H2O-DEPC (H2O destil·lada tractada durant una nit amb dietilpirocarbonat al 0,1% (Sigma) a 37°C i autoclavada). Les mostres d'RNA es conserven a -70°C. Quan la quantitat inicial de cèl·lules per l'extracció no supera 106 cèl·lules, en la precipitació s'afegeixen 0,4 jimol/L de glicogen (BoehringerMannheim). Quan la mostra prové de monocapes de cèl·lules en cultiu (primari o línies transformades} s'han introduit diverses modificacions: I/ la solució desnaturalitzant s'afegeix a la monocapa (prèviament lliure de sèrum boví fetal) a raó de 2ml per 75 mm2 després d'haver-la rentat amb PBS. 2/ El protocol d'extracció és el mateix però el pellet d'RNA es ressuspèn amb 0,5 volums del volum inicial de solució desnaturalitzant 77 3. PROTOCOLS \ es fa una re-extracció d'RNA. Es precipita amb 1 volum d'isopropanol a -20°C durant 16 hores i es recupera el pellet per centrifugació. Quan l'extracció d'RNA es fa a partir de blocs de teixit congelat d'aproximadament 0,5cm3 de volum: I/ el volum de solució desnaturalitzant s'augmenta a 4ml/cm3 de teixit i s'homogenitza en un homogenitzador elèctric en fred. 2/ Es fa una segona purificació de l'RNA ressuspenent-lo per segon cop amb Iml de solució desnaturalitzant i reprecipitant-lo com s'ha descrit en l'anterior apartat. 3.18.3 Càlcul de la concentració i de la puresa i la integritat de l'RNA La concentració i la puresa de les preparacions es determina per espectrofotometria amb lectura a 230nm, 260nm, 280nm i 320nm d'una dilució de l'RNA obtingut. La concentració (en ng/i·il) es calcula amb la fórmula: (A260 x 0,045 - A280 x 0,031) x factor de dilució. El quocient A230/A260 s'utilitza com a índex de lectura de sals i es considera correcte quan està entre 0,4 i 0,6. La relació A26Q/A280=2 o superior es fa servir com a indicador de la puresa i la lectura a A320 com a presència d'anells aromàtics que interfereixen la lectura a 260nm. La integritat de l'RNA es comprova mitjançant una electroforesi en gel d'agarosa a l'l% en el que la mostra s'ha ressuspès en tampó desnaturalitzant (50% formamida, 5,4% formaldèhid, MOPS Ix), s'ha escalfat a 68°C durant lOmin i s'ha refredat fins a 4°C immediatament. L'RNA es visualitza a la llum UV per Unció amb bromur d'etidi utilitzant RNA ribosomal d'E.coli (Boehringen Mannheim) com a control de qualitat. Es considera que l'RNA està íntegre quan les bandes corresponents als RNAs ribosòmics presenten aproximadament una intensitat 2/1 en el ratio 28S/18S. 3.18.4 Eliminació del DNA genòmic S'ha fet en totes les mostres, donat que en un cas els encebadors utilitzats en l'amplificació posterior per PCR no s'han pogut dissenyar en diferents exons. Cada lOng de mostra s'han tractat amb una solució de 40^1 de Dnasa I (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suècia), 20U RNAsin, 5mM DTT, tampó Ix (50mM Tris-HCI, 75mM KCI, 3mM MgCI2 pH 8,3; Life Technologies) durant 30min a 37°C en un bany. L'RNA s'ha precipitat afegint un 10% d'acetat sòdic 3M, 2,5 volums d'etanol absolut i 0,5ng/ml glicogen (Boehringer Mannheim) durant 1 hora a -20°C. L'RNA obtingut per centrifugació a 10000g per 30min a 4°C s'ha rentat amb etanol 75% i s'ha ressuspès en H2O-DEPC. Després del tractament es torna a quantificar i comprovar la integritat de l'RNA. 3.18.5 Retrotranscrípció Després de desnaturalitzar 0,2-2jig d'RNA total i 20pmol d'oligo-d(T)18 (Pharmacia Biotech) a 68°C durant 5-8 minuts, s'afegeixen 40U/nl RNAsin (Clontech), ImM de cada dNTP (Life Technologies), 200U/ml transcriptasa reversa MMLV i tampó Ix (lOmM TrisHCI pH 8,8, 5mM MgCI2, 50mM KCI, Tritó X-100 0,1%; Promega) en un volum final de 10-20nl durant 1 hora a 42°C. La reacció s'atura elevant la temperatura durant 3min a 95°C. En algunes mostres, la retrotranscripció s'ha preparat utilitzant com a transcriptasa reversa la Superscript II (a raó de 100U/ng RNA) en 20fil d'una solució que conté: 0,01M DTT, tampó Ix (50mM Tris-HCI pH 8,3, 75mM KCI, 3mM MgCI2) i ImM de cada dNTP. En el cas de RAG2, la reacció de retrotranscripció s'ha fet amb el mateix encebador 3' que s'usa per la PCR. El producte final de la retrotranscripció s'ha diluit de 5 a 50 vegades en H20 o en TE i s'ha mantingut congelat. 78 3. PROTOCOLS 3.19 PCR, HIBRIDACIÓ AMB OLIGOSONDES ESPECÍFIQUES I SEMIQUANTIFICA CIÓ Aquesta tècnica s'ha aplicat a la detecció del missatge per RAGI, RAG2, LTcc, LTß, LTßR, IFNY, GAPDH i CXCL12 (en els estudis d'inducció d'expressió de la quimiocina per estimulació amb citocines inflamatòries). 3.19.1 Encebadors i oligosondes El disseny dels encebadors i de les oligosondes (taula X) (Sigma-Genosys) s'ha fet utilitzant el programa OLIGO, seguint els criteris que permetin una màxima especificitat a l'amplificació, en base a les seqüències dels corresponents cDNAs i DIMAg publicats. Els primers per amplificar GAPDH han estat dissenyats pel Dr. O. Domínguez. Un cop dissenyats, s'han comprovat l'especificitat utilitzant la base de dades FASTA. En tots els casos, excepte RAGI, els encebadors "sense" i "antisense" s'han dissenyat en diferents exons per tal d'eliminar la possibilitat de coamplificar DNA genòmic. 3.19.2 Comprovació dels cDNAs i normalització En els experiments en el que s'ha fet una semiquantificació dels amplímers obtinguts per PCR, per a,-poder comparar els resultats de l'amplificació entre les diferents mostres s'han normalitzat les quantitats de cDNA en funció de l'expressió del gen constitutiu GAPDH (gliceraldèhid fosfat deshidrogenase) considerat de mitjana expressió. Així, s'han fet dilucions seriades de cada mostra de cDNA i se n'han usat 2^1 de cada per amplificar amb primers específics per a GAPDH a 22 cicles (la reacció d'amplificació es troba a la fase exponencial). Per cada mostra s'ha escollit la dilució de cDNA que donava una intensitat de banda semblant a les altres mostres en un gel d'agarosa tenyit amb bromur d'etidi. La intensitat del senyal de les amplificacions dels gels s'ha quantificat mitjançant el programa Quantity-One en l'aparell Molecular Imager-FX (Bio-Rad, Hercules, USA). 3.19.3 Protocol de la reacció en cadena de la polimerasa S'amplifiquen entre 1 i 5^1 del cDNA d'interès en un volum final de 10-20^1 en una solució que conté 200mM de cada dNTP, l,5-2,5mM MgCI2, tampó Ix (lOrnM Tris-HCI pH 9, 50mM KCI, Tritó X-100 al 0,1%), 0,3nmol/l de cada encebador i 300mU de polimerasa Dynazyme™ II (Finnzymes Inc.,0y, Finlàndia). La reacció es cobreix amb una gota d'oli mineral per evitar evaporacions. Els protocols d'amplificació estan inclosos a la taula X. Les reaccions s'han fet per duplicat i com a controls negatius s'han inclòs: a/ un tub amb tots els reactius excepte cDNA i b/ un altre tub en el que el cDNA s'ha substituït per RNA sense retrotranscriure. 3.19.4 Electró f o resi i transferència I/ Electroforesi. El producte de PCR, al qual s'afegeixen la quantitat necessària-de tampó de blau de bromofenol 5x (10% Ficoll, 0,5% blau de bromofenol i 5M EDTA), es resol en un gel d'agarosa al 1-2,5% (en funció de la mida de l'amplímer) en tampó TAE Ix tenyit amb bromur d'etidi (0,4mg/ml) i s'analitza en un transil·luminador de llum ultraviolada. 2/ Transferència alcalina. Els amplímers de DNA es transfereixen per capil·laritat a una membrana de niló Hybond-N+ (Amersham, Buckinghamshire, UK) (prèviament equilibrada amb 20xSSC; (IxSSC: 0,15M NaCI, 0,013M citrat sòdic)) durant unes 16 hores, utilitzant com a tampó de transferència 0,4N NaOH quan la mida de l'amplímer és inferior a 450bp. Un cop finalitzada la transferència, la membrana de niló es renta 20min amb una quantitat abundant de 20xSSC en agitació. Per amplímers de mida més gran, el gel s'ha tractat amb una solució 20xSSC i s'ha transferit amb aquesta mateixa solució (augmenta la retenció a membrana) i posteriorment s'ha desnaturalitzat durant 5min amb una solució 1,5M NaCI i O,5N NaOH. Després de neutralitzar la membrana amb 1,5M 79 3. PROTOCOLS NaCI, 0,5M Tris-HCI (pH 7.2) i ImM EDTA pH 7, s'ha fixat el DNA per irradiació amb llum ultraviolada (Stratalinker, Stratagene, San Diego, USA). La membrana es conserva seca a T.A. o s'utilitza directament en la pre-hibridació. 3.19.4 Hibridació 3.19.4.1 Marcatge de les oligosondes El marcatge terminal es fa durant 1 hora a 37°C utilitzant 15U de Polinucleòtid quinasa T4 (T4PNK, New England Biolabs, Beverly, USA) i la solució de marcatge que inclou ZOpmols d'oligosonda, tampó (70mM Tris-HCI pH 7,6, lOmM MgCI2, 5mM DTT) i ZOjiCi de (Y32P)-dATP (Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Suècia). Els nucleòtids radioactius no incorporats s'eliminen utilitzant columnes MicroSpin™ (Pharmacia) i es quantifica la radioactivitat incorporada amb un comptador de radiació ß. 3.19.4.2 Pre-hibridadó, hibridació i rentáis l/ Prehibrídació: La membrana equilibrada durant 10min amb un volum suficient de 2xSSC, es pre-hibrida amb una solució que conté 2xSSC, SxDenhardt's, SDS 1% i ssDNA (8,5^1 de DNA d'esperma de salmó a l'l%, l,5ml HCI 9,5M deixat 5min a T.A. i desnaturalitzat amb 3,5(xl NaOH 4M). La membrana es pre-hibrida a la temperatura d'hibridació (Th) adequada a cada oligosonda durant 1-4 hores en rotació suau contínua. 2/ Hibridació: s'afegeixen a la solució de pre-hibridació 106cpm/ml de l'oligosonda marcada i la membrana es manté hibridant en agitació contínua i suau durant 4 hores a la mateixa temperatura. 3/ Rentats i quantífícació: la sonda no incorporada s'elimina fent un rentat de 20min amb 2xSSC/l%SDS a T.A. en agitació enèrgica i un nombre variable de rentats de 20min des de la ta d'hibridació (augmentant cada cop 2°C) amb 2xSSC /1%SDS fins que desapareix el senyal d'hibridació inespecífica del carril que conté el control negatiu. L'anàlisi de la membrana es fa per diferents mètodes: I/ s'exposa a una pel·lícula radiográfica Cronex x-ray film (DuPont) a -70°C durant un temps variable i l'autoradiografia s'analitza amb un escàner Scanjet II (Hewlett Packard) i el programa Scan Analysis (Biosoft, Cambridge, UK) o 2/ la membrana s'analitza directament en un Phosphorimager (Personal Molecular Image, BioRad) i el programa Quantity One. Taula X. Seqüències dels encebadors i de les oligosondes usats, condicions d'amplificació per PCR de les diverses molècules d'estudi i mida de l'amplímer obtingut. 80 ï m oc "¡5 u v. •à § s c ^ 01 U) u JQ ^^ 03 kO (J ^ O 5^ LO O Cl O >o 0 . Lo + 2. p1 xco 0^ sa y oo ?5 Cl C-x v- LO |? N Jx, U LO o »-t ,£-BV3V3V33J-W333V3J.V3V33J.V-,Sasuasi ,£-J.V33J_V33V3VOV33V3VJLV3V3V3-,S asu, Z ,* o & V. ,cr g oi 5 QJ W P encebadors í oligosondes c Q» 1 o 0 0 p c* O to b 01 LO 01 K X oo r>j U U X_LO U* 3 LO U Q £4rG-3' ß ' (Vj ^ LO K ^ O O g. U ^_ P i ^ antisense 5'- ACTGACCCACGGCTCCAC-3' \ oligosonda 5'-GGCGATGCGGCTGATGGT-3' 0 O b 0? ense S'-ATTACCCACCTCTCACCTCTCCCCT-S' X 0 5 01 LO o to o OM K y s ^ O s y s 1 y K. y k "*--* 5 LO o hv VÛ o Q^ i § O í/sense S'-GCTGTTCTATCCCCTTCCATTCTCT-S' oligosonda S'-CCAGCCCAGCCCCCA-S' (J 0 X 0\ 00 IN + sense 5'-GGTGCCTCCGTGTGCGTC-3' i *"< f\ U to - o u N b „^ ! 00 «3 Q_ " 5^ i antisense 5'-GGGGACGCAGTGGTTGTT-3' o O^ Lo ^ + oligosonda S'-TTTTCCTGGTCCCTTGCA-3' v-rf f K LO >< ro OI sense 5'-GTTTTGGGTTCTCTTGG-3' Î2 o *~^ o ^ a o b o» o o +$ 10 O °* Í , o LO "^ b LO LO Q. J3 antisense S'-CGGGCTACAATCTGCAGG-S' oligosonda S'-TGCCTCAGCGACGGG-3' 0? o O ÎO OÎ X LO U ^ K 01 y R b ü U O ^° 0 ^.Q tí? -( 00 i?" sense 5'-A4GGC/lGrG^rGG/íGGGG-3' o + CT\ J^ i °° 00 01 .N s** c^. antisense 5'-CTGGGCTGGTTTCTGTGG-3' LO LO ^ U + o ¡N b i ; oligosonda S'-CTTGGTTCCTGCTTCCG-S' U 'O °o O O ÎS W to R! O Q o o o LO LO oi U + vv- ^}- ~^~ LO U ^ o 5^-Lo Lo 01 ^^ *"< 0 O «3 Slr^ fn sense 5'-CGACATCTCTGCnCTC-3' x^ K y N^ u "^ S *-> b I LO LO *-< Q. J3 P JN rN ^ V" LO antisense 5'-ACTTCCATCATTCTTTG-3' . vj o ¡N N + oligosonda S'-ACAACCATTCCCACGG-3' 5 Q LO LO ^ vo O o p o Q qj to U S ^1 fN *~4 V + R 00 01 ^ c Q_ b *¿ 3, PROTOCOLS 3.20 PCR QUANTITATIVA EN TEMPS REAL És una reacció d'amplificació convencional a la qual s'hi incorpora: a/ un agent intercal·lant que s'uneix inespecíficament al DNA de doble cadena, o b/ una oligosonda o sondes marcades amb fluorocroms. L'amplificació es monitoritza mentre té lloc la reacció mitjançant la detecció dels nivells de fluorescencia incorporada en l'amplimer generat. L'agent intercal·lant que hem utilitzat en aquest treball és el SybrGreen 1, que té el seu espectre màxim d'absorció-emisió de fluorescencia a 497nm i es llegeix al canal FI de l'equip LightCyclerTM (Röche, Mannheim, Germany). La monitorització contínua del procés fa que no només se n'observi el resultat final (quantitat total d'amplimer generat) sinó que també s'obté informació de la cinètica del procés. Aquesta cinètica descriu una corba sigmoidal, que en funció de la quantitat inicial de motlle d'amplificació comença en cicles més primerencs o tardans. Així, per comparació amb un banc de dilucions d'estàndards de la mateixa molècula a concentracions conegudes, es pot conèixer el nombre de molècules en la mostra d'interès. Aquesta aproximació s'ha aplicat a la comparació de l'expressió de CXCL12, CXCL13, CCL21 i CCL22 en les tiroides autoimmunitàries amb i sense fol·licles limfoides i amb les tiroides sense autoimmunitat. 3.20.1 Disseny dels oligonucleòtids Donat que una de les restriccions en la quantificació del producte amplificat mitjançant incorporació de SybrGreen 1 és la mida de l'amplimer, els encebadors 5' i 3' s'han dissenyat en dos exons consecutius i a una distància no superior als 350bp i són els que es troben llistats a la taula X. 3.20.2 Generació dels estàndards S'han obtingut a partir de timus i amígdala palatina humans i de PBLs en cultiu estimulats amb PHA. Els productes d'amplificació s'han generat mitjançant una PCR convencional a partir de 2^1 de cDNA i s'han usat els mateixos encebadors i condicions d'amplificació llistats a la taula X. La quantificació del nombre de molècules s'ha fet en gel d'agarosa per dilució seriada de l'amplimer (entre 10: i 107) i comparació amb les bandes de concentració conegudes de mida similar dels marcadors de pes molecular X174 (Hae III) i ((»A. (Hind III) (Biotools, Edmonton, Canadà). 3.20.3 Reacció d'amplificació Les reaccions d'amplificació dels estàndards i de les mostres a quantificar s'han dut a terme en una LightCycler (Roche) en lOjxl de volum final utilitzant una barreja (master mix) que conté 4mM MgCI2, 0,5-0,3mM cada encebador, 1^1 de LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche) i 1-3^1 del cDNA a quantificar (o de l'estàndard). Genèricament l'amplificació consta de quatre fases que s'especifiquen per a cada molècula a la taula X. Breument consten de: I/ desnaturalizado hot start a 95°C durant 10min; 2/ ciclat, que consisteix en 35-55 cicles de (desnaturalització a 95°C 30 segons, annealing a 55-65°C 10 segons i extensió a 72°C 15-20 segons); 3/ corva de melting que inclou (desnaturalització a 95°C 30 segons, annealing a 50-60°C 30 segons, augment ràpid a 70°C durant O segons a una velocitat de transició de 20°C/segon i un augment lent de temperatura fins a 95°C a una velocitat de transició de 0,05°C/segon i en adquisició de fluorescencia contínua); 4/ refredament lent a 35°C. Les variacions de temperatura d'annealing responen a les característiques pròpies dels encebadors utilitzats i els temps d'extensió s'han triat en funció de la mida de l'amplimer. 82 3. PROTOCOLS 3.20.4 Sensibilitat i reproducíbilitat de l'amplificació La sensibilitat, definida com el nombre mínim de còpies o de molècules détectables, s'ha calculat amb els valors dels estàndards, que s'han utilitzat en cada determinació en dilucions seriades 1/10. La sensibilitat establerta per a cada molècula és la següent: CCL21, 249 molècules; CXCL12, 14 molècules; CXCL13, 150 molècules; CCL22, 3600 molècules. En funció d'aquests paràmetres, les quantificacions inferiors a la sensibilitat mínima establerta s'han conderat com: CCL21, 248 molècules; CXCL12, 13 molècules; CXCL13, 149 molècules; CCL22, 3599 molècules. La reproducibilitat dels experiments s'ha establert tant amb els estàndards com amb les mostres. En els primers s'ha obtingut en cada experiment una recta de regressió entre el logaritme de la concentració de la mostra (nombre de molècules) i el cicle en què l'amplificació d'aquesta comença a ser exponencial (crossing point). S'han acceptat només les rectes de regressió ¡guals o superiors a -0,98 i només s'han comptabilitzat aquelles determinacions en què la desviació estàndard de la quantificació sigui inferior al 5% de la mitjana de les quantificacions. A la figura 18 es mostren les corves d'amplificació i de melting dels estàndards per a cada molècula amplificada mitjançant aquest sistema de quantificació. 3.20.4 Quantificació del nombre de molècules i del nivell d'expressió de les quimiocines La quantitat de molècules d'interès s'ha calculat en la fase d'amplificació/quantificació amb una mesura puntual de fluorescencia mitjançant el mètode de la segona derivada (dF/dT) després d'haver-se confirmat l'especificitat de l'amplificació pel perfil de la corva de melting. Les mostres i els estàndards per la determinació de l'expressió de les quimiocines s'han fet per quadruplicat en quatre assajos independents i per l'expressió de GAPDH s'han fet per sextuplicat en tres assajos independents. L'abundància relativa de cada quimiocina s'ha calculat normalitzant la mitjana dels valors del nombre de còpies de quimiocina en cada mostra (meanCHEMMOsTRA) amb la mitjana dels valors de la GAPDH corresponent (meanGAPDHMosTRA) corregida per l'abundància del missatger de GAPDH a ('amígdala palatina (PT) presa com a teixit de referència i expressada en unitats arbitràries. La fórmula aplicada per a cada mostra és: (meanCHEMMosTRA) x (meanGAPDHPT) expressió de quimiocina per mostra = (meanCHEMp-r) x (meanGAPDHMosTRA) El nivell d'expressió de les quimiocines a cada mostra s'ha calculat definint una "unitat de quimiocina" interna com a: nombre de molècules de CHEM 1 unitat CHEM = nombre de molècules de GAPDH Així, els resultats finals es mostren com a nombre d'unitats de quimiocines i s'expressen com a: 1 molècula de CCL21/ 2,86 molècules de GAPDH; 1 molècula de CXCL12/ 549,51 molècules de GAPDH; 1 molècula de CXCL13/ 2,41 molècules de GAPDH i 5,55 molècules de CCL22/ 1 molècula de GAPDH. 83 3, PROTOCOLS CCL21 CXCL12 CXCL13 i I. ,3 sensibilitat 249 m mida 238 bp sensibilitat 14 m mida 151 bp CCL22 sensibilitat 150 m mida 255 bp Fig. 18 Corves d'amplificació i corves de melting dels estàndards en concentracions decreixents 1/10 per a les quimiocines CCL21, CXCL12, CXCL13 i CCL22. A la part inferior de cada parell de gràfiques s'indiquen la sensibilitat de l'amplificació i la mida de l'amplímer resultant en parells de bases. Les mostres representades en color vermell corresponen als controls negatius. sensibilitat 3600 m mida 672 bp 3.21 ANÀLISI DE LA LONGITUD DEL CDR3 És una tècnica basada en la variabilitat de la longitud del CDR3 (hypervariable antigenbinding complementarity determining region) degut al procés de reordenament dels diferents segments génies que constitueixen les cadenes de les immunoglobulines. Aquesta aproximació s'ha utilitzat en l'estudi de la clonalitat de les línies de cèl·lules B intratiroïdals híbrides amb la línia F3B6. Per aplicar-ho s'ha assumit que cada línia clonal expressarà un únic fragment CDR3 que, amplificat per PCR i analitzat a la LightCycler (utilitzant com a sistema de detecció la incorporació de SybrGreen) emetrà un únic pic de fluorescencia en la corva de melting. Els encebadors usats (InVivoScribe Technologies, San Diego, USA) són una barreja de 6 oligonucleòtids en l'extrem 5' que reconeixen zones conservades del fragment FR3 (framework region 3) de les regions variables i un oligonucleòtid 3' que reconeix específicament una zona consens de la regió JH. 3.21.1 Optimització, precisió i reproducibilitat de l'anàlisi de la corva de melting Optimització. En primer lloc s'ha optimitzat la concentració de Mqz+ mínima necessària (testada entre 4mM i ImM) per obtenir un únic pic d'amplificació i reduir la formació de 84 3. PROTOCOLS dímers d'encebadors i s'ha establert en ImM CI2Mg (figura 19). La temperatura d'annealing s'ha testat entre 50 i 65°C i s'ha establert com a definitiva la més elevada. També s'ha testat el nombre de cicles necessaris per amplificar el fragment CDR3 utilitzant lOOng de DNAg de les línies cel·lulars humanes Namalwa i Daudi i lOOng de DNAg de PBLs i comparant després de la PCR l'alçada del pic de -dF/dT entre mostres i amb el dels PBLs. S'han trobat diferències en l'eficiència d'amplificació quan s'ha treballat entre 30 i 40 cicles, però un increment del nombre de cicles a partir de 40 no millora l'eficiència de l'amplificació, és a dir, l'alçada del pic -dF/dT deixa d'augmentar. Precisió i reproducibilitat. S'ha estudiat utilitzant diferents motllos: a/ 200ng o lOOng de DNAg de Namalwa o de Daudi; b/ lOOng de DNAg de Namalwa mesclats amb lOOng de DNAg de Daudi; c/ lOOng de cDNA de Namalwa amb lOOng de cDNA de Daudi. S'ha repetit 5 cops la reacció d'amplificació en experiments independents i s'ha comprovat que per una mateixa mostra, la Tm de les reaccions se situa en 89,55±0,10 (mitjana±SD) i que una quantitat de DNAg motilo superior a lOOng no augmenta la quantitat d'amplímer obtingut sinó que inhibeix parcialment la reacció de PCR. Basant-nos en els anteriors-criteris, s'ha considerat clonal aquella mostra que presenta un sol pic d'amplificació i que la Tm del 90% de l'àrea del pic -dF/dT no presenta una variació superior a ±1°C (figura 19). 3.21.2 Condicions d'amplificació Les reaccions de PCR es duen a terme en capil·lars en un volum final de 20^1 de reacció que conté 14^1 d'IgH FR3 Master Mixture, ImM CI2Mg, 10% SybrGreen Master Mix, lOOng DNAg o cDNA. El prgrama de ciclat es divideix en el següents passos: I/ desnatura/tizado hot start a 95°C durant 10min; 2/ ciclat, que consisteix en 40 cicles de (desnaturalització a 95°C 30 segons, annealing a 65°C 10 segons i extensió a 72°C 15 segons); 3/ corva de melting que inclou (desnaturalització a 95°C 30 segons, annealing a 60°C 30 segons, augment ràpid a 70°C durant O segons a una velocitat de transició de 20°C/segon i un augment lent de temperatura fins a 95°C a una velocitat de transició de 0,05°C/segon i en adquisició de fluorescencia contínua; 4/ refredament lent a 35°C. 4mM MgCh 3mM MgCh 2mM MgCh ImM MgCh b " lOOng gDNA Nw 200ng gDNA Nw 200/73 gDNA PBLs lOOng gDNA Dd ZOOng gDNA Dd Tomparaütro (*C) Temperatura fC) Fig. 19 Optimització de les condicions d'amplificació del CDR3 mitjançant anàlisi de les corves de melting, a: Test de la concentració òptima de ClaMg en la que s'observen els pics d'amplificació inespecífics (interior del quadrat negre) formats per dímers de primers; b: Variacions en la proporció d'amplímer obtingut a partir de quantitats decreixents de dues mostres (Nw i Dd), cadascuna de les quals presenta una Tm diferent clarament identificable. Nw, Namalwa; Dd, Daudi. 85 3. PROTOCOLS 3.22 SEQÜENCIACIÓ DELS AMPLÍMERS DEL CDR3 3.22.1 Purificació de la mostra L'amplificació del CDR3 per a cada mostra s'ha dut a terme paral·lelament en un capil·lar en el que les condicions d'amplificació són equivalents (3.21.2), exceptuant l'addició de l'intercal·lant SybrGreen per tal que no interfereixi la lectura dels nucleòtids incorporats posteriorment en la reacció de seqüenciació. Els productes d'amplificació obtinguts se separen per electroforesi en un gel d'agarosa d'alta ressolució al 2,5% en IxTAE, es tallen les bandes i s'elueixen els amplímers amb columnes GFX (Pharmacia) seguint les instruccions d'ús. Aquestes breument consisteixen a: I/ incubar el bloc d'agarosa amb la quantitat necessària de tampó de captura del DNA durant 10min a 60°C fins a fondre l'agarosa; 2/ aplicar-ho a la columna que es manté Imin a T.A. i centrifugar 30 segons a 3000g; 3/ rentar la columna amb tampó de rentat (Tris-EDTA 10:1, etanol al 80%); 4/ centrifugar Imin a 3000g i 5/ eluïr la mostra amb 10^1 d'H20 centrifugant 3min a 3000g. 3.22.2 Seqüenciació de l'amplímer S'ha fet seguint el mètode de BigDye teminator (PE Applied Biosystems), que consisteix en la incorporació de dinucleòtids conjugats amb diversos fluorocroms. Així, 5^1 de DNA eluits, sense quantificar i coberts amb oli mineral, s'han sotmès a una PCR en un volum final de 10^1 que conté 2^1 de Terminator Ready Reaction Mix (TTRM, AmpMTaq DNA polimerasa, dinucleòsids, %dye terminators', tampó x 1) i ImM de l'encebador. La reacció se sotmet a 94°C 3min i 25-30 cicles de: 10 segons a 96°C, 10 segons a 55°C i 2min a 60°C i el producte de l'amplificació es precipita amb 0,lvol de KAc 3M, lOng de glucogen i 2,5 volums d'etanol absolut. S'incuba 10min en gel i se centrifuga 30min a 10000g. El precipitat es renta amb etanol al 75% i es ressuspèn en 25^.1 de tampó de seqüenciació o TSR (PE Applied Biosystems). Es desnaturalitza per incubado 3min a 95°C i s'analitza en un seqüenciador automàtic de sistema capil·lar (ABI PRISM™310, Applied Biosystems). L'encebador utilitzat en la seqüenciació (5'-CTGAGGAGACGGTGACC-3') s'ha dissenyat en una zona altament conservada en tots els segments génies de JH. Les seqüències s'han analitzat utilitzant el software MT Navigator PPC (PE Applied Biosystems) usant la base de dades ImMunoGeneTics datábase (IMGT, http://imgt.cnusc.fr). 3.23 OBTENCIÓ DE CÈL·LULES EUCARIOTES TRANSFECTANTS QUE EXPRESSIN LA PORCIÓ EXTRACEL·LULAR DEL TSHR HUMÀ 3.23.1 Obtenció de l'insert purificat Hem disposat de la porció extracel·lular (ECD, extracellular domain} del receptor de la TSH humà donada en el plasmidi pBlueScript II (SK+). L'ECD-TSHR s'ha obtingut per digestió amb la combinació dels enzims de restricció Kpn I/Xba I (Boehringer-Mannheim) a partir de 25ng de mostra en una reacció de digestió amb volum final de 50(il que conté 1% BSA, 40u Kpn I, 30u Xba I i tampó de digestió x 1. La reacció s'ha incubat durant 2 hores a 37°C i s'ha comprovat la digestió total del construct en un gel al 2% d'agarosa de baix punt de fussió (low melting acaróse). La banda de 2,3Kb corresponent a l'ECDTSHR s'ha tallat i eluit del gel amb columnes GFX i la quantificació del material recuperat s'ha fet en gel a I'l,5% d'agarosa amb dilucions successives de l'insert per comparació amb dilucions successives del marcador de pes molecular. 86 3. PROTOCOLS 3.23.2 Obtenció del plasmidi pcDNA3 3.23.2.1 Digestió i purificació del plasmidi pcDNA3 Digestió i purificació. S'ha linealitzat amb els enzims de restricció Kpn.I/Xba I pels quals aquest plasmidi té una diana de restricció única, que genera extrems cohesius. Aquesta s'ha realitzat a partir de lOOjag de pcDNA3 en 50jj.l de volum final que contenen tampó de digestió Ix, lOOu Kpn I, 60u Xba I i un 1% BSA. Després d'incubació durant 2 hores a 37°C, el producte de la digestió s'ha purificat utilitzant les columnes del kit GFX per tal d'eliminar els productes residuals (enzim, buffer...) i s'ha eluit en H2O. Defosforil-lació. Per tal d'evitar la recircularització del plasmidi cal eliminar els grups fosfat que hagin quedat als extrems 5' resultants de la digestió utilitzant 10u/uJ de SAP (shrimp alkaline phosphatase). La reacció s'incuba durant una hora a 37°C seguida per una incubació a 70°C per inactivar Penzim durant 20min i finalment es fa una precipitació per purificar el DNA i es ressuspèn en un volum petit d'H2O. Un cop fet això, s'ha quantificat el pcDNA3 en un gel d'agarosa a Fl%, utilitzant dilucions seriades de la pròpia mostra i del marcador de pes molecular XHindIII (Sigma). .v r 3.23.3 Reacció de I ligado La reacció de lligació ha consistit a la incubació durant tota la nit a 16°C de: lOOng de pcDNA3 amb 125ng d'insert (ECD-TSHR) en presència de 400U de T4 DNA lligasa (New England Biolabs), tampó Ix (Tris-HCI 50mM pH 7.8, lOmM MgCI2, lOmM DTT, ImM ATP, 50 mg/ml BSA) en H2O en un volum total de 15^1. En el control d'autolligació s'han mantingut les condicions omitint l'insert i en el control de transformació s'ha utilitzat el vector sense linealitzar. 3.23.4 Transformació i obtenció de colònies Per a la transformació es mesclen 100^1 de cèl·lules competents One Shot™TOP10F' (Invitrogen) amb 3|j.l de producte de la lligació, es transfereixen a les cubetes d'electroporació i s'aplica un corrent elèctric de 1,8KV, 25}iF 200-400 ohm. Tot seguit s'afegeixen 10ml de medi SOC atemperat (triptona 2%, extracte de llevat 0,5%, NaCI lOmM, KCI 25mM, MgSO4 lOmM, MgCI2 lOmM, glucosa 20mM) i s'incuba Ih a 37°C en agitació orbital a lOOrpm (Gallenkamp Orbital Incubator). El producte de la reacció se sembra en una placa de Petri de medi LB/Agar (triptona 1%, extracte de llevat 0,5%, NaCI 1%, agar 1,5%), IPTG 0,24mg/ml i kanamicina 2mg/ml i es manté invertida 16-20h a 370C. 3.23.4.1 Anàlisi de les colònies obtingudes En funció del nombre de colònies crescudes, s'ha calculat que l'eficiència de transformació ha estat de 107 colònies/ng construcció. S'han seleccionat 30 colònies a l'atzar per fer el cribatge mitjançant una disrupció ràpida de colònies. Breument, el procediment experimental és el següent: es cultiven en 10ml de LB + kanamicina (50 mg/ml) durant la nit a 37°C i a 225 rpm. Abans d'iniciar l'extracció, es congelen 2 tubs de cadascuna afegint 200|al de glicerol a 800p.l de cultiu, es fa un vórtex i es guarden al congelador de -70°C. La minipreparació del DNA plasmídic s'ha realitzat utilitzant el kit ConcertTM High Purity Plasmid Purification Systems (GibcoBRL Products), que utilitza unes columnes amb una resina d'intercanvi aniònic que purifica el DNA plasmídic a un nivell teòricament equivalent a una doble purificació en gradient de clorur de cesi. Sota unes condicions salines moderades, el DNA plasmídic queda unit a la resina, mentre que l'RNA, les proteïnes, els carbohidrats i altres impureses són eliminades. El DNA plasmídic s'elueix amb altes concentracions salines. Posteriorment el DNA es precipita amb etanol i es ressuspèn en TE. Finalment es quantifica com s'ha descrit en apartats anteriors. 87 3. PROTOCOLS 3.23.5 Transfeccions estables S'han transfectat cèl·lules DAP-3 i cèl·lules 300.19 per electroporació. Per a això, les cèl·lules s'han mantingut en creixement exponencial durant dues setmanes fins arribar a un 50-80% de confluència. Les cèl·lules DAP3 s'han recuperat per "rascat" dels flascons de cultiu per evitar l'ús de tripsina. El protocol de transfecció estable ha consistit a mesclar 8 x 106 cèl·lules per condició ressuspeses en SOOjJ de medi de cultiu amb 40|u.g de la construcció ECD-TSHR/pcDNA3 linealitzada amb Pvu I, agitar-ho i incubar-ho durant lOmin en gel. Les condicions d'electroporació usades han estat: 280V, 960mF, 22,3mseg. Després d'incubar-ho lOmin més en gel, les transfectants s'han ressuspès en 15ml del medi de cultiu corresponent, s'ha fet un recompte (1,7 x 105 cèl·lules vives) i s'ha calculat la viabilitat (20% respecte la de l'inici; taronja d'acridina/bromur d'etidi). Les cèl·lules s'han sembrat en plaques de 96 pouets a raó de 11000, 5500, 2900 i 1450 cèl·lules per pouet i s'han mantingut durant dos dies en creixement amb medi complet sense selecció. A les 48 hores s'ha enretirat la meitat del medi i se n'ha afegit de nou amb una concentració final de geneticina (G418) d'lmg/ml. Les cèl·lules s'han seleccionat en funció del seu creixement i en funció de l'expressió en superfície del ECDTSHR. 3.24 ANÀLISI ESTADÍSTICA Els diferents tests estadístics s'han dut a terme amb els paquets estadístics Sigma Stat (Microsoft Corp. Seattle, US) i SPSS® 7.5 per Windows (Microsoft). Anàlisis bivaríants. Les dades amb distribució normal i no normal s'han analitzat respectivament amb els tests estadístics (Student T-test) per dades paramétriques i (Mann-Whitney) per no paramétriques. En algunes ocasions s'ha usat el coeficient de correlació de Pearson a les anàlisis bivariants. S'ha considerat estadísticament significatiu un nivell de significació del 5%. Anàlisi multivariant. S'ha usat una anàlisi discriminant amb imputació de les dades "missing" per càlcul de la mitjana o per regressió en una matriu de covariàncies conjunta. Aquest tipus de test s'ha aplicat a l'anàlisi conjunta de les dades corresponents a l'expressió de citocines, quimiocines i títols d'anticossos en dues poblacions en les que la variant de segregació és la presència/absència de fol·Iicles limfoides a la tiroide. Això s'ha dut a terme per calcular la combinació de variables que siguin capaces de predir la probabilitat de desenvolupament de centres germinals intratiroïdals en un 90% dels casos. 88 4. RESULTATS 4.RESULTATS CONSIDERACIONS PRÈVIES Prèviament a l'anàlisi dels resultats que es presentaran a continuació, és convenient tenir en compte algunes dades referents a les diferències entre la tiroïditis de Hashimoto (HT) i la malaltia de Graves-Basedow (GD) pel que fa als nivells hormonals perifèrics, els autoantígens involucrats en la resposta immunitària, el mecanisme de destrucció glandular, etc. La tiroïditis de Hashimoto és una malaltia de la tiroide resultat de la infiltració i la destrucció de la glàndula degut probablement a la presència d'autoanticossos bloquejants contra el receptor de la TSH, d'anticossos citotòxics i a l'acció directa d'alguns limfòcits T, mentre que la malaltia de Graves-Basedow és la conseqüència d'una hiperfunció tiroïdal per l'acció patogénica directa dels autoanticossos estimuladors contra el receptor de l'hormona estimuladora de la tiroïde. En ambdós casos s'ha demostrat una resposta tant cel·lular com humoral, però la diana principal de la resposta en la HT són la Tg i/o la'TPO mentre que a la malaltia GD la molècula contra la que té lloc la resposta humoral és el TSHR. Tot i amb això, les dues patologies comparteixen alguns trets comuns com una infiltració limfocitària glandular de limfòcits T i B, una incidència més elevada en les dones, una evolució perllongada en el temps, una localització més o menys restringida a la tiroide (amb excepció del greix retro-orbital en el cas dels malalts amb GD) i la presència de cèl·lules B intratiroïdals capaces de produir anticossos contra Tg i TPO in vitro. És per aquest motiu que s'han utilitzat paral·lelament com a models d'autoimmunitat organespecífica humana. És conegut que durant el desenvolupament inicial de les cèl·lules B al moll de l'os i després de la selecció que hi té lloc, hi ha cèl·lules B autoreactives que escapen a aquest procés i que són alliberades a circulació com a cèl·lules amb potencial autoreactiu. El paper que juguen el fol·licles limfoides secundaris en l'eliminació posterior d'aquestes cèl·lules sembla demostrat, però la generació ectòpica de fol·licles limfoides en teixits en els que té lloc un procés autoimmunitari (limfoneogènesi) no sembla que desempenyi la mateixa funció. Al contrari, i per analogia amb les infeccions, sembla que aquestes estructures contribueixin directament a la cronificació de malalties autoimmunitàries tant específiques com no específiques d'òrgan per generació constant de cèl·lules autoreactives en el lloc en el qual la concentració d'autoantigen sembla elevada. Per tal d'estudiar quin paper podria tenir el teixit limfoide terciari que s'estructura en les malalties autoimmunitàries de la tiroide, la part inicial del present estudi s'ha enfocat cap a una anàlisi d'aquest en l'infiltrat de les glàndules i, en particular, dels tipus de limfòcits B que en formen part. Paral·lelament s'hi han estudiat directa o indirectament els fenòmens propis dels fol·licles limfoides secundaris (com proliferació, apoptosi, reordenament, etc), l'especificitat antigènica de les ¡mmunoglobulines de superfície dels limfòcits B presents i finalment s'ha analitzat el paper de quimiocines/citocines i dels seus receptors en l'organització d'aquestes estructures. Com a conseqüència dels resultats obtinguts en el teixit diana de l'atac autoimmunitari, s'han extès els estudis a nivell perifèric i s'ha demostrat l'associació que té una infiltració selectiva de la tiroide amb la reducció dels nivells de receptors de quimiocines als limfòcits de sang perifèrica. En general, la intervenció quirúrgica que ha permès l'accés a les tiroides utilitzades en el present treball ha tingut lloc per fracàs terapèutic al que s'ha sotmès el pacient, per tant no hi ha una homogeneïtat absoluta pel que fa al temps d'evolució de la malaltia, al tractament rebut i a l'edat dels malalts. Per tal de minimitzar l'efecte que hagi pogut tenir això, el present treball s'ha dut a terme fonamentalment utilitzant un nombre elevat de glàndules humanes en diferents estadis d'evolució de la malaltia i s'han agrupat els resultats només quan el seu origen s'ha considerat comparable. 89 4.RESULTATS 4.1. DESCRIPCIÓ DE LES TIROIDES ESTUDIADES I DE LES GLÀNDULES CONTROLS 4.1.1 Estructura de l'epiteli i de l'endoteli glándulars Una de les diferències ja comentades a la introducció entre la HT i la malaltia de GD es la conseqüència que produeix la infiltració limfocitària en l'estructura macro i microscòpica de les tiroides després d'un procès autoimmunitari. 4.1.1.1 Malaltia de Graves-Basedow L'afectació de l'epiteli a la malaltia de Graves-Basedow (GD) varia en funció del grau d'evolució. En general, a nivell macroscopic, la glàndula es veu engrandida (figura 20), és més fibrosa i té més consistència que una tiroide no patològica. A nivell microscopic i utilitzant una tinció d'hematoxilina/eosina s'observa una disminució general de la llum dels fol·licles tiroïdals que en ocasions condueix a un col·lapse total i a una disminució del volum del col·loid. Els tiròcits mantenen la forma cüboidal característica però en molts casos incrementen la seva alçada (comparats amb els de l'epiteli d'una tiroide normal) i sovint s'observen les papil·les típiques de la malaltia. La desestructuració de la glàndula no és total, sinó que es tracta d'un fenomen molt focal que afecta determinades zones, de forma que una àrea amb infiltració limfocitària elevada pot coexistir amb zones lliures d'infiltració en les que l'epiteli no es veu afectat. En seccions de teixit i utilitzant tincions específiques per reconèixer epiteli (citoqueratina 8-18) o epiteli tiroïdal (tiroglobulina o peroxidasa tiroïdal), s'observa que els tiròcits són homogèniament positius per Tg (que a la vegada es detecta al col·loid) mentre que són heterogèniament productors de TPO, en funció de l'activitat glandular del moment. Usant preparacions citològiques obtingudes per digestió mecànica i enzimàtica de la tiroide sense cultiu previ, tenyides per tinció citoplasmàtica amb anticossos contra citoqueratina o contra TPO, es confirma aquest darrer punt (heterogeneïtat en la producció de TPO) i el conjunt de cèl·lules epitelials s'observa com dues poblacions en les que hi ha tiròcits positius i negatius per TPO. Després de cultiu durant 12-24 hores, les cèl·lules productores de peroxidasa tiroïdal deixen de sintetitzar-ne de forma que els tiròcits passen a ser una població única molt més homogènia amb una síntesi mitjana molt inferior a la fisiològica. Fig. 20 Estructura cel·lular tiroïdal de les glàndules amb tíroidopatíes autoimmunitàries. Les imatges d'a-f corresponen a glàndules amb malaltia de Graves-Basedow. i les imatges de g-l corresponen a tiroides amb tiroïditis de Hashimoto, a: Visió macroscópica d'una tiroide en la que s'observa un augment de mida respecte una tiroide normal; b: secció de congelació tenyida amb H/E on es mostren fol·licles tiroïdals que contenen col.loid; c: estructura microscòpica ampliada per observar l'engruiximent de l'epiteli i la formació de les papil·les típiques; d: distribució de l'epiteli tiroïdal identificat com a conjunt de cèl·lules tenyides positivament per citoqueratina (vermell) en una tinció contratenyida amb hematoxilina; e: ídem per a la identificació de tiròcits com a cèl·lules productores de tiroglobulina (marró); f: histogrames superposats en els que es mostra que l'expressió de peroxidasa tiroïdal (detectat amb un sèrum humà amb títols alts d'anticossos anti-TPO) en preparacions de tiròcits directament tenyits després de la digestió és màxim (TPO pre-cultiu, en vermell) i va minvant en preparacions post-cultiu (TPO post-cultiu, en verd). Als histogrames també es mostra la tinció amb sèrum humà normal (control -). Les microfotografies de g-l corresponen a malalts amb tiroïditis de Hashimoto per identificar les mateixes molècules i estructures. Les diferències entre ambdues malalties se situen bàsicament a nivell de mida de la glàndula (molt inferior a la malaltia de Hashimoto) i a nivell de mida de fol·licle tiroïdal que es veu molt réduit per la presència de l'infiltrat limfocitari. I: als histogrames, el contingut TPO pre-cultiu es mostra en verd i el post-cultiu en blau. Els augments utilitzats en cada microfotografia es mostren amb una línia horitzontal que en tots els casos equival a lOOnm. Les imatges a) i g) corresponen al capítol 21 sobre malalties de la tiroide publicat per la University of Kansas Medical Center. 90 4. RESULTATS malaltia de G raves-Basedow TPO post-cultiu l t] ITPO pre-cu/tiu L . . . tiroïditis de Hashimoto TPO post-cultiu TPO pre-cultiu lu1 ió1 iot io> 4.1.1.2 Tiroïditis de Hashimoto Macroscòpicament l'estructura de la glàndula es veu modificada molt més homogèniament que la dels Graves-Basedow donat que la destrucció tiroïdal no és un fenomen tan focal. En general, la consistència global de la glàndula és més fibrosa i de vegades s'observen àrees de necrosi. Microscòpicament, i en funció del grau d'evolució de la malaltia, en el Hashimoto (HT) hi ha una destrucció generalitzada de l'epiteli que, malgrat la infiltració massiva de limfòcits, dóna lloc a una disminució de la mida global de la glàndula. En alguns casos 91 4.RESULTATS l'abundància de l'infiltrat impedeix la detecció de tiròcits amb tinció d'hematoxilina/eosina (figura 20). L'epiteli rémanent, però, manté la funcionalitat i també la positivitat per citoqueratina i la síntesi de Tg i de TPO i s'observa una variació en la mida de l'epiteli i en la mida del fol·licle tiroïdal. En aquest treball es presenten dades de 10 tiroides amb HT: a/ un cas amb 6 anys d'evolució de malaltia amb títols d'autoanticossos sèries molt elevats i una glàndula totalment infiltrada, amb un contingut rémanent de tiròcits molt baix (HT1 o HT385); b/ 8 casos més en que la infiltració és moderada i es troben abundants zones on es distingeix sense dificultat l'arquitectura pròpia d'una tiroide (HT3-HT9); c/ una tiroide catalogada inicialment com a goll nodular (MNG) i posteriorment com a MNG amb signes de tiroïditis (HT2 o HT384), en la que el grau d'infiltració és molt baix i focal i no es detecten autoanticossos circulants en el malalt. 4.1.2 Descripció de l'endotelif percentatge d'infiltració composició de l'infiltrat leucocitari i distribució cel·lular 4.1.2.1 Descripció de l'endoteli limfocitària, Com a conseqüència de la hiperfunció, les glàndules amb autoimmunitat tiroïdal presenten un augment quantitatiu de la densitat de la xarxa capil·lar. En general, quan la tiroide està intensament infiltrada té una densitat elevada de vènules post-capil·lars (estructures endotelials positives per factor VIII, figura 21) distribuïdes uniformement, de les quals un percentatge petit són vènules d'endoteli alt (HEV), identificades com a CLA-1"1" (cutaneous-lymphocyte antigen-1) que es troben sobretot en les zones amb infiltració elevada i que permeten l'arribada dels limfòcits al seu través. En les àrees lliures d'infiltració limfocitària i en els teixits de les tiroides diagnosticades com a goll multinodular (MNG) o sense patologia tiroïdal coneguda, la densitat de vènules postcapil·lars sol ser elevada però no es detecten HEVs, de forma que l'endoteli d'aquestes tiroides és factor VIirCLA-r. 4.1.2.2 Percentatge d'infiltració limfocitària i distribució S'ha estudiat mitjançant dobles tincions (anti-CD45-FITC/anti-CD14-PE) per citofluorimetria en suspensions cel·lulars totals obtingudes per dispersió mecànica i digestió enzimàtica de les glàndules. El percentatge de limfòcits que infiltren les glàndules respecte la resta de tipus cel·lulars que la composen és variable i la distribució de l'infiltrat no és homogènia. Per aquest motiu, i depenent del mostratge que s'ha dut a terme, l'infiltrat pot oscil·lar entre el 5% i el 60% a la malaltia de Graves-Basedow i entre un 20% i un 85% a la tiroiditis de Hashimoto (figures 21d-g). Les variacions en els percentatges de cèl·lules infiltrants són degudes entre d'altres a la fase de desenvolupament de la malaltia, al període i el tractament farmacològic rebut i a la mostra tisular presa per a la determinació. La distribució de l'infiltrat leucocitari també s'ha estudiat en seccions de congelació i en seccions fixades i incloses en parafina. En els Graves-Basedow, els leucòcits que formen part de l'infiltrat tiroïdal tant difús com organitzat, es distribueixen zonalment, de forma que en les seccions es poden observar àrees lliures d'infiltració properes a fol·licles tiroïdals amb aspecte normal que conviuen amb àrees d'infiltració elevada on els fol·licles tiroïdals poden quedar col·lapsats i réduits respecte la seva forma habitual. A les glàndules dels malalts de Hashimoto la infiltració és massiva i distribuïda més uniformement, tant pel que fa a l'infiltrat difús com a l'estructurat (figura 21d). 4.1.2.3 La composició de l'infiltrat tiroïdal leucocitari Quantitativament, els tipus cel·lulars presents en l'infiltrat tiroïdal s'han estudiat després de purificació per gradient de densitat del limfòcits intratiroïdals o per adherència selectiva al plàstic en cultius de curta durada. Amb aquesta darrera aproximació se segreguen dels fibroblastes, macròfags, cèl·lules epitelials, endotelials, dendrítiques i 92 4.RESULTATS dendrítiques fol·liculars. Els limfòcits obtinguts s'han tenyit i analitzat en un citofluorímetre de fluxe (figura 21h-rrí). La composició de l'infiltrat és majoritàriament de cèl·lules T (entre el 40% i el 90% del total de l'infiltrat) i B (entre el 10% i el 60% del total de l'infiltrat) amb variacions quantitatives en funció de la patologia considerada. Així en els pacients amb malaltia de Graves-Basedow segueix la jerarquia: cèl·lules T CD4+ > cèl·lules T CD8+ > cèl·lules B > cèl·lules dendrítiques madures > macròfags, mentre que a les tiroïditis de Hashimoto està composta per cèl·lules T CD8+ > cèl·lules T CD4+ = cèl·lules B > cèl·lules dendrítiques madures> macròfags. El percentatge de cèl·lules dendrítiques madures (CD83+) i macròfags (CD14+), que és el que presenta més variabilitat, oscil·la entre el 10 i el 20% segons la patologia considerada. La quantificació de cada subpoblació de limfòcits infiltrants es veu dificultada per una disminució en la mediana de fluorescencia per a molècules com CD4, CDS, CD19 i d'altres respecte els seus equivalents en sang perifèrica. 4.1.2.4 Distribució dels diferents tipus cel·lulars La distribució dels diferents tipus cel·lulars és molt similar a les dues malalties i, en general, les cèl·lules T CD3+ i T CD4+ es poden trobar tant agrupades en zones d'elevada infiltració com disperses en el teixit entre els fol·licles tiroïdals, mentre que les T CD8+, B ÇD19+, DC CD83+ i CD14"1" solen ser més escasses i estar majoritàriament disseminades. És interessant comentar que els macròfags poden trobar-se a l'interior del col·loid de les zones amb infiltració limfocitària important. Fig. 21 Estructura endotelial, infiltració limfocitària i descripció de les poblacions leucocitàries a les tiroides autoimmunitàries. a, b: vénulas d'endoteli alt (HEVs) a diferents augments identificades com a estructures positivament tenyides per CLA-1 (cutaneous-associated lymphocyte antigen-1) en una tinció amb un anticòs secundari conjugat amb peroxidasa. Les HEVs es troben properes tant a zones d'elevada infiltració leucocitària com a fol·licles tiroïdals. c/ imatge de la destrucció del teixit tiroïdal i substitució per infiltrat difús en un malalt amb tiroïditis de Hashimoto; d-g: imatges de citofluorimetria representatives del percentatge d'infiltració limfocitària intratiroïdal, identificada com la població CD45+CD14", en dos digestions totals de tiroides en els que el grau d'infiltració és diferent i en els que s'observa la presència de cèl·lules grans autofluorescents corresponents als tiròcits; h-i: distribució de cèl·lules T CD3+ a l'infiltrat difús en una tinció amb anti-CD3-FITC sobre una tiroides d'un malalt amb Hashimoto i dot plot representatiu de la proporció del diferents tipus de cèl·lules T (CD4+/CD8+) en una finestra d'anàlisi en la que només es consideren les cèl·lules CD45+; j-k: cèl·lules B CD19+ en un malalt amb Graves-Basedow i dot blot representatiu de la proporció CD3+/CD19+ en una finestra d'anàlisi en la que només es consideren les cèl·lules CD45+; I: cèl·lules dendrítiques madures CD83+ distribuïdes aleatòriament en un infiltrat; m: macròfags CD14+ en l'infiltrat desestructurat no agrupats. Els augments utilitzats en cada microfotografia es mostren amb una línia horitzontal que en tots els casos equival a lOOnm. 93