TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega Dipòsit Legal: T.1022-2011 ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tesisenxarxa.net) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. 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Anabel Alperi Vega Tesis Doctoral 2009 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Agradecimientos: Ha llegado el momento de agradecer, ha llegado el momento de recordar a todas aquellas personas que me han ayudado y contribuido de alguna manera en la elaboración y desarrollo de esta tesis doctoral. En primer lugar mis agradecimientos son para la directora de esta tesis, la Dra. Mª José Figueras Salvat, trabajadora incansable, por su dedicación, entusiasmo y minuciosidad en cada uno de los aspectos de este trabajo. Asimismo, quiero agradecer al co-director de esta tesis, el Dr. Martínez-Murcia, sus críticas y valoraciones. Gracias. También quiero mostrar mi agradecimiento a todos los miembros de esta Unidad de Microbiología, en especial al director de este equipo, el Dr. Guarro que sin pretenderlo ha sido un gran ejemplo para mí, y al Dr. Pastor, porque quieras o no, todos los becarios formamos parte de este “rebaño”. Llegamos a mis COMPAÑERAS. Para vosotras son mis más tiernos agradecimientos. ¿Cómo habría terminado esto sin vosotras? Txutxis!!! Cati, sin tu ayuda esto hubiera durado mucho más de 4 años, pero lo que más te agradezco es tu amistad. De verdad, gracias txutxina. Ester!!! Esos cafés de “banco” con Murphy ... Caracola loca de Mar, si no hubieses abierto “el bar del laboratorio” ¿dónde iríamos a ahogar nuestras penas? A Eduardo y Valentina, mucho más para mí que compañeros de laboratorio y de piso en los últimos tiempos. Luilli, porque la santa caña existe. Gracias. Gracias Mar y Enrique, almas de los antifúngicos. A las VETERANAS, Mabel por tus invalorables consejos tanto profesionales como personales, y Dania, abuela!!! porque sin ti los “fitis” no serían lo mismo. Haybrig, yo nunca dije que mordiera!!! Josep, mi pez predilecto. En serio, gracias Nuria, Sarah, Roxana, Yesica, Mónica, Marsal, Mery, Hugo, Kendra. Espero no dejarme a nadie. Gracias a todos y cada uno de vosotros. A mi familia. A ellos va dedicada esta tesis. Mamá, tanto que me has enseñado en esta vida, mi luchadora favorita. Gracias por ser como eres y por escuchar las interminables quejas de esta “niña rebelde”. Api, porque a tu manera haces que todo funcione. Juancar y Pili, gracias por esas charlas, es un alivio para el espíritu teneros cerca. Mo y Javi, UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 gracias a los dos, porque también es culpa vuestra que hoy esté aquí escribiendo los agradecimientos de esta tesis. Tito y Tita, mi par sin igual, ¿qué nieto soñaría con unos abuelos mejores que vosotros? Gracias a todos por soportarme. Nico. Mi compañero en este viaje. Tú me has traído la calma y la paz. Eres todo un ejemplo de fortaleza y determinación. Gracias cariño, gracias por escucharme, apoyarme y estar siempre a mi lado. Gracias por todos nuestros momentos, los buenos y los malos, por reconfortarme tantas y tantas veces, por mostrarme lo que no podía ver y por enseñarme tantas otras cosas. Gracias por sostenerme, por ser la luz de mi oscuridad, por ser el faro que me guía. Al fin y al cabo, todos vamos en el mismo barco y nos dirigimos a un destino común. LA TESIS. GRACIAS, una palabra que implica un profundo sentimiento por mi parte. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 ÍNDICE Página 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Aeromonas, perspectivas históricas..................................................................................................1 1.2. Taxonomía de género Aeromonas....................................................................................................4 1.2.1. Gen ARNr 16S........................................................................................................................5 1.2.2. Hibridación ADN-ADN (DDH).............................................................................................8 1.2.2.1. DDH en Aeromonas..............................................................................................10 1.2.3. Genes que codifican proteínas esenciales: housekeeping.....................................................14 1.2.4. Estudio fenotípico.................................................................................................................17 1.2.4.1. Características fenotípicas clásicas.......................................................................17 1.2.4.2. Sistemas no automatizados...................................................................................17 1.2.4.3. Sistemas automatizados........................................................................................18 1.2.5. Técnicas de tipado molecular…............................................................................................19 1.3. Epidemiología del género Aeromonas…........................................................................................22 1.3.1. Ecología................................................................................................................................22 1.3.2. Infecciones por Aeromonas en humanos..............................................................................24 1.3.2.1. Intestinales............................................................................................................24 1.3.2.2. Extraintestinales....................................................................................................26 1.3.3. Factores de Virulencia..........................................................................................................31 1.3.3.1. Productos extracelulares.......................................................................................31 1.3.3.2. Sistemas de secreción...........................................................................................36 1.3.3.3. Componentes estructurales...................................................................................40 1.3.4. Resistencia a agentes antimicrobianos..................................................................................47 2. INTERÉS Y OBJETIVOS....................................................................................................................51 3. MATERIALES Y MÉTODOS.............................................................................................................55 3.1. Origen y aislamiento de las cepas..................................................................................................56 3.1.1. Cepas clínicas........................................................................................................................56 3.1.2. Cepas animales......................................................................................................................56 3.1.3. Cepas ambientales.................................................................................................................56 3.1.4. Cepas de colección y referencia............................................................................................56 3.1.5. Resiembra y conservación de cepas......................................................................................56 3.2. Caracterización fenotípica..............................................................................................................57 i UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 ÍNDICE 3.2.1. Cepas clínicas humanas y animales......................................................................................57 3.2.2. Cepas ambientales.................................................................................................................57 3.2.3. Cepas pertenecientes a nuevas líneas filogenéticas..............................................................57 3.3. Caracterización genética.................................................................................................................59 3.3.1. Extracción de ADN...............................................................................................................59 3.3.2. RFLP del ADNr 16S.............................................................................................................60 3.3.3. Secuenciación.......................................................................................................................61 3.3.3.1. Gen ARNr 16S......................................................................................................61 3.3.3.2. Gen rpoD..............................................................................................................62 3.3.3.3. Gen gyrB, gyrA y dnaJ..........................................................................................62 3.3.3.4. Gen recA...............................................................................................................63 3.3.4. Análisis de secuencias y construcción de árboles filogenéticos...........................................63 3.3.5. Hibridación ADN-ADN........................................................................................................64 3.3.6. Técnicas de tipado molecular................................................................................................69 3.3.6.1. ERIC-PCR............................................................................................................69 3.3.6.2. RAPD-PCR...........................................................................................................69 3.3.6.3. PFGE.....................................................................................................................69 3.4. Detección de factores de virulencia................................................................................................70 3.4.1. Detección y secuenciación de los genes que codifican para las toxinas Shiga stx1 y stx2 ....72 3.4.2. Detección de la producción de toxinas Shiga 1 y 2...............................................................72 3.4.3. Extracción de plásmidos........................................................................................................73 3.5. Sensibilidad a agentes antimicrobianos..........................................................................................73 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Taxonomía del género Aeromonas.................................................................................................76 4.1.1. MJ Figueras, A Alperi, J Guarro, AJ Martínez-Murcia. Genotyping of isolates included in the description of a novel species should be mandatory. Int J Syst Evol Microbiol. 2006. 56:1183-1184.....................................................................................................................77 4.1.2. MJ Figueras, A Alperi, J Guarro. On the identification of clinical Aeromonas by a new restriction fragment length polymorphism of 16S rDNA method. Lett Appl Microbiol. 2007. 45:692-463...............................................................................................................80 4.1.3. A Alperi, MJ Figueras, I Inza, AJ Martínez-Murcia. Analysis of the 16S rRNA gene mutations in a subset of Aeromonas strains and their impact in species delineation. Int Microbiol. 2008.11: 185-194.............................................................................................83 4.1.4. Análisis de las secuencias de los operones del gen ARNr 16S en Aeromonas...................96 ii UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 ÍNDICE 4.1.5. AJ Martínez-Murcia, A Monera, A Alperi, MJ Figueras, MJ Saavedra. Phylogenetic evidence indicated that Aeromonas hydrophila subsp. dhakensis Huys et al., 2002 is a synonym of Aeromonas aquariorum sp. nov. Curr Microbiol. 2009. 58:7680........................................................................................................................................99 4.1.6. A Alperi, AJ Martínez-Murcia, A Monera, MJ Saavedra, MJ Figueras. Aeromonas fluvialis sp. nov., isolated from Spanish river. Int J Syst Evol Microbiol. En prensa...............................................................................................................................105 4.1.7. A Alperi, AJ Martínez-Murcia, WC Ko, A Monera, MJ Saavedra, MJ Figueras. Aeromonas taiwanensis sp. nov. and Aeromonas sanarellii sp. nov., two new clinical species from Taiwan. Int J Syst Evol Microbiol. En revisión..........................................123 4.1.8. R Beaz-Hidalgo, A Alperi, MJ Figueras, J Romalde. Aeromonas piscicola sp. nov., isolated from diseased fish. Syst Appl Microbiol. En prensa...........................................143 4.1.9. MJ Figueras, A Alperi, R Beaz-Hidalgo, E Stackebrandt, E Brambilla, A Monera, AJ Martínez-Murcia. Aeromonas rivuli sp. nov. isolated from the upstream region of a karst water rivulet in Germany. Int J Syst Evol Microbiol. En revisión...................................165 4.2. Epidemiología del género Aeromonas 4.2.1. MJ Figueras, A Alperi, MJ Saavedra, WC Ko, N Gonzalo, M Navarro, AJ MartínezMurcia. Clinical relevance of the recently described Aeromonas aquariorum. J Clin Microbiol. En revisión.....................................................................................................181 4.2.2. MJ Figueras, MJ Aldea, N Fernández, C Aspíroz, A Alperi, J Guarro. Aeromonas hemolytic uremic syndrome. A case and a review of the literature. Diagn Microbiol Infect. 2007. 58:23-24......................................................................................................194 4.2.3. A Alperi, MJ Figueras. Shiga toxin (stx1 and stx2) genes in Aeromonas clinical strains show sequences which are highly similar to those of the most virulent human variants of shiga toxin producing E. coli. Clin Microbiol Infec. En revisión...................................199 4.2.4. D Tena, C Aspíroz, MJ Figueras, A González-Praetorius, MJ Aldea, A Alperi, J Bisquert. Surgical site infection due to Aeromonas species: Report of nine cases and literature review. Scand J Infect Dis. 2009. 41:164-170.................................................................208 4.2.5. J Sánchez-Céspedes, MJ Figueras, C Aspíroz, MJ Aldea, M Toledo, A Alperi, F Marco, J Vila. Development of imipenem resistance in an Aeromonas veronii biovar sobria clinical isolate recovered from a patient with cholangitis. J Med Microbiol. 2009. 58: 451455....................................................................................................................................216 5. DISCUSIÓN GENERAL.....................................................................................................................222 6. CONCLUSIONES................................................................................................................................236 iii UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 ÍNDICE 7. BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................................................239 ANEXOS...................................................................................................................................................268 1. Cepas de origen clínico identificadas...............................................................................................269 2. Cepas de origen animal identificadas...............................................................................................277 3. Cepas identificadas proporcionadas por diversos autores................................................................283 4. Cepas de origen ambiental identificadas..........................................................................................288 5. Cepas utilizadas en el estudio 4.1.1.................................................................................................290 6. Cepas utilizadas en el estudio 4.1.3.................................................................................................290 7. Cepas utilizadas en el estudio 4.2.1.................................................................................................292 8. Cepas utilizadas en el estudio 4.2.3.................................................................................................293 9. Cepas utilizadas en el estudio 4.2.4.................................................................................................293 10. Cartas de aceptación de los artículos en prensa...............................................................................294 11. Justificantes de los trabajos en revisión...........................................................................................297 iv UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN 1.1. Aeromonas El género Aeromonas (aer-, del griego: gas; -monas, unidades; unidades productoras de gas), de acuerdo con la edición más reciente del Manual de Bergey (Martin-Carnahan y Jospeh, 2005), pertenece a la Clase de las Gammaproteobacterias, Orden Aeromonadales, Familia Aeromonadaceae, que en la actualidad incluye 3 géneros: Aeromonas, Oceanimonas y Tulomonas (Manual de Bergey, 2ªed.). El género incluye en la actualidad 19 especies y un Grupo de Hibridación (GH) denominado GH13 o Grupo 501 (Tabla 1). Estos microorganismos se caracterizan por ser bacilos Gram negativos, oxidasa y catalasa positivos, capaces de degradar nitratos a nitritos, fermentadores de la glucosa y resistentes al factor vibriostático O/129 (2,4-Diamino-6,7-di-iso-propilpteridina fosfato). A pesar de ser considerados microorganismos autóctonos del medio acuático, también han sido aislados con frecuencia en alimentos destinados al consumo humano, peces enfermos y en diversos procesos infecciosos en humanos (Borrell y cols., 1998; Martin-Carnahan y Joseph, 2005, Figueras 2005). Perspectivas históricas Se considera que la primera descripción de una cepa del género Aeromonas fue la realizada por Sanarelli en 1891, durante un estudio de inmunidad en ranas en el que muchas de éstas desarrollaron una septicemia que se atribuyó a Bacillus hydrophilus fuscus. Durante aquella época se aislaron Aeromonas de agua, peces enfermos y leche (Farmer y cols., 2006). La primera asociación de A. salmonicida con la forunculosis fue en 1894 por Emmerich y Weibel (Farmer y cols., 2006). Desde el primer aislamiento hasta 1943, año en el que se definió el género (Stainer, 1943), las cepas de Aeromonas han sido incluidas en diversos grupos como Bacillus, Proteus, Pseudomonas, Achromobacter o Vibrio, entre otros. De hecho, la definición del género Aeromonas se ha atribuido erróneamente a Kluyver and van Niel en numerosos manuales de microbiología, a pesar de que la comisión judicial del comité internacional de sistemática de bacteriología (1973) estableció la autoría a Stainer, 1943. El género Aeromonas ha residido en la familia Vibrionaceae desde 1965 junto a los géneros Vibrio y Plesiomonas. A mediados de los años 70, la mayoría de las Aeromonas se englobaban dentro de dos grupos principales definidos, esencialmente, en base a la temperatura de crecimiento además de diversas características como la motilidad, la producción de pigmento en TSA o la producción de indol. Estos dos grupos eran los siguientes: - cepas mesófilas (crecimiento óptimo a 35-37ºC) responsables de diversas infecciones en humanos y definidas globalmente bajo el nombre de A. hydrophila - cepas psicrófilas (crecimiento óptimo a 22-28ºC) principalmente patógenas de peces e identificadas como A. salmonicida. Estos dos grandes grupos se reclasificaron posteriormente por estudios de reasociación ADN1 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN ADN (McInnes y cols., 1979; Popoff y cols., 1981; Farmer y cols., 1986). Popoff estableció 8 grupos de hibridación en 1981, por el método de la endonucleasa S1, que llegaron a 12 con los estudios posteriores (Fanning y cols., 1985; Farmer y cols., 1986), con el método de la hidroxiapatita y una temperatura de reasociación óptima de 60ºC (Martin-Carnahan y Joseph, 2005). En 1984 Baumann y Schubert, a partir de un estudio de reasociación del ARNr-ADN entre miembros de la familia Vibrionaceae, observaron que el género Aeromonas presentaba suficientes diferencias para constituir una familia independiente. Estos resultados fueron confirmados posteriormente por Colwell y cols. en 1986, en base al análisis de secuencias de los genes del ARNr 5S y 16S, que demostraban que el género Aeromonas tenía una divergencia evolutiva equidistante con la Familia Vibrionaceae y Enterobacteriaceae justificando así la creación de la familia Aeromonadaceae. Las secuencias del gen ARNr 16S de todas las especies de Aeromonas definidas hasta 1992 (Martínez-Murcia y cols., 1992a) corroboraron la posición del género y la propuesta de Colwell y cols. (1986). 84 56 49 22 A. bestiarum CECT4227T (X60406) A. salmonicida CECT894T (X60405) A. molluscorum CECT5864T (AY532690) A. encheleia CECT4342T (AJ224309) A. eucrenophila CECT4224T (X60411) A. tecta CECT7082T (AJ458403) 99 28 58 21 A. media CECT4232T (X60410) A. hydrophila CECT839T (X60404) 29 18 54 A. popoffii CECT5176T (AJ224308) A. bivalvium CECT7113T (DQ504429) A. sobria CECT4245T (X60412) A. allosaccharophila CECT4199T (S39232) A. trota CECT4255T (X60415) 78 A. aquariorum CECT7289T (EU085557) A. caviae CECT838T (X60409) A. jandaei CECT4228T (X60413) A. culicicola CECT 5761 (AY347680) 99 96 33 58 51 A. veronii CECT4257T (X60414) A. simiae IBS-S6874T (AJ536821) 89 89 “Rama Schubertii” A. schubertii CECT4240T (X60416). Aeromonas sp. G501 (U88663) A. sharmana GPTSA-6 (DQ013306) 0.005 Figura 1. Relación filogenética entre las distintas especies incluidas en el género Aeromonas establecida en base a la secuencia del gen 16S rRNA. 2 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Desde 1992 hasta la fecha se han descrito 10 (Tabla 1 y Figura 1) nuevas especies en el género Aeromonas: A. allosaccharophila (Martínez-Murcia y cols., 1992b), A. encheleia (Esteve y cols., 1995c) a la que también pertenece el GH11 (Huys y cols., 1997b), A. popoffii (Huys y cols., 1997a), A. culicicola (Pidiyar y cols., 2002), A. simiae (Harf-Monteil y cols., 2004), A. molluscorum (MiñanaGalbis y cols., 2004), A. sharmana (Saha y Chakrabarti, 2006), A. bivalvium (Miñana-Galbis y cols., 2007), A. tecta (Demarta y cols., 2008) y A. aquariorum (Martínez-Murcia y cols., 2008). Sin embargo, se vio poco después de su descripción que A. culicicola era un sinónimo de A. veronii (Huys y cols., 2005) y se ha demostrado recientemente que A. sharmana no pertenece al género Aeromonas (Martínez-Murcia y cols., 2007). Pero, esta última propuesta está pendiente de validación por parte del Comité Internacional para la Sistemática de Procariotas. En la actualidad están aceptadas 8 subespecies en el género Aeromonas, 3 pertenecen a A. hydrophila (subsp. ranae, dhakensis e hydrophila) y 5 a A. salmonicida (subsp. salmonicida, achromogenes, mausoicida, smithia y pectinolytica). Tabla 1. Especies aceptadas en el género Aeromonas. Número Especie A. hydrophila a Cepa tipo ATCC 7966T ATCC 51108T NCIMB 1102T ATTC 15468T ATCC 33907T NCIMB 74T NCIMB 12065T ATCC 35624T ATCC 49568T ATCC 43700T ATCC 49657T Equivalentes en otras colecciones CECT 839T; NCIMB 9240T CECT 4227T; NCIMB 1134T CECT 894T; ATTC 33658T CECT 838T, ATCC 15468T CECT 4232T; NCIMB 2237T CECT 4224T; ATCC 23309T ATCC 43979T; CECT4245T CECT 4257T; NCIMB 13015T CECT 4228T; LMG 12221T CECT 4240T; NCIMB 13161T CECT 4255T; LMG 12223T Origen Autores 1 Leche Stainer, 1943 2 A. bestiarum A. salmonicida b Pez enfermo Ali y cols., 1996 3 Salmón Griffin y cols., 1953 4 A. caviae Cobaya Agua de piscifactoría Pez de agua dulce Schubert y Hegazi, 1988 5 A. media Allen y cols., 1983 6 A. eucrenophila Schubert y Hegazi, 1988 7 A. sobria A. veronii c Pez Popoff y cols., 1981 Hickman-Brenner y cols., 1987 Carnahan y cols., 1991c Hickman-Brenner y cols., 1988 Carnahan y cols., 1991b 8 Esputo 9 A. jandaei Heces humanas 10 A. schubertii A. trota d Absceso cutáneo 11 Heces humanas 3 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN 12 A. allosaccharophila CECT 4199T CECT 4342T LMG 17541T IBS S6874T CECT 5864T CECT 7113T CECT 7289T CECT 7082T ATCC 51208T ; LMG 14059T ATCC 51929T; LMG 16330T CECT 5176T; ATCC BAA-243T; NCIMB 13618T CCUG 47378T; CIP 107798T 848T T; CCUG 50741 T; LMG 22214T 868ET; LMG 23376T MDC 47T; DSM 18362T MDC 91T; DSM 17300T Anguila Martínez-Murcia y cols., 1992b Esteve y cols., 1995c 13 A. encheleia Anguila 14 15 A. popoffii A. simiae Agua potable Huys y cols., 1997a Heces de mono Harf-Monteil y cols., 2004 16 A. molluscorum Moluscos bivalvos Miñana-Galbis y cols., 2004 17 A. bivalvium A. aquariorum e Moluscos bivalvos Miñana-Galbis y cols., 2007 Martínez-Murcia y cols., 2008 Demarta y cols., 2008 18 Peces ornamentales Heces de niño con diarrea 19 a A. tecta especie tipo del género Aeromonas para la que se han descrito tres subespecies (A. hydrophila subsp. hydrophila; A. hydrophila subsp. dhakensis y A. hydrophila subsp. ranae); b incluye cinco subespecies (A. salmonicida subsp. salmonicida; A. salmonicida subsp. achromogenes; A. salmonicida subsp. masoucida; A. salmonicida subsp. smithia y A. salmonicida subsp. pectinolytica); c incluye dos biotipos (A veronii bv sobria y A. veronii bv veronii); A. ichtiosmia es un sinónimo de esta especie; d A. enteropelogenes es un sinónimo de esta especie. eEl nombre de esta especie podría variar en un futuro ya que se ha descrito que es idéntica a A. hydrophila subsp. dhakensis definida previamente por Huys y cols. (2002). 1.2. Taxonomía del género Aeromonas En el año 2002, Stackebrandt y cols. recogen las recomendaciones del Comité Internacional de Sistemática de Procariotas (International Committee on Systematic of Prokaryotes o ICSP) para la definición de especies procariotas que incluyen un estudio polifásico con una diferenciación fenotípica, genotípica y filogenética. La diferenciación fenotípica debería estar basada en exámenes bioquímicos, morfológicos, fisiológicos, análisis de perfiles de proteínas y/o ácidos grasos; mientras que la diferenciación filogenética debería incluir la secuencia de al menos 1300 nucleótidos (nt) del gen ARNr 16S. El grado de similitud de esta secuencia con las especies más cercanas debería ser inferior al 97% y en los casos en los que esta similitud fuera mayor, debería evaluarse el grado de similitud de los genomas completos por reasociación ADN-ADN (DDH), que es la técnica de referencia o gold standard en la definición de especies procariotas. Un valor de DDH inferior al 70% con el resto de especies descritas es el establecido para definir una nueva especie, que además debe presentar como mínimo una característica fenotípica que la diferencie del resto de especies del género. Además, se recomienda la secuenciación de al menos 5 genes housekeeping que proporcionen una mayor información/diferenciación filogenética así como determinar la variabilidad intraespecífica con técnicas de tipado moleculares (RAPD, REP-PCR, FAFLP). Se ha observado en diversos géneros [Streptomyces, (Santpierre-Bonaccio y cols., 2004), Mycobacterium (Rhodes y cols., 2003) así como en Aeromonas (Martínez-Murcia y cols., 1992a; Harayama y Kasai, 2006)] que organismos con valores de similitud del gen ARNr 16S superiores al 97% pertenecían a especies diferentes, incluso con similitudes del 99.8% (Stackebrandt y Goebel, 4 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN 1994) o del 100% (Martínez-Murcia y cols., 1992a; Harayama y Kasai, 2006). A raiz de estos datos se ha propuesto que el valor de similitud del gen ARNr 16S, a partir del cual ha de ser obligatorio determinar los valores de DDH, se debe incrementar del 97% previamente establecido (Wayne y cols., 1987) al 98-99% (Stackebrandt y Ebers, 2006). 1.2.1. Gen ARN ribosómico 16S Las secuencias del gen ARN ribosómico 16S han sido clásicamente consideradas como marcadores moleculares estables y específicos para la identificación de especies bacterianas (Woese 1987; Marchandin y cols., 2003) en base a las siguientes características: -es un gen esencial -su distribución es universal, permitiendo la comparación de todos los microorganismos -su tamaño (1550 pb) permite la secuenciación casi completa del gen -su estructura presenta un mosaico de regiones variables, útiles en la diferenciación de organismos estrechamente relacionados, y sus regiones conservadas son útiles para la comparación de organismos lejanos y han permitido el diseño de cebadores “universales” (Woese y cols., 1987). Estos genes están organizados como una familia multigénica que incluye entre 1 y 15 copias (operones) en el genoma bacteriano (Coenye y Vandamme, 2003). Por lo general, se considera que todas las copias de un organismo son idénticas o casi idénticas en su secuencia nucleotídica, sin embargo, en varios géneros se han descrito diferencias nucleotídicas intragenómicas entre las copias del gen ARN 16S (Clayton y cols., 1995; Cilia y cols., 1996; Martínez-Murcia y cols., 1999; Ueda y cols., 1999; Moreno y cols., 2002; Coenye y Vandamme, 2003; Marchandin y cols., 2003; Acinas y cols., 2004; Boucher y cols., 2004; Vásquez y cols., 2005). Estas diferencias entre las copias son denominadas polimorfismos, microheterogeneidades, variabilidad interoperónica o cistrónica. La estructura secundaria del gen ARNr 16S está formada por aproximadamente 50 hélices, las cuales presentan diferentes tasas evolutivas (Woese, 1987). En la mayoría de bacterias, las microheterogeneidades se localizan en las regiones variables (RV) 1, 2, 5 y 6, y por lo general afectan a menos del 1% de las posiciones (Coenye y Vandamme, 2003). Los casos más extremos de variabilidad intragenómica se han descrito en las bacterias termófilas con un 11.6% de posiciones con microheterogeneidad (Acinas y cols., 2004). Algunos autores afirman que la existencia de variabilidad no afecta a la taxonomía (Coenye y Vandamme, 2003; Acinas y cols., 2004) mientras que otros autores han demostrado todo lo contrario, es decir, que la existencia de polimorfismos, aunque sea en menos del 1% de las posiciones, puede conducir a errores en la identificación de especies (Boucher y cols., 2004; Marchandin y cols., 2003; Vásquez y cols., 2005), especialmente en géneros con una escasa variabilidad interespecie (Ninet y cols., 1996). Dentro de este último grupo de microorganismos se incluyen las Aeromonas con una similitud interespecie del gen ARNr 16S del 96.7% al 100% (Saavedra y cols., 2006). 5 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Secuencias del gen ARNr 16S. Las secuencias del gen ARNr 16S de todas las especies del género Aeromonas aceptadas hasta 1999 fueron realizadas por Martínez-Murcia y cols. (1992a, 1999), quienes establecieron la filogenia del género en base a este gen y determinaron que, en la mayoría de los casos, las relaciones filogenéticas obtenidas con este gen eran concordantes con los valores de DDH. Además del alto grado de similitud interespecie (96.7%-100%), se ha observado que las regiones del gen más variables, y en base a las cuales se diferencian la mayoría de las especies, son la RV2, RV3 y RV6 (Martínez-Murcia y cols., 1992a; Saavedra y cols., 2006). Hasta la fecha se ha descrito la existencia de microheterogeneidad o polimorfismo en varias especies del género: A. popoffii (Demarta y cols., 1999), A. molluscorum y A. bivalvium (Miñana-Galbis y cols., 2004, 2007), A. veronii y A. media (Morandi y cols., 2005), A. culicicola (Figueras y cols., 2005), A. bestiarum y A. salmonicida (Martínez-Murcia y cols., 2005) y A. allosaccharophila (Saavedra y cols., 2006), sin embargo, esta variabilidad nunca ha sido analizada conjuntamente. En la actualidad y gracias a las secuencias de los genomas completos de A. hydrophila (Seshadri y cols., 2006) y A. salmonicida (Reith y cols., 2008) se ha observado que el número de copias del gen ARNr 16S en el genoma de Aeromonas podría variar entre las 9 copias de A. salmonicida A449 y las 10 de A. hydrophila ATCC7966T. Además de la secuenciación se han descrito otras técnicas moleculares basadas en este gen para la identificación de especies de Aeromonas. Sondas especie-específicas de Aeromonas. Existen múltiples estudios para la detección de especies concretas: A. hydrophila (Ludwig y cols., 1994; Cascon y cols., 1996; Oakey y cols., 1999), A. trota (Khan y cols., 1999), A. sobria (Shibata y cols., 1996), A. caviae (Wang y cols., 1996) y A. popoffii (Demarta y cols., 1999). La limitación de las sondas es que requieren realizar diversas pruebas para cada uno de los aislados (Martínez-Murcia y cols., 1992) y además, pueden generar falsos resultados por la presencia de microheterogeneidades en las regiones de reconocimiento de la sonda. También se han ensayado otros oligonucleotidos concretos para el género Aeromonas (Kämpfer y cols., 1996). Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos de Restricción. Borrell y cols. en 1997 diseñaron un protocolo basado en el análisis de los patrones de restricción de 1503 pb del ADNr 16S, obtenidos tras la digestión con las endonucleasas AluI (AGCT) y MboI (GATC), que permitía identificar 10 de las 13 especies aceptadas (en aquél momento) en el género. La utilización de endonucleasas complementarias permitía identificar 12 de las 13 especies aceptadas (Borrell y cols., 1997). Tres años después Figueras y cols., (2000a) publican una ampliación de este protocolo que permite entonces la identificación de las 14 especies aceptadas en el momento de su publicación. Hasta la fecha, este protocolo ha sido citado en 76 ocasiones y existen multitud de publicaciones actuales de diversos autores (Park y cols., 2003; Abdullah y cols., 2003; Esteve y cols., 2004; Vilches y cols., 2004, 2007; Aguilera-Arreola y cols., 2005, 2007; Nawaz y cols., 2006; Kozinska, 2007; 6 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Scoaris y cols., 2008; Krzyminska y cols., 2008, 2009) que utilizan este método de indentificación de especies de Aeromonas, lo que indica que, tras casi 10 años desde su publicación, este método sigue siendo válido. Graf en 1999 publica un estudio en el que supuestamente utiliza el protocolo de Borrell y cols. (1997) para la caracterización de 62 aislados de Aeromonas y observa la aparición de más de un patrón para A. veronii bv sobria, A. media y A. encheleia. Este autor supone que dichos patrones son generados por la existencia de microheterogeneidades en el ADNr 16S y que por tanto, el protocolo de RFLP produce identificaciones erróneas. Sin embargo, Graf no sigue fielmente el protocolo de Borrell y cols. (1997), ya que amplifica 600 pb lugar de los 1503 pb del protocolo original y utiliza endonucleasas con dianas diferentes: AluI, CfoI (GCGC) y MnlI (CCTC) (Figueras y cols., 2000b). Tres años después, otros autores (Lee y cols., 2002) publican un protocolo de RFLP del ADNr 16S. Estos autores utilizan cebadores específicos para la amplificación (953 pb) del gen ARNr 16S y las endonucleasas AluI, CfoI, PvuII (CAGCTG) y XhoII (RGATCY) en la digestión. Los patrones obtenidos permitían la identificación de todas las especies, excepto la diferenciación de A. bestiarum y A. salmonicida, y de A. encheleia y HG11, especies que si podían ser diferenciadas con el protocolo propuesto por Borrell y cols. (1997) y Figueras y cols. (2000a). Este protocolo de Lee y cols. (2002) ha sido aplicado en nuestro laboratorio para la separación de las especies A. eucrenophila y A. sobria que presentan un patrón muy similar en base al protocolo de Figueras y cols. (2000a) y permite una separación más fácil de estas especies (datos no publicados). Sin embargo, el protocolo de Lee y cols. (2002) sólo se ha utilizado en un estudio tras su publicación, por lo que los datos obtenidos por estos autores aún no han sido corroborados. También se ha propuesto un protocolo de RFLP del espaciador intergénico (ISR) del ADNr 16S-23S para la identificación de las especies A. hydrophila, A. salmonicida, A. bestiarum, A. caviae, A. media, A. schubertii, A. allosaccharophila, A. popoffii y A. culicicola, utilizando 4 endonucleasas (Laganowska y Kaznowski, 2004). En el año 2005 se publica un protocolo basado en el RFLP del ADNr 16S para diferenciar A. jandaei de A. culicicola (Kaznowski y Konecka, 2005). Estos dos trabajos sólo se han citado en una ocasión y no existen otros estudios que lo utilicen y ratifiquen su utilidad con nuevas cepas. Recientemente, Ghatak y cols. publican en el año 2007 un protocolo para la identificación de las especies clínicas de Aeromonas, en el que utilizando 4 endonucleasas los autores aseguran que se obtienen patrones de RFLP más sencillos de identificar que los generados con el protocolo de Borrell y cols. (1997) y Figueras y cols. (2000a). A partir de un amplificado de 1503 pb del gen ARNr 16S pueden diferenciar A. hydrophila, A. caviae, A. jandaei y A. veronii. Asimismo, proponen una diferenciación entre las dos biovariedades de A. veronii (sobria y veronii) tras la digestión con la endonucleasa NruI (TCGCGA). 7 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN 1.2.2. Hibridación ADN-ADN (DDH) La hibridación ADN-ADN (DDH), tal y como se ha comentado previamente, es el método de referencia utilizado para determinar si dos microorganismos pertenecen o no a la misma especie procariota ya que permite conocer la similitud entre dos genomas completos (Roselló-Móra, 2006). Este método ha sido muy criticado ya que no permite generar bases de datos interactivas y acumulativas, presenta grandes diferencias entre los valores de similitud obtenidos para los mismos microorganismos al ser evaluados por distintos autores, utilizando o no el mismo método, y una elevada desviación estándar además de no proporcionar información filogenética (Stackebrandt, 2003; Rosselló-Móra, 2006; Harayama, 2006). Algunos autores han indicado que la propuesta de secuenciar 5 genes housekeeping, recomendada por el ICSP (Stackebrandt y cols., 2002), con los que se pueden generar bases de datos dinámicas e interactivas y que proporcionan una información filogenética, podrían sustituir definitivamente la técnica de DDH en la definición de especie, siempre que los genes seleccionados fueran una muestra representativa del genoma completo (Rosselló-Mora, 2006). Los resultados de la DDH se expresan como el porcentaje de hibridación (Relative Binding Ratio, RBR) y representa el ADN bicatenario (ADNbc) híbrido formado al enfrentar el ADN monocatenario (ADNmc) de dos genomas en relación al grado de reasociación del ADN homólogo, esto es, el que hibrida consigo mismo. En los experimentos de DDH los factores más determinantes son las concentraciones de los ADNs a comparar, que han de ser equimolares, la pureza de los mismos (1.77ºC indican que ambas cepas pertenecen a diferentes especies (Grimont, 1988). A mayor temperatura de renaturalización aumenta la especificidad de la reacción, siendo la reasociación más estricta y los valores de similitud entre los dos genomas comparados menor (Rosselló-Mora, 2006; MartinCarnahan y Joseph, 2005). Entre las técnicas de DDH más referenciadas en la bibliografía se encuentran las propuestas por de De Ley y cols. (1970), Ezaki y cols. (1989), Johnson (1981) y Ziemke y cols. (1998), ésta es una modificación del método de Brenner y cols. (1969). El método descrito por De Ley y cols. (1970) es un método espectrofotométrico en el que los ADNs se mezclan, son desnaturalizados y su renaturalización se sigue ópticamente con un espectrofotómetro especial. La medida de la reasociación se obtiene midiendo el descenso de la absorbancia del ADN de cadena sencilla (ADNmc) sin requerir marcaje de ningún ADN. La renaturalización del ADN heterólogo se evalúa en función de la reasociación del ADN homólogo. Con este método se obtienen datos tanto del ∆Tm como del RBR. En el método de Ezaki y cols. (1989) el ADN no marcado y desnaturalizado se adhiere covalentemente a los pocillos de una microplaca y en el de Johnson (1981) a un soporte de nitrocelulosa, donde tendrá lugar la hibridación. El ADN de referencia es marcado, con fosfobiotina en el método de Ezaki y con radioisótopos en el de Johnson, y se hibrida con el ADN unido a los pocillos o a la nitrocelulosa. Para descender la temperatura de hibridación y mantener la precisión del proceso se añade a la mezcla formamida, tal y como hemos indicado previamente. Tras la hibridación, el ADNmc se elimina por el tratamiento con el enzima S1. El grado de reasociación o hibridación se revela tras un ensayo ya sea con radioisótopos (Johnson, 1981), fluorométrico o colorimétrico (Ezaki y cols., 1989) pudiéndose determinar en ambos casos tanto el RBR como el ∆Tm. En el método de Ziemke y cols. (1998), el ADN de referencia es marcado con digoxigenina y biotina mientras que en el método de Brenner y cols. (1969) era marcado con radioisótopos. En ambos casos la hibridación tiene lugar en un medio líquido que contiene tampón fosfato (0.28 M), sin la presencia de formamida. La separación del ADNmc y ADNbc se realiza en una matriz de hidroxiapatita. El grado de reasociación o hibridación se revela tras un ensayo inmuno-enzimático en el método de Ziemke y cols. (1998), teniendo en cuenta tanto el ADNmc como el ADNbc, y se obtienen valores del RBR pero no del ∆Tm. Por tanto, las diferencias principales que existen entre los distintos métodos de DDH residen básicamente en el marcaje del ADN [con radioisótopos (Brenner y cols., 1969; Johnson, 1981), marcadores fluorescentes, digoxigenina y biotina (Ziemke y cols., 1998) y fotobiotina (Ezaki y cols., 1989)], el medio en que tiene lugar la hibridación [en un medio líquido (Brenner y cols., 1969; De Ley y cols., 1970; Ziemke y cols., 1998 ) o bien uno de los ADNs estar fijado previamente a una superficie sólida (Johnson, 1981; Ezaki y cols., 1989)] y finalmente la separación del ADNmc y ADNbc [por unión 9 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN específica diferencial de los mismos con hidroxiapatita (Brenner y cols., 1969; Ziemke y cols., 1998) o bien porque el ADNmc se degrade mediante el uso de la endonucleasa S1 (Ezaki y cols., 1989)]. 1.2.2.1. DDH en Aeromonas En los experimentos de DDH, como se ha mencionado previamente, un aspecto crítico es la determinación de la temperatura óptima de renaturalización (TOR) que se calcula a partir de la Tm y por tanto de la [G+C]. En el género Aeromonas el contenido en % de G+C oscila entre el 57% y el 63%, con un valor medio del 60%. A partir de estos valores las temperaturas para las distintas condiciones de renaturalización se han definido como 60ºC, para la renaturalización en condiciones óptimas, y 75ºC en condiciones estrictas (Martin-Carnahan y Joseph, 2005). Sin embargo, dichos valores dependen del método utilizado. Existen bastantes discrepancias en la literatura respecto a estas temperaturas, dependiendo de la fórmula y métodos empleados para su cálculo. Así, en el método de De Ley (1970) la TOR se determina teniendo en cuenta sólo el %G+C: %G+C = a, 57; b, 63; c, 60 TOR = 0.51 x (%G+C) + 47 A partir de esta fórmula y del %G+C, la TOR para Aeromonas oscila entre 76ºC (a) y 79.13ºC (b) con un valor medio de 77.6ºC (c). Sin embargo, utilizando el método de Ziemke y cols. (1998) y (Urdiain y cols., 2008) y las fórmulas: Tm = (%G+C + 182.2)/2.44 TOR = Tm- 30ºC o Tm- 25ºC se obtienen valores de TOR que oscilan entre TOR = Tm- 30ºC= 68 (a), 73ºC (b) y 69.3 (c) o TOR = Tm25ºC= 70 (a), 75ºC (b) y 74.3ºC (c), respectivamente. Tal y como hemos comentado previamente, en el método de Ezaki y cols. (1989) se utiliza formamida con el fin de descender la temperatura de hibridación y mantener las condiciones de renaturalización óptimas. La formamida, como se ha mencionado, desestabiliza la formación de ADNbc, de hecho la Tm desciende 0.6ºC por cada porcentaje de formamida (% v/v) añadido a la mezcla de hibridación (Johnson, 1981). Un 30% de formamida en la mezcla reduce la Tm en 18ºC y en 30ºC cuando la concentración de formamida es del 50%. Partiendo de un valor medio de G+C del 60% 10 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN y en función de la concentración de formamida, las temperaturas óptimas de renaturalización esperadas serán TOR (30% formamida) = [Tm- 30ºC- 18= 51.3ºC] o [Tm- 25ºC-18= 56.3ºC] y TOR (50% formamida) = [Tm- 30ºC- 30= 39.3ºC] o [Tm- 25ºC-30= 44.3ºC]. Heterogeneidad de resultados de DDH en Aeromonas En el género Aeromonas han existido ciertas controversias en torno a la correcta o no definición de varias especies debido, básicamente, a los valores heterogéneos de reasociación de sus ADNs obtenidos por distintos autores (Esteve y cols., 1995c, b; Huys y cols., 1997b, 2001; MartínezMurcia y cols., 2005; Nhung y cols., 2007). Estas diferencias vienen dadas tanto por la utilización de métodos diferentes como por las distintas temperaturas de hibridación utilizadas en los ensayos. Un ejemplo lo encontramos entorno a A. allosaccharophila, especie definida por MartínezMurcia y cols. (1992b) en base a 3 cepas (la cepa tipo, CECT4119T, un duplicado de la misma y la cepa ATCC35942) en cuya descripción no se realizaron experimentos de DDH pero que fueron publicados posteriormente (Esteve y cols., 1995b). Así, la independencia de esta especie fue confirmada a partir de un estudio de DDH (Tabla 2) de Esteve y cols. (1995b) donde la renaturalización se realizó a 54ºC con el método de Johnson (1981) entre el genoma de A. allosaccharophila y el del resto de especies definidas hasta la época. Llama la atención que estos autores obtuvieron valores de similitud del 0% con A. veronii, la especie más cercana en base al gen ARNr 16S. Tabla 2. Valores, condiciones y métodos de DDH entre las cepas tipo de A. veronii y A. allosaccharophila descritos en la literatura. Condiciones y valores de DDH (%) en distintos estudios Parámetros ADN-ADN (%) Temperatura ºC Formamida % Método Esteve y cols., 1995b 0 54 30 Johnson , 1981 Huys y cols., 2001 80 45 50 Ezaki y cols., 1989 Nhung y cols., 2007 84 45 50 Ezaki y cols., 1989 En el año 2001, Huys y cols. proponen que A. allosaccharophila debería ser considerada sinónimo de la especie A. veronii en base a los resultados de DDH del 78-82% obtenidos entre las cepas tipo de estas especies con el método de Ezaki y cols. (1989) a 45ºC. Sin embargo, cabe destacar que en este estudio se obtienen valores de DDH entre las cepas tipo de A. veronii y A. hydrophila del 65% con un 5% de desviación estándar, frente al 60% (±1.5) reportado por Nhung y cols. (2007), cuando en realidad estas dos especies están relativamente alejadas en base al gen ARNr 16S. Recientemente un estudio (Nhung y cols., 2007) reevalúa la taxonomía actual de Aeromonas 11 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN utilizando técnicas de DDH (el mismo método y temperatura de hibridación que la utilizada por Huys y cols., 2001) y un análisis filogenético del género utilizando las secuencias del gen dnaJ. Los valores obtenidos por este autor, 82-86% de similitud entre A. veronii y A. allosaccharophila, apoyan la propuesta de Huys y cols. (2001) de considerar sinónimos las especies A. veronii y A. allosaccharophila. Posteriormente, este problema fue abordado de nuevo en el estudio publicado por Saavedra y cols. (2007) que incluía 4 nuevos aislamientos de A. allosaccharophila y un análisis más extenso de la especie. Sus resultados demostraban la existencia de diferencias fenotípicas y filogenéticas, en base a los genes gyrB y ARNr 16S, entre A. allosaccharophila y A. veronii y contradecían los resultados publicados por Huys y cols. (2001). De los valores de reasociación obtenidos por Nhung y cols. (2007) destacan también los obtenidos entre A. bestiarum, A. salmonicida y A. popoffii, todas ellas pertenecientes al complejo fenotípico “Aeromonas hydrophila”, ya que presentan diferencias con los obtenidos en estudios anteriores (Tabla 3). Un estudio previo de Huys y cols. (1997a), donde se describe la especie A. popoffii, indica valores de similitud de A. popoffii con el resto de especies del complejo por debajo del 63%, con una temperatura de renaturalización de 76.9ºC. La especie más similar, con un 53 (cepa tipo)-63%, fue A. bestiarum (Huys y cols., 1997a). Sin embargo, Nhung y cols. (2007) obtienen valores del 76% de similitud entre estas dos especies. A pesar del alto grado de similitud observado por estos autores entre A. bestiarum y A. popoffii, estas especies presentan suficientes diferencias fenotípicas y filogenéticas que hacen que nadie se haya cuestionado hasta la fecha que pueda tratarse de la misma especie. Contrariamente, se ha sugerido que A. salmonicida y A. bestiarum podrían representar una única especie (Martínez-Murcia y cols., 2005; Nhung y cols., 2007). Tabla 3. Valores, condiciones y métodos de DHH entre las cepas tipo de A. bestiarum, A. salmonicida y A. popoffii descritos en la literatura. Condiciones y valores de DDH (%) en distintos estudios Parámetros 1-2 ADN-ADN (%) 1-3 2-3 Temperatura ºC Formamida % Método Huys y cols., 1997a ND 53 39 76.9 Ezaki y cols., 1989 Martínez-Murcia y cols., 2005 75.6 ND ND 66 De Ley y cols., 1970 Nhung y cols., 2007 70 76 62.5 45 50 De Ley y cols., 1970 1. A. bestiarum CECT4227T, 2. A. salmonicida CECT894T, 3. A. popoffii CECT5176T ; ND No determinado. Los altos valores de similitud por DDH (71%) obtenidos entre A. bestiarum y A. salmonicida, aunque no con la cepa tipo, ya indicaban un único taxón pero aún así, se consideraron dos especies 12 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN independientes (Ali y cols., 1996). Estudios posteriores (Martínez-Murcia y cols., 2005; Nhung y cols., 2007) obtienen valores de reasociación que apoyan los obtenidos por Ali y cols. (1996). Además, las secuencias del gen ARNr 16S de A. bestiarum y A. salmonicida presentan una similitud del 99.8 al 100% (Martínez-Murcia y cols., 1992; Martínez-Murcia y cols., 2005) y presentan sólo 2 nucleótidos distintos entre sus cepas tipos en las posiciones 1011 y 1018 (en referencia a la secuencia de E. coli de Brosius, 1978), mientras que las subespecies A. salmonicida subsp. achromogenes y A. salmonicida subsp. masoucida presentan la misma secuencia del ADNr 16S que A. bestiarum. Esta diferencia entre las secuencias no siempre puede ponerse de manifiesto ya que se ha observado que ambas especies comparten operones ribosómicos (Martínez-Murcia y cols., 2005; Reith y cols., 2008). Sin embargo, la utilización de genes estructurales, concretamente el rpoD y gyrB, permitieron la separación clara de estas dos especies (Yáñez y cols., 2003; Soler y cols., 2004). En lo referente a sus perfiles bioquímicos se ha comprobado que pruebas que se creían específicas y absolutas para la separación de estas dos especies son variables y que por tanto, A. salmonicida y A. bestiarum son difícilmente diferenciables bioquímicamente (Martínez-Murcia y cols., 2005). Otra especie conflictiva es A. encheleia, descrita por Esteve y cols. (1995c) con valores de similitud con el resto de especies de Aeromonas por debajo del 70%, utilizado el método descrito por Johnson (1981) con una temperatura de renaturalización de 56ºC (Tabla 4). Tabla 4. Valores, condiciones y métodos de DDH entre las cepas tipo de A. encheleia, A. eucrenophila y Grupo de Hibridación 11 descritos en la literatura. Condiciones y valores de DDH (%) en distintos estudios Parámetros 1-2 ADN-ADN (%) 1-3 2-3 Temperatura ºC Formamida % Método Esteve y cols., 1995c 7 12 ND 56 30 Johnson , 1981 Huys y cols., 1997b 46 84 52 78.3 De Ley y cols., 1970 Nhung y cols., 2007 66.5 83.5 62.5 45 50 Ezaki y cols., 1989 1. A. encheleia CECT4342T ; 2. A. eucrenophila CECT4224T; 3. Grupo de Hibridación 11 CECT4253; ND No determinado La especie más similar a A. encheleia, con un 49%, fue A. salmonicida mientras que con A. eucrenophila y el GH11 mostraba una similitud de 7 y 12% respectivamente. Un estudio publicado 2 años después (Huys y cols. 1997b) muestra valores de similitud entre A. encheleia y A. eucrenophila y A. encheleia y el GH11 de 46% y 84% respectivamente, utilizando el método de De Ley y cols. (1970) con una temperatura de renaturalización de 78.3ºC. Cabe destacar que en este estudio cepas de A. encheleia mostraban un grado de similitud superior al 100%. Este alto valor de similitud obtenido por 13 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Huys y cols. entre A. encheleia y el GH11 (Huys y cols. 1997b) dio lugar a la propuesta de considerar el GH11 como un sinónimo de A. encheleia. Esta propuesta se ve apoyada por los valores del 83.5% de similitud entre estas dos especies obtenido por Nhung (Nhung y cols., 2007) con el método de Ezaki (Ezaki y cols., 1989) a una temperatura de reasociación de 45ºC. Los datos aportados por la DDH junto con los aportados por los diversos estudios filogenéticos de los gene gyrB, rpoD, rpoB, dnaJ, recA y cpn60 (Yáñez y cols., 2003; Soler y cols., 2004; Küpfer y cols., 2006; Nhung y cols., 2007; Sepe y cols., 2008; Miñana-Galvis y cols., en prensa) indican que A. encheleia y GH11 representan un único taxón. Cabe destacar también el caso de A. hydrophila subsp. dhakensis, descrita por Huys y cols. en el año 2002 en base a cepas aisladas de heces de pacientes con diarrea en Bangladesh y clasificadas en base a su perfil bioquímico de PhP (PhenePlate [PhP] types) como grupo BD-2 (Kühn y cols., 1997). Tanto el análisis bioquímico (152 pruebas) como los análisis de los perfiles de FAFLP y ERIC-PCR mostraban que el grupo BD-2 era fenotípica y genómicamente diferente de A. hydrophila (GH1), sin embargo, los resultados de DDH mostraban un alta similitud (77%) del grupo BD-2 con la cepa tipo de A. hydrophila, por lo que estas cepas se definieron como una nueva subespecie de A. hydrophila. El método de DDH empleado fue el de Ezaki y cols. (1989) a una temperatura de renaturalización de 45ºC (50% formamida). A parte de los valores de similitud del 77-78% del grupo BD-2 con A. hydrophila, ya mencionados, obtienen valores del 33-65% con el resto de especies del género y 7784% entre cepas de este grupo (Huys y cols., 2002). Los estudios recientes que han incluido cepas de esta subespecie en sus análisis filogenéticos con los genes ARNr 16S, rpoB, gyrB, (Küpfer y cols., 2006), dnaJ (Nhung y cols., 2007) y cpn60 (Miñana-Galbis y cols., en prensa) revelan grandes diferencias con el resto de las subespecies de A. hydrophila. Estos autores interpretan dichas diferencias como variablidad intraespecífica. En conclusión se puede decir que existe una elevada variabilidad de resultados de DDH en Aeromonas en función de la temperatura y métodos utilizados en la literatura, lo que unido al alto grado de similitud interespecie en base al ADNr 16S y al solapamiento de los perfiles bioquímicos de las distintas especies, dificulta en gran medida su separación. 1.2.3. Genes que codifican proteínas esenciales: Housekeeping Los genes housekeeping son genes que codifican proteínas con funciones esenciales para la supervivencia de la bacteria. La información filogenética que contienen es mayor que la del ARNr, ya que tienen una tasa evolutiva mayor y sus variaciones se encuentran distribuidas por todo el gen. Existen una serie de condiciones recomendadas para la selección de estos genes (Harayama y Kasai, 2006): - No estar influidos por la Transferencia Génica Horizontal (HGT) - Estar presentes en todas las bacterias - Existir en copia única en el genoma 14 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN - Poseer al menos dos regiones altamente conservadas en el gen para el diseño cebadores (PCR) La HGT es un proceso común entre bacterias, frecuente en los genes que codifican proteínas implicadas en funciones metabólicas y raro en los genes informativos (Harayama Kasai, 2006). Se han propuesto una serie de genes housekeeping que cumplen los requisitos enunciados y que ya han sido utilizados en distintos grupos bacterianos obteniéndose resultados favorables: gen de la proteína RecA (recA), chaperonas (cpn), ARN polimerasa (rpo), Factor elongación G (EF-G) y girasa (gyr) entre otros (Harayama Kasai, 2006). En el género Aeromonas se han evaluado hasta la fecha 6 genes housekeeping: gyrB, rpoD, rpoB, recA, dnaJ y cpn60 (Yáñez y cols., 2003; Soler y cols., 2004; Küpfer y cols., 2006; Nhung y cols., 2007; Sepe y cols., 2008; Miñana-Galbis y cols., en prensa). El primer gen estructural estudiado en el género fue el gyrB (Yáñez y cols., 2003) demostrándose que este gen proporcionaba resultados congruentes con los obtenidos con el análisis del gen ARNr 16S, por lo que fue considerado un buen cronómetro molecular para realizar estudios filogenéticos en Aeromonas. Este gen codifica para la subunidad B de la girasa del ADN, topoisomerasa tipo II compuesta por dos subunidades codificadas por los genes gyrA y gyrB. Esta topoisomerasa actúa durante la replicación del ADN liberando las tensiones del súper-enrollamiento de las hebras efectuando cortes en las 2 cadenas. En el estudio de Yáñez y cols. (2003) se secuenciaron 1100 nucleótidos del gen de 53 cepas comprobándose que el 32% de las posiciones secuenciadas eran variables, los valores medios de similitud máxima interespecie y mínimos intraespecie eran inferiores al 97% y superiores al 98% respectivamente. El valor de similitud dentro del género mínimo del gen gyrB fue del 86% y con los géneros más cercanos inferior al 77% (Yáñez y cols., 2003). No obstante, en base a este gen no se pudieron diferenciar A. encheleia del GH11. La taxonomía de Aeromonas en base al gen rpoD se publicó un año después, en el 2004 por Soler y cols. El gen rpoD codifica para la subunidad o factor sigma de la RNA polimerasa que interacciona con secuencias del promotor para determinar el sitio de inicio de la trascripción. En el trabajo de Soler y cols. (2004) se secuenciaron unos 820 nucleótidos del gen en 70 cepas observándose que el 34% de las posiciones eran variables, un valor muy similar al observado en el estudio del gen gyrB (Soler y cols., 2004). Los valores medios de similitud máximos interespecie y mínimos intraespecie fueron inferiores al 97% y superiores al 98% respectivamente, con un valor de similitud intragénero mínimo del 82% (Soler y cols., 2004). En base a este gen no se pudo diferenciar A. encheleia del GH11 pero se diferenciaban claramente A. salmonicida de A. bestiarum. En este estudio se utilizaron las mismas cepas que en el estudio del gen gyrB (Yáñez y cols., 2003) y se observaron topologías congruentes entre ambos árboles filogenéticos. La concatenación de las secuencias de ambos genes permitió obtener un árbol filogenético más robusto que los árboles individuales (Soler y cols., 2004). El tercer estudio de genes housekeeping en Aeromonas fue el publicado por Küpfer y cols. en el año 2006 en base al gen rpoB que codifica para las subunidad B de la polimerasa del ARN. Se 15 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN secuenciaron un total de 558 nucleótidos del gen de 54 cepas. Los valores de similitud interespecie obtenidos variaban entre el 87-94% pero no se pudieron diferenciar las especies A. bestiarum de A. salmonicida ni A. encheleia del GH11. En este estudio, al igual que en el de Soler y cols. (2004) se compara la topología del árbol construido, con las secuencias del gen rpoB, con el generado en base al gyrB encontrando resultados congruentes entre los dos árboles aunque, a diferencia del trabajo anterior, no llega a sumarse la información de ambos genes. Estudios recientes han demostrado, al analizar diversos géneros bacterianos, que existe una correlación entre los valores de similitud interespecie inferiores al 98% del gen rpoB completo con los valores de similitud de DDH inferiores al 70% proponiéndose que podría utilizarse la secuencia de dicho gen para la delimitación de especies procariotas (Adekambi y cols., 2008). Otro de los genes investigado en Aeromonas es el dnaJ, aunque en este estudio sólo se incluyeron las cepas tipo de las distintas especies y las subespecies de A. salmonicida y A. hydrophila, se realiza conjuntamente un análisis de DDH entre las mismas (Nhung y cols., 2007). El gen dnaJ codifica la proteína de choque térmico 40 que actúa como una cohorte funcional de la proteína DnaK (Caplan y cols., 1993). En el estudio de Nhung y cols. (2007) se secuenciaron unos 891 nucleótidos obteniendo unos valores medios de similitud interespecie inferiores al 94.8% aunque estos valores, tal y como hemos indicado, se derivaron de comparar sólo las cepas tipo. Los valores de similitud intraespecie fueron superiores al 96.7% al comprar sólo las subespecies. El valor de similitud medio dentro del género fue del 89.2%. En base al gen dnaJ no se pudieron diferenciar A. encheleia del GH11 ni A. allosaccharophila de A. veronii. Entre las publicaciones más recientes de genes housekeeping y aplicado a la taxonomía de Aeromonas se encuentra el recA, publicado por Sepe y cols. (2008), del mismo grupo de investigación que estudió el rpoB (Küpker y cols., 2007). El gen recA codifica para una proteína multifuncional implicada en la recombinación homóloga, la reparación de ADN y la respuesta SOS, concretamente se une específicamente a regiones de ADNmc, relaja los dúplex de ADN, y reconoce regiones de los cromosomas homólogas en el proceso de recombinación (Thompson y cols., 2004). En el trabajo de Sepe y cols. (2008) se secuenciaron sólo 272 pb del gen de 54 cepas [las mismas del estudio del rpoB de Küpfer y cols. (2006)] obteniéndose un valor de similitud interespecie medio del 92.2%. La clasificación generada en base a este gen coincide en el 85% de las cepas con la establecida en base al gyrB y rpoB en el estudio de Küpfer y cols. (2006), sin embargo, el resto de cepas se agrupan con especies diferentes (Sepe y cols., 2008). En base al gen recA no se pudo diferenciar A. encheleia del GH11. El último gen estudiado en la discriminación de especies de Aeromonas, cuya publicación aún esta en prensa, es el gen cpn60 (Miñana-Galbis y cols., en prensa). Este gen ha demostrado una buena capacidad en la separación de las especies del género pero, en algunos casos, con una escasa variabilidad intraespecie puesto que varias cepas, dentro de diversas especies, mostraron una secuencia idéntica, en especial dos cepas de A. popoffii (LMG17542 y LMG17543) reconocidas como diferentes 16 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN en varios estudios (Soler y cols., 2003; 2004). Este gen codifica la chaperona tipo I Cpn60 (Hsp60 o GroEl). La región secuenciada por estos autores (555 pb) se había demostrado previamente que era filogenéticamente representativa de la información contenida en el gen completo (Miñana-Galbis y cols., en prensa). La secuenciación de 35 cepas mostró que el 34.1% de las posiciones eran variables, proporción similar a la observada en los genes gyrB y rpoD (Soler y cols., 2004), con valores de similitud intraespecie superiores al 96.5% e interespecie entre el 96.3-83.1%, con un valor dentro del género mínimo del 76.7%. En base a este gen no se pudo diferencia el GH11 de A. encheleia y A. allosaccharophila y A. veronii pueden diferenciarse, aunque existe un alto valor interespecie (96.395.5%), mientras que A. salmonicida y A. bestiarum pueden diferenciarse claramente presentando A. salmonicida una baja variabilidad intraespecífica (0-1.5%). Hasta la fecha, tal y como se ha mencionado previamente, no se ha podido diferenciar filogenéticamente A. encheleia del considerado GH11, lo que confirma la propuesta de Huys y cols. (1997b), en base a la alta similitud de la DDH, de considerar el GH11 como un sinónimo de A. encheleia. 1.2.4. Estudio fenotípico En este apartado se incluyen las características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. En la morfología se estudian tanto parámetros celulares: forma, presencia de flagelos, de cuerpos de inclusión, de endoesporas o la tinción Gram; como parámetros coloniales: color, forma y dimensiones. Las características fisiológicas incluyen datos de las condiciones de crecimiento (sal, pH, temperatura, oxigeno) mientras que las bioquímicas comprenden la presencia de enzimas, metabolización de sustratos y la resistencia a agentes antimicrobianos, así como los perfiles de proteínas totales. 1.2.4.1. Características fenotípicas clásicas Características fenotípicas clásicas para la identificación del género Aeromonas son la tinción de Gram negativa, presencia de la citocromo oxidasa generalmente positiva, crecimiento en caldo nutritivo al 0% de NaCl y negativo al 6%, la no producción de ácido de inositol, la capacidad de oxidar-fermentar la glucosa y el crecimiento en presencia del factor vibriostático O/129 positiva (Altwegg, 1999). 1.2.4.2. Sistemas no automatizados Para la identificación de las especies de Aeromonas se han aplicado numerosos protocolos bioquímicos, muchos de los cuales sólo discriminan a los tres grandes grupos fenotípicos tradicionales que engloban los complejos de especies “A. hydrophila”, “A. caviae” y “A. sobria” (Namdari y Bottone, 1990; Piersimoni y cols., 1990; Wilcox y cols., 1992), mientras que otros están orientados a 17 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN la identificación de cepas a nivel de especie (Carnahan y cols., 1991a; Abbott y cols., 1992; Kämpfer y Altwegg, 1992; Carnahan y Joseph, 1993; Oakey y cols., 1996; Janda y cols., 1996; Kaznowski, 1998; Altwegg, 1999). De todos estos estudios se dedujo que el 85% de las cepas que se caracterizan a partir de muestras clínicas correspondían a las especies A. hydrophila, A. caviae y A. veronii bv sobria. De los trabajos taxonómicos que incluyen de forma mayoritaria cepas de origen ambiental (Austin y cols., 1989; Okpolwasili, 1991; Martínez-Murcia y cols., 1992; Esteve, 1995a; Noterdaeme y cols., 1996; Kaznowski, 1998; Borrell y cols., 1998; Renauld y cols., 1998), se demostró una mayor diversidad de especies, aisladas de muestras ambientales, que la observada a partir de muestras clínicas. El estudio de Miñana-Galbis y cols. (2002) incluye 202 aislados de Aeromonas, 101 de agua dulce, 88 de moluscos bivalvos y 13 de origen clínico, que analizan en base a 64 pruebas bioquímicas y pudiendo identificar el 91% de los aislados con sólo 16 pruebas (Miñana-Galbis y cols., 2002). De los estudios recientes el más destacado es el de Abbott y cols. en el año 2003 en el que ensayan 62 pruebas bioquímicas en 193 cepas de todas las especies de Aeromonas definidas y observando que sólo 9 pruebas (14.5%) generaban resultados comunes para las 163 cepas: presencia de citocromo oxidasa y nitrato reductasa, fermentación de la D-glucosa y trealosa, la no utilización del mucato y la incapacidad de fermentar el D-arabitol, dulcitol, eritol y xilosa. Recogen además una lista de reacciones atípicas junto con distintas pruebas para la diferenciación de fenoespecies dentro de los complejos “A. hydrophila, A. caviae y A. sobria”. En este estudio se observa además que existe, en todas las especies excepto en A. jandaei, una correlación directa entre la fermentación de melobiosa y rafinosa por lo que los que sugieren que los genes que codifican estos procesos podrían estas ligados (Abbott y cols., 2003). En el año 2005 se publica el trabajo de Ormen y cols. que evalúan la concordancia entre identificación molecular, en base al RFLP del ADNr 16S (Borrell y cols., 1997; Figueras y cols., 2000a) y la identificación bioquímica, en base a 19 pruebas, en 171 cepas: 95 clínicas y 72 ambientales junto con 4 cepas de referencia. En este estudio se demuestra que las cepas de origen ambiental presentan un 96% de resultados divergentes frente al 46% observado en cepas clínicas. Estas últimas estaban constituídas principalmente (81%) por A. caviae, A. jandaei, A. hydrophila y A. veronii. Otro estudio más reciente (Kozinska, 2007) identifica con este mismo protocolo de RFLP del ADNr 16S (Borrell y cols., 1997; Figueras y cols., 2000a) 131 aislados de carpa y trucha, conjuntamente con 20 pruebas bioquímicas y observa que existe una gran diversidad fenotípica intraepecífica en las 9 especies que aísla y que además 9 cepas (el 7% de los aislados) sólo podían identificarse por el método molecular. 1.2.4.3. Sistemas automatizados Los sistemas miniaturizados de origen comercial son los más utilizados de forma rutinaria en los laboratorios clínicos para la identificación de bacterias. Éstos sistemas están diseñados 18 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN principalmente para la identificación de bacterias Gram negativas, oxidasa negativas y aerobias o anaerobias facultativas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae y dan poca relevancia a bacterias oxidasa positivas pertenecientes a los géneros Vibrio y Aeromonas (Overman y cols., 1985; Abbott y cols., 1998). Los resultados obtenidos tras comparar la identificación bioquímica de las especies de Aeromonas utilizando sistemas no automatizados y sistemas automatizados mostraron una buena correlación (Vivas y cols., 2000). Sin embargo, cuando ésta comparación se realizó con cepas identificadas genéticamente por RFLP del ADNr 16S la concordancia resultó ser muy baja (Borrell, 1998). El problema más importante que presenta la identificación con los sistemas bioquímicos automatizados es la confusión de cepas de Aeromonas con especies del género Vibrio (Overman y cols., 1985, 1986; Kuijper y cols., 1989; Kuijper y Peeters, 1991; Abbott y cols., 1998; Vivas y cols., 2000), en especial con las especies V. cholerae y V. fluvialis (Soler y cols., 2003). 1.2.5. Técnicas de tipado molecular Las técnicas de tipado se pueden clasificar en función de su diana: 1. el genoma completo: PFGE, RAPD-PCR, AFLP, REP-PCR, ERIC-PCR, BOX-PCR 2. grupos de genes: tipado de operones ribosómicos o ribotipado 3. parte de las agrupaciones de genes: Espaciador intergénico (ITS) del ADNr 16S-23S 4. genes individuales: RFLP del ADNr 16S, T-RFLP, DDGE, TGGE. 1. Genoma completo. Debido a la dificultad para identificar bioquímicamente a las especies de Aeromonas, la mayoría de métodos de tipado empleados en este género han sido valorados también como métodos taxonómicos. Talon y cols. en 1996 realizan un estudio de tipado por PFGE comparando las endonucleasas XbaI, SpeI, SwaI y DraI; observan que los patrones generados eran congruentes y estables excepto con el enzima DraI. Dos años más tarde, este mismo grupo evalúa por el método de RAPD y PFGE, 25 cepas de A. hydrophila de origen clínico y ambiental (Talon y cols., 1998), el RAPD se realizan con los cebadores AP3 y AP5 y utilizan la endonucleasa XbaI para el PFGE. Los resultados que obtuvieron eran concordantes entre las dos técnicas cuando se utilizaban los cebadores AP3 en el RAPD. Hänninen y cols. (1999) estudian la diversidad genética de 105 A. salmonicida atípicas de distintas localizaciones geográficas mediante PFGE, utilizando el enzima XbaI y el método de ribotipado. De las 105 cepas observan 31 genotipos por PFGE, muy similar a lo observado con ribotipado pero siendo el primero más discriminatorio a nivel de cepa. En Aeromonas el RAPD se ha utilizado en diversos estudios obteniéndose en la mayoría de los casos resultados congruentes con los observados con otras técnicas moleculares de tipado con los cebadores AP12H-HLW74 (Davin-Regli y cols., 1998; Alavandi y cols., 2001). Recientemente Korbsrisate y cols. (2007) han determinado la diversidad genética en 110 cepas de A. hydrophila de 19 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN origen clínico y ambiental mediante RAPD destacando un patrón que sólo se asocia con cepas ambientales. O´hIci y cols. (2000) tipan 59 cepas de A. salmonicida mediante PFGE, con el enzima SpeI, y RAPD, con los cebadores H1,H2 y H3, obteniendo resultados concordantes. Villiari y cols. (2000) realizan un estudio de prevalencia de Aeromonas en comida precocinada y destacan que A. hydrophila predomina en alimentos de origen animal mientras que en los de origen vegetal es A. caviae, además observan una gran heterogeneidad en los aislados mediante PFGE (de 27 cepas de A. hydrophila detectan 24 genotipos diferentes y 20 entre las 23 cepas de A. caviae). Girand y cols. (2004) estudian, mediante la técnica PFGE con el enzima de restricción SpeI, la relación clonal entre aislados de A. salmonicida resistentes a las quinolonas y determinan la existencia de un origen común entre los aislados resistentes. Abdullah y cols., (2003) tipan 52 cepas de origen animal, humano y ambiental mediante la misma técnica pero con el enzima XbaI observando una buena correlación con el RFLP del gen aroA (codifica para el enzima 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa, necesaria para la síntesis de aminoácidos aromáticos y cuya función es esencial para la supervivencia de la bacteria), siendo el segundo el más discriminatorio. Bonnadonnna y cols. en el 2002 observan una baja correlación con el tipado bioquímico, siendo la técnica molecular, PFGE, la más discriminatoria y observándose gran homogeneidad fenotípica entre los aislados clínicos. La utilidad del AFLP y FAFLP, con las endonucleasas ApaI y TaqI, con fines taxonómicos en Aeromonas se evaluó en 1996 y 1999 por Huys y cols. incluyendo en ambos estudios 98 cepas tipo y de referencia. Los resultados que obtuvieron eran congruentes con la taxonomía de Aeromonas. Estos trabajos ha sido referenciados en numerosas ocasiones y empleadas las técnicas tanto con fines taxonómicos en la identificación de aislados (Khund y cols., 1997), en la descripción de especies y subespecies (Huys y cols., 1997a, 2002a, 2003; Demarta y cols., 2004, 2007; Miñana-Galbis y cols., 2004, 2007), en reclasificaciones (Huys y cols., 2001) así como en estudios de diversidad genética (Khund y cols., 1997a, b; Ringo y cols., 2002; Lund y cols., 2002; Rahman y cols, 2002, 2007). El único estudio que existe hasta la fecha de tipado de Aeromonas en base a BOX-PCR es el realizado por Tacao y cols. (2005a) con los cebadores A1R. En este estudio se tipan 42 cepas de Aeromonas, identificadas genéticamente en base al RFLP del ADNr 16S (Borrell y cols., 1997; Figueras y cols., 2000a). Los perfiles genotípicos estaban formados por entre 4-16 bandas de 300 a 4500 pb. Se estableció que esta técnica era útil para el tipado a nivel de cepa pero no de especie. Existen, sin embargo, múltiples estudios en los que se han utilizado las técnicas del REP- y/o ERICPCR solas o en combinación con otras técnicas de tipado en Aeromonas (Nocáková y cols., 2009; Beaz-Hidalgo y cols., 2008; Aguilera-Arreola y cols., 2005; Szczuka y Kaznowski, 2004; Huys y cols., 2003; Soler y cols., 2003; Sechi y cols., 2002; Huys y cols., 2002; Davin-Regli y cols., 1998). El ERIC-PCR fue aplicada en un estudio de cepas de A. hydrophila aisladas de 4 pacientes durante un mismo periodo y del agua de suministro del hospital. Aunque no se pudo demostrar la relación entre las cepas aisladas del agua y las de los pacientes, sí se encontraron 2 pacientes colonizados por la 20 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN misma cepa que habían utilizado la misma habitación, demostrándose la eficacia de esta técnica en estudios epidemiológicos (Davin-Regli y cols., 1998). Sechi y cols., (2002) caracterizan 46 cepas de origen ambiental y clínico de Italia también mediante el ERIC-PCR. El estudio comparativo de Soler y cols, (2003) en 26 aislados de A. popoffii de diferentes orígenes geográficos mostró que el ERIC-PCR era más discriminatorio que el REP-PCR y el RFLP del ITS 16S-23S, mientras que al combinar estas técnicas los mejores resultados se obtenían de la combinación del ERIC-PCR con el REP-PCR. En los estudios de Huys y cols. (2002, 2003) se observa una buena correlación entre el ERIC-PCR y F-AFLP. Szczuka y Kaznowski en el 2004 tipan mediante ERIC-, REP-PCR y RAPD 120 cepas de Aeromonas de origen clínico y ambiental observando que ERIC-PCR y RAPD eran las más discriminatorias ya que con el REP-PCR, 25 cepas no se pudieron diferenciar. En este estudio, los autores no pudieron asignar un genotipo determinado de Aeromonas a cepas implicadas en gastroenteritis. Resultados congruentes entre ERIC-PCR y RAPD se observaron también en el estudio de Aguilera-Arreola y cols. en el 2005, en el que evalúan el genotipo de cepas de A. hydrophila. En este estudio se pudieron observar agrupaciones diferentes entre las cepas de A. hydrophila de origen clínico y las ambientales. Recientemente, estudios publicados en el año 2008 muestran que el ERIC-PCR podría ser útil para el tipado a nivel de especie (Nováková y cols., 2008) y subespecie (Beaz-Hidalgo y cols., 2008). 2. El ribotipado de operones ha sido utilizado con fines taxonómicos en el género Aeromonas (Martinetti Lucchini y Altwegg, 1992; Demarta y cols., 2004) aunque principalmente se ha evaluado con fines epidemiológicos (Demarta y cols., 2000). Sin embargo, se ha demostrado que el AFLP presenta un mayor poder discriminatorio que el ribotipado ya que cepas que presentaba patrones de ribotipado idénticos poseían perfiles de AFLP distintos (Demarta y cols., 2004). 3. En Aeromonas, concretamente en A. hydrophila, se ha descrito que la longitud del espaciador intergénico 16S-23S oscila entre 472 y 544 pb (Gürtler y Stanisich, 1996). El estudio de RFLP del 16S-23S ISR, como técnica de tipado, fue evaluada en 55 A. veronii de origen clínico y ambiental, demostrándose que dicha técnica produce patrones cepa específicos y permite reconocer cepas derivadas de un mismo clon en un sistema de distribución de agua potable (Martínez-Murcia y cols., 2000). En este mismo estudio se reconoció su utilidad en el marcaje epidemiológico al detectarse la persistencia de un único microorganismo, al menos durante una semana, en un paciente del que se pudo aislar de dos coprocultivos distintos. En el año 2003, Pidiyar y cols., secuencian el ISR del 16S23S y el gen ARNr 23S de la cepa tipo de A. culicicola, en la actualidad sinónimo de A. veronii (Huys y cols., 2005) revelando la existencia de 10 operones ribosomales. Ese mismo año Lawanowska y Kaznowski publican un trabajo en el que analizan 69 Aeromonas sp. pertenecientes a los 18 Grupos de Hibridación mediante RFLP del ISR 16S-23S. Obtienen genotipos constituidos por 2-8 bandas comprendidas entre los 730 pb y los 1050 pb, pero parte de las bandas eran debidas a la existencia de heteroduplex. Aunque fueron capaces de detectar variabilidad inter- e intraespecífica, la resolución de 21 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN la técnica no permitió el agrupamiento de los genotipos a nivel de especie. Estos mismos autores, un año después (Lawanowska y Kaznowski, 2004) aumentan el número de endonucleasas utilizadas en el protocolo con: Hind6I, Csp6I, TaqI y TasI. La combinación de los distintos patrones les permitió diferenciar algunas genoespecies constituyendo grupos separados, A. hydrophila, A. bestiarum y A. salmonicida del denominado “Complejo Hydrophila” e incluso distinguir algunas subespecies de A. salmonicida. En el año 2005, Martínez-Murcia y cols., publican un estudio de A. bestiarum y A. salmonicida basado en varias técnicas moleculares y bioquímicas. En el análisis de RFLP del ISR 16S-23S realizaron digestiones dobles con HinfI-CfoI y HinfI-TaqI y observaron que el dendograma construido al integrar los genotipos, generados por ambas digestiones, no permitía separar A. salmonicida y A. bestiarum pero que separaba claramente A. hydrophila y A. popoffii. 4. Genes individuales. En Aeromonas la técnica basada en el RFLP del gen ARNr 16S, tal y como se ha comentado previamente, ha sido ampliamente utilizada con fines taxonómicos y existen multitud de protocolos para la identificación de Aeromonas (Borrell y cols., 1997; Graf 1999; Figueras y cols., 2000a; Lee y cols., 2002; Kaznowski y Konecka, 2005; Ghatak y cols., 2007). En Aeromonas la DGGE se ha utilizado en el gen gyrB, amplificado con cebadores específicos de género, comprobando que las cepas que mostraban idénticas bandas eran a su vez idénticas en su secuencia (Tacao y cols., 2005b). En este estudio se pudo además comprobar la existencia de variabilidad intragenómica en el gen ARNr 16S ya que a partir de un único aislado se obtuvieron múltiples bandas cuando el amplicon de 200 pb de la RV3 se sometía a un análisis de DGGE. 1.3. Epidemiología del género Aeromonas 1.3.1. Ecología Animales El género Aeromonas es considerado patógeno de animales desde sus primeros aislamientos en septicemias de ranas y peces enfermos (Farmer y cols., 2006). A. salmonicida y A. hydrophila son patógenos reconocidos de peces, en especial de la familia de los salmónidos en los que generan úlceras, hemorragias, forunculosis y septicemias, produciendo grandes pérdidas en la industria de la acuicultura (Pylkkö y cols., 2005, 2006; Treasurer y cols., 2007; Reith y cols., 2008). También se han detectado como patógenos de equinodermos (Yang y cols., 2008), moluscos (Miñana-Galbis y cols., 2004, 2007) y asociados a copépodos (Glugliandolo y cols., 2008). A. hydrophila es un reconocido patógeno de ranas que causa la denominada “pata roja” (Paerson y cols., 2000; Mauel y cols., 2002; Millers y cols., 2008) y recientemente se ha descrito que esta especie forma parte de la microbiota intestinal normal en cocodrilos del Nilo (Lovely y cols., 2008). También pueden causar septicemia en aves de corral (Saif y Bush, 1974), sin embargo, en gaviotas también se han definido como microbiota normal (Kinzelman y cols., 2008). Existen diversas publicaciones que describen las Aeromonas como 22 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN microbiota normal de los dípteros. A. caviae se ha aislado del tracto digestivo de moscas comunes (Nayduch y cols., 2001) mientras que la especie A. culicicola (en la actualidad sinónima de A. veronii) se aisló del intestino de mosquitos hembra de las especies Culex quinquefasiatus y Aedes aegyptii (Pidiyar y cols., 2002). Recientemente se han propuesto las masas de huevos de dípteros acuáticos como un reservorio de Aeromonas (Senderovich y cols., 2008). La utilización de sanguijuelas con fines medicinales es, en numerosos casos, seguida de una infección por Aeromonas (Kalbermatten y cols., 2007; Etemadi y cols., 2008; Fraisse y cols., 2008). De hecho, se ha reconocido la existencia de una relación simbiótica entre las sanguijuelas y Aeromonas, ya que éstas participan en la hemólisis de los glóbulos rojos. Clásicamente se pensaba que la especie simbionte de las sanguijuelas era A. hydrophila, sin embargo, estudios recientes, utilizando métodos moleculares, han demostrado que no se trata de esta especie sino que son A. veronii y A. jandaei las que están asociadas con sanguijuelas pertenecientes al género Hirudo (H. medicinalis, H. orientalis y H. verbana) utilizadas en medicina (Gaf, 1999; Siddall y cols., 2007; Laufer y cols., 2008). Agua Las Aeromonas son organismos autóctonos del medio acuático. Se han aislado de aguas superficiales, subterráneas, aguas de consumo, embotelladas, residuales, de regadío así como en aguas marinas y de estuarios (Borrell y cols., 1998; Martínez-Murcia y cols., 2000; Maalej y cols., 2002, 2003; Bonadonna y cols., 2003; Villari y cols., 2003; Pianetti y cols., 2004; Figueras y cols., 2005). En las aguas de consumo se han detectado niveles inferiores a las 10UFC/ml, su resistencia a la cloración se relaciona con la formación de biofilms, mientras que en las aguas embotelladas se han detectado concentraciones superiores a 3 log10 UFC/ml (EPA, 2006). En algunos países como Canadá y USA se realiza un control de la presencia de Aeromonas en las aguas embotelladas, que están clasificadas como alimentos (EPA, 2006), mientras que en otros, como Holanda, se han establecido criterios de calidad en base a la presencia de Aeromonas. Las aguas de regadío que contienen Aeromonas se consideran a su vez la primera fuente de contaminación de frutas y vegetales (Pianetti y cols., 2004). Alimentos Las Aeromonas se han aislado tanto de frutas, verduras, productos lácteos, carnes y embutidos, pescados y marisco (Borrell y cols., 1998; Villari y cols., 2002) siendo estos alimentos junto con el agua contaminada la principal fuente de contaminación de Aeromonas en los procesos diarreicos. La temperatura, salinidad, pH, y concentración de agua son los factores que determinan el número de Aeromonas en estos alimentos (Maton-Carnahan y Joseph, 2005). 23 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN 1.3.2. Infecciones por Aeromonas en humanos Las Aeromonas son consideradas, actualmente, como un patógeno oportunista emergente habiéndose asilado como agente etiológico en diversos procesos infecciosos como septicemias, enfermedades pancreáticas o hepatobiliares, peritonitis, colangitis, infecciones nosocomiales, osteomielitis y como agente causal del síndrome urémico hemolítico (SUH) (Janda y Abbott, 1998; Figueras, 2005; Graevenitz, 2007). Sin embargo, las Aeromonas son principalmente patógenos entéricos que afectan con mayor frecuencia a niños, ancianos e individuos inmunocomprometidos (Figueras, 2005). Se han descrito numerosos casos de bacteriemias (Figueras, 2005; Dwivedi y cols., 2009) e infecciones extraintestinales tales como meningitis, neumonía, queratitis (Figueras, 2005) y osteomielitis (Gunasekaran y cols., 2009) causadas por Aeromonas en paciente sanos e inmunocompetentes. Se han descrito múltiples factores de virulencia en Aeromonas en relación con estas infecciones incluyendo aerolisinas, hemolisinas, lipasas, enterotoxinas citolíticas y citotónicas (Martin-Carnahan y Joseph, 2005) así como la existencia de diversos Sistemas de Secreción (Vilches y cols., 2004; Seshadri y cols., 2006; Retih y cols., 2008). Las especies mesófilas de Aeromonas con mayor implicación en clínica son A. hydrophila, A. veronii y A. caviae, responsables del 85-90% de los casos (Janda y Abbott, 1998; Figueras, 2005), sin embargo, otras 11 especies han sido aisladas en diversos casos clínicos (Figueras, 2005). 1.3.2.1. Intestinales El primer aislamiento de Aeromonas de heces tuvo lugar en 1961 aunque ya se había asilado antes, en 1954, como agente de una miositis en una mujer jamaicana y desde entonces son numerosos los estudios que las han asociado con numerosas infecciones siendo las más comunes las gastroenteritis (Graevenitz, 2007; Figueras, 2005). A pesar de que las Aeromonas se han visto implicadas como agentes causales de diarreas y gastroenteritis en numerosos casos, su papel enteropatógeno ha sido puesto en duda debido principalmente a su presencia en portadores asintomáticos y a los escasos brotes epidemicos (Figueras, 2005; Graevenitz, 2007). Aunque este argumento es poco defendible ya que esta peculiaridad también ocurre en otros enteropatógenos, de hecho, al igual que las diarreas causadas por otros microorganismos entéricos, las relacionadas con Aeromonas suelen ser autolimitadas con una duración inferior a una semana o bien prolongarse durante más de dos semanas pudiendo llegar a ser crónica con más de un año de duración. Las nauseas, vómitos, fiebre y calambres abdominales se dan sólo en una fración de los pacientes, mientras que la colitis se da en un tercio de la diarreas causadas por Aeromonas (Graevenitz, 2007). Las gastroenteritis producidas por Aeromonas son un problema entre la población pediátrica con una incidencia de entre el 2.3% y el 13% en paises como Taiwan y Nigeria, respectivamente, ocupando el segundo o tercer puesto entre las bacterias enteropatógenas más frecuentes en dichos 24 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN paises (Figueras, 2005) . En España, en el año 2007 (Figura 2) se registraron 544 casos de gatroenteritis causadas por Aeromonas, ocupando así el cuarto puesto de entre las bactérias entéricas, por delante de Yersinia y Shigella (Boletín Epidemiológico del Centro Nacional de Epidemiología). En el 2-20% de los casos las infecciones son monomicrobianas y sólo entre el 0-2% de los niños son portadores asintomáticos (Chopra y Houston, 1999). Las diarreas se producen principalmente en niños menores de 3 años, con una duración de una o dos semanas y heces de consistencia acousa (Figueras, 2005). Figura 2. Tendencias de los microorganismos más relevantes causantes de infecciones gastrointestinales en España desde 1989 hasta 2007 (Boletín Epidemiológico del Centro Nacional de Epidemiología). La incidencia en adultos varía desde el 2% observado en Suecia, el 6.9% en Hong Kong en personas sanas y el 13% en pacientes inmunocomprometidos, siendo en estos últimos el segundo o tercero de entre los enteropatógenos más frecuentes (Figueras, 2005). Entre los pacientes con diarrea del viajero en España, Aeromonas fue definido como agente causal en el 2% de los casos (Vila y cols., 2003), mientras que en Japón se aisló en un 5.5% de los casos (Figueras, 2005) y un 8.7% en Finlandia. En el 5.5% de los casos de diarrea del viajero, la infección es monomicrobiana (Chopra y Houston, 1999). Recientemente se ha descrito el primer caso de apendicitis asociado a diarrea del vajero causada por A. sobria (Lim, 2009). Aunque la existencia de brotes epidemicos es algo común entre las enterobacterias, en el caso de Aeromonas es complejo localizar una fuente de infección ya que se encuentran tanto en ambientes salobres como en alimentos y suelos. Las infecciones por Aeromonas se adquieren principalmente por el consumo de agua, comida o verdura contaminadas (Graevenitz, 2007). Son pocos los brotes epidémicos bien documentados (Altwegg y cols., 1991; Krovacek y cols., 1995; Monteil y Har- 25 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Monteil, 1997) pero esto es debido a que las Aeromonas generan, en la mayoría de los casos, cuadros clínicos poco graves que se autolimitan rápidamente y hacen innecesario el estudio bacteriológico. Las Aeromonas, así como el resto de enteropatógenos, requieren de una serie de condiciones para producir una infección como son la colonización, la invasión y la proliferación. La capacidad de colonización intestinal de Aeromonas se ha demostrado en un modelo animal inmunocompetente tras alterar el equilibrio ecológico bacteriano intestinal por la administración de estreptomicina (Sanderson y cols., 1996; Lye, 2009). En este estudio (Lye, 2009) las especies con mayor capacidad de colonización intestinal fueron A. caviae (45% de colonización), A. veronii (43%) y A. hydrophila (37%) mientras que esta capacidad colonizadora era inferior en especies poco frecuentes en diarrea como A. salmonicida (7%), A. allosaccharophila (5%) o A. encheleia (0%). Cabe destacar del estudio de Lye (2009) que la susceptibilidad a la infección no sólo es cepa dependiente sino que también depende de las condiciones del hospedador, tal y como cabe esperar. Los primeros experimentos con ratas, ratones y conejos consiguieron demostrar la acción enterotóxica de filtrados de Aeromonas así como de toxinas purificadas, sin embargo, la ruta de infección utilizada no era la ruta oral natural de infección (Chopra y Houston, 1999). Es interesante destacar que, aparte de los estudios referenciados por Janda y cols. (1998), también se pudo comprobar una respuesta inmunológica en los pacientes que presentaban gastroenteritis en un estudio más reciente publicado por Demarta y cols. (2001). 1.3.2.2. Extraintestinales Bacteriemias Las bacteriemias causadas por Aeromonas suelen ocurrir en pacientes cirróticos o con una enfermedad de base, en el 40-50% se trata de procesos cancerosos, enfermedades hepatobiliares en el 15-30% de los casos y diabetes en 3-5% (Tabla 5). En el año 2005, Figueras realiza una revisión de los casos publicados desde 1998 hasta el 2005 dónde se destaca un aumento en el número de casos con enfermedades hepatobiliares (36-54%). Además en este estudio se observan características de las bacteriemias causadas por Aeromonas que son, en su mayoría, monomicrobianas (64-100%), no nosocomiales (59-79%) y con una tasa de mortalidad de entre el 25% y el 70% (Figueras, 2005). La mayoría de las bacteriemias monomicrobianas se relacionan con A. hydrophila (65%), seguidas de las producidas por A. veronii (23-31%) y las generadas por A. caviae (12%); mientras que en las polimicrobianas se aíslan generalmente Aeromonas junto a Enterobacterias, Pseudomonas o Streptococcus/Enterococcus (Janda y Abbott, 1998). 26 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Tabla 5. Características de bacteriemias causadas por Aeromonas. Adaptada de Figueras, 2005. Bacteriemia Autor 1 2 3 4 5 6 7 Pacientes 144 104 42 12 73 41 29 Edad media 54.1 53.6 62 50 61 53.2 ND Monomicrobiana 70 100 64 75 72 75.4 ND Polimicrobiana 30 0 36 25 28 24.6 ND Adquisición Comunitario 60 74 79 59 71 0 ND Nosocomial 40 26 21 41 29 100 ND Infección hepatobiliar 12 54 19 ND 26 ND 33 20 ND 22 5 Presentación clínica Peritonitis 9 Infección tejido blando 8 ND 16 33 1.3 ND 33 Diarrea ND ND 12 17 14 ND 0 Cáncer 42 21 33 58 33 0 25 Enfermedad de base Enfermedad hepatobiliar 38 54 50 0 36 0 13 Otras 19 25 16 33 42 100 62 Mortalidad 31 32 70 25 36 35.6 38 1: Janda y Abbott, 1998; 2: Ko y cols., 2000; 3: Lau y cols., 2000; 4: Campo y cols., 2001; 5: Llopis y cols., 2004; 6: Tsai y cols., 2006; 7: Wu y cols., 2007. 27 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN La incidencia de los casos de bacteriemias por Aeromonas varía según la localización geográfica, aunque se desconoce la incidencia a nivel mundial. En España varía entre el 0.12-0.3% según diversos autores y en Japón alcanza el 3.3% (Figueras, 2005). En aquellos casos en los que la vía de entrada es un traumatismo con una infección severa de la herida, la prognosis de la bacteriemia es extremadamente mala con una tasa de mortalidad superior al 90% (Janda y Abbott, 1998; Figueras, 2005). Los casos de bacteriemias en pacientes previamente sanos se relacionan principalmente con infecciones pulmonares (Janda y Abbott, 1998). Colangitis Las Aeromonas son responsables del 12% de las infecciones hepatobiliares o pancreáticas, entre las cuales la más común (el 70% de los casos) es la colangitis que afectan tanto a individuos sanos como individuos inmundeprimidos, con cáncer de páncreas o carcinoma biliar (Figueras, 2005). Se ha visto que la obstrucción el tracto biliar es un factor de riesgo en estas infecciones (Clark y Chenoweth, 2003). La tasa de mortalidad en los pacientes con estas infecciones por Aeromonas está entre el 10 y el 11.8% (Figueras, 2005). Las especies más frecuentemente aisladas en estos casos fueron A. hydrophila, A. caviae y A. veronii, siendo los antibióticos más activos, en los casos de colangitis por Aeromonas, las cefalosporinas de 3ª generación, imipenem y quinolonas (Clark y Chenoweth, 2003). Heridas Después del tracto gastrointestinal, las heridas son la segunda vía de entrada más frecuente de Aeromonas en humanos. Las heridas infectadas por Aeromonas pueden ser superficiales generando celulitis o forunculosis o llegar a afectar a músculos, tendones, articulaciones y hueso (Janda y Abbott, 1998). En la inmensa mayoría de los casos en los que personas sanas se infectan por Aeromonas, la infección es consecuencia de heridas penetrantes o abrasión, con objetos contaminados o bien, es seguida de una exposición al medio acuático o suelos que contienen Aeromonas. Dichas heridas ocurren frecuentemente en visitantes de parques acuáticos y pescadores. Se suelen localizar en extremidades inferiores y superiores, estando relacionadas con el contacto de agua dulce más que salada (Janda y Abbott, 1998). Otro grupo de pacientes son aquellos que han sufrido accidentes de tráfico, aéreos o náuticos, con heridas de mayor gravedad y quemaduras que dan lugar a mionecrosis, gangrena e infecciones óseas (Figueras, 2005). Sólo el 17-52% de las infecciones de heridas por Aeromonas son monomicrobianas, en el resto de casos bacterias entéricas, enterococos y Bacteroides son aislados conjuntamente con Aeromonas. Entre éstas, A. hydrophila es la más frecuente junto con A. caviae y A. veronii (Janda y Abbott, 1998). Un tercer grupo de pacientes son los que sufren infecciones de herida quirúrgica (SSI). Las SSI son en la mayoría de los casos nosocomiales y están asociadas con una elevada mortalidad y coste 28 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN médico. Los agentes etiológicos son variados pero dependen especialmente del lugar anatómico de la cirugía siendo Staphylococcus aureus, Enterococcus, E. coli y Pseudomonas aeruginosa los más frecuentes. Existen 15 casos en la literatura en los que Aeromonas se ha relacionado con este tipo de infecciones (Slotnick, 1970; Washington, 1972; Soussy y cols., 1975; Janda y cols., 1983; Mellersh y cols., 1984; Isaacs y cols., 1988; Villuendas y cols., 1991; King y cols., 1992; Gold y Salit, 1993; Moawad y Zeiderman, 2002; Clark y Chenoweth, 2003), sin embargo, su papel tanto en las infecciones como las características de las mismas aún no ha sido estudiada en su conjunto. Las infecciones en quemados por Aeromonas no son muy frecuentes, en la actualidad existen publicados pocos estudios en la base de datos de pubmed. Las primeras referencias bibliográficas de quemados infectados por Aeromonas datan de 1981 y 1988 (Ampel y Peter, 1981; Purdue y Hunt, 1988), publicándose la primera revisión en 1996 por Barillo y cols. Se aislaron Aeromonas de infecciones de quemaduras en el 0.1% de los casos en un hospital de USA durante un período de 35 años (Barrillo y cols., 1996), 1 caso por año en otro hospital de Australia (Kienzle y cols., 2000) o 4 casos en 5 años en Singapore (Chim y Song, 2007). En este último estudio se destaca un aumento en la resistencia a antibióticos de los aislados, hecho que también se destaca en otro estudio del mismo año en las cepas de distintas especies de Aeromonas aisladas de un mismo paciente (de sangre y herida) en Taiwán, que mostraron ser resistentes a cefalosporinas de tercera generación (Lai y cols., 2007b). Una revisión de los casos publicados accesibles (Tabla 6) muestra que la edad media de los afectados está entorno a los 26-35 años, las infecciones se producen en pacientes con quemaduras en el 8-80% del cuerpo, las bacteriemias son monomicrobianas mientras que la mayoría (40-75%) de heridas muestran infecciones polimicrobianas donde están presentes Bacillus spp., Enterococos, Enterobacterias y Pseudomonas, entre otros. De todas las bacteriemias y de la mayoría de las heridas, la especie más aislada fue A. hydrophila aunque de heridas también se han aislado A. caviae y A. sobria (Kienzle y cols., 2000; Lai y cols., 2007b), aunque estas identificaciones están basadas en métodos bioquímicos. La tasa de mortalidad de los afectados está entorno al 11-62%. Tabla 6. Características de infecciones en quemados causadas por Aeromonas. Autor Pacientes Edad Contacto agua/suelo (%) 1 2 3 4 5 8 9 5 4 1 33 31 26 35 ND 37.5 ND 60 0 0 ND 33 60 25 ND 38-80 16-51 8-45 35-80 40 100 11 20 50 100 62 11 20 25 0 Monomicrobiana (%) TBSA (%) Bacteriemias (%) Mortalidad (%) 1: Barrillo y cols., 1996; 2: Skoll y cols., 1998; 3: Kienzle y cols., 2000; 4: Chim y Song, 2007; 5: Lai y cols., 2007b. TSBA: Total Surface Body Area 29 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Síndrome urémico hemolítico (SUH) El síndrome urémico hemolítico (SUH) se caracteriza por la presencia de anemia hemolítica, trombocitopenia y daño renal agudo pudiendo generar una disfunción renal crónica e incluso la muerte. El SUH suele estar producido por Escherichia coli productoras de toxina Shiga (STEC) en países desarrollados mientras que en países en vías de desarrollo se ha asociado más frecuentemente con Shigella dysenteriae tipo I (Noris y Remuzzi, 2005). Sólo en Estados Unidos se detectan unos 100,000 casos anuales de estas infecciones generadas por STEC y en el 73% de estos casos la infección se debe al serotipo O157:H7 (Tzipori y cols., 2004). Las infecciones por STEC presentan dolor abdominal y en la mayoría de los casos diarreas sanguinolentas (colitis hemorrágica) entre los 25 días siguientes a la exposición. El SUH ocurre en el 5-10% de los casos varios días después del desarrollo de la colitis hemorrágica, generalmente en niños y ancianos. El principal reservorio animal de STEC es el ganado y la vía más común de infección es por consumo de comida y/o agua contaminada. E. coli son capaces de producir 1 o 2 exotoxinas denominadas toxinas Shiga tipo 1 (Stx1) y toxinas Shiga tipo 2 (Stx2) siendo esta última el principal factor de virulencia del SUH (Orth y cols., 2007). Aunque E. coli O157:H7 junto a S. dysenteriae tipo I son los principales productores de las toxinas Shiga, éstas se han relacionado con varios patógenos entéricos: Vibrio cholera y Vibrio parahaemolyticus de origen clínico y ambiental (O´Brien y cols., 1984), Citrobacter freundii (Schmidt y cols, 1993, Tschäpe y cols., 1995), Enterobacter cloacae (Paton y Paton, 1996), Acinetobacter haemolyticus (Grotiuz y cols., 2006) y Aeromonas (Haque y cols., 1996; Snowden y cols., 2006). Las Aeromonas han estado implicadas en varios casos de SUH, 3 casos relacionados con A. hydrophila (Bogdanovic y cols., 1991; Robson y cols., 1992; Fang y cols., 1999) y 1 con A. veronii bv sobria (San Joaquin y Pickett, 1988). Una incidencia del SUH del 2.5% en niños con diarrea producida por Aeromonas fue la establecida por San Joaquin y Pickett en 1988 con datos recogidos a lo largo de un periodo de 20 meses. A. caviae fue la especie más predominante (69% de los casos) y la que producía las diarreas crónicas e intermitentes (San Joaquin y Pickett, 1988). Bogdanovic y cols. (1991) describen el caso una niña de 23 meses con SUH que presentaba una enterocolitis producida por una cepa de A. hydrophila capaz de generar un efecto verotóxico en células vero (Bogdanovic y cols., 1991). Un año después, Robson y cols. (1992) aportan datos de la incidencia de Aeromonas como productor del SUH en niños, en el 2% de los 87 casos registrados en 5 años, fue aislada A. hydrophila de coprocultivos y asociada como agente causal del síndrome. Fang y cols. (1999) describen un caso de SUH, en un paciente previamente sano de 36 años, en el que se aisló A. hydrophila de 4 hemocultivos y ningún enteropatógeno (Shigella, E. coli, Salmonella, Amoeba) de los coprocultivos. Filler y cols. (2000) describen un caso de una paciente de 6 meses con un fallo renal agudo tras una diarrea sanguinolenta. No se pudieron aislar de coprocultivos enterobacterias patógenas (Shigella spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., E. coli o Yersinia spp.) pero si A. sobria. Aunque 30 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN esta cepa mostró actividad verotóxica no se pudo detectar la existencia de genes stx por PCR con las condiciones descritas por Karch y Meyers (1989) ni la toxina por un ensayo de aglutinación (RPLA, Reverse passive latex aglutination). 1.3.3. Factores de virulencia La presencia de factores de virulencia en las especies de Aeromonas es un hecho reconocido, sin embargo la patogénesis de las infecciones causadas por estos microorganismos se desconoce. La variedad de manifestaciones clínicas observadas en las infecciones causadas por Aeromonas concuerda con la idea de que la patogenicidad de este microorganismo es multifactorial (Yu y cols., 2005). Los factores de virulencia descritos en el género incluyen tanto componentes estructurales como productos extracelulares (Pemberton y cols., 1997; Chopra y Houston, 1999; Janda, 2001; Galindo y cols., 2006; Grevenitz, 2007). 1.3.3.1. Productos extracelulares La interacción entre las bacterias patógenas y las células huéspedes viene dada, además de por los componentes extracelulares de éstas, por toxinas que son secretadas al espacio extracelular (Hueck, 1998). En Aeromonas existen varias toxinas que cumplen estas características, entre las cuales cabe destacar las proteasas, lipasas/fosfoliapasas, DNasas, enterotoxinas citotónicas y hemolisinas (Merino y cols., 1995; Chopra y Houston, 1999; Janda, 2001; Galindo y cols., 2006) y otras no tan reconocidas como las toxinas Shiga (Haque y cols., 1996). A continuación se detallan algunas de ellas: Toxinas Shiga Las toxinas Shiga (Stx1 y Stx2), también denominadas verotoxinas o verocitotoxinas, son genéticamente y antigénicamente diferentes, en base a su secuencia aminoacídica ya que poseen sólo un 56% de similitud. Existen al menos 3 variantes genéticas de stx1 (stx1, stx1c y stx1d) y 5 de stx2 (stx2, stx2c, stx2d, stx2e and stx2f) (Eklund y cols., 2002; Leung y cols., 2003; Lee y cols., 2007), siendo las variantes stx2 y stx2c las más asociadas al SUH mientras que stx1 es frecuente en cepas de STEC que producen casos de diarrea y de portadores asintomáitcos (Eklund y cols., 2002; Jenkins y cols., 2003; Friedrich y cols., 2003; Orth y cols., 2007). Ambas toxinas son holotoxinas AB5 formadas por una cadena A con actividad enzimática (32KDa) y 5 cadenas B (7KDa cada una) responsables de la unión a la célula diana. La subunidad A es una N-glicosidasa del ARNr 28S que genera la inhibición de la síntesis proteica mientras que el pentámero B es el responsable de la unión de la toxina a la célula diana por el reconocimiento del receptor, el glicolípido globotriaosilceramida [ά Gal (1→4) β Gal (1→4) β Glc-ceramida] (Gb3). Aunque Stx1 y Stx2 tienen el mismo receptor, Gb3, Stx1 poseen aproximadamente 1000 veces más afinidad por este receptor que Stx2 por Gb3, sin embargo la disociación de Stx2 del mismo es mucho más lenta (Noris y yRemuzzi, 2005). 31 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Las toxinas Shiga están codificadas en bacteriófagos que normalmente se hallan integrados en el cromosoma bacteriano. Cuando se induce el ciclo lítico, se liberan grandes cantidades de los mismos capaces de infectar a otras bacterias, actuando como vectores de transmisión horizontal de los genes stx (Herold y cols., 2004). Figura 3. Influencia de los subcultivos en la estabilidad de stx2 en C. freundii (Schmidt y cols., 1993). 1,2: La señal de amplificación desaparece tras 2 subcultivos; 3,4: Señal tenue tras un subcultivo; 5,6: Señal intensa del amplificado del stock inicial. En algunas enterobacterias, mencionadas anteriormente, que presentan los genes stx como E. coli (Paton y Paton, 1997; Karch y cols., 1992), E. cloacae (Paton y Paton, 1997), C. freundii (Schmidt y cols., 1993) y A. haemolyticus (Grotiuz y cols., 2006), se ha descrito la existencia de inestabilidad del gen stx2. Karch y cols. en 1992 y Schmidt y cols. en 1993 fueron los primeros en observar que el subcultivo de las cepas portadoras generaba la desaparición de stx2 (Figura 3). Estos autores observaron que dicha pérdida era “común” (1/3 de las cepas de E. coli y 5/7 de las cepas C. freundii) e independiente del medio de cultivo (sólido o líquido) utilizado (Karch y cols., 1992) y sugirieron que la presencia de menos de 10 copias del fago por 106 ufc podría explicar este hecho (Schmidt y cols., 1993). En el género Aeromonas se ha detectado también la existencia de inestabilidad en el gen cagA-like, un conocido factor de virulencia de Helicobacter pylori, codificado en elementos móviles y que inicialmente fue adquirido por transmisión horizontal (Datta y cols., 2003). En 1996, Haque y cols. detectan la presencia de stx1, codificado en un plásmido, en 3 cepas de A. hydrophila y en 1 cepa de A. caviae, mediante PCR, Southern y Dot Blot con sondas de stx1 específicas de E. coli. Asimismo, fueron capaces de detectar la producción de Stx1 en estas cepas de Aeromonas y neutralizarla con anticuerpos específicos para Stx1 de E. coli, por lo que se supuso una alta similitud tanto biológica como inmunológica y genética entre ambas toxinas (Haque y cols., 1996). Diez años después, se detectó de nuevo por PCR el gen stx1 en Aeromonas, en esta ocasión, en una cepa de A. veronii (Snowden y cols., 2006) empleando lo cebadores y condiciones descritas por Pass y cols. (2000). Se ha descrito que existen cepas portadoras de los genes stx1 y/o stx2 que no producen toxinas Shiga (García-Aljaro y cols., 2004, 2005). En los estudios de García-Aljaro y cols. (2004, 2005) se 32 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN observó, a partir de cepas de E. coli O157:H7 aisladas de aguas residuales de humanos, que sólo el 7% eran capaces de expresar las Stx1 y Stx2, mientras que en las aguas residuales de ganado vacuno el 75% eran capaces de expresar Stx2 frente al 0% de las aisladas de aguas de cerdos, utilizando en ambos casos un kit comercial para la detección de las toxinas (Duopath Verotoxin test). Aerolisinas y hemolisinas Las hemolisinas, al igual que las toxinas Shiga, fueron inicialmente descritas en E. coli (Inukai y Kodama, 1965). En Aeromonas se han definido dos tipo de hemolisinas, α y ß, con diferencias fisiológicas y funcionales (Singh y Sanyal, 1992) pero que son capaces de formar poros en la membrana de la célula diana generando su lisis osmótica (Kirov, 1997; Galido y cols., 2006). La caracterización de las β-hemolisinas de Aeromonas se ha visto dificultada tanto por la variedad de las mismas como por la terminología múltiple y confusa con la que se las ha descrito (Hly, HlyA de 49KDa y Ahh-1, AerA, Act, Asa1) (Buekley y Howard, 1999; Erova y cols., 2007). Una de ellas, la hemolisina Act, es además entero- y citotóxica y ha demostrado ser letal en cantidades de nanogramos vía intravenosa en ratones (Galindo y cols., 2006; Erova y cols., 2007). La aerolisina es el prototipo de hemolisina del género y fue caracterizada en el año 1974 por Bernheimer y Avigad. Al gen estructural se le da el nombre de aerA. La aerolisina es secretada por el sistema de secreción tipo 2 (T2SS) que es sec-dependiente, se transcribe como una pre-pro-aerolisina que sufre diversos procesos de maduración durante su secreción para convertirse en una aerolisina activa de 47.5 kDa en el medio extracelular (Howard y cols., 1996). La aerolisina activa se une a glicoproteínas de la membrana celular del huésped, en el caso de eritrocitos o células de mamíferos, o a la glicoproteína glicosilfosfatidilinositol (Thy-1), en el caso de los linfocitos antes de oligomerizarse (Buckley, 1992; Nelson y cols., 1997). Diversos estudios han tratado de determinar la incidencia de los genes hlyA y aerA en las especies A. hydrophila, A. caviae y A. veronii bv sobria, habiéndose encontrado que los genotipos más frecuentes son: aerA+/hlyA+ para A. hydrophila, aerA+/hlyA- para A. veronii y aerA/hlyA- para A. caviae (Heuzenroeder y cols., 1999; González-Rodríguez y cols., 2002). Wang y cols. (2003) estudiaron la distribución de los genes ahh1, asa1 y aerA en cepas de Aeromonas de origen clínico. Estos autores determinaron que los genotipos más frecuentes son el ahh1+/aerA+ (37.5%) y ahh1+ (36%), mientras que un 8.5% de las cepas presentaron el genotipo asa1+ (8.5%), y que sólo el 4% el genotipo ahh1+/asa1+. El 14% de las cepas no presentó ninguno de éstos genes. Las cepas con el genotipo ahh1+/aerA+ fueron las que presentaron mayor actividad citotóxica en células Vero y concluyen que las cepas con éste genotipo debían ser las que presenten mayor virulencia. Asimismo destacaron el caso de aislados de A. caviae que no producían citotoxinas o hemolisinas pero que recuperaban la capacidad de expresarlas tras el paso por el sistema digestivo del animal y que volvían a perderla tras varios subcultivos (Wang y cols., 2003). 33 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Soler y cols. (2002) desarrollan una serie de PCR específicas para diversos genes de virulencia. A partir de 10 secuencias nucleotídicas de las diversas hemolisinas y aerolisinas diseñan cebadores para una región común de 431 pb que definen como aerolisina/hemolisina. Estos autores observan que el 88% de las A. popoffii evaluadas poseen dichos genes aunque la hemólisis depende de la temperatura y el tipo de sangre. Chacón y cols. (2003) estudiaron la distribución de diversos factores de virulencia en Aeromonas ssp., identificadas molecularmente, de origen clínico y ambiental y observaron que la Aerolisina/hemolisina y la presencia de ß-hemólisis era significativamente mayor en cepas de origen clínico que en cepas de origen ambiental. Proteasas Se cree que el papel principal de las proteasas es establecer y mantener la infección, sobre todo en el caso de heridas e infecciones como la celulitis (Janda, 2001). Las Aeromonas produce al menos tres tipos de proteasas: metaloproteasa (ahp, aphB), acetilcolinesterasa y serina proteasa (aspA) (Seshadri y cols., 2006; Reith y cols., 2008). La serina proteasa ha sido implicada en la activación de la pre-pro-aerolisina (Abrami y cols., 1998) y la pro-GCAT (Eggset y cols., 1994; Vipond y cols., 1998). Lipasas Las Aeromonas spp. al igual que otras muchas bacterias patógenas secretan lipasas al medio que actúan como hidrolasas sobre los lípidos de membrana (Jaeger y cols., 1994). En A. hydrophila se han encontrado diversas lipasas como la Ah65 lipasa/acetiltranferasa y otras con un alto grado de homología como la lipH3, Apl-1, Lip, Pla, PlaC y GCAT, siendo la fosfolipasa C la que parece tener una implicación más clara en la virulencia ya que muestra actividad lecitinasa y capacidad citotóxica (Merino y cols., 1999). Se ha demostrado que estos genes se encuentran presentes en todas las especies del género, y observado una correlación con la actividad lipolítica de las cepas, mientras que no se han detectado diferencias entre la presencia de lipasas y el origen clínico o ambiental de las cepas (Soler y cols., 2002; Chacón y cols., 2003; Castro-Escarpulli y cols., 2003). Castro-Escarpulli y cols. (2003) evaluaron tres métodos diferentes para determinar la actividad lipolítica de las cepas (medio mantequilla-resarsurina, α-lecitina y agar tributirina) no encontrándose diferencia entre ellos. El glicerofosfolípido colesterol acetiltransferasa, GCAT, se encuentra exclusivamente en Aeromonas spp. y no presenta homología a nivel de nucleótidos con ninguna otra lipasa bacteriana (Chacón y cols., 2004). La GCAT es secretada por la bacteria sobre la bicapa lipídica como proGCAT, la pro-GCAT es capaz de hidrolizar lípidos pero no bicapas lipídicas. Cuando la pro-GCAT sufre un corte en el extremo C-terminal su conformación cambia convirtiéndose en un dímero (GCAT activa) (Hilton y cols., 1990; Ausio y cols., 1993). Este corte puede ser producido por proteasas de la misma bacteria como la tripsina o la serina proteasa (Eggset y cols., 1994). La importancia de la 34 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN GCAT como factor de virulencia sólo ha sido estudiada en profundidad en cepas de A. salmonicida aisladas de peces enfermos (Lee y Ellis, 1990). DNasas Las DNasas son consideradas de gran importancia en Streptococcus para producir la infección en las células huéspedes humanas y hacer que ésta progrese (Podbielski y cols., 1996; Ericksson y cols., 1999). En un estudio de Soler y cols. (2002) todas las cepas de A. popoffii analizadas presentaron los genes de las DNasas así como la actividad fenotípica. Chacón y cols. (2003) demostraron que estos genes se encuentran significativamente más presentes en cepas de Aeromonas de origen clínico (95%) que ambiental (85%), aunque esta diferencia no se observó al evaluar la expresión fenotípica en un medio de cultivo con ADN. Por otro lado, este gen estaba presente en el 83% de las cepas procedentes de pescado congelado y todas las cepas presentaron actividad DNasa (Castro-Escarpulli y cols., 2003). Enterotoxinas Las toxinas de mayor relevancia en infecciones gastrointestinales, las denominadas enterotoxinas, están también presentes en Aeromonas (Graevenitz, 2007). Existen dos tipos principales de enterotoxinas: las citotóxicas y las citotónicas. Entre las toxinas citotóxicas se ha descrito Act (52KDa), que es termolábil (56ºC 20 min), secretada por el T2SS y que presenta una actividad multifuncional ya que es hemolítica, afecta al epitelio intestinal vía citoquinas y por la activación del metabolismo del ácido araquidónico, con una DL50 de 27.5ng. La toxina Act es capaz de inhibir la capacidad fagocitaria de los fagocitos de ratón, aumentar los niveles del factor de necrosis tumoral (TNF)-α y la interleucina (IL)-1ß en macrofagos (Galindo y cols., 2006; Graevenitz, 2007). Aunque muestra similitud inmunológica con la toxina colérica (CT), no es neutralizada por los anticuerpos para esta. El gen act muestra un 75% de similitud en su secuencia nucleotídica con el gen aer (aerolisina) y en base a su secuencia aminoacídica entre un 79-93%. Al igual que la toxina α de Staphylococcus aureus, Act se activa por unión a la membrana plasmática de la célula diana. La activación de estas toxinas implica su oligomerización que da lugar a la formación de un poro en la membrana plasmática de la célula diana (Chopra y Houston, 1999; Galindo y cols., 2006). Se han descrito 2 enterotoxinas citotónicas, la primera, Alt, es termolábil (56ºC 10 min) y la segunda, Ast, es termoestable (100ºC 30 min). Ambas provocan un aumento del AMPc y del nivel de prostaglandinas, así como elongación en células de ovario de hamster chino (CHO) (Graevenitz, 2007). Atl (44KDa, 175aa) muestra una similitud en su secuencia aminoacídica del 45-51% con la lipasa y fosfolipasa C y no es similar inmunológicamente a la CT, por lo que no existe reconocimiento por parte de los anticuerpos anti-CT de la toxina Alt. Contrariamente, este reconocimiento sí existe para Ast (Chopra y Houston, 1999). 35 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Se ha detectado la existencia de una correlación positiva entre Act y las enterotoxinas citotónicas en cepas de A. hydrophila subsp. dhakensis de origen diarréico en Bangladesh, sugiriendo que existe un efecto sinérgico de Alt y Ast en la severidad de la diarrea; mientras que act se relaccionó con diarreas sanguinolentas (Kuhn y cols., 1997). 1.3.3.2. Sistemas de secreción Se conocen en la actualidad 6 sistemas de secreción (Figura 4) en las bacterias Gram negativas, los sistemas de secreción tipo I, II III, IV, V (o auto-transporte) y VI, que están implicados en el transporte de factores de virulencia al medio extracelular o directamente dentro de la célula huésped (Tseng y cols., 2009; Suárez y cols., 2008). Se ha demostrado que el sistema de secreción tipo IV en Agrobacterium tumefaciens está además implicado en la transferencia de plásmidos por conjugación (Rangrez y cols., 2006). Los sistemas de secreción tipo II y V son Sec- o Tatdependientes, esto implica que los factores de virulencia secretados por estos mecanismos contienen péptidos-señal que son reconocidos por las proteínas Sec o Tat, de la vía secretora, permitiendo su translocación de la membrana interna hacia el espacio periplásmico, sin embargo, los sistemas de secreción I, III, IV y VI son Sec- y Tat-independientes y por lo tanto no requieren este sistema y exportan las proteínas directamente bien a la superficie celular o al interior de la célula huésped (Hueck y cols., 1998; Tseng y cols., 2009). Figura 4. Resumen esquemático de los sistemas de secreción conocidos en bacterias Gram negativas (Tseng y cols., 2009). HM, membrana de la célula diana, OM, membrana externa; IM, membrana interna; OMP, proteína de membrana externa; MFP, proteína de fusión de membranas. 36 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN El sistema de secreción tipo 1 (T1SS) es el sistema de secreción general, posee tres componentes mayoritarios: sistema de transporte ABC, factores de membrana externa y proteínas de fusión de membrana. El sistema de secreción tipo 2 (T2SS) es un sistema de secreción exclusivo de las proteobacterias que muestra un origen evolutivo común con los pili de tipo IV (Cianciotto, 2005; Tseng y cols., 2009). Este sistema de secreción es esencial en la patogénesis de diversos microorganismos como Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, E. coli (Cianciotto, 2005), A. hydrophila (Seshadri y cols., 2006) y A. salmonicida (Retih y cols., 2008) ya que es la vía de secreción de la toxina colérica, la toxina termolábil (E. coli) (Cianciotto, 2005) así como aerolisinas, amilasas, DNasas, GCAT y proteasas (A. salmonicida y A. hydrophila) (Seshadri y cols., 2006; Retih y cols., 2008). El sistema de secreción tipo 3 (T3SS) o inyectosoma es uno de los sistemas de secreción por los que las proteínas pueden ser inyectadas directamente desde el protoplasma de la célula bacteriana al citoplasma de la célula diana o bien al espacio extracelular (Tseng y cols., 2009). Se han identificado 7 familias del T3SS existiendo en algunas cepas de Salmonella typhimurium representantes del T3SS de diversas familias. Sólo 9 de las 25 proteínas necesarias para el ensamblaje de este sistema de secreción se conservan entre las 7 familias. En muchos casos los genes del T3SS están codificados en islas de patogenicidad localizadas en plásmidos (Tseng y cols., 2009) por lo que comúnmente están sujetos a la transmisión horizontal. La mayoría de los microorganismos que poseen este sistema de secreción, tanto patógenos de humanos, de animales o plantas así como simbiontes, pertenecen a las proteobacterias (Cornelis, 2006). Los microorganismos patógenos de animales secretan mediante dicho sistema entre 6 y 20 proteínas efectoras que interaccionan y modulan funciones, maquinaria y morfología de la célula huésped permitiendo la colonización y multiplicación del patógeno e interfieren en la respuesta inmune del huésped (Coburn y cols., 2007). Tanto la diarrea como la colitis hemorrágica se encuentran entre los efectos que generan en el hospedador las proteínas efectoras (Figura 5). Sin embargo, el efecto patogénico no sólo depende de la proteína efectora sino también de la célula diana y tejido (Coburn y cols., 2007). La patogenicidad asociada a este sistema de secreción ha sido probada mediante la utilización de mutaciones dirigidas en los genes estructurales y observando el descenso en la virulencia de la cepa mutante con respecto a la salvaje (Coburn y cols., 2007; Corneli y cols., 2007). En Aeromonas, los genes del T3SS han sido ampliamente estudiados (Burr y cols., 2002; Yu y cols., 2004; Chacón y cols., 2004; Vilches y cols., 2004, 2008; Sha y cols., 2007; Tan y cols., 2008) habiéndose identificado 5 proteínas efectoras secretadas por este sistema i.e. AexT (Braun y cols., 2002), AopP (Feher y cols., 2006); AopH, AopO (Dacay y cols., 2006); AexU (Sha y cols., 2007) y 3 proteínas ExoT-like (Yu y cols., 2007). Se ha detectado que las proteínas efectoras AopH y AopO están codificadas en plásmidos mientras que AexT lo está en el genoma bacteriano y los componentes del T3SS pueden localizarse tanto en plásmidos como en el genoma bacteriano (Burr y Frey, 2007; 37 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Seshadri y cols., 2006; Reith y cols., 2008). El inyectosoma de Aeromonas, al igual que el de Pseudomonas aeruginosa, pertenece a la familia Ysc de Yersinia spp. (Cornelis, 2006). En A. salmonicida y A. hydrophila se ha demostrado la virulencia del T3SS ya que al inocular in vivo cepas con genes estructurales del T3SS mutados se observaba un descenso en la virulencia en comparación con la cepa salvaje (Vilches y cols., 2004; Burr y Frey, 2007). Sin embargo, las mutaciones de los genes de las proteínas efectoras AexT, AopO y AopH mostraron sólo un descenso moderado de la virulencia (Burr y Frey, 2007). Los genes que codifican el T3SS son más frecuentes en cepas clínicas que ambientales de Aeromonas (Vilches y cols., 2004) y más frecuentes en A. veronii (68-80%) y A. hydrophila (53-80%) que en A. caviae (15-6%), que son las especies con mayor incidencia en clínica (Vilches y cols., 2004; Chacón y cols., 2004). Figura 5. Funciones de las proteínas efectoras del T3SS con importancia patofisiológica (Coburn y cols., 2007). El Sistema de Secreción tipo 4 (T4SS) es el único de los sistemas de secreción capaz de transportar además de proteínas ADN, lo que le confiere un papel homólogo al sistema de conjugación bacteriano (Tseng y cols., 2009). Diversos organismos patógenos poseen T4SSs homólogos: Agrobacterium tumefaciens (VirB), Bordetella pertussis (PtI), E. coli (Tra), Legionella pneumophila (Dot), Pseudomonas aeruginosa (TraS/TraB) y Helicobacter pylori (CAG, ComB) pero sólo tienen una proteína en común VirB10 (TrbI) (Tseng y cols., 2009). Recientemente se ha descrito la presencia del T4SS en A. culicicola (Rangrez y cols., 2006), sinónimo de A. veronii (Huys y cols., 2005), y A. caviae (Rhodes y cols., 2004) codificado en ambos casos en un plásmido, así como el gen de la proteína CagA, factor de virulencia típico de H. pylori que es secretada por el T4SS (Datta y cols., 2003). El Sistema de Secreción Tipo 6 (T6SS) o Vas (virulence-asociated secretion) ha sido el último sistema de secreción en reconocerse, en el año 2006, y sin embargo, su existencia se sospechaba desde 38 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN hace una década (Bingle y cols., 2008). Al igual que los T3SS y T4SS es capaz de inyectar proteínas efectoras directamente en el citosol de la célula diana (Figura 4), aunque se ha identificado este sistema de secreción en organismos no patógenos ni simbiontes (Bingle y cols., 2008). De entre las proteínas efectoras secretadas las más conocidas son VgrG y Hcp. Figura 6. Relaciones filogenéticas del T6SS a partir de las secuencias de las proteínas DUF770 y DUF877 concatenadas (Bingle y cols., 2008). *Especies no patógenas ni simbiontes. Alfaproteobacterias: negro, Betaproteobacterias: azul, Gammaproteobacterias: rojo, Deltaproteobacterias: turquesa, Epsilonproteobacterias: verde, Acidobacteria: púrpura, Planctomycetales: amarillo. La distribución del T6SS es mayoritaria en las proteobacterias. En Aeromonas, se detectó por primera vez en el año 2006 (Figura 6), con la secuenciación del genoma completo de A. hydrophila (Seshadri y cols., 2006) aunque se desconocía su funcionalidad. La secuenciación del genoma de A. 39 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN salmonicida reveló también la existencia de los genes del T6SS localizado tanto en el cromosoma, al igual que en A. hydrophila, como en plásmidos, aunque ninguno de los dos es funcional (Reith y cols., 2008). Asimismo se detectó en un plásmido la presencia de los genes de las proteínas efectoras VgrG y Hcp (Reith y cols., 2008). La funcionalidad de este sistema de secreción se ha demostrado en A. hydrophila (Suárez y cols., 2008). En este trabajo se puso de manifiesto la patogenicidad del T6SS y Hcp, mediante estudios in vitro e in vivo con mutantes, como la generación de anticuerpos frente a Hcp de Aeromonas (Suárez y cols., 2008). 1.3.3.3. Componentes estructurales La adhesión de las bacterias a los tejidos del huésped es un paso crítico en la fase inicial de las infecciones causadas por muchos microorganismos. Las bacterias se adhieren a los tejidos y células del huésped y alteran sus mecanismos de defensa iniciando así la colonización (Westerlund y Korhonen, 1993). Los componentes estructurales más estudiados en Aeromonas que se han involucrado en el proceso de adhesión y patogenicidad son los flagelos, pilis, cápsula, capa S, lipopolisacáridos (LPS) y las proteínas de la membrana externa (OMP). Flagelos Los flagelos son orgánulos responsables de la movilidad bacteriana que se componen de un filamento, un gancho y un cuerpo basal. En algunos Vibrio, Aeromonas y en otras proteobacterias coexisten dos sistemas flagelares codificados por diferentes conjuntos de genes (Canals y cols., 2007). Los flagelos polares, constitutivos, se suelen utilizar cuando nadan en medios líquidos, mientras que los flagelos laterales, inducibles, entran en funcionamiento cuando los primeros experimentan una gran resistencia al giro, proporcionando movilidad en fluidos viscosos o sobre superficies. Además las flagelinas polares actúan como adhesinas mientras que las laterales sirven como factores de colonización (Kirov y cols., 2004). Existen cepas de Aeromonas, AH-3 y Sch3N, capaces de expresar estos dos tipos de flagelos (Canal y cols., 2007). Se han reconocido 2 genes, flmA y flmB, implicados en la glicosilación de ambos flagelos en las cepas AH-3 y Sch3N y en la cepa Sch3N, 3 genes más: neuA-like, flmD y neuB-like, localizados cerca de los genes que codifican para el flagelo polar, esenciales no sólo para la expresión de los flagelos sino que también se relacionan con los LPS (Canal y cols., 2007). Diversos estudios han demostrado que la movilidad generada por los flagelos polares es imprescindible para la adhesión de las Aeromonas a su célula diana (Merino y cols., 1997; Rabaan y cols., 2001; Gryllos y cols., 2001). Los genes que codifican para el flagelo polar de Aeromonas (Figura 7) se disponen en tándem en 6 regiones (Canals y cols., 2006b; Wilhelms y cols., 2009). La región 1 está constituida por 16 genes implicados en la biogénesis del flagelo, la región 2 contiene 6 genes implicados en la 40 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN glicosilación del flagelo, la región 3 contiene 29 genes la mayoría implicados en la estructura del cuerpo basal, la región 4 se compone de un único gen (motX) esencial para la funcionalidad del motor y la región 5 que contiene los genes reguladores (Canals y cols., 2006b). Recientemente se ha descrio la región 6 que contiene 2 genes adicionales (pomA2 y pomB2) de la estructura del cuerpo basal (Wilhelms y cols., 2009). Esta misma distribución y organización, descrita en la cepa AH-3, se ha corroborado con la secuenciación del genoma completo de A. hydrophila (Seshadri y cols., 2006), así como en el genoma de A. salmonicida en el que se han observado mutaciones en los genes flgL (región 1), maf1 (región 2) y flrA (región 5), lo que hace que no sea funcional, tal como se había definido la especie A. salmonicida, no móvil (Reith y cols., 2008). Figura 7. Regiones genéticas del flagelo polar de Aeromonas en la cepa AH-3 (Canals y cols., 2006b; Wilhelms y cols., 2009). Region 6: Aproximadamente el 60% de las Aeromonas poseen flagelos laterales (Seshadri y cols., 2006). En A. hydrophila AH-3 se han determinado 38 genes que codifican para los flagelos laterales (Canals y cols., 2006a) pero dichos genes no existen en la cepa tipo de esta especie (Seshadri y cols., 2006). Aunque se han detectado la presencia de genes que codifican para el flagelo lateral (lafA-U) en A. salmonicida (Merino y cols., 2003; Reith y cols., 2008) diversas mutaciones en los genes lafA y lfgD hacen que no sean funcionales (Reith y cols., 2008). Se ha demostrado que los flagelos laterales son esenciales para la adherencia a células epiteliales humanas y la formación de biofilms a partir de estudios con mutaciones en los genes lafA1, lafA2, fliU o lafT (Gavín y cols., 2002). Pilis Los pilis son estructuras que al igual que los flagelos tienen función de adherencia a otras bacterias o a las células del huésped. Estas estructuras se forman a partir de subunidades proteicas, llamadas pilinas, y pueden ser diferenciadas del flagelo porque tienen un diámetro menor (3-8 nm frente a 15-20 nm de los flagelos) y normalmente no presentan una estructura enrollada (Murray y cols., 2002). En las bacterias Gram negativas existen 4 clases pincipales de pilis (Figura 8) en función 41 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN de la vía de ensamblamiento: por la vía chaperonas-asociada o pili CU (chaperone-usher), pili tipo VI, pili curli y por la vía alternativa a la CU o pilis de la familia CS1 (Proft y Baker, 2009). Los pili CU incluyen a los pili tipo I, los pilis P, la familia de adesinas Afa/Dr asi como otras estructuras de adhesión. En este grupo los pilis se constituyen por homopolímeros o heteropolímeros de pilina que son secretados por la vía general al espacio periplásmico y se unen específicamente a una chaperona, el complejo es secretado al exterior para el ensamblaje del pili. Se ha detectado la existencia de pilis tipo I en Aeromonas tras la scuenciación de los genomas de A. hydrophila y A. salmonicida, existiendo un operón completo e intacto (Seshadri y cols., 2006; Reith y cols., 2008). Figura 8. Pilis y su mecanismo de ensamblaje en bacterias Gram negativas (Frozes y cols., 2008). E, espacio extracelular; OM, membrana externa; P, periplasma; IM, membrana interna; C, protoplasma. Los pili tipo IV son producidos por diversos patógenos humanos como Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, S. enterica, Legionella pneumophila y E. coli enteropatógenas (EPEC) e involucrados en la auto-agregación, adhesión, movilidad “twitching”, formación de biofilm o invasión de la célula diana (Frozes y cols., 2008). Se distinguen dos grupos principales de pilis tipo IV, a y b, en función de las pilinas y su maduración (Proft y Baker, 2009; Frozes y cols., 2008). En Aeromonas, dentro del gupo de los pili IVa se han definido varias familias i.e. tap, flp-like y msh (Seshadri y cols., 2006; Reith y cols., 2008; Boyd y cols., 2008). Aunque en Aeromonas sólo la relación entre el pili tipo IV y la enteropatogeneicidad ha 42 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN podido ser establecida (Graevenitz, 2007) se ha observado que los pilis Tap y Flp contribuyen en baja medida a la virulencia de Aeromonas salmonicida (Boy y cols., 2008). No se ha encontrado ninguna referencia que indique la presencia de los pili curli (genes csg) en Aeromonas. La familia CS1 de pilis comprende a CFA/I, CS2, CS4, CS14, CS17 Y CS19. Son también clasificados como vía alternativa a la CU, Clase 5 o α-fimbrias relaccionadas con E. coli enterotóxicas (ETEC) que son las principales causantes de diarrea (Proft y Baker, 2009). Se han detectado genes de este grupo (Figura 9) en el genoma de la cepa tipo de A. hydrophila (Seshadri y cols., 2006; Nuccio y Bäumler, 2007). Figura 9. Relaciones filogenéticas de los operones de las α-fimbrias (Nuccio y Bäumler, 2007). Cápsula La cápsula es una estructura formada por polisacáridos (disacáridos y trisacáridos) y polipéptidos que se encuentra recubriendo la membrana externa de la célula bacteriana. Ésta estructura, altamente hidratada, es importante para la supervivencia de la bacteria dentro del huésped ya que promueve la resistencia a la acción del complemento, puede actuar como barrera frente a moléculas hidrofóbicas tóxicas como los detergentes y puede ayudar a la adherencia a otras bacterias o a los tejidos del huésped (Murray y cols., 2002). La cápsula, además, se ha utilizado para la clasificación de grupos dentro de un taxón debido a sus propiedades antigénicas. En A. hydrophila PPD14/91 (Figura 10) se determinó que los genes de la cápsula se distribuían en tres regiones i.e. la RI que contiene 4 genes de proteínas transportadoras; la RII con 5 genes de la vía de síntesis de la cápsula y la RIII con 2 genes de proteínas transportadoras (Zhang y cols., 2007). 43 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Figura 10. Organización genética del cluster de la cápsula de A. hydrophila PPD134/91 (Zhang y cols., 2007). Capa S (Capa A) La capa S es una capa paracristalina que se encuentra, en algunas cepas, recubriendo la pared celular de la bacteria (Ishiguro y cols., 1986) protegiéndola de los mecanismos de defensa del huésped y por lo tanto facilitando la colonización del mismo (Munn y cols., 1982). La capa S está formada por subunidades proteicas (proteína A) que se disponen de forma tetragonal y que se unen a la superficie celular a través de los lipopolisacáridos (LPS) (Kay y Trust, 1991; Thomas y cols., 1992). La capa S se ha detectado en especies de Aeromonas (A. hydrophila, A. veronii y A. schubertii) patógenas para humanos (Kokka y cols., 1991; 1992). En estas especies la capa S consiste en una única proteína acídica con un peso molecular de 52-53 kDa que se encuentra en el exterior de la pared celular (Dooley y cols., 1988; Kokka y cols., 1992) y que es codificada por el gen ahsA (Thomas y Trust, 1995). No existen en el genoma de la cepa tipo de A. hydrophila los genes que codifican para la capa S (Seshadri y cols., 2006). Sin embargo, en el genoma de A. salmonicida A449 existen los genes vapA así como un sistema de secreción tipo 2 VapA-específico. Se ha observado que los genes que codifican la vía de síntesis y secreción de VapA en A. salmonicida poseen un contenido en G+C% inferior al del resto del genoma (Reith y cols., 2008). Se ha demostrado que las cepas virulentas de A. salmonicida que presentaban la capa S son capaces de adherirse, invadir y sobrevivir dentro de los macrófagos de peces con una eficacia de 10 a 20 veces superior que las cepas de A. salmonicida sin capa S (Garduño y cols., 2000). Sin embargo en este estudio se indica que la capa S no es un factor de invasión sino una adhesina que ayuda, pero no media, la invasión en líneas no-fagocíticas de peces. Se sugirió que el gen vapA siempre está presente en las cepas de A. salmonicida (Gustafson y cols., 1992); sin embargo se ha demostrado que éste solo se encuentra en el 65-75% de las A. salmonicida virulentas (Austin y cols., 1998; Høie y cols., 1999) LPS (Lipopolisacáridos) Los LPS consisten en tres partes estructurales (Figura 11): el lípido A, el polisacárido central y el antígeno O, siendo el lípido A el principal responsable de la actividad endotóxica de los LPS (Murray y cols., 2002). En el año 2001 y con base a los determinantes antigénicos únicos presentes en los LPS (antígeno O) se determinó que el género Aeromonas existían 96 serogrupos (Janda, 2001). 44 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Se ha descrito la agrupación genética implicada en la biosíntesis del antígeno O en 2 cepas de A. hydrophila, PPD134/91, JCM3980 (Zhang y cols., 2007). El cluster contiene 17 genes, 7 codifican enzimas implicadas en la rutas biosintéticas de los precursores de la ramnosa y manosa, 6 genes de transferasas, 1 gen (wwz) implicado en la longitud del antígeno O y otro (wzx) implicado en translocación de proteínas a través de la membrana interna (Zhang y cols., 2007) de undecaprenilpirofosfato (Marolda y cols., 2004). Figura 11. Estructura y disposición de los LPS en la membrana externa de las bacterias Gram negativas. Los genes del polisacárido central han sido descritos recientemente en A. hydrophila, ATCC7966T y AH-3, (Sheshadri y cols., 2006; Jiménez y cols., 2008) y A. salmonicida subsp. salmonicida, A449 y A450, (Reith y cols., 2008; Jiménez y cols., 2009) dispuestos en 3 regiones (Figura 12). Existe congruencia entre los genes definidos en las 2 A. salmonicida (Jiménez y cols., 2009) así como entre los genes de las 2 A. hydrophila (Jiménez y cols., 2008). Los genes de la RII y RIII de A. hydrophila AH-3 son idénticos a los de A. salmonicida A450, mientras que la RI, constituida por 7 genes, mostró 3 genes idénticos a los descritos en AH-3, 3 similares y uno único (Jiménez y cols., 2009) Los LPS en Aeromonas son capaces de provocar una coagulación intravascular diseminada en individuos que presentan una septicemia (Ko y Chuang, 1995). Además se ha comprobado que el LPS que presentan las cepas con serogrupo O:34 juega un papel importante en la adherencia de la cepa a las células HEp-2 (Merino y cols., 1996). Sin embargo, un estudio realizado con mutantes para el LPS produjo una disminución de la DL50 muy pequeña en comparación con la cepa salvaje, lo cual minimizaría el papel del LPS en la patogenicidad (Aguilar y cols., 1997). 45 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Figura 12. Organización genética de las 3 regiones cromosómicas de los genes del polisacárido central del LPS de las cepas AH-3 (A) y A450 (B) (Jiménez y cols., 2009). OMP (Proteínas de la membrana externa) Las OMP son proteínas con dominios extracelulares de carácter hidrofóbico que se encuentran ancladas en la membrana lipídica externa de la célula. Hay poca información sobre las proteínas de membrana externa del género Aeromonas. La expresión de estas proteínas depende del medio de crecimiento así como de diversas características físico-químicas del mismo, sin embargo, recientemente se han demostrado diferencias entre los perfiles de OMP en cepas de A. hydrophila cuando son cultivadas in vitro e in vivo, siendo las proteínas que se expresan in vivo más numerosas y por tanto las que, deberían ser las dianas de las vacunas (Poobalane y cols., 2008). Se han caracterizado diversas OMP en Aeromonas y en la actualidad se cree que su función principal es la de la adherencia y aglutinación (Rocha de Souza y cols., 2008). En la Tabla 7 se resumen las OMP que se conocen en Aeromonas. 46 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Tabla 7. Características de las proteínas de membrana externa (OMP). OMP Tamaño del gen (pb) Tamaño de la proteína Especie (cepa) AA kDa Características Conclusión del estudio Proteína I1 1337 445 47 A. hydrophila (Ah65) A. salmonicida Maltoporina homóloga a la LamB de Proteína formadora de canales E. coli Receptor C1q del A. hydrophila Proteína II 2 Porina homóloga a las porinas OmpN, PhoE y OmpF de E. coli complemento responsable de la activación de la ruta CPC Confiere sensibilidad al suero humano 1055 351 39 (Ah65) A. hydrophila (AH3) Proteína III3 - - 36 A. hydrophila (Ah65) A. hydrophila (Ah65) A. salmonicida (NCIMB 1102) A. salmonicida (NCIMB 1102) A. caviae Porina homóloga a la OmpC, PhoE y OmpF de E. coli Proteína formadora de canales Proteína IV4 OmpAI5 OmpAII5 - - 27 Porina no homóloga a otras OMP Porina homóloga a la OmpA de la familia Enterobacteriaceae Porina homóloga a la OmpA de la familia Enterobacteriaceae Se une a la superficie celular de células HEp-2 Proteína formadora de canales 1019 339 33.5 Proteína formadora de canales 992 330 32.5 Proteína formadora de canales - 6 - - 43 (Ae56, Ae391, Ae398) Relacionada con la adherencia in vitro de A. caviae Omp487 (LamB-like) Omp388 LamB9 OmpA10 1 1278 1047 1345 3877 401 329 409 671 44 38 30 A. veronii A. veronii A. hydrophila A. veronii Porina no-específica Porina no-específica Porina específica de maltosa. - Proteína formadora de canales Proteína formadora de canales Proteína formadora de canales - Jeanteur y cols. (1992); 2Dodsworth y cols. (1993); 3Nogueras y cols. (2000); 4Janda (2001); 5Costello y cols. (1996); 6Rocha de Souza y cols. (2001); 7Vazquez-Juárez y cols., 2004; 8Vazquez-Juárez y cols., 2005; 9Upadahayaya y cols., 2007; 10Namba y cols., 2008. 1.3.4. Resistencia frente a los agentes antimicrobianos Las especies móviles de Aeromonas son generalmente resistentes a la penicilina, ampicilina, carbenicilina y ticarcilina, sensibles a cefalosporinas de 2ª y 3ª generación, aminoglucósidos, carbapenem, cloranfenicol, tetraciclinas, T-S (Trimetoprim-sulfametoxazol o co-trimoxazol) y quinolonas, según Martin-Carnahan y Joseph en el 2005. Los respuestas frente a 19 antibióticos de 1051 cepas (660 cepas clínicas y 91 ambientales) evaluadas por distintos métodos obtenidos por diversos estudios recientes se incluyen en la Tabla 8. A pesar de mostrar resultados congruentes con los publicados anteriormente, se aprecian diferencias entre las respuestas de cepas de origen clínico y 47 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN ambiental (Figura 13). Las cepas de origen ambiental fueron más resistentes a la gentamicina, sulfamidas y cefalosporinas de 1ª y 3ª generación mientras que fueron más sensibles al resto de aminoglucósidos, imipenem, cefalosporinas de 2ª generación y penicilinas. Casi la totalidad de las cepas clínicas fueron resistentes a la ampicilina frente al escaso 60% de las cepas ambientales siendo los antibióticos que mostraron una mayor actividad, tanto en cepas clínicas como en ambientales, la amikacina, cefepime y ciprofloxacino. Asimismo se han detectado diferencias en la respuesta a antibióticos en cepas procedentes de diversas zonas geográficas, lo que indicaba que la resistencia a los diferentes antibióticos podría estar influenciada por factores geográficos (Ko y cols., 1996; MartinCarnahan y Joseph, 2005) mientras que la aparición de nuevas resistencias en cepas ambientales se ha asociado a un elevado impacto humano (Goñi-Urriza y cols., 2000a,b) junto con la transmisión horizontal de los genes de resistencia codificados en elementos móviles (Martin-Carnahan y Joseph, 2005). 48 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Tabla 8. Resistencia frente a agentes antimicrobianos de Aeromonas Antibiótico Amikacina Gentamicina Tobramicina Imipenem Cefalotina Cefuroxima Cefotaxima Ceftazidima Ceftriaxona Cefepime Aztreonam Amoxicilina Ampicilina Piperacilina Ticarcilina Ciprofloxacino T-S Tetraciclina Cloranfenicol Estudio (nº cepas) Método Origen geográfico Origen aislados 4 12 25 9 81 ND 19 6 21 3 5 ND 99 ND 70 1 41 49 ND 1 (234) AD Taiwán Clínicas 2 2 16 33 ND 2 0 0 0 ND 0 ND 72 16 47 0 0 ND ND 2 (56) MS USA Clínicas ND 1 7 0 93 ND 4 ND ND ND ND ND 99 ND 87 2 42 14 2 3 (138) DD España y Francia Agua de río 0 1 16 0 ND 0 0 0 ND 0 0 ND 100 3 64 0 19 ND ND 4 (43) C África, América latina y Asia Clínicas ND ND ND ND ND ND 0 ND ND ND ND ND 100 ND ND 0 12 37 31 5 (16) DD España Diarrea del viajero Resistencia % 2 0 9 ND 64 ND 0 0 0 ND 0 97 100 1 ND 0 2 0 0 6 (130) AD y DD Australia Clínicas 0 0 ND 36 29 2 2 2 ND ND ND ND ND 11 ND 0 18 ND ND 7 (45) DD Taiwán Sangre de bacteriemias 0 0 0 0 ND ND 4 3 ND ND ND ND ND ND ND 0 12 16 1 8 (83) DD Brasil ND 7 ND 24 75 11 11 ND 2 2 4 ND 98 46 ND 14 70 ND ND 9 (116) DD Taiwán 0 1 1 6 ND ND 26 28 26 ND 11 ND 55 22 ND 1 14 12 ND 10 (147) DD Turquía ND 26 ND 4 87 ND 30 ND ND ND 30 ND 91 ND ND 0 26 26 52 11 (23) DD Brasil 5 5 0 8 ND 11 0 0 0 ND 11 13 97 3 56 0 ND 21 ND 12 (20) MIC/ID Turquía Total % 1.6 5 9.25 12 71.5 5.2 8 4.87 8.16 1.6 7.62 55 91.1 14.56 64.8 1.5 23.27 21.87 17.2 (1051) Clínicas Clínicas Agua de Aguas Heces de y consumo consumo ganado vegetales T-S: Trimetoprim-Sulfametoxazol (Co-trimoxazole). AD: Difusión en agar, MS: Sistema MicroScan Walkaway 40, DD: Difusión en disco, C: Sistema MicroScan Combo Urine IS, MIC/ID: Sistema Septor Gram negative MIC/ID. 1 Ko y col., 1996; 2Overman y col., 1999; 3Goñi-Urriza y cols., 2000; 4Vila y col., 2002; 5: Vila y col., 2003; 6Saccher y col., 2005; 7Tsai y col., 2006; 8Palú y col., 2006; 9Wu y col., 2007; 10Koksal y col., 2007; 11Scoaris y col., 2008; 12Ceylan y cols., 2009. 49 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTRODUCCIÓN Aunque las Aeromonas se habían descrito como microorganismos sensibles a las cefalosporinas de tercera generación se ha visto que la resistencia a los antibióticos β-lactámicos se asocia a la síntesis β-lactamasas inducibles (Ko y cols, 2000) que hidrolizan irreversiblemente el enlace amina del anillo de los ß-lactámicos (Sharma y cols., 2008). Las ß-lactamasas se clasifican en función de los grupos de antibióticos que hidrolizan como penicilasas, cefalosporinasas y carbapenemasas, y en función de sus secuencias aminoacídicas en cuatro clases: A, B, C y D. Las metallo-ß-lactamasas (MßLs) pertenecen a la clase B e inactivan todas las penicilinas. Dentro de esta clase existen tres subclases: B1, B2 y B3. ImiS es una B2MßL identificada en una aislado clínico de A. veronii bv. sobria (Walsh y cols., 1998) que requiere zinc para su catálisis y es muy similar en su secuencia aminoacídica al resto de la subclase B2MßL (Sharma y cols., 2007). La resistencia a las quinolonas ha sido atribuida a mutaciones en el gen gyrA, indicando que la girasa del ADN es la principal diana para estos antibióticos, además la presencia simultánea de una mutación en el gen parC (que codifica para la subunidad C de la topoisomerasa IV) aumenta la resistencia tanto a las quinolonas no fluoradas como a las fluoradas, indicando que la segunda diana para estos antibióticos es la topoisomerasa IV (Goñi-Urriza y cols., 2002). Figura 13. Resistencia frente a agentes antimicrobianos con los datos de los estudios de la Tabla 8 que incluye Aeromonas clínicas, (estudios 1, 2, 4-7, 9 y 12, n= 660) y ambientales (estudios 3, 8, 10 y 11, n=391) 120,00 100,00 80,00 % Resistencia 60,00 40,00 Cepas ambientales Cepas clínicas 20,00 0,00 Amikacina Gentamicina Tobramicina Imipenem Cefalotina Cefuroxima Cefotaxima Ceftazidima Ceftriaxona Cefepime Aztroenam Amoxicilina Ampicilina Piperacilina Ticarcilina Ciprofloxacino T-S Tetraciclina Antibiótico Aminoglucósidos Cefalosporinas 1ªG Cefalosporinas 2ªG Cefalosporinas 3ªG Cefalosporinas 4ªG Carbapenem Penicilinas Tetraciclinas Cloranfenicol Sulfamidas Quinolonas 50 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTERÉS Y OBJETIVOS El género Aeromonas está constituido por bacterias Gram-negativas aisladas frecuentemente en el agua, alimentos, heces de pacientes con cuadros diarreicos e infecciones extraintestinales. Además, algunas de las especies del género también son patógenas de peces. Durante las últimas décadas, el interés en el estudio de las distintas especies de Aeromonas como microorganismos patógenos ha ido creciendo gradualmente siendo numerosos los investigadores, en campos muy diversos de la microbiología, que han de enfrentarse a la difícil labor de identificar dichas bacterias. La mayoría de los laboratorios clínicos utilizan métodos miniaturizados semiautomáticos (API20E, Vitek GNI, BBL Crystal, MicroScan) u otras pruebas bioquímicas descritas en manuales de microbiología poco actualizados para la identificación de las especies de Aeromonas. Sin embargo, estos métodos bioquímicos conducen a identificaciones erróneas no sólo de las especies sino también de género. Por tanto, uno de los objetivos de esta tesis consistió en la identificación de aislados de origen clínico y ambiental mediante métodos moleculares. La aplicación de un protocolo de RFLP del ADNr 16S, publicado por nuestro grupo, permite la identificación de 14 de las 17 especies descritas en el género hasta el año 2000. Sin embargo, la aplicación rutinaria de este protocolo reveló que algunas cepas presentan patrones de RFLP atípicos y distintos a los descritos para las cepas tipo de las diferentes especies del género. En estos casos se hace necesaria la secuenciación del gen ARNr 16S y el gen rpoD. El primero permite establecer si las secuencias de este gen presentan microheterogeneidades, es decir, si presentan nucleótidos diferentes en una misma posición en las distintas copias del gen existentes en el genoma. Las secuencias del gen rpoD permiten una correcta identificación y establecer si se trata o no de una posible nueva especies. En Aeromonas se sabe que existen entre 9 y 10 copias del gen ARNr 16S, gracias a los 2 genomas de Aeromonas secuenciados en la actualidad (A. hydrophila y A. salmonicida) y a estudios de polimorfismo de longitud de la región ISR 16S-23S (A. culicicola). La existencia de microheterogeneidades en el gen del ARNr 16S se ha demostrado en algunas de las especies del género como A. popoffii, A. media, A. molluscorum, A. veronii, A. bestiarum, A. salmonicida y A. allosaccharophila. Sin embargo, la frecuencia, localización y composición de estas posiciones variables así como su impacto en la taxonomía de Aeromonas aún no ha sido investigado en profundidad. Asimismo, otros autores también han publicado, en estos años, otros protocolos de RFLP del ADNr 16S para la identificación de las especies de Aeromonas más habituales en clínica. Sin embargo, no se ha evaluado si éstos son realmente específicos para las especies para las que se han propuesto. En el año 2002 el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas (ISCP) propuso que para la definición del taxón especie se realice un estudio polifásico, fenotípico y molecular, donde se incluya, además de las técnicas genéticas clásicas (hibridación ADN-ADN, secuenciación de al menos 1300 pb del gen ARNr 16S), el análisis de las secuencias de 5 genes housekeeping. Estos genes poseen una tasa de mutación mayor que el gen ARNr 16S permitiendo así discriminar especies estrechamente relacionadas. Sin embargo, hasta la fecha no existe ninguna descripción de nuevas especies de 52 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTERÉS Y OBJETIVOS Aeromonas que utilice 5 genes housekeeping, tal y como recomienda el ISCP. Nuestro grupo de investigación fue pionero en la introducción de los genes housekeeping (gyrB y rpoD) en el análisis filogenético del género Aeromonas. Desde entonces otros autores han ido publicando otros estudios utilizando diversos genes (rpoB, dnaJ y recA) que también han demostrado ser útiles para establecer las relaciones filogenéticas en el género. Por tanto, es importante utilizar estos genes a la hora de caracterizar posibles nuevas especies. La definición de nuevas especies debe incluir, como requisito indispensable, el grado de similitud de sus genomas con el de las especies más relacionadas filogenéticamente utilizando la técnica de hibridación ADN-ADN. Algunos de los método empleados para la hibridación requieren de aparatos específicos y costosos, siendo escasos los centros de referencia donde se realizan estos ensayos. Sin embargo, existen métodos de hibridación ADN-ADN que se pueden implantar en cualquier laboratorio de microbiología sin grandes inversiones, por lo que nos planteamos poner a punto esta técnica en nuestro laboratorio. Se realizó una estancia de tres semanas en la Universidad de Valencia, dónde tenían implementada esta técnica, con el objeto de poder adquirir los conocimientos necesarios para reproducirla en nuestro laboratorio. El aislamiento de Aeromonas asociadas a diversos procesos diarreicos es frecuente pero su papel como agente etiológico de infecciones gastrointestinales, ha sido cuestionado en numerosas ocasiones. Algunas especies del género han sido consideradas el agente causal del síndrome urémico hemolítico (SUH). Las toxinas relacionadas con el SUH son las toxinas Shiga, Verotoxinas o Verocitotoxinas tipo 1 (Stx1) y tipo 2 (Stx2). Hasta la fecha, estas toxinas y los genes que las codifican (stx1 y stx2) han estado muy poco estudiados en Aeromonas. Existen sólo dos estudios que investigan la presencia de estos genes en Aeromonas. En uno de ellos se detectó la presencia del gen stx1 en cuatro cepas y se observó que dicha toxina estaba codificada en un plásmido. En el otro se detectó este gen en una cepa aislada de una muestra de agua. No obstante, en ninguno de estos 2 estudios se ha llegado a secuenciar el gen stx1 ni se ha logrado detectar el gen stx2. La demostración de la presencia de estos genes en Aeromonas podría justificar su asociación con procesos diarreicos así como ratificar su capacidad de producir SUH. A parte de los procesos diarreicos mencionados, Aeromonas es capaz de producir otros procesos infecciosos (septicemia, enfermedad pancreática o hepatobiliar, peritonitis, colangitis e infecciones nosocomiales). En la presente tesis, y en colaboración con los hospitales: Hospital Clinic de Barcelona, Royo Vilanova de Zaragoza y Hospital General de Guadalajara, se aporta un caso de colangitis con una posible inducción in vivo de resistencia antibiótica al imipenem así como diversos casos de infecciones de herida quirúrgica. Las cepas de Aeromonas aisladas en estos casos se han identificado genéticamente y se ha evaluado por PCR la existencia de los genes de diversos factores de virulencia en las mismas. Con este trabajo se pretende contribuir al esclarecimiento de los aspectos mencionados anteriormente a través de los siguientes objetivos concretos: 53 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas INTERÉS Y OBJETIVOS 1. Identificar genéticamente las cepas ambientales, aisladas en nuestro laboratorio, y las de origen clínico, recibidas de diversos hospitales, caracterizando los patrones de RFLP del gen ARNr 16S. Utilizar el gen rpoD para identificar las cepas que presentan un patrón de RFLP atípico y determinar cuales son las especies más prevalentes. 2. Investigar si otros protocolos de RFLP del ADNr 16S propuestos por otros autores permiten la identificación correcta de las especies para las que se han definido. 3. Investigar la microheterogeneidad del gen ARNr 16S en las cepas con patrón atípico y establecer su frecuencia y localización así como su repercusión en la taxonomía de Aeromonas. 4. Poner a punto las técnicas de hibridación ADN-ADN en nuestro laboratorio para poder establecer el grado de similitud de las cepas candidatas a pertenecer a nuevas líneas filogenéticas con sus especies más cercanas. 5. Caracterizar las cepas que potencialmente pertenezcan a nuevas especies de Aeromonas mediante un estudio polifásico que incluya la hibridación, un amplio análisis fenotípico y filogenético del gen ARNr 16S y de cinco genes housekeeping (gyrB, rpoD, recA, dnaJ y gyrA). 6. Identificar genéticamente una cepa de Aeromonas aislada de una paciente con síndrome urémico hemolítico (SUH) y establecer si posee los genes que codifican para factores de virulencia tales como la aerolisina, el Sistema de Secreción Tipo 3 y de la proteína efectora AexT secretada por este sistema. 7. Investigar si los genes stx1 y stx2 que codifican para las toxinas Shiga están presentes en cepas de Aeromonas de origen humano y si lo están, establecer su incidencia y similitud con los genes stx1 y stx2 de E. coli productoras de toxinas Shiga (STEC). 8. Establecer qué especies de Aeromonas se asocian a casos de infección de herida quirúrgica y determinar las características clínicas de estas infecciones. 9. Caracterizar genéticamente 9 aislados de Aeromonas de dos muestras de bilis de un paciente con colangitis y determinar las causas que generan la resistencia de algunos de estos aislados al imipenem. 54 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Origen de las cepas Todas las cepas identificadas en el presente estudio se detallan en los anexos adjuntos (Anexo1-4). 3.1.1. Cepas clínicas Las cepas clínicas analizadas (Anexo 1 y 3) en la presente tesis doctoral fueron facilitadas por los siguientes hospitales: Hospital Universitario Sant Joan de Reus; Hospital Universitario Miguel Servet de Zaragoza, Hospital Royo Vilanova de Zaragoza, Hospital Universitario de Guadalajara, Hospital Universitario Nacional Cheng Kung de Tainan (Taiwán) e Instituto Oswaldo Cruz de Río de Janeiro (Brasil). Además, se utilizaron en diversos estudios cepas clínicas de la colección de esta Unidad de Microbiología recibidas previamente del Hospital Universitario Vall d´Hebrón y Hospital Universitario Clínic, de Barcelona, y cepas del Hospital Universitario Sant Joan de Reus. 3.1.2. Cepas animales Las cepas de origen animal identificadas durante el presente estudio fueron aisladas principalmente de peces y con menor frecuencia de ganado bovino, ovejas, cerdos, grullas, patos, búhos y pitones (Anexo 2). Estas cepas fueron proporcionadas por el Dr. Ron A. Miller del Center for Veterinary Medicine (CVM) of the Food and Drug Administration (FDA) de USA, por la Dra. Mª Cristina Osiprandi de la Universita Degli Estudi di Parma (Parma, Italia), por el Dr. Jens P. Teifke del Instituto Friedrich-Loeffler (Insel Riems, Alemania) así como por el Dr. Jesús Romalde de la Universidad de Santiago de Compostela (USC). 3.1.3. Cepas ambientales Las cepas ambientales que se detallan en el Anexo 4, identificadas en el presente trabajo fueron aisladas de aguas procedentes principalmente de balsas de regadío, de la red de distribución de aguas del aeropuerto de Reus y del río Llobregat. 3.1.4. Cepas de colección y de referencia En el presente estudio se han utilizado también cepas tipo de todas las especies de Aeromonas así como cepas de referencia procedentes de diferentes colecciones de cultivo que se especifican en cada estudio (Anexos 5-9). Las cepas pertenecientes a otros géneros se detallan en aquellos estudios en los que se han utilizado. 3.1.5. Resiembra y conservación de cepas Las colonias aisladas a partir del medio selectivo ADA (Agar Dextrosa Ampicilina) así como las cepas recibidas de los diferentes hospitales, se sembraron en agar sangre de carnero (Biomedics) y se incubaron durante 24 h a 30oC, tal como recomiendan Toranzo y cols. (1986). 56 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS Conservación a corto plazo. Se resembraron las cepas en agar sangre de carnero, se cultivaron a 30ºC durante 24 h y se mantuvieron a 4ºC durante un periodo no superior a una semana. Conservación a largo plazo Ultra-congelación. Las cepas se inocularon en viales que contenían TSB (Difco) con un 15% de glicerol y se congelaron a -80oC. Liofilización. Las cepas se inocularon en TSA (Agar Triptona Soja) o agar sangre en siembra masiva y se incubaron durante 24 h a 30oC para asegurar un mínimo de 108 células viables por mililitro. Se recogió todo el cultivo con un asa de siembra y se mezcló en 3 ml de leche desnatada al 10% (crioprotector) previamente esterilizada. Se dispensaron 0.5 ml de la mezcla en viales de vidrio estériles de 1.5 ml y a continuación se congelaron a -45oC durante 1 h dentro del propio liofilizador (Advantage 2.0 Series; Virtis Company Gardiner). La sublimación se consiguió a -45oC, seguido de un vacío de 200 mTorr y el siguiente ciclo de liofilización: 4 h a -30oC, 4 h a -10oC, 5 h a 10oC y finalmente 5 h a 30oC. Una vez finalizado el proceso, se sellaron los viales en condiciones de vacío. El éxito de la liofilización se determinó comprobando la viabilidad del cultivo de varias de las muestras elegidas al azar. 3.2. Caracterización fenotípica 3.2.1. Cepas clínicas humanas y animales Las cepas clínicas fueron identificadas en los diferentes centros de procedencia mediante los sistemas comercializados como API 20E o Vitek (Biomérieux) o con protocolos bioquímicos establecidos en los centros de origen. 3.2.2. Cepas ambientales Las cepas de origen ambiental se identificaron como Aeromonas en base a pruebas características del género como la formación de colonias amarillas en ADA, el crecimiento al 0 y 3% de cloruro sódico pero no al 6% (en TSB), la respuesta positiva a las pruebas de la oxidasa (Difco) y la catalasa, la reducción de nitratos a nitritos así como la resistencia al factor vibriostático O129 (150 g de 2,4-Diamino-6,7-di-iso-propilpteridina fosfato por disco, Oxoid). 3.2.3. Cepas pertenecientes a nuevas líneas filogenéticas En los estudios 4.1.5.-4.2.9, una vez se confirmaron las cepas como Aeromonas y se identificaron como líneas filogenéticas independientes mediante diversos métodos moleculares (secuenciación de distintos genes housekeeping, DDH), se sometieron a un extenso análisis bioquímico. En dicho análisis se incluyeron tanto un control positivo como negativo para cada una de 57 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS las pruebas. Estos controles pertenecían a cepas tipo de una especie reconocida de Aeromonas y/o de Vibrio procedentes de las diversas colecciones de cultivo. La caracterización bioquímica de los aislados se realizó en base a las siguientes pruebas. La motilidad se evaluó en medio semisólido (sulfuro-indol-motilidad = SIM, Difco) y por observación al microcopio óptico mientras que la presencia de swarming se determinó en agar específico (agar swarm). También se evaluaron la producción de ácido sulfhídrico (H2S) a partir de la cisteína (SIM), la producción de Indol (Difco), la reacción de Voges-Proskauer (caldo RM/VP con reactivos de VP de Barritt), la producción de gas de la glucosa así como la producción de las enzimas argininadihidrolasa, ornitina- y lisina-decarboxilasas (en medio Møller), gelatinasa, ureasa, DNAsa, elastasa y ß-galactosidasa. Además, se valoró la fermentación/oxidación de la sacarosa, L-arabinosa, celobiosa, m-inositol, lactosa, D-manitol, D-rafinosa, L-ramnosa, salicina, D-sorbitol y glicerol en medio líquido con rojo de metilo como indicador de pH (pH ácido color amarillo, pH básico color rojo). Todos los hidratos de carbono así como el glicerol se prepararon al 1% en el medio final excepto la salicina que se preparó al 0.5% (Borrell y cols., 1998). Todas las pruebas se realizaron por triplicado. La mayoría de estos tests se evaluaron también con los kits comerciales API20E y API20NE (Biomérieux), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Con dichos kits se evaluó además, la capacidad de utilización de la D-manosa, D-glucosa, N-acetilglucosamina, D-maltosa, gluconato potásico, ácido málico, L-arabinosa, D-manitol, ácido cáprico, ácido adípico, ácido fenilacético y citrato trisódico como únicas fuentes de carbono y energía. El kit comercial API50CH (Biomérieux) se utilizó para evaluar la producción de ácido del glicerol, D-ribosa, D-galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, D-lactosa, N-acetilglucosamina, salicina, D-celobiosa, D-maltosa, D-sacarosa, D-trealosa, almidón, glucógeno, gentiobiosa, gluconato potásico, eritritol, L- y D-arabinosa, L- y D-xilosa, D-adonitol, metil-ß-D-xilopiranosa, L-sorbosa, L-ramnosa, dulcitol, inositol, D-manitol, D-sorbitol, metil-α-Dmanopiranosido, metil-α-D-glucopiranósido, amigdalina, arbutina, esculina, D-melobiosa, inulina, Dmelezitosa, D-rafinosa, xilitol, D-turanosa, D-lixosa, D-tagatosa, L- y D-fucosa, L- y D- arabitol, 2cetogluconato potásico y del 5-cetogluconato potásico. Las pruebas bioquímicas se incubaron a las temperaturas óptimas de crecimiento, generalmente a 30ºC en los casos de cepas ambientales, y adicionalmente a 36ºC en las cepas de origen clínico. Todas las respuestas se evaluaron cada 24 h durante 7 días. A partir de las respuestas obtenidas se seleccionaron las pruebas características que permitían la diferenciación de cepas representantes de nuevas líneas filogenéticas del resto de las especies descritas en el género, evaluándose también estas pruebas en las cepas tipo de cada una de las especies. Asimismo se valoró la producción de pigmento marrón a temperatura ambiente y a 30oC en TSA (Austin y cols., 1998), realizándose lecturas cada 24 h durante 5 días. El rango de temperatura y temperatura óptima así como el rango de pH y pH óptimo de crecimiento se determinaron en medio líquido (TSB) mediante densidad óptica a 450 nm. Se preparó un cultivo líquido de TSB (1 colonia por 10 ml de TSB) y se realizaron alícuotas de 2 ml por tubo que se colocaron en nevera, a 4ºC, y en 58 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS estufas a las temperaturas de 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45 y 50º C. La evaluación del pH óptimo de crecimiento se realizó añadiendo 0,5 ml del mismo cultivo líquido a 2 ml de TSB a los que se les había ajustado el pH a valores de 5, 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8 y 9, y fueron incubados a la temperatura óptima de crecimiento. Las lecturas de absorbancia se realizaron transcurridas 24 y 48 h. La determinación de la morfología, tamaño celular y presencia de flagelo, se realizó al microscopio electrónico de barrido y al microscopio electrónico de transmisión. La preparación de las muestras y su observación microscópica se realizaron en el Servicio de Microscopía de la Universidad Rovira i Virgili. Para la preparación de estas muestras las cepas fueron sembradas en TSA y se incubaron durante 24 h a 30ºC. Microscopía electrónica de barrido: se recortaron fragmentos de agar que contenía colonias de una placa de TSA y se fijaron con glutaraldehído al 2,5% (v/v) en tampón fosfato 0.1 M a temperatura ambiente durante 2 h y posteriormente con tetróxido de osmio al 1% (v/v) en H2O destilada durante 4 h. Tras 3 lavados con agua destilada, las muestras se deshidrataron con etanol a concentraciones crecientes (30, 50, 70%) y finalmente con etanol absoluto realizándose a continuación la técnica del punto crítico. Tras el montaje y metalización, las muestras se observaron en un microscopio JEOL JSM 6400. Microscopía electrónica de transmisión (Tinción negativa): Se tomó una muestra de un cultivo en TSA y se resuspendió en una solución de ácido fosfotúngstico al 2% y pH 6.9. Tras una breve agitación en el vórtex se depositó cuidadosamente una gota de la mezcla sobre una rejilla recubierta con Formvar y carbón. Transcurrido un minuto se eliminó el exceso de muestra de la rejilla y una vez seca la preparación, las células se observaron en un microscopio JEOL 1011. 3.3. Caracterización genética Todas las cepas, tanto las recibidas de otros centros como las aisladas en nuestro laboratorio, se confirmaron a nivel de género mediante la PCR específica para Aeromonas descrita por Chacón y cols. (2002). 3.3.1. Extracción de ADN El ADN se extrajo con la matriz comercial InstaGene Matrix (BioRad) para la amplificación de los genes del ARNr 16S, housekeeping y los que codifican para factores de virulencia. Se tomaba una colonia y se resuspendía en un eppendorf que contenía 1 ml de H2OmQ. Tras centrifugar 1 min a 12000 rpm se eliminaba el sobrenadante, seguidamente se añadían 200 l de la matriz comercial que se incubaban entre 20-25 min a 56ºC. A continuación se transferían los tubos eppendorf a un baño a 100ºC, donde se mantenían 8 min, y se centrifugaban 5 min a 13000 rpm. Se transferían 100-150 l del sobrenadante que contiene el ADN, a un tubo limpio y se conservaba a -20ºC. 59 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS 3.3.2. Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP) del gen ARN ribosómico 16S (RFLP del ADNr 16S) Tanto las cepas aisladas en nuestro laboratorio como aquellas recibidas de distintos autores y centros, fueron caracterizadas en base a su patrón de RFLP del gen ARNr 16S utilizando el método desarrollado por Borrell y cols. (1997) y ampliado posteriormente por Figueras y cols. (2000a). La amplificación de 1503 pb del ADNr 16S se realizó utilizando los cebadores y condiciones descritos por Martínez-Murcia y cols. (1992a) y se comprobó cargando 5 l del producto en geles de agarosa al 1% en todos los estudios en los que se ha secuenciado o digerido este gen. En el primer paso de este protocolo (Figura 14) y tras la digestión de los 1503 pb del gen ARNr 16S con las endonucleasas AluI y MboI, se generaban patrones especie-específico para 10 de las especies del género (Borrell y cols., 1987; Figueras y cols., 2000a). Las especies A. salmonicida, A. bestiarum, A. encheleia, A. popoffii eran identificadas mediante digestiones con diversos enzimas de restricción siguiendo el protocolo de Figueras y cols. (2000a). Los patrones atípicos, diferentes a los esperados para especies conocidas del género Aeromonas, se analizaron cuidadosamente, en especial en los estudios 4.1.3, 4.1.4 y 4.1.6-4.1.9. A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. encheleia, Aeromonas HG11, A. popoffii, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, A. jandaei, A. schubertii, A. trota, A. allosaccharophila, Aeromonas Group 501 346 207 195 157 138 118 A .h y A dro .c av phi ia la e A .m ed ia A .s ob ria A .e uc re no A .v ph er ila on ii A .j an da A ei .s ch ub er A .t tii ro ta A .a llo sa cc A ha .c ro ul ph ic ila ic ol A a .s im ia e AluI+MboI species-specific patterns for: (A. hydrophila, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, A. jandaei, A. schubertii, A. trota, A. allosaccharophila)* Aeromonas Group 501 228 207 180 158 78 40 1050 452 species-specific pattern for: Aeromonas HG11 195 common pattern for: A. bestiarum, A. salmonicida, A. encheleia, Aeromonas HG11, A. popoffii 540,458 434 267 234 213 192 184 124,123 104 1502 NarI common pattern for: A. bestiarum, A. salmonicida common pattern for: Aeromonas HG11, A. encheleia, A. popoffii HaeIII 317 220 204 common pattern for: 171 168 A. encheleia, A. popoffii PstI species-specific pattern for: A. bestiarum A. salmonicida SfaNI species-specific pattern for: A. bestiarum A. salmonicida 262 220 204 171 168 AlwNI species-specific pattern for: A. encheleia species-specific pattern for: A. popoffii 1502 1005 497 575 504 371 575, 556 371 1044 574 470, 458 458 Figura 14. Patrones de RFLP del ADNr 16S obtenidos siguiendo el protocolo de Figueras y cols., 2000a para las 14 especies del género Aeromonas. Modificado de Borrell y cols. (1997) y Figueras y cols. (2000a). 60 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS 3.3.3. Secuenciación La reacción de secuenciación se realizó para todos los genes en un volumen final de 10 µl que contenían 100-200 ng (2 µl) del correspondiente producto de PCR purificado, 1 µl (3.2 pmol) del cebador y 7 µl de la mezcla constituida por BigDye: 4 µl, Sequencing Buffer: 2 µl y H2OmQ: 8 µl, de ABI PRISM® BigDye™ Terminators vers. 2.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Las condiciones para cada ciclo de reacción programada fueron: 94oC, 5 min (desnaturalización); seguida de 25 ciclos de 96oC, 10 s (desnaturalización); 50oC, 5 s (hibridación); 60oC, 4 min (extensión). El producto de cada reacción fue precipitado con etanol y analizado en un secuenciador automático ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. 3.3.3.1. Gen ARN ribosómico 16S Se secuenció el gen del ARNr 16S, 1503 pb, en las cepas que mostraron un patrón de RFLP atípico así como en las cepas representantes de potenciales nuevas líneas filogenéticas de Aeromonas. Una vez comprobada la amplificación del gen, el resto del producto se purificó para la secuenciación con un kit comercial, GFXTM PCR DNA - Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la secuenciación se utilizaron 10 cebadores diferentes (Tabla 9) con el fin de obtener suficientes cromatogramas solapados de las regiones sospechosas de poseer microheterogeneidades y poder así comprobar la dualidad de la señal en cada uno de ellos. Tabla 9. Cebadores utilizados en la amplificación y secuenciación del ADNr 16S de Aeromonas. Cebador Anti 1 16SseqF1 16SseqF2 16SseqF3 16SseqF4 S seqR1 seqR2 seqR3 seqR4 Secuencia 5’ Posición1 8-27 288-308 578-598 884-904 1164-1182 1509-1491 1262-1242 1005-985 782-762 366-346 AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3’ AGC TGG TCT GAG AGG ATG AT 3’ ACG CAG GCG GTT GGA TAA GT 3’ TGG GGA GTA CGG CCG CAA GG 3’ GGT GAT AAA CCG GAG GAA GG 3’ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’ TTG CAG CCC TCT GTA CGC GC 3’ TCC AGA CAT GTC AAG GCC AG 3’ ATC CTG TTT GCT CCC CAC GC 3’ ATT CCC CAC TGC TGC CTC CC 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 1 Localización según su posición en Escherichia coli (Brosius, 1978) 61 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS La detección y marcaje de las microheterogeneidades se realizó visualmete mediante el análisis ciudadoso de los electroferogramas y utilizando el código de la IUPAC para marcar y revelar tanto la mutación como la posición correspondiente en la secuencia consenso generada (Figura 15). Y R Figura 15. Detección y marcaje del polimorfismo interoperónico del ADNr 16S en Aeromonas. 3.3.3.2. Gen rpoD La amplificación para la secuenciación de 820 pb del gen rpoD (factor sigma de la polimerasa de ARN) se realizó con los cebadores y condiciones descritos previamente por nuestro grupo (Soler y cols., 2004) mediante la técnica del Touch Down PCR combinada con la técnica del Hot Start PCR. Se obtuvieron secuencias del gen rpoD en los estudios 4.1.3-4.1.9, 4.2.1 y 4.2.4. 3.3.3.3. Genes gyrB, gyrA y dnaJ Se secuenciaron los genes housekeeping gyrB, gyrA y dnaJ en los estudios de descripción de nuevas especies de Aeromonas, estudios 4.1.5-4.1.9, cuyas secuencias se concatenaron con las de los genes rpoD y recA en un estudio de Multi-Locus-Phylogenetic-Analysis (3684 pb) llevado a cabo en el Molecular Diagnostic Center (Martínez-Murcia y cols., en revisión). La secuenciación del gen gyrB (subunidad ß de la girasa de ADN) se realizó siguiendo el protocolo descrito por Yáñez y cols. (2003), también en el Molecular Diagnostic Center y fue asimismo utilizada en el estudio 4.2.1. 62 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS 3.3.3.4. Gen recA Las secuencias del gen recA se realizaron en los estudios polifásicos de descripción de nuevas especies de Aeromonas (4.1.6-4.1.9), tal y como se ha mencionado. Aunque en la actualidad existe un protocolo para la secuenciación de 272 pb del gen recA en Aeromonas (Sepe y cols., 2008), nuestro grupo trabaja en el desarrollo del MLPA desde el año 2003 (Yáñez y cols., 2003). Uno de los genes del MLPA es el gen recA que codifica una proteína requerida en la reparación del ADN por recombinación homóloga. El estudio de este gen comenzó en nuestro laboratorio en el año 2004 a partir de la única secuencia pública disponible en aquella época, U8368, de 1212 pb perteneciente a A. salmonicida A449 (Umelo y cols., 1996). A partir de esta secuencia se diseñaron los cebadores recAF y recAR, que amplificaban 720 pb e incluían una región de la que se había demostrado su utilizad en la taxonomía del género Vibrio (Thompson y cols., 2004). La amplificación del gen recA se realizó en un volumen final de 50 l que contenía 1 g de ADN genómico, 1X tampón (20 mM Tris-HCl pH8.4, 50 mM KCl), 1 M de cebador recAF (5´- VCTVGGTCARATTGAAAAGC -3´), 1 M del cebador recAR (5´-VTCGCCGTTATAGCTGTACC-3´), 3 mM MgCl2, 0.3 mM dNTP´s y 2.5 U Taq polimerasa (Invitrogen; Barcelona, España). Las condiciones para cada ciclo de reacción programada fueron 94ºC, 5 min de desnaturalización seguida de 35 ciclos de 94°C, 1 min (desnaturalización), 55°C, 1 min (hibridación); 72°C, 1 min (extensión); y finalmente una extensión a 72ºC 5 min. La amplificación se realizó en un termociclador 2710 o 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems). Se comprobaba que el fragmento amplificado correspondía con el esperado, de unos 720 pb, mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% de 5 l del volumen de PCR. El resto del producto de PCR fue purificado para su secuenciación mediante el GFXTM PCR DNA - Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech), siguiendo las instrucciones del fabricante. En el proceso de secuenciación se utilizaron 4 cebadores: 2 cebadores externos, los diseñados para el proceso de la amplificación, y 2 cebadores internos (recAseqF1:5´GAAATCGAAGGSGAGATG3´; recAseqR1: 5´ GACATCAGACGRGCCTGC3´), tal y como se ha detallado al comienzo del apartado 3.3.3. 3.3.4. Análisis de las secuencias y construcción de los árboles filogenéticos Las secuencias obtenidas fueron ensambladas con el programa informático AutoAssembler vers. 1.40 (Applied Biosystems) o DNAstar SeqMan (Lasergene) y alineadas mediante el programa informático CLUSTAL W (Thompson y cols., 1994). Los dendogramas se construyeron a partir de las secuencias alineadas utilizando el programa informático Mega (Molecular Evolutionary Genetics Análisis) vers. 3 (Kumar y cols., 2004) y vers. 4 (Tamura y cols., 2007). El análisis filogenético se realizó con el método de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987), y el método de Máxima-Parsimonia en los estudios 4.1.6-4.1.9, utilizando el modelo de Kimura- 2 parámetros (Kimura, 1980). La consistencia del análisis de evaluó con el test de bootstrap con 1000 repeticiones (Felsenstein, 1985). 63 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS 3.3.5. Hibridación ADN-ADN La hibridación ADN-ADN (DDH) fue la técnica empleada para determinar la similitud entre los genomas de 2 microorganismos en los estudios de descripción de nuevas especies de Aeromonas (4.1.6-4.1.9) utilizando el método descrito por Lind y Ursing (1986), con las modificaciones propuestas por Ziemke y cols. (1998) y Bouchotroch y cols. (2001). El proceso se desarrolló en 6 pasos: - Extracción del ADN - Marcaje del ADN - Reacción de hibridación - Separación de cadenas sencillas y dobles - Detección del ADN marcado - Análisis de los datos y cálculo de resultados Extracción del ADN Para la extracción del ADN se utilizó el método descrito por Marmur (1961) con algunas modificaciones que se indican a continuación. Las cepas a estudiar se inocularon en TSA en siembra masiva por triplicado y se dejaron crecer 24-48 h. El primer día del proceso de extracción del ADN, se transfería la biomasa a un tubo de 50 ml que contenía 10 ml de tampón Salino-EDTA. Las células se resuspendían en esta solución, se añadía lisozima (10 mg) y se incubaba 10 min a 37oC. Seguidamente, se añadían 1.5 ml de una solución de SDS al 25% y 3 ml de NaCl 5 M, se agitaba suavemente y se adicionaban 10 l de proteinasa K (Sigma) (10 mg/ml). La mezcla de incubaba 1 h a 60ºC. Transcurrido este tiempo, se añadían 10 ml de una mezcla 24:1 de cloroformo (9.6 ml): alcohol isoamílico (0.4 ml) y se mezclaba por inversión para obtener una suspensión homogénea. El volumen total se distribuía equitativamente en tubos eppendorf de 2 ml y se centrifugaba durante 20 min a 8000 rpm. El sobrenadante generado en cada eppendorf se transfería a un único tubo de 50 ml con cuidado de no arrastrar la interfase. El ADN se precipitaba añadiendo 0,56 partes del volumen transferido de isopropanol (que se almacenaba a -20ºC) y 1/9 partes de ese mismo volumen de acetato de sodio 3 M frío (4ºC) (Tabla 10), dejándolos resbalar suavemente por la pared del tubo. Tabla 10. Volúmenes de ADN, isopropanol y acetato de sodio utilizados en la precipitación del ADN. Tabla elaborada a partir de los datos del protocolo de Marmur (1961). Vol. de ADN transferido (ml) Vol. Isopropanol (ml) Vol. de Acetato de sodio (ml) 15 8,4 1,6 7 3,92 0,77 2 1,12 0,213 64 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS El ADN precipitado se enrollaba en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio estéril (Figura 16) y así se transfería a un tubo de 50 ml donde se lavaba este ADN, aún enrollado en la varilla, con concentraciones crecientes de etanol: dos lavados con etanol de 70% y un lavado final con etanol 100%. El alcohol se eliminaba por decantación y se dejaba secar el ADN a temperatura ambiente o en un termobloque a 40ºC. Finalmente la varilla se transfería a un tubo que contenía 2 ml de SSC 0,1X y se almacenaba a 4ºC hasta que el ADN se resuspendía totalmente, generalmente transcurrían entre 24 o 72 h. Una vez resuspendido el ADN, se adicionaban 220 l de SSC 10X y 20 l RNasa (Sigma) (10 mg/ml) a los 2 ml de SSC 0,1X. La mezcla se incubaba 1 h a 37 ºC. Seguidamente se añadían 1.5 ml de SDS al 25% y 3 ml de NaCl 5 M, se agitaban suavemente y se mantenían 10 min a 60ºC. A partir de este punto se continuaba igual que este mismo paso del primer día pero una vez se había secado el ADN, éste se resuspendía en agua miliQ estéril y no en SSC 0,1X. Figura 16. ADN recogido con una varilla durante el proceso de extracción. Marcaje del ADN Para el marcaje del ADN se utilizó un kit comercial, Kit Nick Translation (Roche). A partir de los nucleótidos independientes proporcionados por el kit (dATP, dCTP, dGTP) se preparó una mezcla con igual concentración de todos ellos excepto de dTTP, cuya proporción era inferior (Tabla 11). La diferencia se compensó adicionando uracilo marcado con digoxigenina (Dig-11-dUTP, Roche) y biotina (Biotin-11-dUTP, Roche), responsables en sí del marcaje. La mezcla se preparaban siguiendo las instrucciones del fabricante según se ilustra en la Tabla 11 y Figura 17. Tabla 11. Preparación de las mezclas de marcaje del ADN en función del número de ADNs a marcar. l dATP:dCTP:dGTP (1:1:1) Premezcla 1 (P1) Mezclar Volumen de la P1 a añadir a la MI 1 3:3:3 9 2 3:3:3 9 3 5:5:5 13.5 4 6:6:6 18 5 8:8:8 22.5 6 8:8:8 22.5 MI: Mezcla Intermedia Nº ADNs a marcar l dTTP a añadir a la MI l dUTP-digx:dUTP.biotin (0.75:0.25) Premezcla 2 (P2) Mezclar Volumen de la P2 a añadir a la MI 0.75:0.25 1 0.75:0.25 1 1.5:0.5 1.5 1.5:0.5 2 3:1 2.5 3:1 2.5 Volumen final Mezcla Intermedia (MI) 12 12 18 24 30 30 2 2 3 4 5 5 65 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS Figura 17. Esquema del marcaje del ADN con el kit comercial Nick Translation. Premezcla 1 16 l dATP 16 l dGTP 16 l dCTP Transferir (22.5x2) 45 l rir nsfe T ra 2 ) 5 l x (2 . 5 Mezcla Intermedia 45 l Premezcla 1 + 10 l dTTP + 5 l Premezcla 2= 60 l Premezcla 2 6 l dUTP-digx 2 l dUTP-biotin MEZCLA FINAL para 10 reacciones X10 Mezcla Intermedia Buffer 10x Enzimas H2OmQ 5 1 1 1 50 10 10 10 VT=80 l 8 l Mezcla Final + 2 l del DNA a marcar Ejemplo de la mezcla intermedia y final para 4 muestras de ADN por duplicado más el control positivo (n=9). Para conocer los volúmenes que debe incluir la mezcla intermedia que se calcula para 10 reacciones, se utilizan el doble de los volúmenes establecidos en la Tabla 10 para 5 ADNs a marcar. Una vez preparada la mezcla final, se añadían 8 l de ésta a 2 l (0.5 µg) del ADN a marcar. La mezcla se incubaba 90 min a 15ºC (en un termociclador) y seguidamente se realizaba la precipitación del ADN mediante la adición a la mezcla de 40 µl de acetato de sodio 3 M (frío), 890 µl de etanol (a -20ºC) y 390 µl de agua miliQ (frío). Esta mezcla se mantenía a 4 ºC durante 15 min o bien a -20ºC toda la noche. Seguidamente, se centrifugaba a 13000 rpm durante 10 min, se eliminaba el sobrenadante por decantación y una vez seco el ADN precipitado, se resuspendía en 100 µl de agua miliQ. Un microlitro de esta solución se utilizaba para comprobar la eficiencia del marcaje siguiendo el protocolo de detección del ADN marcado que se describe más adelante. Reacción de hibridación Para realizar la hibridación ADN-ADN se enfrentan el ADN marcado de la cepa a estudiar frente al ADN sin marcar de aquellas cepas con las que se quiere conocer el grado de similitud así como su propio ADN. Para ello se mezclaron, en un eppendorf, entre 6-12 µl de ADN marcado (en función de la calidad del marcaje obtenido) con 15 µg del ADN sin marcar ajustando el volumen hasta 72 µl con agua miliQ estéril. Seguidamente las mezclas de ADNs se desnaturalizaron físicamente (10 min a 95ºC seguidos de 5 min a 0ºC) y se añadieron a las mezclas 28 µl de tampón fosfato (PB) 1 M obteniendo una concentración final del mismo de 0.28 M. Finalmente las mezclas de ADNs se recubrieron con 100 µl de aceite mineral estéril para evitar la evaporación de las mismas y se incubaron durante 16 h a una temperatura óptima de renaturalización o reasociación (TOR) de 70ºC. Esta TOR se calculó utilizando el valor medio del 60% de G+C del género Aeromonas (MartinCarnahan y Joseph, 2005) y aplicando las siguientes fórmulas, tal y como se describe en la introducción (Urdiain y cols., 2008): 66 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS Tm = ([G+C] + 182.2)/2.44 TOR = Tm- 30ºC Separación de cadenas sencillas y dobles Para la separación de las cadenas sencillas (ADNmc) de las cadenas dobles (ADNbc) se utilizó una matriz de hidroxiapatita (tipo I, Sigma) según el protocolo de Brenner y cols. (1969). Previamente a la separación de las cadenas sencillas y dobles de ADN, la hidroxiapatita se equilibró añadiendo 10 ml de agua miliQ por gramo de hidroxiapatita, y después con PB 0.14 M al 0.2% de SDS a igual concentración (p/v). Tras centrifugar (1 min a 13000 rpm) la mezcla hidratada de hidroxiapatita se eliminó el sobrenadante y se resuspendió, con un agitador, totalmente el pellet en 1 ml de tampón fosfato 0.14 M. El lavado con tampón fosfato se repitió tres veces y finalmente se hicieron alícuotas de 200 µl que se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante de cada tubo para quedarnos con los precipitados de hidroxiapatita equilibrada. Paralelamente, y transcurrido el periodo de reasociación (16 h), se extrajeron las mezclas ADNs de hibridación del fondo de los eppendorf y se transfirieron a un tubo nuevo. A cada tubo, se le añadió exactamente el mismo volumen de agua miliQ, obteniendo así una concentración final de 0.14 M de tampón fosfato. Se añadieron 50 µl de esta solución a las alícuotas que contenían el precipitado de hidroxiapatita equilibrada, se homogeneizaron con agitador y se incubaron a un temperatura 5ºC por debajo de la TOR , i.e. 65ºC, durante 15 min Seguidamente se centrifugaron las mezclas (2 min a 13000 rpm) y los sobrenadantes que contiene el ADN monocatenario (ADNmc) se transfirieron a tubos estériles. Este paso se repitió 2 veces adicionando a los tubos volúmenes de 450 µl y 500 µl de PB 0.14 M con incubaciones de 5 min a 65ºC en cada una de ellas. Tras estos 3 lavados, y de modo similar, se efectuaron otros 2 lavados para liberar las cadenas de ADN bicatenario (ADNbc) pero utilizando en este caso 200 µl de PB 0.4 M y sin realizar ninguna incubación. Finalmente obteníamos el ADNmc en 1000 l de PB 0.14 M y ADNbc en 400 l en PB 0.4 M. Detección del ADN marcado La detección del ADN marcado, tanto tras la hibridación como para la comprobación del marcaje, se realizó en microplacas (StreptaWell, Roche) que llevan unida estreptavidina, ésta posee una gran afinidad con la biotina (Figura 18). A cada pocillo se le adicionaron 2 µl de albúmina bovina al 10%, con el fin de evitar uniones inespecíficas, y 200 µl de las alícuotas de ADNmc y ADNbc, este último previamente desnaturalizado, y se incubaba durante 1 h 30 min a 28ºC en agitación. 67 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS ESTRPTAVIDINA DIGOXIGENINA BIOTINA pNPP PA PA color PA pNPP color ADNmc ANTI-DIGOXIGENINA MICROPLACA Figura 18. Esquema de la detección del ADN marcado en microplaca con estreptavidina. Una vez unido el ADN marcado, con la digoxigenina y biotina, a la placa por la unión específica de la biotina con la estreptavidina (Figura 18), se procedió al lavado de los pocillos con tampón fosfato salino (PBS), 3 veces, con el fin de eliminar los restos del ADN no unidos a la placa. Seguidamente se añadieron 200 l por pocillo de una solución de PBS (5 ml) con anticuerpo (1 l) anti-digoxigenina (Roche) y se incubaron las microplacas durante 1 h 30 min a 28ºC con agitación. El anticuerpo anti-digoxigenina lleva unida una fosfatasa alcalina (PA). Transcurrida la incubación se realizaron otros 3 lavados con PBS y finalmente un lavado con 200 l de coating buffer (Na2CO3 7.5 mM, NaHCO3 15.5 mM, MgCl2 1 mM). Finalmente se añadieron a cada pocillo 250 µl de la solución de detección constituida por una pastilla de p-nitrofenilfosfato (pNPP, Sigma, sustrato de la fosfatasa alcalina) disuelta en 5 ml de coating buffer. La microplaca se incubó a 37ºC sin agitación hasta que se desarrolló totalmente el color amarillo del producto de la fosfatasa. La lectura de la microplaca se realizó en un lector de ELISA (Kinetic-QCL) a una longitud de onda de 405 nm. Los valores de absorbancia obtenidos se transformaban entonces en valores del grado de reasociación (BR) tal y como se describe a continuación. Las mediciones se prolongaron durante 24 h hasta obtener 3 veces consecutivas un valor del grado de reasociación relativo (RBR) constante. Análisis de datos y cálculo de resultados La similitud ADN-ADN se obtuvo teniendo en cuenta tanto la reasociación del ADN homólogo (el que hibrida consigo mismo) como el heterólogo o híbrido (el ADN marcado con el ADN con el que queremos conocer el grado de similitud). Concretamente, el grado de reasociación (BR) se obtuvo como el porcentaje de ADN marcado obtenido a partir del ADNbc respecto al ADN total [ADNbc / (ADNmc + ADNbc)]. Asimismo, el grado de reasociación relativo (RBR) del ADN heterólogo se expresó como porcentaje del homólogo [(grado de reasociación del ADN 68 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS heterólogo/grado de reasociación del ADN homólogo) x 100]. Los experimentos de hibridación se realizaron por duplicado y se repitieron tres veces de manera directa (A*x B) y tres veces de manera recíproca (B*x A) obteniendo una media que fue considerada el resultado final. Un grado de reasociación relativo por debajo del 70%, en condiciones de renaturalización óptimas, indica que los dos genomas pertenecen a especies diferentes (Rosselló-Móra, 2006). 3.3.6. Técnicas de tipado molecular Las técnicas de tipado se emplearon principalmente en los estudios 4.1.1, 4.2.1 y 4.2.5. 3.3.6.1. ERIC - PCR La técnica del ERIC-PCR se realizó siguiendo las condiciones descritas por Soler y cols. (2003). La amplificación se realizó a partir de 100 ng de ADN total en un volumen final de 50 l. La reacción de PCR contenía tampón 1X (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl), 1 M de cebador ERIC-1 (5’ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C3’), 1 M de cebador ERIC-2 (5’AAG TAA GTG ACT GGG GGT3’) (Vila y cols., 1996), 3 mM MgCl2, 0.3 mM dNTP´s y 2.5 U Taq polimerasa. Las condiciones para cada ciclo de reacción programada fueron: 94°C, 1 min (desnaturalización); 52oC, 1 min (hibridación); 65oC, 8 min (extensión); estas condiciones se repitieron en 30 ciclos y al finalizar se efectuó una última polimerización durante 16 min a 65°C. Los productos de amplificación fueron sometidos a electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% incluyendo en ambos extremos el marcador de peso molecular AmpliSizeTM de 50 a 2000 pb (Bio-Rad Laboratories). El revelado del gel se realizó durante 20 minutos en 500 ml de una solución de tampón TBE 1X que contenía 25 l de una solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) (Sambrook y cols., 1989). 3.3.6.2. RAPD-PCR La amplificación aleatoria de ADN polimórfico se llevó a cabo en el Molecular Diagnostic Center (Orihuela). Los cebadores empleados fueron A8 y OPA20, recomendados en la bibliografía (Martínez-Murcia y cols., 1995). 3.3.6.3. PFGE La electroforesis en campo pulsante fue realizada en el Hospital Clínic de Barcelona siguiendo las condiciones descritas en la literatura (Gautom 1997; Talon y cols., 1996; Giraud y cols., 2004). Las cepas se sembraron en caldo cerebro-corazón (Brain Heart Infusion, BHI) y se incubaron durante 24 h a 30ºC. Se tomaron 1.5 ml del cultivo y se precipitaron las células por centrifugación (13000 rpm, 2 min). El precipitado se lavó con 500 l de tampón TE-1 (Tris 100 mM - EDTA 100 mM) y se resuspendió en 300 l de este mismo tampón. De esta suspensión se tomaron 100 l a los que se añadió lisozima (1 mg/ml) y se incubó durante 15-20 min a 37ºC. Se preparó agarosa (Incert Agarose, 69 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS Cambrex), a una concentración 1.8%, en tampón TE-1 que se estabilizó a 55ºC. A los 100 l de la solución celular con lisozima se añadieron 120 l de agarosa a 55ºC, consiguiendo una mezcla homogénea con la que se rellenaron los moldes. Estos se dejaron enfriar a 4ºC durante 5-10 min para que se solidificaran. Seguidamente, los bloques de agarosa se incubaron 2 h a 55ºC en 2.5 ml de una solución de EDTA 0.5 M y Sodio-Lauril sarcosina (1%) con proteinasa K (1 mg/ml). A continuación se realizaron varios lavados, el primero de 10 min con agua y 4 lavados más de 15 min cada uno con TE-2 (Tris 10 mM -EDTA 1 mM). Para la digestión del ADN se equilibraron los bloques de agarosa con el tampón de la endonucleasa (1X) durante 15-20 min. La endonucleasa utilizada para la digestión del genoma completo fue la SpeI. Se añadieron a cada bloque una solución de 150 l que contenía del tampón 1X de la enzima y 40 U de SpeI. Los productos de restricción fueron separados en geles de agarosa (Certified Megabase Agarose, Bio-Rad Laboratories Inc) al 1% con el marcador de peso molecular Lambda PFG Marker (BioLabs Laboratories Inc) y las siguientes condiciones de electroforesis: temperatura de electroforesis de 12ºC, tiempo inicial de reorientación de 2 min, tiempo final de reorientación 20 min, ángulo de reorientación de 120º y un gradiente de 6 V/cm utilizando un CHEF-DR III (Bio-Rad Laboratories Inc). La electroforesis se prologó durante 24 h. El revelado del gel se realizó durante 20 min en una solución de tampón TBE 0.5X (200 ml) que contenía 30 l de bromuro de etidio (10 mg/ml). 3.4. Detección de factores de virulencia Se evaluó la presencia de diversos factores de virulencia (estudios 4.2.1, 4.2.2 y 4.2.4) en base a la detección de sus genes mediante la amplificación por PCR de un fragmento de los mismos utilizando los cebadores y condiciones descritos en la bibliografía que se referencia en la Tabla 12. Tabla 12. Genes de factores virulencia, cebadores y condiciones de PCR utilizados para su determinación. Genes Cebadores Condiciones Temperatura Tiempo Ciclo (ºC) (min) 95 3 95 1 1 1 5 10 0.15 0.30 0.30 10 3 25 35 56 72 72 95 95 Producto (pb) aer-hemo 1 aer-F: 5´-CCTATGGCCTGAGCGAGAAG-3´ aer-R: 5´-CCAGTTCCAGTCCCACCACT-3´ 431 act2 AHCF1: 5´-GAGAAGGTGACCACCAAGAACA-3` AHCR1: 5´-AACTGACATCGGCCTTGAACTC-3´ 66 72 72 232 alt 3 alt-F: 5´-AAAGCGTCTGACAGCGAAGT-3´ 95 320 70 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS alt-R: 5´-AGCGCATAGGCGTTCTCTT-3´ 94 50 72 72 95 94 1 1 1 5 3 1 1 1 5 3 1 1 1 5 3 1 1 1 5 3 1 1 1 5 3 1 1 1 5 3 1 1 1 5 5 1 1 1 7 5 1 1 1 7 3 1 1 1 5 4 35 ast 3 ast-F: 5´-ATCGTCAGCGACAGCTTCTT-3´ ast-R: 5´-CTCATCCCTTGGCTTGTTGT-3´ 50 72 72 95 94 35 504 GCAT1 GCAT-F: 5´-CTCCTGGAATCCCAAGTATCAG-3´ GCAT-R: 5´-GGCAGGTTGAACAGCAGTATCT-3 56 72 72 95 94 35 237 serina1 Serine F: 5´-CACCGAAGTATTGGGTCAGG-3´ Serine-R: 5´-GGCTCATGCGTAACTCTGGT-3´ 60 72 72 95 94 35 350 lipasa1 lip-F: 5´-CA(C/T)CTGGT(T/G)CCGCTCAAG-3´ lip-R: 5´-GT(A/G)CCGAACCAGTCGGAGAA-3´ 56 72 72 95 94 35 247 DNasa 1 Exu-F: 5´-(A/G)GACATGCACAACCTCTTCC-3´ Exu-R: 5´-GATTGGTATTGCC(C/T)TGCAA(C/G)-3´ 54 72 72 95 94 35 323 laf 3 lip-F: 5´-CA(C/T)CTGGT(T/G)CCGCTCAAG-3´ lip-R: 5´-GT(A/G)CCGAACCAGTCGGAGAA-3´ 50 72 72 95 94 35 737-743 ascV 4 ascV-F: 5´-ATGGACGGCGCCATGAAGTT-3´ ascV-R: 5´-TATTCGCCTTCACCCATCCC-3´ 50 72 72 95 94 36 710 ascF-G 4 ascF-G-F: 5´-ATGAGGTCATCTGCTCGCGC-3´ ascF-G-R: 5´-GGAGCACAACCATGGCTGAT-3´ 50 72 72 95 94 36 900 aexT5 RASEXOS-L: 5´- GGCGCTTGGGCTCTACAC-3´ RASEXOS-R: 5´- GAGCCCGCGCATCTTCAG-3´ 60 72 72 35 535 1 Soler y cols., 2002; Kingombe y cols., 1999; Aguilera-Arreola y cols., 2005; Chacón y cols., 2004; 5Braun y cols., 2002. 2 3 71 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS 3.4.1. Detección y secuenciación de los genes que codifican para las toxinas Shiga stx1 y stx2 Para la detección por PCR de los genes stx1 y stx2, que codifican las toxinas Shiga 1 y 2 (estudio 4.2.3), se utilizaron los mismos cebadores empleados por Haque y cols. (1996). Para la detección del gen stx1 se utilizaron también los diseñados por Pass y cols. (2000) y empleados previamente para la detección de estos genes en Aeromonas (Haque y cols., 1996; Snowden y cols., 2006). La amplificación de los genes stx1 y stx2 se realizó utilizando los cebadores y condiciones un kit comercial, Primer set EVT-1, EVT-2 para stx1 y Primer set EVS-1, EVS-2 para stx2, siguiendo las recomendaciones del fabricante (TaKaRa). El volumen final de la reacción de PCR, 50 l, contenía tampón 1X proporcionado por la casa comercial, 0.19 pmol de cada cebador, 0.2 mM dNTP´s y 1.25 U Taq polimerasa. Las condiciones para cada ciclo de reacción programada fueron: 94°C, 1 min (desnaturalización); 55oC, 1 min (hibridación); 72oC, 8 min (extensión); condiciones que se repitieron en 35 ciclos y realizándose una última polimerización durante 10 min a 72°C. En la amplificación de gen stx1 con los cebadores diseñados por Pass y cols. (2000) se siguieron las condiciones descritas por estos autores. En ambos casos se tomaron muestras de 25 l del volumen del producto de la PCR para la electroforesis en un gel de agarosa al 1%, con el fin de comprobar las amplificaciones de los fragmentos esperados, de unos 350 pb para el gen stx1 y de 406 pb para el stx2 con las condiciones de Haque y cols. (1996) y con las condiciones de Pass y cols. (2000) unos 121 pb para el gen stx1. Para la secuenciación de los fragmentos se utilizaron los mismos cebadores de la amplificación y se realizó tal como se ha detallado en el apartado 3.3.3. Las secuencias obtenidas se compararon con las depositadas en las bases de datos utilizando públicas las (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&cmd=search&term) herramientas informáticas descritas en el apartado 3.3.4. 3.4.2. Detección de la producción de toxinas Shiga 1 y 2 Para evaluar la producción de toxinas Shiga o verotoxinas (estudio 4.2.3) se utilizó el test rápido inmunocromatográfico Duopath® Verotoxina (Merk), cuyo límite de detección de Stx1 y Stx2 es 25 ng/ml y 62.5 ng/ml, respectivamente. Se utilizó el medio de cultivo CAYE, el suplemento C (10 g/ml de inductor de verotoxina) y la Polimixina B o Suplemento selectivo de Bacillus cereus tal como recomienda el fabricante (Merk). Se sembraron las 19 cepas a analizar (Anexo 8) en TSA (Difco) y se incubaron durante 24 h a 30ºC. El contenido de un vial de Suplemento C se resuspendió en 1 ml de H2OmQ que se añadió a 200 ml de caldo CAYE. Esta mezcla se dispensó a razón de 1 ml por tubo en los cuales se resuspendieron 10 colonias de cada cepa y se incubaron durante 6 h a 37 ºC. De este cultivo líquido se pasaron 180 l a un eppendof nuevo y se le añadieron 20 l de la solución 72 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS de Polimixina B (5 mg/ml), se mezclaron e incubaron durante 10 min a 35-37ºC. Seguidamente se agitaron y se tomaron 150 µl de la mezcla que se depositaron en la ventana de carga del Duopath Verotoxin (Figura 19). Tras una incubación de 20 min a temperatura ambiente (20-25ºC) se realizó la lectura siguiendo las instrucciones del fabricante. Se considera un resultado positivo cuando en las zonas de lectura VT1 (Stx1) y/o VT2 (Stx2) aparecen líneas rojas mientras la aparición de líneas oscuras (negras) en la zona o el no desarrollo de color se consideran resultados negativos. Figura 19. Kit Duopath verotoxins para la detección de verotoxinas mostrando un resultado positivo de Stx1 y Stx2. 3.4.3. Extracción de plásmidos El aislamiento de plásmidos (estudio 4.2.3) se realizó con el kit comercial UltraCleanTM 6 Minute Mini Plasmid Prep (MoBio, USA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para ello se realizaron cultivos líquidos en TSB de las cepas 885c y 535c que se ajustaron por densidad óptica a una absorbancia de valor 2 con una longitud de onda de 600 nm. Se tomaron 5 ml de la suspensión bacteriana y se centrifugaron durante 1 min a 15000 rpm, se eliminó totalmente el medio de cultivo, repitiendo el proceso hasta conseguir un precipitado seco. A este precipitado se añadieron 50 l de un tampón de lisis (solución 1) que contiene RNAsa y se resuspendió en agitación durante 1 min hasta conseguir una suspensión celular homogénea a la que se añadieron 100 l de una solución alcalina (solución 2). Se mezcló por inversión sólo una vez y se añadieron 325 l de una solución neutralizante (solución 3). La mezcla se volvió a homogenizar por inversión una única vez y se centrifugó a 15000 rpm durante un 1 min Se recogió el sobrenadante que se trasfirió a una columna de filtrado. Seguidamente se centrifugó 30 s a 15000 rpm. Se eliminó el filtrado y se añadió sobre el filtro de la columna una solución de lavado (solución 4). Seguidamente se volvió a centrifugar 30 s a 15000 rpm. La columna se transfirió entonces a un tubo eppendorf limpio y se añadieron sobre el filtro 50 l del tampón de elución (solución 5). Finalmente se centrifugó durante 30 s a 15000rpm recuperando el filtrado que contenía el ADN plasmídico. 3.5. Sensibilidad a agentes antimicrobianos Se ensayó la sensibilidad frente diferentes agentes antimicrobianos (Tabla 13) tanto en la descripción de nuevas especies de Aeromonas (estudios 4.1.6-4.1.8) como en el estudio de los 73 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas MATERIALES Y MÉTODOS primeros aislamientos de A. aquariorum (estudio 4.2.1). Estos ensayos se realizaron en el Departamento de Ciencias Veterinarias de la CECAV-Universidad de Trás-os-Montes y Alto Douro, Portugal. La sensibilidad se evaluó tras una incubación de 24 h a 35ºC, utilizando el método de discos de Kirby-Bauer en placas de Mueller-Hinton (Oxoid) e inóculos a una densidad óptica equivalente a 0.5 de la escala McFarland, siguiendo las recomendaciones del CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) recogidas en el documento M54-A (CLSI, 2006). Las cepas fueron clasificadas con respecto a cada antibiótico como sensibles (S), intermedias (I) o resistentes (R) conforme a lo establecido en el año 2006 por el CLSI. Tabla 13. Agentes antimicrobianos evaluados en Aeromonas Grupo Aminoglucósidos Antibiótico Amikacina (AK) Gentamicina (CN) Kanamicina (K) Estreptomicina (S) Trobamicina (TOB) Carbapenem Cefalosporinas Imipenem (IMP) Cefalotina (KF) Cefoxitina (FOX) Cefoperazona (CFP) Cefotaxima (CTX) Ceftazidima (CAZ) Ceftriaxona (CRO) Cefepime (FEP) Macrólidos Monobactámicos Penicilinas Eritromicina (E) Aztreonam (ATM) Amoxicilina (AML) Piperacilina (PRL) Ticarcilina (TIC) Quinolonas Ácido nalidixico (NA) Ciprofloxacino (CIP) Sulfoamidas Tetraciclinas Otros Trimetoprim-sulfametoxazol (SxT) Tetraciclina (TE) Cloranfenicol (C) Fosfomicina (FOS) Combinaciones Piperacilina con tazobactama (TZP) Amoxicilina con ácido clavulánico (AMC) Ticarcilina con ácido clavulánico (TIM) Ácido clavulánico Tazobactam 74 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Durante la presente tesis doctoral se han identificado a nivel de especie un total de 682 cepas de Aeromonas (Figura 20), 377 (55.3%) de origen clínico, 189 (27.7%) asiladas de animales y 116 (17%) de origen ambiental. Se ha secuenciado el gen rpoD de 149 cepas de las 682 (21.8%) para llegar a la correcta asignación o confirmación de especie. De todas las cepas analizadas, el 29.3% se identificaron como A. caviae, el 18.5% como A. veronii y el 13.8% como A. salmonicida, mientras que sólo el 8.8% pertenecían a A. hydrophila. La distribución de especies por orígenes indica que las especies con mayor relevancia en clínica fueron A. caviae (50.3%), A. veronii (23.6%), A. hydrophila (10.8%), la recientemente descrita A. aquariorum (7%) y A. media (5%). Mientras que A. salmonicida (32%), seguida por A. veronii (14%) y A. bestiarum (12.5%) han sido las de mayor relevancia entre las especies ambientales. Así mismo, se ha detectado que de las especies A. encheleia, A. sobria y A. bestiarum no se ha aislado ninguna cepa clínica. Pese a su reciente descripción también se ha identificado una cepa de A. tecta pero no se han identificado aislados de A. popoffii, A. simiae, A. molluscorum o A. bivalvium. A. bivalvium A. molluscorum A. simiae A. popoffii A. schubertii A. tecta A. allosaccharophila A. jandaei A. eucrenophila A. trota Nuevas especies A. encheleia A. sobria A. aquariorum A. bestiarum A. media A. hydrophila A. salmonicida A. veronii A. caviae Especies 0 Cepas clínicas 20 40 60 80 100 Nº de cepas 120 140 160 180 200 Cepas ambientales Figura 20. Distribución por origen y especie de las cepas de Aeromonas identificadas en la presente tesis doctoral. 76 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Taxonomía del género Aeromonas Carta al Editor: 4.1.1. MJ Figueras, A Alperi, J Guarro, AJ Martínez-Murcia. Genotyping of isolates included in the description of a novel species should be mandatory. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2006. 56: 1183-1184. Resumen El Comité Internacional para la Sistemática de Procariotas (ICSP) recomienda incluir en las descripciones de nuevas especies bacterianas un análisis de genotipado en los casos en los que la nueva especie incluya más de una cepa. El presente trabajo pone en evidencia, mediante tres técnicas de genotipado (ERIC-PCR, RAPD y PFGE), la inclusión de cepas duplicadas en las publicaciones donde se describen las especies A. culicicola y A. simiae, mientras que no se han detectado duplicados entre los cinco aislados incluidos en la descripción de A. molluscorum. Nuestros resultados confirmaron los resultados obtenidos con AFLP incluidos en la descripción de esta especie. En este trabajo proponemos que el genotipado de los aislados incluidos en la descripción de nuevas especies sea un requisito obligado y no una recomendación como establece el ICSP. 77 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Carta al Editor: 4.1.2. MJ Figueras, A Alperi, J Guarro. On the identification of clinical Aeromonas by a new restriction fragment length polymorphism of 16S rDNA method. Letters in Applied Microbiology. 2007. 45: 692-693. Resumen En el año 2007, Ghatak y cols. publican un protocolo basado en el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción del gen ARN ribosómico 16S (RFLP del ADNr 16S) para la identificación de especies de Aeromonas indicando que este nuevo protocolo proporciona patrones de RFLP de más fácil interpretación que los obtenidos con el protocolo publicado por nuestro grupo (Borrell y cols., 1997; Figueras y cols., 2000a) y utilizado para la identificación de las cepas incluidas en esta tesis doctoral. Asimismo, Ghatak y cols. (2007) indicaban que los dos biovares descritos para la especie A. veronii (bv sobria y bv veronii) podían diferenciarse con su protocolo. Con la finalidad de evaluar si estas aseveraciones eran ciertas se realizó la simulación informática de las digestiones incluidas en el protocolo de Ghatak y cols. (2007), con las cepas tipo de todas las especies y con cepas de referencia de ambos biovares de A. veronii. Nuestros resultados mostraban que las especies A. popoffii, A. bivalvium, A. bestiarum, A. salmonicida y A. jandaei mostraban el mismo patrón. Asimismo, el patrón de las dos biovariedades de A. veronii era común e idéntico al de A. sobria y A. allosaccharophila. Estos resultados demostraban que los patrones definidos por estos autores no eran especie-específicos y por tanto, el nuevo protocolo que proponían no permitía la identificación inequívoca de las especies de Aeromonas spp. ni tampoco la separación de los dos biovares de A. veronii. 80 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Artículo: 4.1.3. A Alperi, MJ Figueras, I Inza, AJ Martínez-Murcia. Analysis 16S rRNA gene mutations in a subset of Aeromonas strains and their impact in species delineation. International Microbiology. 2008. 11: 185-194. Resumen La caracterización de 999 cepas de Aeromonas utilizando un método, previamente descrito, basado en el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción del gen ARN ribosómico 16S (RFLP del ADNr 16S), reveló que el 8% (81) de las cepas no podían ser identificadas ya que generaban patrones de restricción atípicos (diferentes a los esperados para las especies conocidas). Se secuenció el gen ARNr 16S de 27 de estas cepas, representativas de los 12 tipos de patrones de RFLP atípicos identificados, y se constató que estos patrones atípicos eran debidos a la presencia de polimorfismos (también denominados microheterogeneidades) en las copias de los operones del gen ARNr 16S. Dichos polimorfismos se reflejaban como dobles picos en los electroferogramas de las secuencias obtenidas. Se evidenció que aún cuando el número de microheterogeneidades es muy bajo (0.6%), estas conducen a una identificación errónea de los aislados o a un resultado poco concluyente en el 70-74% de las cepas estudiadas. Las cepas que presentaron patrones atípicos pudieron ser identificadas inequívocamente utilizando las secuencias del gen rpoD como pertenecientes a A. caviae, A. media y A. veronii, especies que se encuentran comúnmente asociadas a infecciones humanas. La existencia de microheterogeneidad fue significativamente superior (P<0.01) en cepas de origen clínico que en las de origen ambiental. La secuenciación directa tras PCR del gen ARNr 16S es una técnica cada vez más utilizada para la identificación de las especies asociadas a infecciones humanas. Por tanto, este artículo pretende alertar sobre las limitaciones que presenta este gen en la identificación correcta de las especies de Aeromonas y propone como alternativa la secuenciación del gen rpoD. 83 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1.4. Análisis de las secuencias de los operones del gen ARNr 16S Recientemente se han publicado las secuencias completas de los genomas de A. hydrophila (Seshadri y cols., 2006) y A. salmonicida (Reith y cols., 2008) que mostraron poseer 10 y 9 copias de los genes ribosomales, respectivamente. Así mismo se detectaron 10 copias de estos genes mediante el análisis del espaciador intergénico 16S-23S en A. culicicola (Pidiyar y cols., 2003), en la actualidad considerada sinónimo de A. veronii, y recientemente se han detectado la existencia de al menos 5 copias en A. veronii (LMG13695) y 6 en A. media mediante subclonación de las copias del gen ARNr 16S (Morandi y cols., 2005). Por lo general, como se comentó en la introducción, se consideraba que todas las copias de este gen en un microorganismo eran idénticas o casi idénticas en su secuencia nucleotídica sin embargo, en varios géneros bacterianos se han descrito diferencias nucleotídicas entre las copias del gen ARNr 16S que en general afectan a menos del 1% de las posiciones (Coenye y Vandamme, 2003). En el estudio de Morandi y cols. (2005) se determinó un valor máximo de posiciones polimórficas en Aeromonas del 1.5%, 21 posiciones variables, en A. veronii LMG13695. Sin embargo, se han detectado solamente 2 bases diferentes, 0.13%, entre las 10 copias del ADNr 16S de A. hydrophila (Seshadri et al., 2006) y 8 posiciones, 0.53%, muestran diferente composición en nucleótidos entre las 9 copias de A. salmonicida (Reith y cols., 2008). Se construyó un árbol filogenético con las secuencias, accesibles en el GenBank, de las copias independientes de los operones del gen ARNr 16S de A. veronii LMG13695 (Morandi et al. 2005) (Nº de acceso al GenBank. AF418209-13), A. hydrophila ATCC7966T (Seshadri et al., 2006) (Nº de acceso al GenBank CP000462) y A. salmonicida A449 (Reith et al., 2008) (Nº de acceso al GenBank. CP000644) junto con las secuencias consenso de este gen de las cepas tipo de todas las especies definidas hasta entonces, con el fin de evaluar si el polimorfismo detectado afecta a la posición filogenética de las copias independientes. Además, se secuenció el ADNr 16S de la cepa de A. veronii LMG13695, en la que se había descrito que existían 21 posiciones polimórficas (Morandi y cols., 2005) y de la que no existían ninguna secuencia consenso de este gen ni de otros genes en el GenBank que confirmara su identidad como A. veronii. Por ello se secuenciaron tanto el gen ARNr 16S como el gen rpoD confirmándose el aislado como A. veronii. La secuencia obtenida del gen ARNr 16S, reflejando en las posiciones polimórficas la base correspondiente al pico predominante del cromatograma, fue depositada en el GenBank bajo el número EU488698 así como la secuencia del gen rpoD bajo el número EU488651. Todas las copias de la cepa tipo de A. hydrophila se localizaron en la misma rama que la secuencia consenso de esta misma cepa, depositada por Martínez-Murcia y cols. (1992), así mismo, 8 de las 9 copias de A. salmonicida A449, se agruparon con la secuencia consenso de la cepa tipo de esta especie, sin embargo una copia (1-A499) se agrupaba con A. bestiarum (Figura 21). La presencia de copias del gen ARNr 16S con la secuencia definida para A. bestiarum en el genoma de A. salmonicida y viceversa, había sido propuesto anteriormente por Martínez-Murcia y col. (2005) a partir de los 96 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN patrones mixtos de RFLP-ADNr 16S observados para cepas de estas especies utilizando el protocolo de Borrell y cols. (1997) y Figueras y cols. (2000) y mediante el reconocimiento de polimorfismos en las posiciones diana de las endonucleasas (1011 y 1018) mediante secuenciación del ARNr 16S. Contrariamente a lo observado para las copias de los genomas completos, las secuencias de 4 de las 5 copias del ADNr 16S de A. veronii LMG 13695 obtenidas mediante subclonación por Morandi y cols. (2005) se localizaron dispersas entre otras especies de Aeromonas y sólo el clon 2 se agrupó con la secuencia de la cepa tipo (Figura 21), con la que mostró 1 nucleótido diferente. La localización de los clones 5 y 3 era la esperada para cepas de A. veronii con microheterogeneidades en el gen ARNr 16S de acuerdo con los resultados obtenidos por Alperi y cols. (2008; estudio 4.1.3) que observaron que todas las cepas de esta especie con microheterogeneidades se habían localizado en la “rama Schubertii”, a la pertenece A. veronii. Sin embargo, llama la atención la localización de los clones 1 y 4, puesto que se localizaban fuera de esta rama. También fue sorprendente el hecho de que Morandi y cols. (2005) encontraran polimorfismo en la región variable (RV) 2, ya que esta región posee los tripletes signatura (posiciones 154-156 y 165-167) que separan la “rama de Schubertii” (TAC y GTA), i.e. A. jandaei, A. veronii, A. simiae, Aeromonas Grupo 501 y A. schubertii, del resto de especies del género (AGT y ACT) (Martínez-Murcia y cols.,1992) y ninguna de las cepas de A. veronii evaluadas mostró variabilidad en esta región (Alperi y cols., 2008). Hasta donde sabemos, nunca antes se había descrito en ninguna otra especie microheterogeneidad en la RV2 pero la recientemente descrita A. tecta posee los tripletes característicos de la “rama Schubertii” y se localiza fuera de la misma (Demarta y cols., 2008). La secuencia consenso del ARNr 16S realizada en 2 laboratorios independientes (URV y Molecular Diagnostic Center) confirmó el polimorfismo en una posición de la RV2: 167: A/G (Tabla 14). La secuencia del clon 5 muestra así mismo una G en dicha posición mientras que los clones 3 y 2 poseen una A y los clones 1 y 4, los localizados fuera de la rama poseen una T. La existencia de la transición A/G (R) en la posición 167 no es tan rara si se tiene en cuenta que A. simiae (Harf-Monteil y cols., 2004), localizada dentro de la “rama Schubertii”, posee una G en dicha posición, a parte de lo mencionado para A. tecta. Así mismo, la secuenciación del gen ARNr 16S reveló la existencia de polimorfismo en la cepa LMG 13695 pero sólo en 8 (0.53% de las 1503 posiciones secuenciadas) de las 21 posiciones descritas por Morandi y cols. (2005). Tabla 14. Posiciones con polimorfismo detectadas en la cepa de A. veronii LMG13695 expresadas con el código de la IUPAC. Posiciones1 Polimorfismo 1 167 W R 457 Y Y 458 R R 469 W W 474 Y Y 475 R R 1011 Y Y 1018 R R Morandi y cols. (2005) Este estudio En referencia a la secuencia de E. coli (Brosius 1978). W: T o A; Y: T o C; R: A o G. 97 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3-A449 6-A449 4-A449 7-A449 84 A. salmonicida CECT894T (X60405) 5-A449 2-A449 8-A449 9-A449 Secuencias de los operones individuales de A. salmonicida A499 78 46 35 71 A. bestiarum CECT4227T (X60406) 1-A449 A. molluscorum CECT5864T (AY532690) 1 A. encheleia CECT4342T (AJ224309) 58 A. popoffii CECT5176T (AJ224308) A. bivalvium CECT7113T (DQ504429) A. sobria CECT4245T (X60412) 3 9 16 3 Aeromonas sp. HG11 ATCC35941 (X60417) A. veronii LMG13695 clone 4 (AF418212) 98 A. allosaccharophila CECT4199T (S39232) 15 A. eucrenophila CECT4224T (X60411) A. media CECT4232T (X60410) A. hydrophila CECT839T (X60404) 163378-164914 85 85180-86716 349952-351488 803849-805385 95 38 c4702867-4701331 214913-216449 933026-934562 c4371416-4369880 c4454438-4452902 c3956749-3955213 Secuencias de los operones individuales de A. hydrophila ATCC7966T 85 A. veronii LMG13695 clone 1 (AF418209) A. trota CECT4255T (X60415) 99 96 94 93 95 75 A. caviae CECT838T (X60409) A. veronii LMG13695 (EU488698) A. veronii LMG13695 clone 5 (AF418213) A. jandaei CECT4228T (X60413) A. veronii LMG13695 clone 3 (AF418211) A. culicicola CECT 5761 (AY347680) A. veronii CECT4257T (X60414) 75 “Rama Schubertii” A. simiae IBS-S6874T (AJ536821) A. veronii LMG13695 clone 2 (AF418210) Aeromonas sp. G501 (U88663) 91 99 A. schubertii CECT4240T (X60416) 0.002 Figura 21. Árbol filogenético del gen ARNr 16S construido a partir de las secuencias de los 10 operones de la cepa tipo de A. hydrophila, ATCC7966T (CP000462, el número junto al operón indica la posición en el genoma), los 9 de A. salmonicida A449 (CP000644), de los 5 clones de A. veronii LMG13695 (AF418209-13) junto con la secuencia consenso de esta cepa y de las cepas tipo del resto de especies de Aeromonas spp. Los números de los nodos indican el valor del bootstrap (porcentaje de 1000 repeticiones). 98 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Artículo: 4.1.5. AJ Martínez-Murcia, A Monera, A Alperi, MJ Figueras, MJ Saavedra. Phylogenetic evidence indicated that Aeromonas hydrophila subsp. dhakensis Huys et al., 2002 is a synonym of Aeromonas aquariorum sp. nov. Current Microbiology. 2009. 58: 76-80. Resumen Tres cepas de Aeromonas hydrophila subsp. dhakensis se sometieron a un análisis filogenético por secuenciación de los genes gyrB, rpoD y el gen ARNr 16S. Los árboles filogenéticos de los genes gyrB y rpoD, construidos con cepas de todas las especies aceptadas del género, revelaron que las cepas de A. hydrophila subsp. dhakensis se agrupaban con las de la especie de reciente descripción A. aquariorum. Asimismo, no se detectaron diferencias entre las secuencias del ADNr 16S de A. hydrophila subsp. dhakensis y la cepa tipo de A. aquariorum. Este resultado indica que en la descripción de la subespecie A. hydrophila subsp. dhakensis que incluía un estudio polifásico con hibridación ADN-ADN, dichos aislados fueron erróneamente identificados como A. hydrophila. En conclusión, A. aquariorum y A. hydrophila subsp. dhakensis deberían considerarse nombres sinónimos de un único taxón. 99 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Artículo: 4.1.6. A Alperi, AJ Martínez-Murcia, A Monera, MJ Saavedra, MJ Figueras. Aeromonas fluvialis sp. nov., isolated from Spanish river. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. En prensa. Resumen Un bacilo Gram negativo y anaerobio facultativo (cepa 717), aislado en el río Muga, en Cataluña, presentó un patrón de RFLP del ADNr 16S atípico. El análisis preliminar de la secuencia del gen ARNr 16S mostró que pertenecía al género Aeromonas siendo la especies más cercana, con un 99.5% de similitud (7 nucleótidos diferentes), A. veronii. Sin embargo, la secuencia del gen rpoD indicaba que podía tratase de una potencial nueva línea de filogenética. Un estudio polifásico, basado en un análisis filogenético multilocus con 5 genes housekeeping (gyrB, rpoD, recA, dnaJ y gyrA; 3684 pb), corroboró que el aislado 717 representaba una nueva línea filogenética dentro del género, siendo en este caso Aeromonas sobria, Aeromonas veronii y Aeromonas allosaccharophila, las especies más cercanas. Los experimentos de reasociación ADN-ADN así como el análisis fenotípico confirmaron a la cepa 717 como una nueva especie de Aeromonas para la cual se ha propuesto el nombre de Aeromonas fluvialis con la cepa 717 (=CECT 7401T = LMG 24681T) como cepa tipo. 105 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aeromonas fluvialis sp. nov., isolated from Spanish river Anabel Alperi1, Antonio J. Martínez-Murcia2, Arturo Monera2, Maria J. Saavedra2, 3, Maria J. Figueras1* Unit of Microbiology. Rovira i Virgili University. IISPV. Sant Llorenç 21, 43201, Reus. Spain. 2Molecular Diagnostics Center (MDC), Biomolecular Technologies S.L., and Miguel Hernández University, Orihuela E03300, Alicante. Spain. 3Department of Veterinary Sciences, CECAV-University of Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. *corresponding author: Maria J. Figueras, mariajose.figueras@urv.cat, Tlf:+34-977759321, Fax: +34-977759322 1 SUMMARY A Gram-negative, facultatively anaerobic bacterial strain designated 717 was isolated from a water sample collected from the Muga river, Girona, north-east Spain. Preliminary analysis of the 16S rRNA gene sequence showed that this strain belonged to the genus Aeromonas, the nearest species being A. veronii (99.5% similarity, with 7 different nucleotides). A polyphasic study based on a Multilocus Phylogenetic Analysis of 5 housekeeping genes (gyrB, rpoD, recA, dnaJ and gyrA; 3684 bp) showed isolate 717 to be an independent phylogenetic line with Aeromonas sobria, Aeromonas veronii and Aeromonas allosaccharophila as the closest neighbour species. DNA-DNA reassociation experiments and phenotypic analysis recognized strain 717 as a novel species, for which the name Aeromonas fluvialis sp. nov. is proposed, with the type strain 717 (=CECT 7401T=LMG 24681T). Running title: Aeromonas fluvialis sp. nov The GenBank accession numbers for the 16S rRNA, rpoD, recA, gyrB, dnaJ and gyrA genes sequence of strain 717 are FJ230078, FJ603453, FJ603457, FJ603455, FJ603454 and FJ603456 respectively. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN The genus Aeromonas belongs to the class Gammaproteobacteria and to the family Aeromonadaceae, and includes facultative anaerobic Gram-negative, non-spore-forming motile bacilli or cocobacilli that are oxidase and catalase positive and able to reduce nitrate to nitrite and are generally resistant to the vibriostatic agent O/129 (Abbott et al., 2003; Martin-Carnahan & Joseph, 2005). Aeromonas are primarily inhabitants of aquatic environments often associated with fish and human diseases (Martin-Carnahan & Joseph, 2005; Figueras 2005). The genus includes 19 species: A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, A. jandaei, A. schubertii, A. trota, A. allosaccharophila, A. encheleia, A. popoffii, A. simiae, A. molluscorum, A. bivalvium, the recently described A. aquariorum and A. tecta and one unnamed DNA homology group, Aeromonas Group 501 (Harf-Monteil et al., 2004; Miñana-Galbis et al., 2004; Martin-Carnahan & Joseph 2005; Miñana-Galbis et al., 2007; Martínez-Murcia et al., 2008, Demarta et al., 2008). Furthermore, there is considerable evidence that the species Aeromonas sharmana (Saha & Chakrabarti, 2006) may not belong to the genus Aeromonas (Martínez-Murcia et al., 2007) while A. culicicola (Pidiyar et al., 2002) and A. hydrophila subsp. dhakensis (Huys et al., 2002) are potentially considered synonyms of A. veronii (Huys et al., 2005) and A. aquariorum (Martínez-Murcia et al., 2009) respectively. The taxonomy of this genus is complex due to the high inter-species similarity of the 16S rRNA gene, which ranges from 96.7 to 100% (Martínez-Murcia et al., 2007), the overlap of biochemical profiles and a poor correlation between genotypic and phenotypic identification (Soler et al., 2003; Figueras 2005; Ormen et al., 2005). Furthermore, the existence of microheterogeneities in the 16S rRNA gene could generate misidentifications (Alperi et al., 2008; Morandi et al., 2005). This has recently been shown to occur between A. media and A. hydrophila, A. caviae and A. trota and A. veronii and A. jandaei (Alperi et al., 2008). Analysis based on the sequences of one or two housekeeping genes have proven to be a useful tool for inferring the taxonomy of Aeromonas (Yañez et al., 2003; Soler et al., 2004; Küpfer et al., 2006; Nhung et al., 2007; Sepe et al., 2008). Recently a comprehensive Multi Locus Phylogenetic Analysis (MLPA) based on 7 housekeeping genes (gyrB, gyrA, rpoD, dnaJ, dnaX, recA and atpD), including several strains of the 19 described species, have shown a robust phylogenetic frame that can be used for taxonomy with a clear differentiation among closely related Aeromonas species whose positions had previously been questioned (Martínez-Murcia et al., submitted). The present investigation was initiated to determine the taxonomic position of strain 717 Aeromonas sp. that presented a new 16S rDNA RFLP pattern when using a RFLP protocol design to differentiate all Aeromonas species described up to 2000 (Figueras et al., 2000). Furthermore strain 717 appeared as an independent phylogenetic line after analysis of the rpoD gene. In the present study, a polyphasic approach based on an MLPA of five genes (gyrB, gyrA, rpoD, dnaJ and recA), DNA-DNA reassociation experiments and phenotypic analysis was performed to establish the UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN taxonomic allocation of strain 717. Results shows that it belongs to a new Aeromonas species, for which the name Aeromonas fluvialis sp. nov. is proposed. Strain 717 was isolated from a water sample of the Muga river, Girona, north-east Spain, using the membrane filtration technique and ampicillin dextrin agar as described previously (Borrell et al., 1998). The strain was genetically confirmed as Aeromonas using the genus probe described by Chacon et al. (2002) and showed a new pattern with the 16S rDNA-RFLP identification method (Figueras et al., 2000). The following phenotypic tests used for characterization of strain 717 were selected from Abbott et al., (2003) i.e., catalase and oxidase activity, nitrate reduction, hydrogen sulphide production from cysteine, indole production, susceptibility to vibriostatic agent O/129 (150µg), growth in nutrient broth at 0% and at 6% NaCl; production of: brown diffusible pigment (on TSA) and gas from Dglucose, Voges-Proskauer (VP) test; β-galactosidase activity (ONPG), growth on MacConkey agar; hydrolysis of: elastin, gelatin, DNA and urea, and presence of: arginine dihydrolase (ADH), lysine decarboxylase (LDC) and ornithine decarboxylase (ODC) by the Moeller’s method; acid production from carbohydrates was determined in nutrient broth at a final concentration of 1% (w/v), except for salicin, which was at 0.5% (w/v), supplemented with phenol red and one of the following substrates: sucrose, L-arabinose, cellobiose, lactose, raffinose, L-rhamnose, m-inositol, D-mannitol, D-sorbitol, N-acetyl glucosamine and salicin (Borrell et al., 1998). These tests were performed at least twice and some of them (production of indole, hydrogen sulphide, VP test, β-galactosidase activity, presence of ADH, LDC and ODC, hydrolysis of gelatin, urea, acid production from D-mannitol, D-sorbitol, Lrhamnose, m-inositol, sucrose and L-arabinose) were performed in parallel using conventional methods and commercial identification kits (API20NE and API20E, BioMerieux). Finally, forty-nine carbohydrates for substrate fermentation/oxidation were tested by using API50CH (BioMerieux) following the manufacturer’s instructions. Appropriate positive and negative controls were included. All tests were evaluated for 7 days and performed at 30ºC with the exception of A. salmonicida, which was tested at room temperature (± 25ºC). Type strains belonging to all Aeromonas species were evaluated under identical conditions than strain 717 for all tests included in the Table 1. Isolate 717 was biochemically different from the rest of the Aeromonas species by its ability to produced acid from lactose and sucrose but not from L-arabinose or D-mannitol together with the negative production of ADH, LDC and ODC (Table 1). Acid production from D-lactose was negative with API50CH but positive in MacConkey agar and nutrient broth. Cell size, morphology and the presence of flagella were determined with Electron Microscopy (Figs. S1A and S1B) following procedures described in a previous paper (Collado et al., in press). The susceptibility of strain 717 against 27 antibiotics was tested as described earlier (Martínez-Murcia et al., 2008) and classified as susceptible, intermediate, or resistant according to CLSI standards UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN (CLSI, 2005). The following antibiotic-containing disks were obtained from Oxoid: piperacillin (PRL100), piperacillin plus tazobactam (TZP110), amoxicillin (AML10), amoxicillin plus clavulanic acid (AMC30), ticarcillin (TIC75), ticarcillin plus clavulanic acid (TIM85), cephalothin (KF30), cefoxitine (FOX), cefotaxime (CTX30), cefoperazone (CFP30), ceftazidime (CAZ30), ceftriaxone (CRO30), cefepime (FEP30), aztreonam (ATM30), imipenem (IMP10), gentamicin (CN10), kanamycin (K30), tobramycin (TOB10), amikacin (AK30), streptomycin (S), tetracycline (TE30), ciprofloxacin (CIP5), nalidixic acid (NA), fosfomycin (FOS), erythromycin (E15), trimethoprimsulfamethoxazole (SxT25) and chloramphenicol (C30). To perform the phylogenetic study of the 16S rRNA and rpoD genes, strain 717 was cultured on blood agar at 30ºC. DNA was extracted from a single colony by using InstaGeneTM Matrix (BioRad Laboratories) following the manufacturer’s instructions. Primers and conditions for the amplification and sequencing of the 16S rRNA (1503 bp) and rpoD (820 bp) have been described previously (Martínez-Murcia et al., 1992; Soler et al., 2004). PCR products were purified using GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience) and prepared for sequencing employing a BigDye Terminator v.1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems). The amplified genes were sequenced with an ABI PRISM 310 genetic analyzer (Applied Biosystems). Using CLUSTAL W program, version 1.83 (Thompson et al., 1994) the sequences obtained were independently aligned with the sequences of the type and reference strains of all the members of the genus Aeromonas that were available in the GenBank. Genetic distances and clustering were obtained using Kimura´s 2-parameter model (Kimura 1980) and evolutionary trees were constructed by the neighbour-joining (for the 16S rRNA and rpoD genes) and maximum-parsimony methods (for the 16S rRNA gene) (Saitou & Nei, 1987) using the MEGA4 program (Tamura et al., 2007). Stability of the relationships was assessed by the bootstrap method (1000 replicates). The MLPA was performed on the basis of gyrB (923 bp), rpoD (652 bp), recA (600 bp), dnaJ (800 bp) and gyrA (709 bp) genes, in the Molecular Diagnostic Center (MDC), Orihuela, Spain, as has been described previously (Martínez-Murcia et al., submitted). Sequence analysis of the 16S rRNA gene of strain 717 showed the existence of polymorphism (Table S1) in 7 positions (0.46%), all of them within the V3 region. This may hamper proper identification with the nearest species A. veronii (Alperi et al., 2008). The 16S rRNA gene phylogenetic trees (Fig. 1 and Fig. S2) showed this strain as an independent phylogenetic line within the genus Aeromonas. The 16S rRNA gene sequence similarity between strain 717 (GenBank accession number FJ230078) and other Aeromonas species ranged from 97.6% to 99.5%, corresponding to 36-7 bp, values within the range (96.7%-100%) described for the genus Aeromonas (Saavedra et al., 2006; Martínez-Murcia et al., 2007). The most similar Aeromonas species on the basis of this gene showed to be A. veronii (99.5%) with 7 bp differences, A. allosaccharophila UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN (99.4%) with 9 bp differences followed by A. jandaei (99.1%) with 13 bp differences. This high similarity is very common in Aeromonas, in fact only one species (A. simiae) of the 19 presently accepted in the genus shows 16S rDNA similarities below 97%. The rpoD phylogenetic tree showed strain 717 (rpoD sequence GenBank accession number FJ472926) as an independent phylogenetic line, A. veronii and A. allosaccharophila being the phylogenetically closest neighbours (94.6% and 94.3% similarity that corresponds with 43 bp and 47 bp differences respectively). These values were under the intra-species similarities value of 97% obtained from rpoD phylogeny in Aeromonas (Soler et al., 2004; Alperi et al., 2008). The alignment of the rpoD sequences of strain 717 showed a deletion of a single triplet in the same position as that described for A. trota CECT4255T (GenBank accession number AY169344) (Soler et al., 2004). The MLPA tree showed strain 717 within the cluster of A. veronii, A. allosaccharophila and A. sobria, representing an independent branch (Fig. 2). In contrast to what was observed with the other genes (16S rRNA and rpoD), the MLPA tree reveals strain 717 to be more distant from A. veronii or A. allosaccharophila, A. sobria being the phylogenetically closest neighbour. DNA hybridization studies were performed between strain 717 and the type strains of the closest phylogenetic species: A. sobria, A. allosaccharophila, A. veronii and A. jandaei, as well as with the unrelated species A. molluscorum. DNA was extracted using the method described by Marmur (1961) and DNA-DNA hybridization was conducted using the method described by Ziemke et al. (1998) and Urdiain et al. (2008). Renaturalization was performed under optimal conditions at 70ºC, single and double-strand DNAs were separated by the use of hidroxyapatite and colour development was measured at 405 nm using a Bio Whittaker Kinetic-QCL Microplate Reader. Values of DNA-DNA reassociation were determined at least three times for both direct and reciprocal reactions (e.g. A x B and B x A) for any given strain pair. Average DNA binding levels of strain 717 with the type strains of A. sobria CECT4245T, A. allosaccharophila CECT4199T, A. veronii CECT4257T and A. jandaei CECT4228T were 54%, 61%, 66% and 40% respectively (Table S2). All of them under the 70% limit (Wayne et al., 1987, Stackebrandt & Goebel, 1994) but some above 60% in concordance with other Aeromonas species (Huys et al., 1997; Nhung et al., 2007). Despite DNA-DNA reassociation being considered to give information on the DNA similarity between the entire bacterial genome, it has been criticized because of its high number of experimental errors associated with its lack of reproducibility and its failure to generate collective databases (Rosselló-Mora, 2006). Moreover, DNA-DNA reassociation values do not provide any information concerning phylogenetic relationships (Harayama & Kasai, 2006) in contraposition to the phylogenetic reconstruction with the MLPA performed for Aeromonas (Martínez-Murcia et al., submitted) and applied in the present study. The polyphasic approach, using the 16S rRNA gene, the MLPA, DNA-DNA reassociation results and phenotypic characterization all clearly differentiated strain 717 from the rest of the Aeromonas species. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Description of Aeromonas fluvialis sp. nov Aeromonas fluvialis (flu. vi. alis. L. adj. fluvialis belonging to a river). Cells are straight Gram-negative, non-spore forming, rods non-encapsulated, mobile by single polar flagella and are 0.6-0.7 µm wide and 3-3.5 µm long, oxidase and catalase positive, reduce nitrate to nitrite and resistant to vibriostatic agent O/129. Colonies on TSA are 4-5 mm in diameter, opaque, circular and beige in colour after 48 h at 30ºC. No brown diffusible pigment is produced on TSA at room temperature or 30ºC. Optimal growth temperature occurs at 30ºC after 24 h in TSB. Growth was observed at 37ºC but not at 4ºC or 40ºC on TSA. No haemolysis was observed on sheep blood agar at 30ºC. Strain 717 was able to grow on MacConkey agar and at 0% of NaCl on TSB but not at 6%. Optimal growth occurs at pH 9 after 24 h on TSB but it does not grow at pH 4.5. Strain 717 produces indole from tryptophan and gas from glucose, is positive for the ONPG test and is able to use citrate. However, it is negative for the production of hydrogen sulphide from cysteine, VP test, hydrolysis of esculin, elastin, gelatinase, DNAase, urease, L-tryptophane deaminase and for the production ADH, LDC and ODC. Strain 717 is able to use D-mannose, D-glucose, N-acetyl-glucosamine, D-maltose, potassium gluconate and malic acid as sole carbon and energy source but not L-arabinose, D-mannitol, capric acid, adipic acid, phenylacetic acid or trisodium citrate. Acid is produced from glycerol, D-ribose, D-galactose, Dglucose, D-fructose, D-mannose, D-lactose, N-acetylglucosamine, salicin, D-cellobiose, D-maltose, Dsaccharose, D-trehalose, amidon, glycogen, gentiobiose and potassium gluconate, but not from erythritol, L- or D-arabinose, L- or D-xylose, D-adonitol, methyl-ßD-xylopiranoside, L-sorbose, Lrhamnose, dulcitol, inositol, D-mannitol, D-sorbitol, metyl-αD-mannopyranoside, metyl-αDglucopyranoside, amygdalin, arbutin, aesculin, D-melobiose, inulin, D-melezitose, D-raffinose, xylitol, D-turanose, D-lyxose, D-tagatose, L- or D-fucose, L- or D- arabitol, potassium 2ketogluconate or from potassium 5-ketogluconate. The API20E and API20NE profiles obtained for strain 717 were 1240024 and 7062744 respectively. Strain 717 showed resistance to amoxicillin, amoxicillin plus clavulanic acid and ticarcillin, it was intermediate to ticarcillin plus clavulanic and susceptible to the rest of the antimicrobials tested. Isolated from water of the Muga river, Girona, north-east Spain. Type strain is 717 (=CECT 7401T=LMG 24681T). Acknowledgements We are grateful to Mª Jesús Pujalte and to Javier Pascual for their help with the DNA-DNA hybridization, to Mª Isabel Inza for her help with the phenotypic characterization and to Catalina Nuñez for her excellent technical assistance. We are also grateful to the Pharmacology Unit of the Rovira i Virgili University for let us to use the Bio Whittaker Kinetic-QCL Microplate Reader. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig. 1. Unrooted phylogenetic tree derived from the 16S rRNA gene sequences showing relationships of the strain 717 to all other Aeromonas species described with the neighbour-joining method. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). A. bestiarum CECT4227 (X60406) T A. salmonicida CECT894 (X60405) 60 T A. encheleia CECT4342 (AJ224309) 16 T A. molluscorum CECT5864 (AY532690) 61 T A. eucrenophila CECT4224 (X60411) 5 T A. tecta CECT7082 (AJ458403) 58 T 4 A. popoffii CECT5176 (AJ224308) T A. bivalvium CECT7113 (DQ504429) 67 39 Aeromonas sp. HG11 ATCC35941 (X60417) T A. sobria CECT4245 (X60412) 26 T A. media CECT4232 (X60410) 99 T A. hydrophila CECT839 (X60404) T 34 A. caviae CECT838 (X60409) 32 T A. trota CECT4255 (X60415) 99 T 27 A. aquariorum CECT7289 (EU085557) 88 T A. allosaccharophila CECT4199 (S39232) 30 717 (FJ230078) T A. jandaei CECT4228 (X60413) T A. veronii CECT4257 (X60414) T A. simiae IBS-S6874 (AJ536821) T A. schubertii CECT4240 (X60416) 92 Aeromonas sp. G501 (U88663) 73 86 0.002 T UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig. 2. Unrooted phylogenetic tree derived from the MLPA showing the corresponding relationships of strain 717 to all other Aeromonas species described with the neighbour-joining methods. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Table 1. Key tests for phenotypic differentiation of strain 717 from other Aeromonas species. Taxa are identified as: 1, A. hydrophila; 2, A. bestiarum; 3, A. salmonicida; 4, A. caviae; 5, A. media; 6, A. eucrenophila; 7, A. sobria; 8, A. veronii biovar sobria; 9, A. jandaei; 10, A. veronii biovar veronii; 11, A. schubertii; 12, A. trota; 13, A. encheleia; 14, A. allosaccharophila; 15, A. popoffii; 16, A. simiae; 17, A. molluscorum; 18 A. bivalvium; 19 A. aquariorum; 20 A. tecta. All tests have been performed for strain 717 and type strains of the different species at 30ºC and evaluated for 7 days. +, 100-85%of strains positive; V, 84-16% of strains positive; -, 15-0% of strains positive; ND, no data from these authors. 16 ∆ + (+) + (+) ND (-) 17 ø + (+) - (-) ND (-) 18 † - (+) + (+) + (+) 19 ‡ + (+) + (+) + (+) 20 ¥ + (+) V (+) ND (-) Characteristic ADH LDC Gelatin Acid from D-saccharose Lactose D-mannitol L-arabinose Salicin 717 - 1 + (+) + (+) + (+) 2 + (+) V (+) V (+) 3 V (+) V (+) + (+) 4 + (+) - (-) + (+) 5 V (+) - (-) V (-) 6 V (+) - (-) + (+) 7 - (+) + (+) - (-) 8 + (+) + (+) + (+) 9 + (+) + (+) + (+) 10 - (-) + (+) + (+) 11 + (+) V (+) + (+) 12 + (+) + (+) + (+) 13 V (+) - (-) - (-) 14 V (+) + (+) + (+) 15 + (+) - (-) + (+) + + + + (+) V (-) + (+) V (+) V (-) + (+) - (-) + (+) + (+) V (+) + (+) + (-) + (+) + (+) V (-) + (+) V (-) + (+) + (+) V (+) + (+) V (+) + (+) + (+) V (+) V (+) - (+) + (+) V (+) V (+) + (+) - (-) + (+) - (-) - (-) + (+) - (-) + (+) V (+) - (-) - (+) - (-) + (+) - (-) - (-) + (+) V (-) + (+) - (-) + (+) - (-) - (-) - (-) - (-) - (-) V (-) - (+) V (+) - (-) - (-) V (+) - (-) + (+) - (-) - (+) + (+) - (-) + (+) V (+) - (+) - (+) - (-) + (+) V (+) - (+) ø + (+) ND(-) - (-) - (-) - (-) + (+) - (-) + (+) + (+) ND (+) +(+) - (-) + (+) + (+) + (+) ∆ + (+) - (-) + (+) - (-) + (+) - (-) - (-) ND (+) - (-) V (+) Data from species 1 to 15 were obtained from Abbott et al. (2003) who performed tests at 35ºC with the exception of A. popoffii and A. sobria which were at 25ºC, as did Miñana-Galbis et al. (2004); Harf-Monteil et al. (2004), ‡Martínez-Murcia et al. (2008) and ¥Demarta et al. (2008) performed tests at 30ºC; †Miñana-Galbis et al. (2007) performed test at 25-30ºC. Type strains results are expressed in the table in brackets as (+) or (-). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Supplementary Table S1. Base differences in the 16S rRNA gene sequence between strain 717 and the type strains of A. veronii and A. allosaccharophila. Strain GenBank accession no. 460 461 A/G A 462 C/G G Position* 464 T/G T 468 A/C A 469 C/G A 472 C/T G 717 A. veronii CECT4257T FJ230078 X60414 T/C T A. allosaccharophila CECT4199T * S39232 T A G G A A G Following the Escherichia coli nomenclature (Brosius et al., 1978). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Supplementary Table 2. DNA-DNA relatedness between strain 717 and A. veronii, A. allosaccharophila, A. sobria, A. jandaei and A. molluscorum type strains. Results are percentages and are expressed as the mean of three determinations. Labelled DNA Strain 717 A. veronii CECT4257T A. allosaccharophila CECT4119T A. sobria CECT4245T A. jandaei CECT4228T A. molluscorum CECT5864T 717 100 67.1 58.8 51.9 40.3 52.9 CECT4257T 66.5 100 CECT4119T 63.2 100 CECT4245T 57.3 100 - Fig. S1A Fig. S1B Supplementary Fig. S1. A-B. Electron microscopy images of strain 717. A. Transmission electron microscope, negative stain Bar, 0.5 µm. B. Scanning electron microscope, Bar 6 µm. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 42 6 A. eucrenophila CECT4224 (X60411) A. tecta CECT7082 (AJ458403) T A. encheleia CECT4342 (AJ224309) A. molluscorum CECT5864 (AY532690) T T T 10 9 52 77 A. bestiarum CECT4227 (X60406) A. salmonicida CECT894 (X60405) T A. popoffii CECT5176 (AJ224308) A. bivalvium CECT7113 (DQ504429) Aeromonas sp. HG11 ATCC35941 (X60417) A. sobria CECT4245 (X60412) 90 T T T T 8 16 51 22 A. media CECT4232 (X60410) A. hydrophila CECT839 (X60404) T T 43 41 96 A. caviae CECT838 (X60409) 50 T 22 38 A. trota CECT4255 (X60415) T A. aquariorum CECT7289 (EU085557) A. allosaccharophila CECT4199 (S39232) A. jandaei CECT4228 (X60413) A. veronii CECT4257 (X60414) T T T T 91 66 A. simiae IBS-S6874 (AJ536821) T A. schubertii CECT4240 (X60416) Aeromonas sp. G501 (U88663) 717 (FJ230078) T Supplementary Fig. S2. Unrooted phylogenetic tree derived from the 16S rRNA gene sequences showing relationships of the strain 717 to all other Aeromonas species described with the maximum-parsimony method. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN REFERENCES Abbott, S. L., Cheung, W. K. & Janda, J. M. (2003). The genus Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification schemes. J Clin Microbiol 41, 23482357. Alperi, A., Figueras, M. J., Inza, I. & Martínez-Murcia, A. J. (2008). Analysis of 16S rRNA gene mutations in a subset of Aeromonas strains and their impact in species delineation. Int Microbiol 11, 185-194. Borrell, N., Figueras, M. J. & Guarro, J. (1998). Phenotypic identification of Aeromonas genomospecies from clinical and environmental sources. 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International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. En revisión. Resumen Dos cepas clínicas de Aeromonas, aisladas de heridas de pacientes en Taiwán y recibidas en nuestro laboratorio para su identificación, no se pudieron asignar a ninguna especie conocida del género ya que presentaban patrones de RFLP del ADNr 16S atípicos. Tampoco las secuencias del gen ARNr 16S permitieron su identificación inequívoca. El análisis preliminar de estas secuencias mostró que las especies más similares en ambos casos (entre el 99.6 y el 99.8% de similitud) eran Aeromonas caviae, Aeromonas trota y Aeromonas aquariorum. Las secuencias obtenidas del gen rpoD mostraron, sin embargo, a estas dos cepas como dos líneas filogenéticas de Aeromonas independientes. El análisis filogenético multilocus con 5 genes housekeeping (gyrB, rpoD, recA, dnaJ y gyrA; 3684 pb) confirmó ambas cepas como líneas independientes dentro del género. Estos datos, junto con los resultados de reasociación ADN-ADN y la caracterización fenotípica, corroboran que estas dos cepas representan nuevas especies del género Aeromonas para las cuales se han propuesto los nombres de Aeromonas taiwanensis, cuya cepa tipo es A2-50 (CECT 7403T= LMG 24683T) y Aeromonas sanarellii, con la cepa tipo A2-67 (CECT 7402T= LMG 24682T). 123 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aeromonas taiwanensis sp. nov. and Aeromonas sanarellii sp. nov., two new clinical species from Taiwan Anabel Alperi1, Antonio J. Martínez-Murcia2, Wen-Chien Ko3, Arturo Monera2, Maria J. Saavedra2, 4 & Maria J. Figueras1* Unit of Microbiology. Rovira i Virgili University. IISPV. Sant Llorenç 21, 43201, Reus. Spain. 2Molecular Diagnostics Center (MDC), Biomolecular Technologies S.L., and Miguel Hernández University, Orihuela E03300, Alicante, Spain. 3Department of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan. 4 Department of Veterinary Sciences, CECAV-University of Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. 1 *corresponding author: Mª José Figueras, mariajose.figueras@urv.cat Tel: +34-977759321; Fax: +34-977759322. SUMMARY Two clinical Aeromonas sp. strains (A2-50 and A2-67) recovered from the wounds of two patients in Taiwan could not be assigned to any known species of this genus based on the sequences of the 16S rDNA gene that showed similarities with A. caviae, A. trota and A. aquariorum ranging from 99.6% to 99.8%. The rpoD phylogenetic tree allocated these two strains to two new and independent phylogenetic lines, the neighbouring species being A. caviae showing 93.2% similarity (56 bp differences) with strain A2-50 and 92.2% (63 bp differences) with strain A2-67. A multi-locus phylogenetic analysis of 5 housekeeping genes (gyrB, rpoD, recA, dnaJ and gyrA; 3684 bp) confirmed both strains as independent phylogenetic lineages within the genus. This data together with the phenotypic characterization and DNA-DNA reassociation results revealed that these two strains are novel Aeromonas species, for which the names Aeromonas taiwanensis sp. nov., with the type strain A2-50 (=CECT 7403T=LMG 24683T) and Aeromonas sanarellii sp. nov., with the type strain A2-67 (=CECT 7402T=LMG 24682T) are proposed. Running title: Two new Aeromonas clinical species from Taiwan. The GenBank accession number for the 16S rRNA, gyrB, rpoD, recA, dnaJ and gyrA genes sequences of A2-50 and A2-67 are FJ230077 and FJ230076, FJ807272 and FJ807277, FJ807271 and FJ807275, FJ807273 and FJ807278, FJ807270 and FJ807279, FJ807274 and FJ807276, respectively. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN The genus Aeromonas includes facultative anaerobic Gram-negative, non-spore-forming generally motile bacilli or cocobacilli, usually oxidase and catalase positive, able to reduce nitrate to nitrite and generally resistant to the vibriostatic agent O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine) (Abbott et al., 2003; Martin-Carnahan & Joseph, 2005). The genus belongs to the family Aeromonadaceae, order Aeromonadales into the class of the Gammaproteobacteria (Martin-Carnahan & Joseph, 2005). Today, the genus Aeromonas includes 20 recognized species: A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, A. jandaei, A. schubertii, A. trota, A. allosaccharophila, A. encheleia, A. popoffii, A. simiae, A. molluscorum, A. bivalvium and the lately described A. aquariorum and A. tecta (Harf-Monteil et al., 2004; MartinCarnahan & Joseph, 2005; Miñana-Galbis et al., 2004, 2007; Martínez-Murcia et al., 2008; Demarta et al., 2008). Recently two new species, A. fluvialis isolated from river water and A. piscicola isolated from diseased fish, have been proposed by our group (Alperi et al., in press; Beaz-Hidalgo et al., submitted) as well as some reclassifications (Martínez-Murcia et al., 2007, 2009). The taxonomy of this genus is complex because despite each species apparently having specific phenotypic characteristics, biochemical identification is laborious and very imprecise showing a poor correlation with genotypic identification (Borrell et al., 1998; Soler et al., 2003; Figueras, 2005; Ormen et al., 2005). The 16S rRNA sequence similarity among the species of the genus is very high, ranging from 96.7% to 100% (Martínez-Murcia et al., 1992, 2007; Saavedra et al., 2006). In fact 19 of the 20 accepted species have similarities >97% (Alperi et al., in press) and furthermore, this gene presents microheterogeneities (Figueras et al., 2005; Martínez-Murcia et al., 2005; Morandi et al., 2005; Alperi et al., 2008) all of which hamper the usefulness of these genes for identification (Alperi et al., 2008), such is the case with A. culicicola (Figueras et al., 2005; Alperi et al., 2008) now considered a synonym of A. veronii (Huys et al., 2005). However, several housekeeping genes have proven to have a high discriminatory power for differentiating neighbouring species and have been used to clarify the phylogeny of Aeromonas (Yañez et al., 2003; Soler et al., 2004; Küpfer et al., 2006; Nhung et al., 2007; Sepe et al., 2008). Recently, a complete Multi Locus Phylogenetic Analysis (MLPA) based on 7 housekeeping genes (gyrB, gyrA, rpoD, dnaJ, dnaX, recA and atpD), which included several strains of each of the 19 species, has been developed (Martínez-Murcia et al., submitted). Aeromonas are primarily inhabitants of aquatic environments often associated with fish and human diseases (Figueras, 2005; Martin-Carnahan & Joseph, 2005). The most common clinical presentation of Aeromonas is diarrhoea followed by localized soft-tissue infections and bacteraemia, being the prevailing associated species A. veronii, A. caviae and A. hydrophila (Figueras, 2005). Over recent years numerous cases of Aeromonas infections have been described in Taiwan (Wu et al., 2007). The present investigation was initiated to genetically identify a group of Aeromonas extraintestinal strains isolated in the National Cheng Kung University Hospital in Tainan, Taiwan, using a previously described 16S rDNA-RFLP method (Figueras et al., 2000). Two of these strains, UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN A2-50 and A2-67, received as A. hydrophila and A. caviae respectively, both showed an atypical RFLP pattern similar to patterns observed for A. caviae strains that presented microheterogeneities in the 16S rRNA gene (Alperi et al., 2008). However, the rpoD sequences showed that these strains might constitute two novel and independent Aeromonas phylogenetic lines. In the present study, a polyphasic approach, based on the sequences of the 16S rRNA gene, MLPA of five genes (gyrB, rpoD, recA, dnaJ and gyrA), DNA-DNA reassociation experiments and a phenotypic analysis, were performed to establish the taxonomic position of the two clinical isolates, A2-50 and A2-67. Strain A2-50 together with Enterobacter cloacae and Enterococcus sp was isolated on the 10th day of hospitalization from the burn wound of a 40-year-old male with flame burn involving 52% of body surface area. The patient also development a concurrent Aeromonas and Enterococcus bacteraemia, but unfortunately the Aeromonas blood isolate was lost. Both, the burn wound infection and the bacteraemia were considered nosocomial. Strain A2-67 was isolated from a 70-year-old female with non-insulin-dependent diabetes mellitus. She experienced trauma and had abrasion wounds over her right elbow and a right humeral fracture. On admission, a wound culture from her right elbow grew Aeromonas, Pseudomonas aeruginosa and Bacillus species. No bacteraemia was noted. To perform the phylogenetic study strains A2-50 and A2-67 were cultured on sheep blood agar at 30ºC, DNA was extracted from single colonies using InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad Laboratories) following the manufacturer’s instructions in order to sequence the 16S rDNA (1503 pb) and rpoD (820 pb) genes. Primers and conditions for the amplification and sequencing of those genes have been described previously (Martínez-Murcia et al., 1992; Soler et al., 2004). The 16S rDNA and rpoD sequences obtained were independently aligned with the sequences of the type and references strains of all the members of the genus Aeromonas that were available in the GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore) by CLUSTAL W program, version 1.83 (Thompson et al., 1994). Genetic distances and clustering were obtained using Kimura´s 2-parameter model (Kimura, 1980), evolutionary trees were constructed by the neighbour-joining (and maximumparsimony for 16S rRNA gene) method (Saitou & Nei, 1987) using the MEGA4 program (Tamura et al., 2007). Stability of the relationships was assessed by bootstrapping (1000 replicates). The MLPA was performed on the basis of gyrB (923 bp), rpoD (652 bp), recA (600 bp), dnaJ (800 bp) and gyrA (709 bp) genes, in the Molecular Diagnostic Center (MDC), Orihuela, Spain, as described previously (Martínez-Murcia et al., submitted). The 16S rRNA gene phylogenetic trees (Fig. 1 and Fig. S1) showed strains A2-50 and A2-67 as independent phylogenetic lines within the genus Aeromonas. Those strains clustered in the 16S rDNA phylogenetic trees with A. caviae, A. trota and A. aquariorum, with a 99% robust bootstrap value when the phylogeny was inferred with the neighbour-joining algorithm (Fig. 1) and 96% with maximum-parsimony algorithm (Fig. S1). The two strains were highly related to each other, just 3 bp UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN differences (99.8%) between their 16S rDNA sequences. The nearest species to these two strains (A250 and A2-67) on the basis of this gene were A. trota (99.7% and 99.6% similarity, 4 and 5 bp differences respectively), A. caviae (99.6% and 99.7% similarity, 5 and 4 bp respectively) and the recently described A. aquariorum (99.8% and 99.6% similarity, 2 and 5 bp respectively). Chromatogram analysis of the 16S rDNA sequences (1503 bp) of strains A2-50 and A2-67 revealed the existence of microheterogeneities in 8 and 3 positions respectively (Table S1), representing a variability of 0.53% and 0.2% respectively. Microheterogeneities were located within the V3 and V6 regions, the ones containing the signature nucleotides that enable the identification of most Aeromonas species (Martínez-Murcia et al., 1992; Saavedra et al., 2006), therefore hampering proper identification (Alperi et al., 2008). Strains A2-50 and A2-67 showed a 99% similarity with A. caviae, A. trota and A. aquariorum using BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). This high similarity is in agreement with the general behaviour of the species within this genus. In fact, two species, A. salmonicida and A. bestiarum, posses an identical 16S rDNA sequence (Martínez-Murcia et al., 1992, 2005) and the others possess similarity values that range from 96.8% (48 bp differences between A. simiae and A. bestiarum type strain) to 99.8% (3 bp differences between A. molluscorum and A. encheleia, and between A. hydrophila and A. media type strains). Consequently, in Aeromonas the 16S rDNA similarity cut value of 97% proposed for species differentiation (Stackebrandt & Goebel, 1994; Stackebrandt et al., 2002) cannot be applied, nor can the new proposed value of 98.7-99% (Stackebrandt & Ebers, 2006). This statement agrees with conclusions derived from an early 16S rRNA phylogeny published by Martinez-Murcia et al. (1992), where absolute values for species delineation in bacteria were not recommended because of different rates of sequence divergence. The rpoD phylogenetic tree showed strains A2-50 and A2-67 as two independent phylogenetic lines within Aeromonas (data not shown), showing a 92.7% similarity, 59 bp differences between their sequences. The nearest species on the basis of the rpoD gene was A. caviae, showing sequence similarities of 93.2% (56 bp differences) to A2-50 and 92.2% (63 bp differences) to A2-67. These values are below the mean intra-species similarity of 97% previously established for the rpoD gene in the genus Aeromonas (Soler et al., 2004; Alperi et al., 2008). The MLPA tree showed, in concordance with the rpoD phylogeny (data not shown) and in contrast with the 16S rRNA gene, that strains A2-50 and A2-67 were not phylogenetically related to A. trota or A. aquariorum (Fig. 2), but appeared in the same cluster that included A. media and A. caviae, forming independent branches. Species delineation based on the analysis of five housekeeping genes have been recommended (Stackebrandt et al., 2002), although only the recently described A. fluvialis (Alperi et al., in press) and the two species described in this study comply with this recommendation in the genus Aeromonas. To establish DNA-DNA reassociation values, DNA was extracted using the Marmur’s method (Marmur, 1961). The reassociation experiments were conducted using the methodology of Ziemke et al. (1998) and Urdiain et al. (2008). Renaturalization was performed under optimal conditions at 70ºC, UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN reassociation values were determined at least three times (direct and reciprocal reactions, e.g. A x B and B x A) for any given strain pair and results expressed as the mean, as described earlier (Alperi et al., in press). The DNA-DNA reassociation values between A2-50 and A2-67 with A. caviae type strain (CECT838T), the most closely phylogenetic species on the basis of the MLPA, were 60% and 65% respectively, while both strains showed a 64% similarity (Table S2), all below the 70% established for species delineation (Wayne et al., 1987; Stackebrandt & Goebel, 1994; Stackebrandt et al., 2002; Rosselló-Móra, 2006). Although DNA-DNA hybridization values >60% may be considered borderline, these values are quite common for different Aeromonas species (Nhung et al., 2007; Alperi et al., in press). This also happens among species of the neighbour genus Vibrio (Gómez-Gil et al., 2003, Thompson et al., 2003). In order to determine colony characteristics i.e., size, colour, production of brown diffusible pigment, strains A2-50 and A2-67 were grown at 30ºC for 24h on TSA, and on blood agar to determine the existence of haemolysis. Optimal growth temperature and pH were determined on TSB after 24h by optical density. Twenty-eight phenotypic tests, selected from Abbott et al. (2003) and listed in a previous study (Alperi et al., in press), were used for the characterization of strains A2-50 and A2-67. These tests were performed three times and were incubated at 30ºC and also at 36ºC, due to the clinical origin of the strains. Some tests were further confirmed in parallel using commercial identification kits (API20NE and API20E, BioMerieux). Additional tests from the latter kits together with the fermentation and oxidation of 49 carbohydrates using API50CH (BioMerieux), were also considered. Type strains belonging to all Aeromonas species were evaluated, under identical conditions as those used for A2-50 and A2-67, for all differential tests included in Table 1. Strains A2-50 and A2-67 showed relatively similar biochemical profiles, but they could be differentiated from each other because A2-50 is able to use citrate and to produce acid from Draffinose but not A2-67. In addition, the latter is able to growth at 45ºC in sheep blood agar but not A2-50 (Table 1). Strains A2-50 and A2-67 also showed distinctive characters that separated them from other species (A. hydrophila, A. veronii bv. sobria and A. caviae) commonly encountered in clinical samples (Table 1). Interestingly, both strains were able to produce acid from amygdalin, a characteristic only so far described in nine Aeromonas strains within a study performed by Abbott et al. (2003) who evaluated the atypical phenotypic properties of the genus. In that study, they encountered four A. caviae strains that produced acid from amygdalin and from D-raffinose, which coincides with the profile of A2-50 (Table 1). Other traits that differentiated A2-50 and A2-67 from other species were their capacity to produce acid from L-arabinose, glycerol and salicin as well as to hydrolyze aesculin, and their negative results for the VP test, LDC and production of gas from glucose and acid from D-cellobiose and D-mannose (Table 1). Interestingly, strain A2-67 displayed two colony types of the same size (4-5 mm in diameter). One was opaque, circular and beige in colour while the other was translucent on TSA after 48h at 30ºC. These two morphologies were also observed UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN on blood agar. Both colony types produced the same biochemical responses and showed identical ERIC-PCR profiles (data not shown). Cell sizes, morphologies and the presence of flagella were determined with Electron Microscopy (Fig. S2) following procedures described in a previous study (Collado et al., in press). The susceptibilities of strains A2-50 and A2-67 against 27 antibiotics (Table S3) were tested, at the University of Trás-os-Montes e Alto Douro in Portugal as described earlier (Alperi et al., in press). Both strains showed resistance to amoxicillin, amoxicillin plus clavulanic acid, ticarcillin, ticarcillin plus clavulanic, cephalothin and erythromycin; A2-50 was intermediate to streptomycin, while A2-67 was resistance to cefoxitine. Both strains were susceptible to the other antimicrobials tested. The 16S rDNA sequences, MLPA, phenotypic characterization, and DNA-DNA reassociation results all clearly separated strain A2-50 from A2-67 and both strains from the other Aeromonas species. Aeromonas taiwanensis sp. nov Aeromonas taiwanensis (tai.wan.en´sis. N.L. fem. adj. taiwanensis of Taiwan, where the strain was isolated). Cells are straight Gram-negative, non-spore forming, rods, non-encapsulated, motile and are 0.8-1 µm wide and 1.8-2.5 µm long, oxidase and catalase positive, reduce nitrate to nitrite and resistant to vibriostatic agent O/129. Colonies on TSA are 2-5 mm in diameter, opaque, circular and beige in colour after 48h at 30ºC. No brown diffusible pigment is produced on TSA. Optimal growth temperature occurs at 30ºC. Growth was observed at 36ºC but not at 40ºC or 4ºC after 24h on sheep blood agar. No ß-haemolysis was observed on sheep blood agar at 30ºC or 36ºC. A2-50 is able to grow on MacConkey agar and at 0% of NaCl but not at 6% after 24h on TSB. Optimal growth pH occurs at pH 8.5-9.5 after 24h on TSB but does not grow at pH 4.5. Strain A2-50 produces indole from tryptophan, ADH, is positive for the ONPG test, hydrolysis of aesculin, gelatin, DNA and L-tryptophane and is able to use citrate. However, is negative for VP test, hydrolysis of elastin and urea and for the production of hydrogen sulphide from cysteine, gas from glucose, swarming, LDC and ODC. Strain A2-50 is able to use Dglucose, L-arabinose, D-mannitol, D-maltose, N-acetyl-glucosamine, potassium gluconate, capric acid and malic acid as sole carbon and energy sources but not D-mannose, adipic acid, phenylacetic acid or trisodium citrate. Acid is produced from D-glucose, D-saccharose, L-arabinose, D-raffinose, D-ribose, amygdalin, salicin, D-galactose, D-fructose, D-mannitol, glycerol, N-acetyl glucosamine, arbutin, aesculin, D-maltose, D-trehalose, amidon, glycogen and potassium gluconate but not from D- UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN cellobiose, D-arabinose, L-rhamnose, m-inositol, erythritol, L- or D- xylose, D-adonitol, metyl-ßDxylopiranoside, D-mannose, L-sorbose, L-rhamnose, dulcitol, inositol, D-sorbitol, metyl-αDmannopyranoside, metyl-αD-glucopyranoside, D-lactose, D-melobiose, inulin, D-melezitose, xylitol, gentiobiose, D-turanose, D-lyxose, D-tagatose, L- or D-fucose, L- or D-arabitol, potassium 2ketogluconate or potassium 5-ketogluconate. The API20E and API20NE codes for strain A2-50 were: 3266127 and 7575754, respectively. Isolated fromTainan, Taiwan. Type strains is A2-50 (=CECT 7403T=LMG 24683T). Aeromonas sanarellii sp. nov Aeromonas sanarellii (sa.na.re.lli.i. M.L. adj. sanarellii in honour of Sanarelli, for his contribution to our knowledge of Aeromonas describing the first Aeromonas as Bacillus hydrophilus fuscus in 1891 (Martin-Carnahan & Joseph, 2005)). Cells are straight, non-spore forming, non-encapsulated, motile and are 0.7 µm wide and 2.5 µm long. Gram-negative, oxidase and catalase positive, reduce nitrate to nitrite and showed to be resistant to vibriostatic agent O/129. Aeromonas strain A2-67 displayed two colony types in TSA and blood agar. Colonies on TSA are 4-5 mm in diameter, one of them opaque, circular and beige in colour while the other is translucent, after 48h at 30ºC. No brown diffusible pigment is produced on TSA. Optimal growth temperature occurs at 30ºC, growth was observed up to 45ºC but not at 50ºC after 48h and at 4ºC after 7 days on sheep blood agar. No ß-haemolysis was observed on sheep blood agar at 30ºC or 36ºC. Strain A2-67 is able to grow on MacConkey and at 0% of NaCl but not at 6% on TSB. Optimal growth pH occurs at pH 9 after 24h on TSB but does not grow at pH 4.5. Strain A2-67 produces indole from tryptophan, ADH, is positive for the ONPG test, hydrolyzes aesculin, gelatin, DNA and Ltryptophane. However, it is negative for VP test, utilization of citrate, hydrolysis of elastin and urea and for the production of hydrogen sulphide from cysteine, gas from glucose, swarming, LDC and ODC. Strain A2-67 is able to use D-glucose, L-arabinose, D-mannitol, D-maltose, N-acetylglucosamine, potassium gluconate, capric acid and malic acid as sole carbon and energy sources but not D-mannose, adipic acid, phenylacetic acid or trisodium citrate. Acid is produced from D-glucose, D-saccharose, L-arabinose, D-ribose, amygdalin, salicin, D-galactose, D-fructose, D-mannitol, glycerol, N-acetyl glucosamine, arbutin, aesculin, D-maltose, D-trehalose, amidon, glycogen and potassium gluconate but not from D-cellobiose, D-raffinose, D-arabinose, L-rhamnose, m-inositol, erythritol, L- or D- xylose, D-adonitol, metyl-ßD-xylopiranoside, D-mannose, L-sorbose, L-rhamnose, dulcitol, inositol, D-sorbitol, metyl-αD-mannopyranoside, metyl-αD-glucopyranoside, D-lactose, Dmelobiose, inulin, D-melezitose, xylitol, gentiobiose, D-turanose, D-lyxose, D-tagatose, L- or Dfucose, L- or D- arabitol, potassium 2-ketogluconate or potassium 5-ketogluconate. The API20E and API20NE codes for strain A2-67 were 3066127 and 7575754, respectively. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Isolated from Tainan, Taiwan. Type strain is A2-67 (=CECT 7402T=LMG 24682T). Acknowledgements We are grateful to Mª Isabel Inza for her help in the phenotypic characterization and to Catalina Nuñez for her excellent technical assistance. We are also grateful to the Pharmacology Unit of the Rovira i Virgili University for the use of their Bio Whittaker Kinetic-QCL Microplate Reader. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 82 50 42 11 A. bestiarum CECT4227 (X60406) A. salmonicida CECT894 (X60405) A. molluscorum CECT5864 (AY532690) T T T T A. encheleia CECT4342 (AJ224309) A. eucrenophila CECT4224 (X60411) T T 37 53 73 A. tecta CECT7082 (AJ458403) A. bivalvium CECT7113 (DQ504429) A. popoffi CECT5176 (AJ224308) T T 50 18 25 Aeromonas sp. HG11 ATCC35941 (X60417) A. sobria CECT4245 (X60412) A. media CECT4232 (X60410) 99 T T T 21 A. hydrophila CECT839 (X60404) T T 45 A. allosaccharophila CECT4199 (S39232) A. caviae CECT838 (X60409) 29 99 37 39 31 47 A2-67 (FJ230076) A. trota CECT4255 (X60415) A2-50 (FJ230077) A. aquariorum CECT7289 (EU85557) T T T A. jandaei CECT4228 (X60413) A. fluvialis CECT7401 (FJ230078) A. veronii CECT4257 (X60414) A. simiae IBS-S6874 (AJ536821) 95 89 T T T T A. schubertii CECT4240 (X60416) Aeromonas sp. G501 (U88663) 0.002 Fig. 1. Unrooted phylogenetic tree derived from the 16S rRNA gene sequences shows the relationships of strains A2-50 and A2-67 and all other Aeromonas species by the neighbour-joining method. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig. 2. Unrooted phylogenetic tree derived from the MLSA shows the corresponding relationships of strains A250 and A2-67 to all other Aeromonas species by with the neighbour-joining method. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Table 1. Key tests for phenotypic differentiation of strains A2-50 and A2-67 from other Aeromonas species Taxa are identified as: 1, A. hydrophila; 2, A. bestiarum; 3, A. salmonicida; 4, A. caviae; 5, A. media; 6, A. eucrenophila; 7, A. sobria; 8, A. veronii bv sobria; 9, A. jandaei; 10, A. veronii bv veronii; 11, A. schubertii ; 12, A. trota; 13, A. encheleia; 14, A. allosaccharophila; 15, A. popoffii; 16, A. simiae; 17, A. molluscorum; 18 A. bivalvium ; 19 A. aquariorum; 20 A. tecta, 21 A. fluvialis. Tests for the type strains of species 1-15 were performed at 36ºC while for the other species at 30ºC, tests of strains A2-50 and A2-67 were performed at those two temperatures. All were evaluated for 7 days. +, 100-85% of the strains positive; v, 84-16% of the strains positive; -, 15-0% of the strains positive; ND, no data from these authors Characteristic VP LDC Glucose (gas) Hydrolysis of aesculin Citrate utilization Grow at 45ºC on sheep blood agar + + + + 1 + (+) + (+) + (+) + (+) + (+) + (+) 2 v (-) v (-) v (+) v (+) - (-) - (-) 3 v (+) v (-) v (-) v (+) + (-) - (-) 4 - (-) - (-) - (-) v (+) + (+) + (+) 5 - (-) - (-) - (-) v (-) v (+) - (-) 6 - (-) - (-) v (+) v (+) - (-) - (-) 7 - (-) + (+) v (-) - (-) + (+) - (+) 8 + (+) + (+) + (+) - (-) v (-) - (-) 9 + (+) + (+) + (+) - (-) + (+) + (+) 10 v (-) + (+) + (+) + (+) + (+) + (+) 11 v (-) v (-) - (-) - (-) v (+) + (+) 12 (-) (+) v (+) - (-) + (+) - (-) 13 - (-) - (-) v (+) v (+) - (-) - (-) 14 - (-) + (+) + (+) v (+) v (-) - (-) 15 + (+) - (-) + (+) - (-) + (+) - (-) 16∆ + (+) + (+) - (-) v (-) ND 17ø - (-) - (-) - (-) + (+) + (+) - (-) 18† - (-) + (+) - (-) + (+) + (+) + (+) 19‡ - (-) + (+) + (+) + (+) v (+) - (-) v (-) v (-) + (+) v (-) ND (-) 21# - (-) - (-) + +) - (-) + (+) - (-) (-) + (+) - (-) Acid from Amygdalin D-cellobiose D-raffinose L-arabinose Glycerol Mannose Salicin + + + + + + + + + - (-) - (-) - (-) V (+) + (+) + (+) V (-) - (-) v (-) - (-) + (+) + (+) + (+) v (-) - (-) v (-) - (-) + (-) + (-) + (-) v (-) - (-) + (+) - (-) + (+) v (-) v (-) v (+) - (-) + (+) - (-) + (+) v (+) + (+) v (-) - (-) v (+) - (-) v (+) - (-) + (+) v (-) - (-) + (+) - (-) - (-) + (+) + (+) - (-) - (-) v (-) - (-) - (+) + (+) + (+) - (-) - (-) - (-) - (-) - (-) - (+) - (+) - (-) - (-) v (+) - (-) - (-) + (+) + (+) + (+) - (-) - (-) - (-) - (-) - (-) + (+) - (-) - (-) + (+) - (-) - (-) v (+) + (+) - (-) - (-) - (-) - (-) - (-) + (+) + (+) - (-) - (-) + (+) v (-) v (+) + (+) + (+) - (-) - (-) - (-) - (-) v (+) + (+) + (+) - (-) - (-) + (+) - (-) - (-) + (+) - (+) - (-) ND (-) ND ND (-) (-) - (-) - (-) - (-) - (-) + (+) + (+) + (+) - (-) - (-) ND - (-) + (+) - (-) - (-) + (+) + (+) + (+) + (+) - (-) + (+) + (+) + (+) ND - (-) + (+) + (+) - (-) - (-) (-) - (-) + (+) ND (+) (-) - (-) A: A2-50, B: A2-67. Data from species 1 to 15 were obtained from Abbott et al. (2003) who performed tests at 35ºC with the exception of A. popoffii and A. sobria which were at 25ºC, as did øMiñana-Galbis et al. (2007); ∆HarfMonteil et al. (2004), ‡Martínez-Murcia et al. (2008), ¥Demarta et al. (2008) and #Alperi et al. (in press) performed tests at 30ºC; †Miñana-Galbis et al. (2004) performed tests at 25-30ºC. Type strains results are expressed in the table in brackets as (+) or (-). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Supplementary Table S1. Base differences in the 16S rRNA gene sequences among strains A2-50, A2-67 and the type strains of A. caviae, A. trota and A. aquariorum. GenBank Strain A2-50 A2-67 A. caviae CECT838T A. trota CECT4255T A. aquariorum CECT7289 * T Position* 457 C/T C C C C 458 A/G A A A A 469 T C T T T 471 T/C T T T T 472 G/A G G G G 474 T/C T T T T 475 G/A G G G G 476 A G G G A 649 A A/G A G A 1011 C/T C/T T C C 1018 G/A A/G A G G 1350 G G A A A 1362 C C T T T accession no. FJ230077 FJ230076 X60409 X60415 EU085557 Following the Escherichia coli nomenclature (Brosius et al., 1978). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Supplementary Table S2. DNA–DNA relatedness between strains A2-50 and A2-67 and A. caviae type strain. Results are expressed as the mean of three replicates. Labelled DNA Strain A. caviae A. caviae CECT838T A2-50 A2-67 100 68.4 67.3 A2-50 51.4 100 61.4 A2-67 62.1 66.3 100 Supplementary Table S3. Antibiotic resistance of A2-50 and A2-67 against 27 antibiotics tested in this study. Antibiotic Piperacillin Piperacillin plus tazobactam Amoxicillin Amoxicillin plus clavulanic acid Ticarcillin Ticarcillin plus clavulanic acid Cephalothin Cefoxitine Cefotaxime Cefoperazone Ceftazidime Ceftriaxone Cefepime Aztreonam Imipenem Gentamicin Kanamycin Tobramycin Amikacin Streptomycin Tetracycline Ciprofloxacin Nalidixic acid Fosfomycin Erythromycin Trimethoprim-sulfamethoxazole Chloramphenicol intermediate, or (R) resistant. A2-50 S S R R R R R S S S S S S S S S S S S I S S S S R S S A2-67 S S R R R R R R S S S S S S S S S S S S S S S S R S S The presumptive new species were classified as (S) susceptible, (I) UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 22 23 96 47 49 A. trota CECT4255 (X60415) A. aquariorum CECT7289 (EU85557) A2-67 (FJ230076) A2-50 (FJ230077) T T A. caviae CECT838 (X60409) A. media CECT4232 (X60410) T T 33 94 A. hydrophila CECT839 (X60404) A. allosaccharophila CECT4199 (S39232) T T 27 15 48 26 41 19 92 68 15 A. jandaei CECT4228 (X60413) A. veronii CECT4257 (X60414) A. fluvialis CECT7401 (FJ230078) A. simiae IBS-S6874 (AJ536821) A. schubertii CECT4240 (X60416) Aeromonas sp. G501 (U88663) A. sobria CECT4245 (X60412) Aeromonas sp. HG11 ATCC35941 (X60417) A. bivalvium CECT7113 (DQ504429) 71 T T T T T T T 54 A. popoffii CECT5176 (AJ224308 A. encheleia CECT4342 (AJ224309) T T 19 47 75 A. molluscorum CECT5864 (AY532690) A. bestiarum CECT4227 (X60406) A. salmonicida CECT894 (X60405) A. eucrenophila CECT4224 (X60411) A. tecta CECT7082 (AJ458403) T T T T T Supplementary Fig. S1. Unrooted phylogenetic tree derived from the 16S rRNA gene sequences shows the relationships of strains A2-50 and A2-67 to all other Aeromonas species by the maximum-parsimony method. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN A B C D Supplementary Fig. S2. A-B. Electron microscopy images of strain A2-50. A. Transmission electron microscope, negative stain. Bar: 0,5µm. B. Scanning electron microscope. Bar: 7 µm. C-D. Electron microscopy images of strain A2-67. C. Transmission electron microscope, negative stain. Bar: 0,5µm. Arrow indicates the presence of polar flagella. D. Scanning electron microscope Bar: 8 µm. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN REFERENCES Abbott, S. L., Cheung, W. K. & Janda, J. M. (2003). The genus Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification schemes. J Clin Microbiol 41, 23482357. Alperi, A., Martínez-Murcia, A. J., Monera, A., Saavedra, M. J. & Figueras, M. J. (in press). Aeromonas fluvialis sp. nov., isolated from Spanish river. Int J Syst Evol. Alperi, A., Figueras, M. J., Inza, I. & Martínez-Murcia, A. J. (2008). Analysis of 16S rRNA gene mutations in a subset of Aeromonas strains and their impact in species delineation. Int Microbiol 11, 185-194. Borrell, N., Figueras, M. J. & Guarro, J. (1998). 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UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Artículo: 4.1.8. R Beaz-Hidalgo, A Alperi, MJ Figueras, J Romalde. Aeromonas piscicola sp. nov., isolated from diseased fish. Systematic and Applied Microbiology. En prensa. Resumen Cuatro cepas de Aeromonas (S1.2, EO-0505, TC1 y TI 1.1) aisladas de peces moribundos, mostraron un patrón de RFLP-ADNr 16S similar al generado por cepas de Aeromonas salmonicida y Aeromonas bestiarum, sin embargo, las secuencias del gen rpoD indicaban que podía tratarse de una nueva línea filogenética. El análisis filogenético multilocus con 5 genes (ARNr 16S, gyrB, rpoD, recA y dnaJ; 4321 pb) mostró que estos aislados constituían un grupo independiente dentro del género siendo A. salmonicida, A. bestiarum y Aeromonas popoffii las especies filogenéticamente más cercanas. Además, una cepa (AH-3) bioquímicamente identificada como Aeromonas hydrophila y que mostraba un patrón de RFLP del ADNr 16S de A. bestiarum también se agrupaba dentro de esta nueva rama en el análisis multilocus. Los genes rpoD y gyrB fueron los mejores marcadores filogenéticos para diferenciar estos aislados de las especies filogenéticas más cercanas. Estas cepas presentaban características bioquímicas que permitían diferenciarlas de cepas pertenecientes a las especies más cercanas como la producción de ácido a partir del glicerol y salicina, la producción de elastasa así como su incapacidad para crecer con L-lactato como única fuente de carbono. El estudio polifásico, realizado en base al análisis del gen ARNr 16S (1503 pb), de 4 genes housekeeping, la reasociación ADN-ADN y el análisis fenotípico, que incluye además los perfiles de proteínas totales con MALDI-TOF-MS; confirmó estas 5 cepas como representantes de una nueva especie de Aeromonas para la cual se propone el nombre de Aeromonas piscicola con el aislado S1.2 (CECT 7443T = LMG 24783T) como cepa tipo. 143 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aeromonas piscicola sp. nov. , isolated from diseased fish. R. Beaz-Hidalgo 1, A. Alperi 2, M. J. Figueras 2 & J. L. Romalde 1 Departamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de Biología. Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, Spain. 2 Departamento de Ciencias Médicas Básicas. Universidad de Rovira i Virgili, Reus, Spain. 1 * Corresponding author: Phone: +34-981563100 # 1 Fax: +34-981596904 E-mail: jesus.romalde@usc.es Four Aeromonas strains (S1.2, EO-0505, TC1 and TI 1.1) isolated from moribund fish in Spain showed a restriction fragment length polymorphism (RFLP) pattern related to strains of A. salmonicida and A. bestiarum but their specific taxonomic position was unclear. Multilocus sequence analysis (MLSA) of housekeeping genes rpoD, gyrB, recA and dnaJ confirmed the allocation of these isolates in an unknown genetic lineage within the genus Aeromonas with A. salmonicida, A. bestiarum and A. popoffii as the phylogenetically nearest neighbours. Furthermore, a strain biochemically labelled as A. hydrophila (AH-3), showing a pattern of A. bestiarum in basis to 16S rDNA-RFLP, also clustered with the unknown genetic linage. The genes rpoD and gyrB proved to be the best phylogenetic markers to differentiate these isolates from their neighbour species. Useful phenotypic features for differentiating the novel species from other known Aeromonas species include their ability to hydrolyze elastin, produce acid from L-arabinose and salicine, and their inability to produce acid from lactose and use L-lactate as a sole carbon source. A polyphasic approach using phenotypic characterization, phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene and of 4 housekeeping genes including, DNA-DNA hybridization studies and an analysis of the protein profiles by MALDI-TOF-MS showed that these strains represented a novel species for which the name Aeromonas piscicola sp. nov. is proposed with isolate S1.2T (=CECT 7443T= LMG 24783T) as the type strain. Keywords: Aeromonas piscicola sp. nov., DNA-DNA hybridizations, 16S rDNA, housekeeping genes, MALDI-TOF-MS. Running title: Aeromonas piscicola sp. nov. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN INTRODUCTION Several approaches have been attempted to clarify the phylogenetic relationships among the species of the genus Aeromonas but the taxonomy remains complex and appears to be continuously changing due to the addition of new described species. At present the genus comprises of 19 species: A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. caviae (synonym is A. punctata) A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii (synonyms are A. ichthiosmia and A. culicicola), A. jandaei, A. schubertii, A. trota (synonym is A. enteropelogenes), A. allosaccharophila, A. encheleia, A. popoffii, A. simiae, A. molluscorum, A. bivalvium, A. aquariorum, A. tecta, and two DNA homology groups, Aeromonas sp. HG11 (proposed to be the synonym of A. encheleia [10]) and HG13 (Enteric group 501), without a species name [6, 7, 9, 12, 13, 20, 25, 27, 28, 32]. Right after the species A. aquariorum was defined [24], it was recognized that A. hydrophila subsp. dhakensis [14] was maybe wrongly classified as A. hydrophila since, on the basis of the rpoD and gyrB genes, it clustered phylogenetically within the group of A. aquariorum. Therefore, these two taxa should be considered synonyms pending a more extensive re-evaluation [23]. One of the most evident problems is the delineation of the species of the A. hydrophila complex which includes A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida and A. popoffii [24]. Particularly difficult is the separation between A. bestiarum and A. salmonicida. The gene 16S rRNA has been found to be highly conserved and unable to differentiate members of the latter species [22, 24]. Moreover, A. salmonicida is divided into four psycrophilic subspecies isolated from fish A. salmonicida subsp. salmonicida, A. salmonicida subsp. achromogenes, A. salmonicida subsp. masoucida and A. salmonicida subsp. smithia, and one mesophilic subspecies A. salmonicida subsps. pectinolytica isolated from water [20, 31]. Other motile A. salmonicida mesophilic strains have been described and can be misidentified as A. bestiarum or A. hydrophila [3, 16, 24]. A number of articles have described atypical A. salmonicida strains that cannot be included in any of the described subspecies due to the presence of atypical phenotypic or genetic characteristics [2, 10, 18, 42]. A previously described molecular method based on 16S rDNA RFLP analysis has provided species specific profiles enabling the identification of most species of Aeromonas [8]. The five fish strains analyzed in this study displayed mixed patterns between A. salmonicida and A. bestiarum when RFLP analysis was performed. In previous studies, strains with such behaviour could be assigned to either one of these two species using gyrB and rpoD genes [24]. Recently, other studies have contributed to the clarification of controversial relationships in the genus Aeromonas and have demonstrated that the genes dnaJ and recA can also be powerful tools for interspecies differentiation [29, 35]. In the present study, the five Aeromonas isolates were subjected to a polyphasic approach including phylogenetic analysis derived from 16S rRNA and 4 housekeeping genes (gyrB, rpoD, dnaJ, and recA), DNA-DNA hybridization, MALDI-TOF-MS analysis, and extensive biochemical tests in UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN order to determine their taxonomic positions. Based on the reported findings, we describe a novel species within the genus Aeromonas. MATERIALS AND METHODS Bacterial strains and phenotypic tests The strains used in this study had been previously classified as belonging to the genus Aeromonas based on phenotypic features. Four strains S1.2T (=CECT 7443T, =LMG 24783T), EO0505, TC1 (=CECT 7444, =LMG 24784) and TI 1.1 were isolated from diseased fish; strains S1.2T and EO-0505 from salmon (Salmo salar) in 2005 and strains TC1 and TI 1.1 from trout (Oncorhynchus mykiss) in 2007, all belonging to the Collection of the University of Santiago de Compostela. Strain AH-3, originally identified as A. hydrophila and isolated from gold fish (Carassius auratus) [26], was kindly supplied by Dr. Tomás (Universidad de Barcelona, Spain). The isolates were grown in Trypticase Soy Agar (TSA) (Pronadisa) and incubated at 25±2ºC for 24h. Stock cultures were maintained frozen at -80ºC in tryptone soy broth (TSB) with 15% (v/v) glycerol. Physiological and biochemical characterization of the five isolates was performed by standard techniques, following the methodologies described in previous studies [17, 19, 41]. Incubation was performed at 25±2ºC. The following tests were performed: Gram-staining, motility, cytochrome oxidase, catalase activity, nitrate reduction, susceptibility to the vibriostatic agent (150 g), glucose oxidation-fermentation test, production of a brown diffusible pigment, gas production from D-glucose, methyl red (MR) and Voges-Proskauer (VP) reactions, arginine dihydrolase (ADH), lysine and ornithine decarboxylases (LDC, ODC) activity (Moeller´s method), indole production, hydrolysis of gelatin, starch, esculin, Tween 80, elastin and DNA and β-hemolysis on Columbia sheep blood agar (CBA, Oxoid). Growth temperatures were assayed in TSA and on TSB after 24h at 4, 25, 30, 37 and 44ºC. Optimal growth temperature was determined by measuring the optical density of the TSB liquid cultures. Salt tolerance was determined in nutrient broth agar containing 0, 0.5, 3, and 6% (w/v) NaCl. Utilization of the following substrates as carbon sources were assayed: L-arabinose, sucrose, cellobiose, L-rhamnose, D-mannitol, D-sorbitol, m-inositol, L-lactate, raffinose and salicine. The test β-galactosidase (ONPG) was performed using API 20E (BioMérieux) following the instructions of the manufacturer, with the exception of using saline solution (0.85%) for the preparation of the inocule and incubation was performed at 25±2ºC. Hydrogen production from cysteine was performed in the A. hydrophila medium [15]. Fermentation of forty-nine carbohydrate substrates were tested by using API 50CH (BioMérieux) at 25±2ºC for 24h, following the manufacturer’s instructions. In addition, API 20E, API 50CH, as well as some test useful for the species differentiation we also performed at 30 and 35ºC. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Antibiotic susceptibility tests were undertaken by the disc method on Müeller-Hinton agar plates (Oxoid, UK). After 24h of incubation at 25±2ºC, organisms were classified as susceptible (S), intermediate (I) or resistant (R) according to the guidelines of the Clinical and Laboratory Standards Institute [5]. The antibiotic containing discs ( g ml-1) were the following: ampicillin (AMP10), amoxicillin (AML25), amoxicillin + clavulanic acid (AMC30), tricarcillin (TIC75), cephalotin (KF30), gentamicin (CN10), norfloxacin (NOR10), erythromycin (E5), trimethoprin-sulfamethoxazole (SXT25), chloramphenicol (C30), streptomycin (S10), penicillin (P10), tetracycline (TE30) and nalidixic acid (NA30). Electron microscopy Flagellar arrangement and cellular size were determined by transmission electron microscopy (TEM). Cells were stained with phosphotungstic acid (2%) and processed samples were visualized by an electron microscope Philips CM-12. 16S rRNA and housekeeping analyses Genomic DNA extraction was prepared using the InstaGene Matrix (Bio-Rad) according to the instructions of the manufacturer. 16S rDNA sequencing was performed using primers and conditions as previously described [22, 30]. Amplification and sequencing reactions of the housekeeping genes gyrB, rpoD, dnaJ, and recA were carried out by the methods previously described [29, 36, 39, 43]. PCR products were purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen). Sequencing reactions were performed using the kit GenomeLab DTCS-Quick Start Kit (Beckman Coulter). Sequences were analyzed in an Automatic DNA Sequencer (model 373A, Applied Biosystems). Sequencing was also performed for 3 strains of A. bestiarum (116p, 117p and J4N 98) for the genes 16S rRNA, recA and dnaJ, and for 3 strains of A. popoffii (LMG 17543, LMG 17545 and LMG 17546) the genes 16S rRNA (except strain LMG 17543), recA and dnaJ in order to have more related sequences to compare with the fish strain sequences. Additional sequencing was performed for type strains absent in the NCIMB database: A. salmonicida subsp. achromogenes CECT 895T, A. salmonicida subsp masoucida CECT 896T and A. salmonicida subsp petinolytica 34melT for the gene recA, A. bivalvium CECT 7113T, A. aquariourum CECT 7289T and A. tecta CECT 7082T for the genes dnaJ and recA; and the gene rpoD for the latter species. Sequence corrections and analysis were performed with DNAstar Seqman program (Lasergene) and AutoAsembler 1.40 (Applied Biosystems). Alignments using the above mentioned sequences and those already available were used to construct the phylogenetic trees by neighbourjoining (NJ) with the program Mega version 4.0. [38] and maximum likelihood (ML) (jModelTest, http://darwin.uvigo.es/, [33], FigTree 191 v1.1.2, http://tree.bio.ed.ac.uk). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN DNA-DNA hybridization Genomic DNA for DNA-DNA hybridizations was prepared using the Easy DNA (Invitrogen) kit. DNA-DNA hybridization experiments were done by the hydroxiapatite/microtitre plate method [44] with a hybridization temperature of 60ºC. Reciprocal reactions (eg. A x B and B x A) were performed and the DNA homology percentage reported are the means of a minimum of 3 hybridizations. MALDI-TOF-MS The protein analysis by MALDI-TOF-MS was performed in the mass spectrometry unit of the RIAIDT (University of Santiago de Compostela). Protein extraction was performed with ethanol, formic acid and acetonitrile (AN). Processed samples were placed in a 384 well plate, allowed to dry and covered with a matrix solution (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; HCCA). Mass spectra were obtained using a MALDI-TOF Autoflex mass spectrometer (Bruker Daltonik GmbH, Germany). The measured mass range of spectra was 2.000-20.000 Da. Peak comparison was done with the data-base of Bruker Daltonik GmbH. Escherichia coli strain CECT 433, with with well established profile, was included in the analysis as control. In order to determine significant differences in the profiles, reproducibility of the results were assessed by repetition of at least 10 independent assays and reciprocal data was considered. RESULTS AND DISCUSSION Optimum growth temperatures for the strains within novel species were in the range 25-30ºC. The novel mesophilic species showed several differentiating features in relation to other Aeromonas species (Table 1). Our isolates were readily distinguished from typical psychrophilic A. salmonicida by its motility, inability to produce brown pigment and growth at 37ºC [31]. The fish isolates could be differentiated from mesophilic A. salmonicida strains by their inability to produce acid from lactose and L-arabinose, from A. hydrophila by their inability to use L-lactate as a sole carbon source, and from A. bestiarum strains by the ability to produce acid from L-arabinose. The novel strains were βhemolytic in CBA, positive for LDC, hydrolysis of elastin and esculin unlike A. popoffii. Three or more tests allowed differentiation from all known Aeromonas species. Useful phenotypic tests to differentiate this group of strains from all Aeromonas taxa described up to date were hydrolysis of elastin and acid production of salicin (Table 1). Salicin and arbutin were positive when tested with the API 50CH system at 25±2ºC but not at 35±2ºC after 24h. However, acid was produced from salicin at the latter temperature when tested in nutrient broth (Difco) at a final concentration of 1% w/v. The isolates studied were phenotypically homogeneous except for 3 variable traits, i.e. strain S1.2T used cellobiose as a carbon source, strains AH-3 and EO-0505 produced acid from L-rhamnose and strain AH-3 produced acid from D-sorbitol. In addition strain EO-0505 produced acid from L-rhamnose at UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25±2ºC but not at 35±2ºC in the API 50CH method. Strain AH-3 has been proven to bare an important determinant of virulence in several studies [4, 26, 40]. Is important to consider that antibiotic susceptibility tests showed that the strains analysed were susceptible dose dependent to streptomycin (10 g) and sensitive to gentamicin (10 g), norfloxacin (10 g), trimethoprim + sulfamethoxazole (25 g) and chloramphenicol (10 g). Previous phylogenetic analyses of A. bestiarum and A. salmonicida strains demonstrated that the gene 16S rRNA is not sufficiently discriminative to clearly differentiate some strains of both species [21]. The type strain of A. bestiarum is identical to that of A. salmonicida subsp achromogenes and A. salmonicida subsp. masoucida and only shows two nucleotide differences (positions 1011 and 1018) from that of A. salmonicida subsp. salmonicida [24]. Similar results were obtained for the strains analyzed in this study. Strains S1.2T, TC1, TI 1.1 and AH-3 clustered with the type strain of A. bestiarum (CECT 5227T), A. salmonicida subsp. masoucida (CECT 896T) and A. salmonicida subsp. achromogenes (CECT 895T), but strain EO-0505 clustered with the type strain of A. salmonicida subsp. salmonicida (CECT 894T) (Fig. 1 and S1). Phylogenetic analysis of the isolates examined in this study based on the genes rpoD and gyrB showed that, although genetically related to A. bestiarum and A. salmonicida, they formed a clear separated cluster (supported by a 100% bootstrap value) with considerable phylogenetic divergence (Fig. S2). Phylogenetic trees based on recA and dnaJ sequences also differentiated this new Aeromonas cluster, although less phylogenetic divergence was appreciated with the closest neighbour A. bestiarum (Fig. S3). It has already been proved that gyrB and rpoD genes are excellent molecular markers for assessing the phylogeny of A. bestiarum / A. salmonicida [24]. The results obtained here with these genes support this statement. Multilocus sequence analysis (MLSA) on the four concatenated genes reinforced the above results (Fig. 2 and S4). The inter-species percentage similarities of the genes obtained in this study showed that the closest phylogenetic relative to all fish strains was A. bestiarum (Table 2). Rates of nucleotide substitutions at the inter-species level have been described to be 3% or higher for the gene rpoD and 1.8-4.3% for gyrB [36]; the five strains examined were within these proposed limits. For the dnaJ and recA genes the divergences found between the fish strains and A. bestiarum were lower than the interspecies limits described in previous studies (5.2% and 7-8% respectively) [29, 35]. Is important to consider that only sequences from type strains were used in the study proposing the limits for the dnaJ gene [29], whereas for the recA gene the sequence fragment examined was 272 bp [35] in comparison with 559 bp used in the present work. Levels of DNA-DNA relatedness determined between the strain S1.2T of the presumptive novel species and type strains of A. salmonicida, A. popoffii, and A. bestiarum were 49.9%, 60.6% and 65.4% respectively, below the suggested level (i.e. 70%) for species delineation [37]. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN MALDI-TOF-MS mass spectra of cell extracts confirmed the differentiation of strain S1.2T from the type strains of the phylogenetically closest species A. bestiarum, A. salmonicida and A. popoffii (see Supplementary Fig. S5). As a control, a correct identification of E. coli CECT 433 was obtained with profiles always above log score 2.400. Strain S1.2T with its own profile had a mean log score of 2.744. Mean log scores with A. popoffii, A. salmonicida, and A. bestiarum were 2.348, 2.324 and 2.234 respectively. Based on the results of the phylogenetic analyses using gyrB, rpoD, recA and dnaJ genes, DNA-DNA hybridization, MALDI-TOF-MS analysis and phenotypic characterization, it is evident that the strains isolated from diseased fish represent a single novel species of the genus Aeromonas, for which the name A. piscicola sp. nov. is proposed with the strain S1.2T (=CECT 7443T= LMG 24783T) as the type strain. Description of Aeromonas piscicola sp. nov. Aeromonas piscicola (pi.sci´co.la L.n. piscis fish; L. suff.- cola dweller; N. L. n. piscicola, fish dweller). Cells are Gram-negative, motile rods with a polar flagellum, 1.5-2.0 m long and 0.6-1.0 m wide. Growth occurs at 4-37ºC and at 0-3% NaCl (w/v). Optimum growth temperature is 25-30ºC. Strains are oxidase and catalase positive, reduce nitrates to nitrites and are resistant to the vibriostatic agent O/129 (150 g). No brown diffusible pigment is produced. Chemo-organotrophic, with both oxidative and fermentative metabolism. Positive for ADH, LDC, indol, VP and β-galactosidase test. All strains hydrolyse gelatin, elastin, esculin, starch, Tween 80 and DNA. Produce gas from Dglucose, H2S from cysteine and are β-hemolytic in sheep blood agar. Negative for ODC and MR tests. All strains utilize sucrose and mannitol as an energy source but not m-inositol, L-lactate or raffinose. Acid is produced from glycerol, D-ribose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, Dmannitol, methyl-αD-glucopyranoside, N-acetylglucosamine, aesculin, arbutin (at 25±1ºC), salicin, Dmaltose, D-sucrose, D-trehalose, starch, glycogen and potassium gluconate. Does not produce acid from erythritol, D-arabinose, L-arabinose, D-xylose, L-xylose, D-adonitol, methylβD- xylopyranoside, L-sorbose, dulcitol, inositol, methyl-αD-mannopyranoside, amygdalin, D-cellobiose, D-lactose, D-melibiose, inulin, D-melezitose, D-raffinose, xylitol, gentiobiose, D-turanose, D-lyxose, D-tagatose, D-fucose, L-fucose, D-arabitol, L-arabitol, potassium 2-ketogluconate and potassium 5ketogluconate. Type strain utilizes D-cellobiose and does not produce acid from L-rhamnose. All strains are resistant to ampicillin (10 g), amoxicillin (25 g), amoxycilin + clavulanic acid (30 g), tricarcillin (75 g), cephalotin (30 g), erythromycin (5 g) and penicillin (10 g). All strains show susceptibility dose dependent to streptomycin (10 g) and sensitive to gentamicin (10 g), norfloxacin (10 g), trimethoprim + sulfamethoxazole (25 g) and chloramphenicol (10 g). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN The type strain is S1.2T (=CECT 7443T= LMG 24783T) was isolated in 2005 from wild diseased salmon, (Salmo salar) in Galicia (Spain). The GenBank accession numbers for the 16S rRNA gene sequences of Aeromonas piscicola strains S1.2T, EO-0505, TC1 and TI 1.1 are FM999971, FM999970, FM999972 and FM999973. The GenBank accession numbers for the rpoD, gyrB, dnaJ and recA gene sequences of strains S1.2T, EO0505, TC1 and TI 1.1 are FM999069, FM999963, FM999949, FM999941, FM998645, FM999962, FM999948, FM999939, FM999068, FM999964, FM999950, FM999940, FM999070, FM999965, FM999951, FM999942 respectively. (GenBank accession numbers for the rest of species sequenced in the study are in Fig. 1, S1, S2 and S3 available on line). Acknowledgements This work was supported in part by a grant AGL2006-13208-C02-01, from the Ministerio de Ciencia y Tecnología (Spain). R B. H. acknowledges the Ministerio de Ciencia y Tecnología (Spain) for research fellowship. The authors thank E. Guitián from the RIAIDT (USC) for the mass spectrometry analysis and Bruker Daltonk GmbH for the data-base availability. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Table 1. Key tests for the phenotypic differentiation of A. piscicola from other Aeromonas species. Character Β-Haemolysis Brown pigment Motility Indol VP ODC LDC Glucose (gas) Hydrolysis of Elastin Aesculin Acid from Glycerolf Sucrosef L-arabinosef D- cellobiose f Salicinf D-sorbitolf Lactosef Utilization of L- lactatef 1 + + + + + + + + + + + V 2 V V V + V V V V + + + + V V + + 3 + + + V + + + + + + + V V 4 + + + + + + + + + + + + V + 5 V + + + + + + + V V 6 V + V + + + + + + V V + 7 + + + + V V + + V 8 V + + V + + + 9 + + + + + + + + V 10 + + + + + + + 11 + + + + + + + + + + V + V 12 V + V V + 13 V + + + V + V + + 14 V + + V + + V + + V + V 15 V + + V V V 16 + + V + + V + 17a + + ND V + + + ND ND 18b V + + + + + V V 19c + + + + ND + + ND + + 20d ND + + + + + ND + ND + + 21e + + V V + ND V + V ND Taxa are identified as: 1, A. piscicola (data from this study); 2, A. salmonicida; 3, A. bestiarum; 4, A. hydrophila; 5, A. caviae; 6, A. media; 7, A. eucrenophila; 8, A. sobria; 9, A. veronii biovar sobria; 10, A. jandaei; 11, A. veronii biovar. veronii; 12, A. schubertii; 13, A. trota; 14, A. allosaccharophila; 15, A. encheleia; 16, A. popoffii; 17, A. simiae; 18, A. molluscorum; 19, A. bivalvium; 20, A. aquariorum; 21, A. tecta. Abbreviations: +, 85-100% of strains positive; -, 0-15% of strains positive; V, 16-84% of strains positive; ND, no data available. Data from species 2 to 16 obtained from [1], performed tests at 35ºC with the exceptions of A. popoffii and A. sobria which were at 25ºC; b[27], performed tests at 25ºC. Data from a[9], d[25], e[7] performed tests at 30ºC and c[28] performed tests at 25-30ºC. fTests for A. piscicola strains were performed at 25±2ºC (illustrated in the table) and at 35±2ºC (salicine was negative at 35±2ºC with the API 50CH). Only the strain AH-3 was positive for D- sorbitol. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Table 2. Range of percentage similarities (16S rRNA, rpoD, gyrB, dnaJ and recA) of all A. piscicola strains with phylogenetically related Aeromonas species. 16S rRNA A. salmonicida subps. salmonicida CECT 894 T rpoD 92.2-92.3 92.3-92.4 92.3-92.4 92.3-92.4 92.0-92.2 95.4-96.3 94.5-94.9 89.2-89.5 gyrB 96.7-97.3 96.6-97.2 96.9-97.4 96.9-97.4 96.9-97.4 97.2-97.5 95.3-95.6 91.6-91.9 dnaJ 95.0-95.3 95.1-95.4 95.4-95.6 95.3-95.5 93.8-94.1 98.2-98.6 94.2-94.4 90.6-90.9 recA 93.7-94.8 93.7-94.8 ND* 93.7-94.8 93.9-95.0 97.3-98.2 93.6-94.4 93.0-93.7 99.9-100.0 99.9-100.0 99.6-99.7 99.9-100.0 99.8-99.9 99.9-100.0 99.2-99.3 99.8-99.9 A. salmonicida subps. achromogenes CECT 895T A. salmonicida subps. smithia NCIMB 13210 A. salmonicida subps. pectinolytica 34melT A. bestiarum CECT 4227T A. popoffii CECT 5176T A. hydrophila CECT 839T * ND, no data available. T A. salmonicida subps. masoucida CECT 896T UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN A. salmonicida masoucida ATCC 27013 (X74680) A. salmonicida smithia NCIMB 13210 (NR025295) A. bestiarum J4N98 (FM999977) A. bestiarum 117p (FM999976) A. piscicola TC1 (FM999972) 83 T T A. bestiarum CECT 4277 (NR026089) A. piscicola S1.2 (FM999971) A. piscicola AH-3 (FM999974) T A. salmonicida achromogenes CECT 895 (AM296505) A. bestiarum 116p (FM999975) A. piscicola TI 1.1 (FM999973) T T 86 54 83 A. piscicola EO-0505 (FM999970) A. salmonicida salmonicida CECT 894 (AY9877501) A. salmonicida pectinolytica 34mel (AF134065) 62 T T A. encheleia CECT 4342 (AJ224309) T A. molluscorum CECT 5864 (AY532690) A. sobria CECT 4245 (X60412) A. bivalvium CECT 7113 (DQ504429) A. popoffii LMG 17543 (AJ223181) T T T 81 A. popoffii CECT 5176 (AJ224308) A. popoffii LMG 17545 (FM999978) 48 T A. popoffii LMG 17546 (FM999979) A. eucrenophila CECT 4224 (X60411) T T 63 58 65 97 56 95 99 60 61 A. tecta CECT 7082 (AJ458403) T A. hydrophila CECT 839 (X60404) A. media CECT 4232 (X60410) T T T A. allosaccharophila CECT 4199 (S39232) A. hydrophila subsp. dhakensis CECT 5744 (AJ508765) A. aquariorum CECT 7289 (EU085557) T A. caviae CECT 838 (X60408) A. trota CECT 4255 (X60415) T T T 76 A. jandaei CECT 4228 (X60413) A. veronii biovar veronii CECT 4257 (X60414) 99 T A. veronii biovar sobria CECT 4246 (AY987748) A. schubertii CECT 4240 (X60416) 94 T A. simiae CIP 107798 (AJ536821) T 0.002 Fig.1. Unrooted neighbour-joining phylogenetic tree derived from partial 16S rRNA gene sequences showing the corresponding relationships of Aeromonas piscicola sp. nov. to known species of Aeromonas. The phylogenetic tree was constructed by using 1338 nt. Numbers shown next to each node indicate bootstrap values (percentages of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN A. piscicola EO-0505 A. piscicola S 1.2 100 T A. piscicola AH-3 A. piscicola TC1 100 100 A. piscicola TI 1.1 A. bestiarum CECT 4227 A. bestiarum J4N98 A. bestiarum 116p T 100 99 54 100 A. bestiarum 117p T A. popoffii CECT 5176 A. popoffii LMG 17543 100 69 100 A. popoffii LMG 17545 A. popoffii LMG 17546 T T T A. salmonicida pectinolytica 34mel 100 100 94 A. salmonicida salmonicida CECT 894 A. salmonicida acromogenes CECT 895 T A. salmoncida masoucida CECT 896 T 82 A. bivalvium CECT 7113 T A. molluscorum CECT 5864 A. encheleia CECT 4342 100 93 T A.eucrenophila CECT 4224 A. tecta CECT 7082 A. media CECT 4232 T T T T 94 A. caviae CECT 838 T A. aquariorum CECT 7289 A. hydrophila CECT 839 T A. trota CECT 4255 A. jandaei CECT 4228 T T T 43 52 100 A. sobria CECT 4245 T A. allosaccharophila CECT 4199 A. veronii biovar veronii CECT 4257 A. schubertii CECT 4240 100 T T T A. simiae CIP 107798 0.01 Fig.2. Unrooted neighbour-joining phylogenetic tree derived from MLSA (16S rRNA, rpoD, gyrB, dnaJ and recA genes) showing the corresponding relationships of Aeromonas piscicola sp. nov. to all other Aeromonas species described. The phylogenetic tree was constructed by using 4321 nt. Numbers shown next to each node indicate bootstrap values (percentages of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig.3. Transmission electron micrograph of Aeromonas piscicola sp. nov strain. T A. salmonicida masoucida ATCC 27013 (X74689) T A. salmonicida achromogenes CECT 895 (AM296505) A. bestiarum J4N98 (FM999977) A. bestiarum 117p (FM999976) A. bestiarum 116p (FM999975) T A. bestiarum CECT 4277 (NR026089) A. piscicola AH-3 (FM999974) T A. salmonicida smithia NCIMB 13210 (NR025295) A. piscicola TC1 (FM999972) A. piscicola S1.2 (FM999971) A. piscicola TI 1.1 (FM999973) T A. salmonicida pectinolytica 34mel (AF134065) A. piscicola EO-0505 (FM999970) T A. salmonicida salmonicida CECT 894 (AY9877501) T A. molluscorum CECT 5864 (AY532690) T A. encheleia CECT 4342 (AJ224309) T A. sobria CECT 4245 (X60412) T A. bivalvium CECT 7113 (DQ504429) A. popoffii LMG 17543 (AJ223181) A. popoffii LMG 17546 (FM999979) T A. popoffii CECT 5176 (AJ224308) A. popoffii LMG 17545 (FM999978) T A. tecta CECT 7082 (AJ458403) T A. eucrenophila CECT 4224 (X60411) T A. media CECT 4232 (X60410) T A. trota CECT 4255 (X60415) T A. caviae CECT 838 (x60408) T A. aquariorum CECT 7289 (EU085557) T A. hydrophila CECT 839 (X60404) A. veronii biovar sobria CECT 4246 (AY987748) T A. veronii biovar veronii CECT 4527 (X60414) T A. allosaccharophila CECT 4199 (S39232) T A. jandaei CECT 4228 (X60413) T A. simiae CIP 197798 (AJ536821) T A. schubertii CECT 4240 (X60416) 0.0050 T Fig.S1. Unrooted maximum likelihood phylogenetic tree derived from partial 16S rRNA gene sequences showing the corresponding relationships of Aeromonas piscicola sp. nov. to known species of Aeromonas. The phylogenetic tree was constructed by using 1338 nt. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig.S2. Unrooted neighbour-joining phylogenetic tree derived from rpoD (A) and gyrB (B) gene sequences showing the corresponding relationships of Aeromonas piscicola sp. nov. to known species of Aeromonas. The phylogenetic tree was constructed by using 743 nt and 894 nt respectively Numbers shown next to each node indicate bootstrap values (percentages of 1000 replicates). A. piscicola EO-0505 (FM998645) A. piscicola S 1.2T (FM999069) 100 A. piscicola AH-3 (FM999071) A. piscicola TC1 (FM999068) 100 A. piscicola TI 1.1 (FM 999070) A. bestiarum CECT 4227T (AY169326) 54 A. bestiarum J4N98 (AY185589) 98 100 A. bestiarum 116p (AY185592) 100 A. bestiarum 117p (AY185591) T 57 A. popoffii CECT 5176 (AY169347) A. popoffii LMG 17546 (AY185583) 100 A. popoffii LMG 17543 (AY169367) 65 A. popoffii LMG 17545 (AY185582) A. salmonicida pectinolytica 34 melT (AY169324) A. salmonicida masoucida CECT 896T (AY169330) 100 T 100 A. salmonicida achromogenes CECT 895 (AY169329) A. salmonicida salmonicida CECT 894T (A Y169331) 62 A. salmonicida smithia NCIMB 13210T (AY169331) A. hydrophila CECT 839T (AY169325) A. aquariorum CECT 7289T (EU268461) 100 A. hydrophila subsp. dhakensis CECT 5744T (EF465510) A. encheleia CECT 4342T (AY169346) A. media CECT 4232T (AY169338) A. eucrenophila CECT 4224T (AY169339) A. tecta CECT 7082T (FM999725) A. caviae CECT 838T (AY169337) A. trota CECT 4255T (AY169344) A. jandaei CECT 4228T (AY169341) A. sobria CECT 4245T (AY169340) A. allosaccharophila CECT 4199T (AY169348) 100 A. veronii biovar veronii CECT 4257T (AY127862) 99 A. veronii biovar sobria CECT 4246 (AY928474) A. bivalvium CECT 7113T (EF465512) A. molluscorum CECT 5864T (DQ411504) A. schubertii CECT 4240T (AY169336) A. simiae CIP 107798T (DQ411508) 100 89 A 99 100 49 54 48 94 51 46 96 100 0.02 B 100 74 57 90 64 27 38 18 77 83 32 71 57 79 99 99 A. piscicola TC1 (FM999964) A. piscicola T1.1 (FM999965) 50 A. piscicola S1.2T (FM999963) 100 A. piscicola AH-3 (FM999966) 81 A. piscicola EO-0505 (FM999962) A. salmonicida pectinolytica 34melT (AY101810) A. salmonicida salmonicida CECT 894T (AY101773) 99 A. salmonicida smithia NCIMB 13210T (AM262159) 99 72 A. salmonicida achromogenes CECT 895T (AM262161) 59 A. salmonicida masoucida CECT 896T (AM262160) 87 A. bestiarum 116p (AY237566) 77 A. bestiarum 117p (AY237565) 86 A. bestiarum CECT 4227T (AY101774) A. bestiarum J4N98 (AY299323) 58 A. popoffii LMG 17543 (AY101803) A. popoffii LMG 17546 (AY237584) 100 88 A. popoffii CECT 5176T (AY101801) 60 A. popoffii LMG 17545 (AY237583) A. encheleia CECT 4342T (AY101799) A. eucrenophila CECT 4224T (AY101776) A. tecta CECT 7082T (AJ964952) A. bivalvium CECT 7113T (EF465525) A. molluscorum CECT5864T (DQ411472) A. media CECT 4232T (AY101782) A. sobria CECT 4245T (AY101781) A. allosaccharophila CECT 4199T (AY101777) A. veronii biovar veronii CECT 4257T (AY101795) 100 A. veronii biovar sobria CECT 4246 (AY101775) A. caviae CECT 838T (A Y101783) A. hydrophila CECT 839T (AY101778) A. jandaei CECT 4228T (AY101780) A. trota CECT 4255T (AY101800) A. aquariorum CECT 7289T (EU268444) A. hydrophila subsp. dhakensis CECT 5744T (AM262163) A. schubertii CECT 4240T (AY101772) A. simiae CIP 107798T (DQ411480) 57 96 0.01 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig.S3. Unrooted neighbour-joining phylogenetic tree derived from dnaJ (A) and recA (B) gene sequences showing the corresponding relationships of Aeromonas piscicola sp. nov. to known species of Aeromonas. The phylogenetic tree was constructed by using 781 nt and 559 nt respectively. Numbers shown next to each node indicate bootstrap values (percentages of 1000 replicates). 98 73 A 66 A. piscicola EO-0505 (FM999948) A. piscicola TC1 (FM999950) A. piscicola TI 1.1 (FM999951) 99 A. piscicola S 1.2T (FM999949) A. piscicola AH-3 (FM999952) A. bestiarum CECT 4227T (AB280554) 97 83 60 81 46 96 80 45 51 A. bestiarum J4N98 (FM999955) A. bestiarum 116p (FM999953) 79 A. bestiarum 117p (FM999954) A. popoffii LMG 17545 (FM999956) A. popoffii CECT 5176T (AB280567) 100 A. popoffii LMG 17546 (FM999957) 67 87 A. popoffii LMG 17543 (FM999958) A. salmonicida pectinolytica 34melT (AB280570) A. salmonicida smithia NCIMB 13210T (AB280567) 100 T 76 A. salmonicida masoucida CECT 896 (AB280569) A. salmonicida salmonicida CECT 894T (AB280571) 79 77 A. salmonicida achromogenes CECT 895 T (AB280568) A. molluscorum CECT 5864T (AB280566) A. sobria CECT 4245T (AB280575) A. bivalvium CECT 7113T (FM999959) 47 A. allosaccharophila CECT 4199T (AB280553) 99 A. veronii biovar sobria CECT 4246T (AB280577) A. veronii biovar veronii CECT 4257T (AB280553) A. jandaei CECT 4228T (AB280564) A. hydrophila CECT 839T (AB280575) A. trota CECT 4255T (AB280558) A. aquariorum CECT 7289T (FM999961) 100 92 70 A. hydrophila subsp. dhakensis CECT 5744T (AB280560) A. encheleia CECT 4342T (AB280557) A. eucrenophila CECT 4244T (AB280559) A. tecta CECT 7082T (FM999960) A. media CECT 4232T (AB280565) A. caviae CECT 838T (AB280555) A. schubertii CECT 4240T (AB280574) 100 A. simiae CIP 107798T (AB280573) 0.02 41 84 B 97 82 A. piscicola TC1 (FM999940) A. piscicola TI 1.1 (FM999942) A. piscicola EO-0505 (FM 999939) A. piscicola AH-3 (FM999943) 53 81 93 41 38 A. piscicola S 1.2T (FM999941) A. bestiarum CECT 4227T (FM179260) A. bestiarum J4N98 (FM999985) 76 A. bestiarum 116p (FM999983) 98 91 A. bestiarum 117p (FM999984) A. salmonicida pectinolytica 34melT (FN179272) A. salmonicida salmonicida CECT 894T (FN179261) 100 A. salmonicida acromogenes CECT 895T (FN179271) 94 A. salmoncida masoucida CECT 896T (FN179273) 80 A. popoffii CECT 5176 T (FN179259) 100 A. popoffii LMG 17543 (FM999982) A. popoffii LMG 17546 (FM999980) 91 A. popoffii LMG 17545 (FM999981) A. sobria CECT 4245T (FN179266) A. allosaccharophila CECT 4199T (FN179258) A. veronii biovar sobria MDC 39 (unpublished) A. veronii biovar veronii CECT 4257T (FN179257) A. trota CECT 4255T (FN179264) A. tecta CECT 7082T (FM999945) A. jandaei CECT 4228T (FN179262) A. caviae CECT 838T (FN179263) A. aquariourum CECT 7289T (FM999944) A. hydrophila CECT 839T (FN179266) A. media CECT 4232T (FN179265) A. encheleia CECT 4342T (FN179267) A.eucrenophila CECT 4224T (FM999947) A. bivalvium CECT 7113T (FM999946) A. molluscorum CECT 5864T (AY829475) A. schubertii CECT 4240T (AY829474) A. simiae CIP 107798T (FN179269) 30 53 41 78 70 81 81 0.01 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig.S4. Unrooted maximum likelihood phylogenetic tree derived from concatenated sequences of the16S rRNA, rpoD, gyrB. dnaJ and recA genes. The phylogenetic tree was constructed by using 4321 nt. A. molluscorum CECT 5864T A. bivalvium CECT 7113T A. popoffii LMG 17546 A. popoffii LMG 17545 A. popoffii LMG 17543 A. popoffii CECT 5176T A. bestiarum J4N98 A. bestiarum 117p A. bestiarum 116p A. bestiarum CECT 4227T A. piscicola S 1.2T A. piscicola AH-3 A. piscicola EO-0505 A. piscicola TC1 A. piscicola TI 1.1 A. salmonicida pectinolytica 34melT t A. salmoncida masoucida CECT 896T A. salmonicida acromogenes CECT 895T A. salmonicida salmonicida CECT 894T A. tecta CECT 7082T A.eucrenophila CECT 4224T A. encheleia CECT 4342T A. media CECT 4232T A. trota CECT 4255T A. veronii veronii CECT 4257T A. allosaccharophila CECT 4199T A. sobria CECT 4245T A. jandaei CECT 4228T A. hydrophila CECT 839T A. aquariorum CECT 7289T A. caviae CECT 838T A. simiae CIP 107798T A. schubertii CECT 4240T 0.03 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig. S5. MALDI-TOF-MS spectra of (a) A. piscicola S1.2T, (b) A. bestiarum CECT 6277T, (c) A. salmonicida CECT 894T, (d) A. popoffii CECT 5176T in the mass range 2.000-20.000 Da. A B C D UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN REFERENCES [1] S. Abbot, W. K. W. Cheung, M. Janda, The genus Aeromonas: Biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification schemes. J. Clin. Microbiol. 41 (2003) 23482357. [2] B. Austin, D. A. Austin, I. Daalsgard, B. K. Gudmundsdóttir, S. Hoie, J. M. Thornton, J. L. Larsem, B. O´Hici, R. Powell, Characterization of atypical Aeromonas salmonicida by different methods. Syst. Appl. Microbiol. 21 (1998) 50-64. [3] G. Castro-Escarpulli, M. J. Figueras, G. Aguiler-Arreola, L. Soler, E. Fernández-Rendón, G. O. Aparicio, J. Guarro, M. R. 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Resumen Dos cepas aisladas del agua de un riachuelo en Alemania (WB4.1-19T y WB4.4-101) y recibidas en nuestro laboratorio para su identificación, mostraron una similitud del 99.9% entre sus secuencias del gen ARNr 16S, siendo la especie más similar a ellas, en base a este gen, Aeromonas sobria (99.7% similitud; 6 pb diferentes). La reconstrucción filogenética en base a las secuencias concatenadas de 5 genes housekeeping (gyrB, rpoD, recA, dnaJ y gyrA; 3684 pb) mostró que dichos aislados representaban cepas distintas y que constituían una línea filogenética independiente, siendo las ramas de las especies Aeromonas molluscorum y Aeromonas bivalvium las más cercanas. Los valores de reasociación ADN-ADN entre las dos cepas fue del 83% y de entre el 47 y 66% con las cepas tipo de las especies más cercanas. Las características fenotípicas de estas dos cepas permitió diferenciarlas del resto de especies definidas en el género. Los datos obtenidos muestran que estas dos cepas representan una nueva especies de Aeromonas para la cual se propone el nombre de Aeromonas rivuli con la cepa WB4.1-19T (=CECT 7518T=DSM 22539T) como cepa tipo. 165 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aeromonas rivuli sp. nov. isolated from the upstream region of a karst water rivulet in Germany Figueras MJ1, Alperi A1, Beaz-Hidalgo R1, Stackebrandt E2, Brambilla, E2, Monera, A3, Martínez-Murcia AJ3. Unitat de Microbiologia, Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, Reus, Spain. 2DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschwieg, Germany. 3Molecular Diagnostics Center and Universidad Miguel Hernández, Orihuela, España. 1 *corresponding author: Mª José Figueras, mariajose.figueras@urv.cat Tel: +34-977759321; Fax: +34-977759322. SUMMARY Two freshwater isolates (WB4.1-19T and WB4.4-101), sharing 99.9% 16S rRNA gene sequence similarity among each other, were highly related to members of Aeromonas sobria (99.7% similarity; 6 bp differences). A phylogenetic tree derived from the Multi-LocusPhylogenetic-Analysis (MLPA) of concatenated sequences of 5 housekeeping genes (gyrB, rpoD, recA, dnaJ and gyrA; 3684 bp) clustered both strains as an independent phylogenetic line next to members of the species A. molluscorum and A. bivalvium. The DNA-DNA reassociation value obtained for these two isolates was 89.3%, while those for the two isolates and type strains of A. sobria, A. molluscorum and A. bivalvium ranged between 50 and 59.6%. The phenotypic characterization differentiated these two strains from all other Aeromonas type strains. These data indicated that both strains belong to a novel Aeromonas species, for which the name Aeromonas rivuli sp. nov. is proposed, with the type strain WB4.1-19T (=CECT7518T=DSM22539T). Running title: Aeromonas rivuli The GenBank accession number of strains WB4.1-19T and WB4.4-101 for the 16S rRNA, gyrB, rpoD, recA, dnaJ and gyrA genes sequences are FJ976900 and FJ976899, FJ969434 and FJ969439, FJ969433 and FJ969437, FJ969435 and FJ969440, FJ969432 and FJ969441, FJ969436 and FJ969430, respectively. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN The genus Aeromonas (family Aeromonadaceae, class Gammaproteobacteria), include bacteria which are considered autochthonous of aquatic environments and often associated with fish and humans diseases (Martin-Carnahan & Joseph, 2005; Figueras 2005). At present the genus includes more than 19 species and four new proposed species are in the process of being published (Alperi et al. a in press, b submitted; Beaz-Hidalgo et al., in press). The taxonomy of Aeromonas is considered complex using either classical identification tools such as phenotypic characters or the 16S rRNA gene (Ormen et al., 2005; Martínez-Murcia et al., 2005). Though 16S rRNA gene sequences are considered a robust taxonomic tool, widely used in bacterial taxonomy, in Aeromonas this gene shows a very high inter-species similarity ranging from 96.7% to 100% (Martínez-Murcia et al., 1992; 2007) and furthermore presents mutations which hamper its utility in this genus (Alperi et al., 2008). A threshold value similarity of about 97% had been proposed for the latter gene, below which strains exhibit sufficiently low DNA-DNA reassociation values (i.e., <70%) that could be considered individual species (Stackebrandt et al., 2002). Recently, based on a broader data set, the threshold value had been increased to 98.7–99.0% in order to facilitate taxonomic studies without sacrificing the quality and precision of a ‘species’ description (Stackebrandt & Ebbers, 2006). The use of housekeeping genes in the polyphasic approach to classification had been recommended to genomically circumscribe species and to differentiate this taxon from neighboring species detected by; for example, 16S rRNA gene sequences (Stackebrandt et al., 2002). We introduced sequence analyses of housekeeping genes (gyrB and rpoB) for studies on the phylogenetic relationships among Aeromonas species (Yáñez et al., 2003; Soler et al., 2004) which turned out to constitute a turning point in the taxonomy of aeromonads because these genes, as others recently investigated (rpoB, dnaJ and recA) by other authors (Küpfer et al., 2006; Nhung et al., 2007; Sepe et al., 2008), show a much higher resolution than 16S rRNA gene sequences. Housekeeping genes not only led to some reclassification proposals (Martínez-Murcia et al., 2007; 2009) but enabled the recognition of new Aeromonas species, e.g., A. aquariorum and A. tecta (Martínez-Murcia et al., 2008; Demarta et al., 2008) and more recently A. fluvialis, A. piscicola, A. taiwanensis and A. sanarellii (Alperi et al., a in press, Alperi et al., b submitted; Beaz-Hidalgo et al., in press). In a recent environmental study, the taxonomic diversity of aerobic bacteria (n=681) in a karst water rivulet in northern Germany (Westerhöfer Bach) was evaluated and 40 different genera and about 60 novel phylospecies were identified (Cousin et al., 2008). Fifteen of the recovered isolates belonging to Aeromonas on the basis of 16S rDNA partial sequences (432 bp) were sent to our laboratory for further molecular characterization. The present communications described the polyphasic approach to the classification of a novel Aeromonas species. All 15 isolates were cultured on sheep blood agar at 30ºC and DNA was extracted from single colonies using InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad Laboratories). The conditions for rpoD (820 bp) and 16S UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN rRNA gene (1503 bp) sequences analysis, including primers, amplification conditions and sequencing, was done as previously described (Martinez-Murcia et al., 1992; Soler et al., 2004). The rpoD sequences obtained were independently aligned with the sequences of the type and reference strains of all the members of the genus Aeromonas that were available in the GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore) by CLUSTAL W program, version 1.83 (Thompson et al., 1994). Genetic distances and clustering were obtained using Kimura´s 2-parameter model (Kimura 1980), evolutionary trees were constructed by the neighbor-joining (and maximumparsimony for 16S rRNA gene) method (Saitou & Nei 1987) using the MEGA4 program (Tamura et al., 2007). Stability of the relationships was assessed by bootstrapping (1000 replicates). The rpoD phylogenetic analysis revealed that 13 of the 15 strains belonged to known Aeromonas species while two strains (WB4.1-19T and WB4.4-101) grouped as an individual lineage within the A. molluscorum / A. bivalvium cluster (data not shown). Both WB isolates showed 97.7% similarity of the rpoD gene (20 bp differences between their sequences) while similarity with the nearest species A. molluscorum was 94.3% for WB4.1-19T and 94.5% for WB4.1-101. These values are below the minimum intra-species similarity of 97% previously established for the rpoD gene in the genus Aeromonas (Soler et al., 2004; Alperi et al., 2008). The almost complete 16S rRNA gene (1503 bp) was sequenced from both strains (WB4.1-19 T and WB4.4-101) using primers and conditions previously described (Martinez-Murcia et al., 1992). The two strains were highly related to each other (99.9%; 2 bp differences) sharing 99.7% similarity with A. sobria CECT 4245T. These results were in agreement with those obtained at the DSMZ laboratory using partial sequences (432 bp) of the 16S rRNA gene. Within the 16S rDNA phylogenetic trees the two isolates cluster next to A. sobria CECT 4245T, however with low bootstrap values no matter when phylogeny was inferred with either the neighbor-joining algorithm (Fig. 1) or maximumparsimony algorithm (Supplement Figure S1). Chromatogram analysis of the 16S rDNA sequences of both strains showed microheterogeneities in two positions (1011 and 1018) for strain WB4.1-19T and in 4 positions (258, 469, 1355, 1357) for strain WB4.4-101 (Supplement Table S1). Microheterogeneities have been described in other Aeromonas species (Alperi et al., 2008; Alperi et al., a in press, b submitted). The Multi-Locus Sequence Analysis (MLPA), performed on the basis of gyrB (923 bp), rpoD (652 bp), recA (600 bp), dnaJ (800 bp) and gyrA (709 bp) genes, was done in the Molecular Diagnostic Center (MDC), Orihuela, Spain, as it has been previously described (Martínez-Murcia et al., submitted). The MLPA tree showed, in concordance with all five single-gene phylogenies and in contrast with the 16S rRNA gene, that strains WB4.1-19T and WB4.4-101 were not phylogenetically related to UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN A. sobria (Fig. 2), but appeared as an independent branch in a cluster that included members of A. molluscorum and A. bivalvium. Species delineation based on the analysis of five housekeeping genes, had been recommended by an Ad-hoc Committee (Stackebrandt et al., 2002), but only the recently described species A. fluvialis (Alperi et al., a in press) and two species A. taiwanensis and A. sanarellii, described from clinical isolates (Alperi et al., b submitted) complies with this recommendation. DNA-DNA reassociation experiments were performed between the two isolates and the type strains of A. sobria, A. molluscorum and A. bivalvium. DNA extraction and reassociation experiments were conducted as previously described (Alperi et al., a in press). The DNA-DNA reassociation values between strains WB4.1-19T and WB4.4-101 was 89.5%, while they were 52.5% with A. sobria CECT4245T, 59.6% with A. molluscorum CECT5864T and 50% with A. bivalvium CECT7113T (Table S2), all below the 70% threshold established for species delineation (Stackebrandt et al., 2002). Optimal growth temperature and pH were determined in tryptic soy broth (TSB, Difco) after 24h by optical density. Cell sizes, morphologies and the presence of flagella were determined by electron microscopy using described methods (Collado et al., in press). Both strains were straight, non-spore forming, non-encapsulated rods and motile by polar flagella (Supplement Figure S2). Cultural characteristics of strains WB4.1-19T and WB4.4-101, i.e., size and color of colonies and production brown diffusible pigment, were determined on tryptic soy agar (TSA, Difco) at 30ºC for 24h. Sheep blood agar (Biomedics) was used to evaluate haemolysis under the same conditions. Twenty eight phenotypic tests selected from Abbott et al., (2003) and also determined in a previous study (Alperi et al., in press) were used for the characterization of strains WB4.1-19T and WB4.4-101. These tests were performed in triplicate at 30ºC. Some tests were further confirmed using commercial identification kits (API20NE and API20E, BioMèrieux). Additional tests included in the latter kits together with the fermentation/oxidation reactions of 49 carbohydrates using API50CH (BioMèrieux) were also considered. Phenotypic characteristics that differentiate both isolates from the other of Aeromonas spp. are presented in Table 1. Though not especially tested in this study, all Aeromonas type strains, including the recent described ones, were evaluated for most of the differential tests (Table 1) under identical conditions that those used for strains WB4.1-19T and WB4.4-101. Interestingly the two isolates show phenotypic similarity with A. molluscorum as they are the only taxa negative for indole, Voges-Proskauer (VP) and lysine decarboxylase (LDC) test. The major characteristics that differentiate the two isolates from A. molluscorum are their ability to produce acid from salicin and L-arabinose. Aeromonas species with similar phenotypic profiles such as A. bivalvium, A. caviae and A. media, can be differentiated by the production of indol and acid UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN production from L-arabinose. Other species such as A. fluvialis and A. tecta differ in the production of gas from D-glucose, and from A. simiae by test lysine decarboxylase (LDC) or acid production from salicin. Four or more phenotypic tests allowed differentiation from the other currently known Aeromonas species (Table 1). Useful phenotypic tests to differentiate this group of strains from all Aeromonas taxa described up to date were their inability to produce indol, gas from D-glucose, LDC and β-haemolysis from sheep blood agar. Strain WB4.4-101 was positive for LDC, ODC and urease with the API 20E system, however, both amino acids were negative when tested by the Moeller’s method. Based on molecular and phenotypic evidence we conclude that strains WB4.1-19T and WB4.4101 represent a new Aeromonas species, for which the name Aeromonas rivuli sp. nov is proposed. Description of Aeromonas rivuli sp. nov. Aeromonas rivuli (ri´vu.li. L. gen. masc. n. rivuli of/from a rivulet, a small creek). Cells are Gram-negative, non spore forming motile rods with a polar flagellum and are 2.0-2.5 m long and 0.5-0.7 m wide. Oxidase and catalase positive, reduce nitrates to nitrites and are resistant to the vibriostatic agent O/129 (150 g). Chemo-organotrophic, with both oxidative and fermentative metabolism. Colonies on TSA are opaque, beige in colour and 2.0-2.5 mm in diameter after 48h at 30ºC, and 1.0-2.0 mm at 37ºC. No brown diffusible pigment is produced on TSA at 25ºC and 30ºC. No haemolysis is observed on sheep blood agar at 30ºC. Growth occurs at 7-37ºC and at 0-3% NaCl (w/v). Optimal growth temperature occurs at 30ºC and at pH 8.7-9.0 after 24h on TSB. Both strains are positive for the β-galactosidase test, ADH, hydrolysis of esculin, gelatin, starch and tween 80. However, they are negative for LDC, ODC, VP, production of indol from tryptophan, gas from glucose and hydrogen sulphide from cysteine, and hydrolysis of elastin and DNA. Utilization of citrate is variable. Both strains are able to use D-sucrose, D-mannitol, L-lactate and salicin as sole carbon energy source but not L-arabinose, cellobiose, inositol, L-rhamnose, D-sorbitol and raffinose. Acid is produced from glycerol, D-ribose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-mannitol, Nacetylglucosamine, arbutin, aesculin, salicin, D-cellobiose, D-maltose, D-saccharose, D-trehalose, starch and glycogen. The strains do not produce acid from erythritol, D-arabinose, L-arabinose, Dxylose, L-xylose, D-adonitol, methyl- ß-D-xylopiranoside, L-sorbose, L-rhamnose, dulcitol, inositol, D-sorbitol, methyl-αD-mannopyranoside, methyl-αD-glucopyranoside, amygdalin, D-lactose, Dmelibiose, inulin, D-melezitose, D-raffinose, xylitol, gentiobiose, D-turanose, D-lyxose, D-tagatose, D-fucose, L-fucose, D-arabitol, L-arabitol, potassium gluconate, potassium 2-ketogluconate and potassium 5-ketogluconate. The API20NE profiles for both strains were 5576354. The API 20E profile for strain WB4.1-19T was 3006125 and for strain WB4.4-101 was 7116125. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN The strains were isolated from a karst hardwater creek Westerhöfer Bach located at the northwester slope of the Harz Mountain, Lower Saxony, Germany. The isolation site was 350 m downstream the discharge site. The type strain is WB4.1-19T (=CECT7518T =DSM22539T). Acknowledgements We are grateful to Mª Isabel Inza for her help in the phenotypic characterization and to Catalina Nuñez for her excellent technical assistance. We are also grateful to the Pharmacology Unit of the Rovira i Virgili University for the use of their Bio Whittaker Kinetic-QCL Microplate Reader. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 91 77 A. bestiarum CECT4227T (X60406) A. piscicola S1.2T (FM999971) A. salmonicida CECT894T (X60405) A. molluscorum CECT5864T (AY532690) A. encheleia CECT4342T (AJ224309) A. eucrenophila CECT4224T (X60411) 59 A. tecta CECT7082T (AJ458403) A. popoffii CECT5176T (AJ224308) 67 A. bivalvium CECT7113T (DQ504429) Aeromonas sp. HG11 ATCC35941 (X60417) A. sobria CECT4245T (X60412) WB4.1-19 T (FJ976900) WB4.4-101T (FJ976899) 99 48 60 A. media CECT4232T (X60410) A. hydrophila CECT839T (X60404) A. sanarellii CECT7402T (FJ230076) 98 43 A. caviae CECT838T (X60409) A. trota CECT4255T (X60415) 34 43 38 A. aquariorum CECT7289T (EU085557) A. taiwanensis CECT7403T (FJ23007) 38 A. allosaccharophila CECT4199T (S39232) A. jandaei CECT4228T (X60413) A. fluvialis CECT7401T (FJ230078) A. veronii CECT4257T (X60414) A. simiae IBS-S6874T (AJ536821) 96 88 A. schubertii CECT4240T (X60416) Aeromonas sp. G501 (U88663) 0.002 Fig. 1. Unrooted phylogenetic tree derived from the 16S rRNA gene sequences showing relationships of strains WB4.1 -19T and WB4.4-101 to all other Aeromonas species described with the neighbour-joining method. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig. 2. Unrooted phylogenetic tree derived from the MLPA showing the corresponding relationships of strains WB4.1-19T and WB4.4-101 to all other Aeromonas species described with the neighbour-joining methods. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Table 1. Key tests for the phenotypic differentiation of Aeromonas rivuli from other Aeromonas species. Character β-haemolysis Indol VP ODC LDC Glucose (gas) Hydrolysis of Aesculin Acid from Glycerol D-saccharose L-arabinose Salicin Lactose Utilization of L-lactate 1 + + + + + 2a + + + + + + 3a 4a + V + + V(-) V(+) V (-) V(-) + V(-) + 5a V + 6a V + 7a 8a + + + + V(+) V(-) + + 9a + + + + + + + 10 a + + + + + + 11 a + + V(-) + + + + + + + V(-) 12 a 13 a 14 a V V V + + V(-) V(-) + V(+) V(+) + 15 a V + V + + 16 a + + + 17b + + V(-) + + (+) ND 18c V + + + + (-) V 19d + + + (-) + + + 20e ND + + + + + + + + 21f + V(-) V(-) + V(-) + V(-) ND 22g + + + + + + ND 23h + + + + + + + + 24i + + + + + + + + ND 25i + + + + + + + + ND V(+) V(+) V(-) V(+) V(+) V(+) + + V(-) V(+) + + + + + V(+) V(+) + + + + V(+) V(-) V(-) V (-) V(+) V(-) V(-) V(-) + V(-) V(+) +k + V + - V(+) + + + V(-) V(+) + V(+) V(+) +j + V + Taxa are identified as: 1, A. rivuli (data from this study at 30ºC); 2, A. hydrophila; 3, A. bestiarum; 4, A. salmonicida; 5, A. caviae; 6, A. media; 7, A. eucrenophila; 8, A. sobria; 9, A. veronii biovar sobria; 10, A. jandaei; 11, A. veronii biovar. veronii; 12, A. schubertii; 13, A. trota; 14, A. encheleia, 15, A. allosaccharophila,; 16, A. popoffii; 17, A. simiae; 18, A. molluscorum; 19, A. bivalvium; 20, A. aquariorum; 21, A. tecta; 22, A. fluvialis; 23, A. piscicola; 24, A. taiwanensis; 25, A. sanarelli. Abbreviations: +, 85-100% of strains positive; -, 0-15% of strains positive; V, 16-84% of strains positive; ND, no data available. Data from species obtained from: aAbbott et al., (2003) who performed tests at 35ºC with the exceptions of A. popoffii and A. sobria which were at 25ºC, as did cMiñana-Galbis et al., (2004); bHarf-Monteil et al., (2004), eMartínez Murcia et al., (2008), fDemarta et al., (2008), gAlperi et al., (a, in press), hBeaz-Hidalgo et al., (in press), iAlperi et al., (b, submitted) performed tests at 30ºC; dMiñana-Galbis et al., (2007) performed tests at 25-30ºC; and j Esteve et al., (1995) and kHuys et al., (1997) performed tests at 28ºC. Type strain results are expressed in brackets for variable responses or when no data was available. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN A. trota CECT4255T (X60415) A. aquariorum CECT7289T (EU085557) 96 49 47 A. taiwanensis CECT7403T (FJ23007) A. sanarellii CECT7402T (FJ230076) A. caviae CECT838T (X60409) A. media CECT4232T (X60410) 94 32 A. hydrophila CECT839T (X60404) A. allosaccharophila CECT4199T (S39232) A. jandaei CECT4228T (X60413) 29 47 A. veronii CECT4257T (X60414) A. fluvialis CECT7401T (FJ230078) 40 92 69 54 A. simiae IBS-S6874T (AJ536821) A. schubertii CECT4240T (X60416) . Aeromonas sp. G501 (U88663) A. bivalvium CECT7113T (DQ504429) A. popoffii CECT5176T (AJ224308) Aeromonas sp. HG11 ATCC35941 (X60417) 45 54 A. eucrenophila CECT4224T (X60411) A. tecta CECT7082T (AJ458403) A. encheleia CECT4342T (AJ224309) 69 22 A. molluscorum CECT5864T (AY532690) A. sobria CECT4245T (X60412) WB4.1-19T (FJ976900) 26 41 WB4.4-101 (FJ976899) A. salmonicida CECT894T (X60405) A. bestiarum CECT4227T (X60406) A. piscicola S1.2T (FM999971) Supplementary Fig. S1. Unrooted phylogenetic tree derived from the 16S rRNA gene sequences showing relationships of strains WB4.1-19T and WB4.4-101 to all other Aeromonas species described with the maximumparsimony method. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN A B Supplementary Fig. S2. A-B. Electron microscopy images of strain WB4.1-19T. A. Transmission electron microscope, negative stain Bar, 500 nm. B. Scanning electron microscope, Bar 5 µm. Supplementary Table S1. Base differences in the 16S rRNA gene sequence between strain WB4.1-19T and WB4.4-101 and the type strains of A. sobria, A. molluscorum and A. bivalvium. Strain WB4.1-19 T GenBank accesion nº. FJ976900 FJ976899 X60412 AY532690 DQ504429 258 A A/G G A N 456 T T T T A 459 G G G A C 460 C C C T T 462 G G G C G 469 T T/C T C T 470 C C C G C Position* 471 T T T T C 472 T T T A A 476 A A G A T 677 C C T C C 1011 1018 1355 T/C C C T T A/G G A A A G G/A A G A 1357 C C/T T C T WB4.4-101 A. sobria CECT 4245T A. molluscorum CECT 5864T A. bivalvium CECT 7113T *Following the Escherichia coli nomenclature (Brosius et al.,1978). Supplementary Table S2. DNA-DNA relatedness (%) between strain WB4.1-19T and WB4.4-101, A. molluscorum, A. bivalvium and A. sobria type strains. Results are percentages and are expressed as the mean ± standard deviation of three duplicate determinations. Strains WB4.4-101 A. molluscorum CECT5864T A. bivalvium CECT7113T A. sobria CECT4245T % DNA-DNA relatedness with A. rivuli (WB4.1-19T) 89.3±6.5 59.6±6.5 50.0±3.0 52.5±2.51 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN REFERENCES Abbott, S. L., Cheung, W. K. & Janda, J. M. (2003). The genus Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification schemes. J Clin Microbiol 41, 23482357. Alperi, A., Figueras, M. J., Inza, I. & Martínez-Murcia, A. J. (2008). Analysis of 16S rRNA gene mutations in a subset of Aeromonas strains and their impact in species delineation. Int Microbiol 11, 185-194. Alperi, A., Martínez-Murcia, A. J., Monera, A., Maria J. Saavedra & Figueras, M. J. (2009a). Aeromonas fluvialis sp. nov., isolated from Spanish river. Int J Syst Evol Microbiol (In press). Beaz-Hidalgo, R., Alperi, A., Figueras, M. J. & Romalde, J. 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UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.2. Epidemiología del género Aeromonas Artículo: 4.2.1. MJ Figueras, A Alperi, MJ Saavedra, WC Ko, N Gonzalo, M Navarro, AJ MartínezMurcia. Clinical relevance of the recently described Aeromonas aquariorum. Journal of Clinical Microbiology. En revisión. Resumen Ciento cincuenta cepas de origen extraintestinal aisladas en el Hospital Universitario Nacional Cheng Kung de Tainan (Taiwán) se recibieron en nuestro laboratorio para su identificación genética. Sorprendentemente, 22 cepas (el 50% de ellas aisladas de sangre) resultaron pertenecer a la especie Aeromonas aquariorum de la cual también habíamos reconocido 3 cepas de pacientes con diarrea aisladas en el Hospital Comarcal Vega Baja de Orihuela. Esta es una especie de reciente descripción definida a partir de cepas aisladas de peces ornamentales y agua de acuario y por tanto se desconocía en el ámbito clínico. Con el ánimo de alertar a los clínicos de la posible importancia de esta nueva especie, realizamos un estudio para caracterizar el potencial virulento y la resistencia a los agentes antimicrobianos de estas 25 cepas de A. aquariorum, además de proporcionarles las herramientas necesarias para diferenciar esta especie del resto de especies con importancia clínica. Todas las cepas mostraron ser resistentes a la amoxicilina, cefalotina y cefoxitina, siendo el 96% resistente a la eritromicina mientras que el 4% lo fueron frente al cloranfenicol e imipenem. Todas las cepas poseían los genes para la aerolisina/hemolisina y las de origen intestinal poseían además los genes act y ast, cuyas toxinas generan un efecto sinérgico en la severidad de la diarrea (Khün y cols., 1997), así como los genes del Sistema de Secreción tipo 3 (T3SS o TTSS) y de la proteína efectora AexT. Los genes del T3SS también se detectaron en más de la mitad de las cepas procedentes de sangre y heridas. Aunque A. aquariorum se ha confundido bioquímicamente con A. hydrophila, se diferencia de ésta por la incapacidad de utilizar el L-lactato. A pesar de la similitud entre A. caviae y A. aquariorum en sus secuencias del gen ARNr 16S, ambas especies se pueden diferenciar por su capacidad de producir gas de la glucosa, H2S de la cisteína y ácido de la salicina, entre otros. 181 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Clinical relevance of the recently described Aeromonas aquariorum Mª José Figueras1, Anabel Alperi1, Mª José Saavedra2, Wen-Chien Ko3, Nieves Gonzalo4, Maria Navarro4 and Antonio J. Martínez- Murcia5 Unidad de Microbiología. Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud. Universitat Rovira i Virgili, Sant Llorenç 21, 43201, Reus. Spain. 2Department of Veterinary Sciences, CECAV-University of Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. 3National Cheng Kung University Hospital, Tainan, Taiwan. 4Servicio de Microbiología, Hospital Comarcal Vega Baja, Orihuela, Alicante, Spain. 5Molecular Diagnostics Center (MDC), Biomolecular Technologies S.L., and Universidad Miguel Hernández, Orihuela, Alicante, Spain. 1 Twenty-two human extraintestinal (11 from blood) strains of Aeromonas aquariorum, a species known only from ornamental fish, and three isolates recovered from patients with diarrhoea had been genetically characterized. The strains showed to bear an important number of virulence genes and to be all resistant to amoxicillin, cephalotin, cefoxitin. Members of the genus Aeromonas are responsible for producing intestinal and extra intestinal infections worldwide (1, 11). The most common Aeromonas clinical presentation is diarrhoea followed by bacteraemia and localised soft-tissue infections. Bacteraemia mainly occurs in patients with underlying diseases i.e. hepatobiliary disorders, cancer and diabetes. In patients with hepatobiliary and pancreatic disease, and especially in those with cirrhosis, they can produce cholangitis, spontaneous peritonitis, empyema, osteomelitis and necrotizing fasciitis (1, 11), the latter presentation can be fatal, despite surgical intervention and antibiotic therapy. Pathogenicity of Aeromonas has been associated to numerous virulence factors including the aerolysin/hemolysin group of genes, the cytotonic enterotoxins Ast and Alt (4, 9, 24), the cytotoxin encoded by the act gene (32), and a type III secretion system (TTSS) (8, 30). The TTSS is virulence mechanism that directly delivers toxins (AexT among others) into the host cell inducing apoptosis (8, 30, 31). Furthermore a correlation has been found between the presence of both TTSS and act genes and lactone production associated with quorum sensing (25). The most recent update included 16 species in the genus (23), but since then it had been enlarged with the addition of Aeromonas bivalvium (21), and very recently with Aeromonas tecta (10) and Aeromonas aquariorum, the latter isolated from water and skin of ornamental fish (19). Furthermore it has been recognized that A. hydrophila subsp dakhensis, defined from 10 haemolytic and cytotoxic strains isolated from children with diarrhoea in Bangladesh (16) and A. aquariorum should be considered synonyms (18). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN The most prevailing species associated with human infections when using extended biochemical protocols or molecular identification methods are A. veronii, A. caviae and A. hydrophila. Despite that, the later is the most referred species at the clinical literature being this an erroneous by product of the imprecision of biochemical identification methods (11, 17, 27). Among a set of extraintestinal strains received from Taiwan for genetic identification in our laboratory, we have recognized that 22 belonged to A. aquariorum, as did 3 clinical strains isolated from patients with diarrhoea in Spain. Described here is the molecular characterization, antibiotic susceptibility and the virulence potential of those strains providing tools for clinicians to differentiate A. aquariorum from other commonly encountered clinical species. Strains and molecular identification. A total of 150 biochemically identified extraintestinal clinical isolates were received in our laboratory from Dr. Wen-Chien Ko from the Cheng Kung University Hospital in Tainan, Taiwan, for genetic identification using a previously described 16S rDNA-RFLP method (6, 12). In brief the method consists of an initial digestion of 1503 bp of the amplified 16S rRNA gene with enzymes AluI and MboI, that enables recognition based on the different obtained patterns of 10 Aeromonas species including A. hydrophila, A. caviae, and A. veronii. Of the Taiwan strains, 22 (14.6%) showed a similar RFLP pattern (with some extra bands) to that described for A. caviae (Fig. 1), 19 of them arrived identified as A. hydrophila and 3 as Aeromonas sp based on biochemical methods. To confirm the identity of all these strains the rpoD and gyrB genes were sequenced using primers and conditions previously described (28, 33). The 3 Spanish strains (MDC562, MDC573, and MDC671) were isolated in the Hospital Comarcal Vega Baja, (Orihuela, Spain) and were recognized with gyrB gene to belong to A. aquariorum, and the rpoD of these strains was also sequenced. The phylogenetic tree constructed with the individual genes (data not shown) or the concatenated rpoD and gyrB sequences grouped these 25 strains with the newly described species A. aquariorum (Fig 2). Antimicrobial susceptibility. The susceptibility of the twenty-five strains against a panel of 27 antimicrobial agents was evaluated using agents and conditions described earlier (19). All the strains were susceptible to aztreonam, ciprofloxacin, amikacin, gentamicin, tobramycin, fosfomycin and cefepime, but showed varying resistance to 20 other antimicrobial agents (Table 1). All the isolates were resistant to amoxicillin, cephalotin, cefoxitin and all but one strain, isolated from an infected wound, to erythromycin, 68% of the isolates were resistant to amoxicillin clavulanic acid (AMC), 48% to ticarcillin and 28% to tetracycline. These responses were similar to those obtained for the environmental strain of this species (19) with the exception of the 100% resistance to AMC that contrasted with 32% encountered in the environmental strains. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Detection of virulence genes. The strains were also screened for the presence of several virulence genes (aerolysin/hemolysin, ast, alt, act, TTSS and aexT), using primers and conditions described earlier (2,7,8,13). The genes that encode the pore forming toxin aerolysin/hemolysin were present in all the strains (Table 2). The two cytotoxic enterotoxin genes, the heat-stable ast and the heat-labile alt, were present in 84% and 28% of the strains respectively, the prevalence of ast being much higher that found in previous studies (2). Interestingly all 3 strains isolated from faeces of patients with diarrhoea and an important number of the strains from wounds (66.6%) and blood strains (63.3%) possessed the ascF-G genes which are part of the TTSS of Aeromonas. The aexT gene which encodes one of the better characterized toxin secreted by this system (30) was present in all stool strains and in ca. 30% of the blood and wound strains (Table 2). Interestingly, 8 of the strains simultaneously possessed the act and the TTSS genes, reflecting the probable synergistic role of those genes in quorum sensing, demonstrated by Sha et al. (25). Differentiation of A. aquariorum from other species. A re-examination of the16S rDNARFLP patterns of the Taiwan A. aquariorum strains and the evaluation of the method on the type strain of this species (MSM18362T) and on strains previously considered A. hydrophila subsp. dakhensis (LMG19559, LMG15962 and LMG19564 (now synonymized with A. aquariorum (18)), showed that all these strains produced either the pattern of A. caviae or an slightly similar pattern with an extra band (Fig. 1). This result lead us to suspect the possibility that some other clinical strains identified by the 16S rDNA-RFLP method at our laboratory as A. caviae could in reality belong to A. aquariorum. To evaluate this we screened 65 strains of our collection that showed the A. caviae RFLP pattern (originally biochemically identified as A. hydrophila at different Spanish hospitals), for the production of acid from D-cellobiose (positive (>85%) for A. caviae, negative (<15%) for A. aquariorum (19)). Only 6 of those strains, recovered from faeces of patients with diarrhoea, were presumptively A. aquariorum based on their negative production of acid from D- cellobiose. However, the rpoD gene sequences of these strains (data not shown) confirmed only 2 strains (33%) as belonging to A. aquariorum while the remaining 3 belonged to A. caviae. These results confirmed that some A. caviae strains did not produce acid from D-cellobiose (1) and furthermore that A. aquariorum is in fact more frequent than previously thought because it that can be uncovered under biochemically characterised strains of A. hydrophila, or under genetically identified A. caviae strains using the 16S rDNA-RFLP method. Biochemical differentiation of A. aquariorum from A. caviae can be further confirmed by its positive production of: gas from D-glucose, H2S from cysteine and acid from salicin, while differentiation from A. hydrophila can be achieved by the lack of utilization of L-lactate by the new species (19). Strains with such characteristics should be suspected to belong to these new species A. aquariorum. The sequences of 16S rRNA gene was considered a reliable and straight forward tool for the characterization of Aeromonas spp. (11) and had increasingly been used in the medical literature for UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN characterizing clinical Aeromonas strains (3, 14, 22, 29). However, the high similarity between the sequences of different species together with the intragenomic heterogeneity reported for this gene (20) that can account for 8% of the strains and the fact that it is more prevalent in clinical strains of A. caviae and A. veronii (5) makes this gene unreliable for identification below the genus level. In fact, there are only 3 base differences between the 16S rDNA sequence of A. aquariorum and A. caviae type strains (19) and in these three positions the existence of heterogeneities in A. caviae strains have been described (5). This limitation had been superseded by the use of housekeeping genes, such as rpoD and gyrB (3, 19, 20, 28, 33) employed in this study. Epidemiological related strains. Three A. aquariorum strains (A2-126, A2-131 and A2-96) showed identical gyrB and rpoD sequences (Fig. 2), indicating that they could be derived from the same clone. Genotyping with ERIC-PCR using primers and conditions described previously (26) showed an identical ERIC pattern (data not shown) confirming that they belonged to the same genotype. Furthermore, these strains bear the same virulence genes and showed resistance to amoxicillin, amoxicillin clavulanic acid, cephalotin, cefoxitin, erythromycin and tetracycline. A retrospective search on the origin of those strains was performed. Two of the three strains (A2-126 and A2-131) were isolated from a 69-year-old patient with acute cholangitis one strain from a bile sample obtained from endoscopic nasobiliary drainage and the other from a surgical wound of the abdominal wall after a cholecystectomy was performed 14 days later. The third strain (A2-96) was isolated from an ascites culture 7 months earlier from a 70-year-old patient that presented acute appendicitis complicated with peritonitis. This suggests a probable common source of infection, but the epidemiological relationship of the patients could not be established. Cholangitis is the most common Aeromonas infection of the hepatobiliary systems with an incidence of isolation from bile samples ranging from 1.3 to 2.9% (11). Cases of secondary Aeromonas peritonitis due to appendix perforation have also been described (11, 15). Conclusions. This could be considered the first formal description of the implication of the new species A. aquariorum in clinical cases. However, we have to take into account that since A. hydrophila subsp. dhakensis (now a synonym of A. aquariorum (18)) was isolated from patients with diarrhoea in Bangladesh (16) this was in reality the first record. The present study shows that the clinical strains of A. aquariorum possess many virulence genes that can potentially play an important role in the development of the infection. Clinicians should be aware of this new relevant Aeromonas species, which can be associated with diarrhoea, bacteraemia (11 of the 22 strains from Taiwan) and with several extraintestinal infections, as can be seen from the diversity of clinical samples in which it was recovered (Table 1). The original description of A. hydrophila subsp. dhakensis (16) and A. aquariorum (19), together with the present results from Taiwan, linked this species to Oriental countries. However, the clinical diarrhoeal isolates from different Spanish hospitals provides UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN evidences that the new species A. aquariorum could be distributed globally, probably unrecognized under A. hydrophila or A. caviae. MDC work has been supported by Grant IMIDTA/2007/68 from IMPIVA, Generalitat Valenciana, Spain. M.J. Saavedra was the recipient of a grant (SFRH/BSAB/774/2008) from the Fundação para a Ciênciae Tecnologia. Part of this work was also supported by funds from the European Commission for the HEALTHY WATER Project (FOOD-CT-2006-036306). However, the authors are solely responsible for the content of this publication and it does not represent the opinion of the European Commission. The European Commission is not responsible for any use that might be made of data appearing therein. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Fig 1. Polyacrylamide gel showing the same RFLP patterns, obtained by using endonucleases AluI and MboI, of 16S rRNA genes amplified by PCR of a representative number of A. aquariorm, A. hydrophila subsp dhakensis and A. caviae. Lanes: 1 and 11, pBR322 DNA/BsuRI (HaeIII) Marker 5 ; 2, A. hydrophila subsp. dhakensis LMG19559; 3,A. hydrophila subsp. dhakensis LMG 19562; 4, A. hydrophila subsp. dhakensis LMG19564; 5, A. caviae CECT838T; 6, A.aquariorum MDC562; 7, A. aquariorum MDC573; 8, A. aquariorum MDC671; 9, A. aquariorum A2-4; 10, A. aquariorum A2-96. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas MDC573 MDC671 MDC562 A2-126 7 A2-096 100 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 99 98 30 A2-131 0 A2-112 A. aquariorum DSM18362T 22 2 75 A2-061 A2-013 A2-086 99 A2-056 A2-094 A2-04 A2-157 2 A. aquariorum 81 21 25 13 23 A2-053 A2-140 A2-107 79 40 100 3 A2-040 A2-042 A2-098 7 99 A2-058 A2-114 100 63 86 A2-155 A2-159 A2-070 A. hydrophila CECT839T 39 100 48 46 100 31 100 A. hydrophila subsp. ranaei A. hydrophila 140P A. caviae CECT838T A. caviae CECT4221 A. trota CECT4255T A. trota CECT4935 A. jandaei CECT4228T 100 A. jandei 344 100 A. eucrenophila CECT4224 T 68 84 A. eucrenophila CECT4827 A. tecta Aeromonas sp. HG11 CECT4253 A. encheleia CECT4342T A. encheleia CECT4341 A. media CECT4232T 100 59 100 78 10 A. media 480 A. bivalvium CECT 7113T A. molluscorum CECT5864T 99 99 A. veronii CECT4257T A. veronii CECT 4246 A. allosaccharophila CECT4199 T 100 33 95 99 A. allosaccharophila CECT4220 A. sobria CECT4245T 100 70 A. sobria 350 A. salmonicida subsp. masoucida A. salmonicida CECT894T A. salmonicida subsp. pectinolytica A. popoffii CECT5176T A. popoffii LMG 17545 29 100 100 A. salmonicida subsp. achromogenes 100 100 100 100 A. bestiarum CECT4227T A. bestiarum LMG13448 A. simiae IBS-S6874T 100 100 A. schubertii CECT 4240 Aeromonas sp. G501 CECT4254 0.02 Fig 2. Phylogenetic tree based on the combined stretch of gyrB (450bp)-rpoD (790bp) gene sequences showing the relationship within the genus Aeromonas of 25 clinical A. aquariorum strains. Type strains are in bold. Numbers at nodes indicate bootstrap values (1000 replicates). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Table 1. Antibimicrobial resistance found in 25 clinical Aeromonas aquariorum strains Antimicrobial agent Amoxicillin Cephalothin Cefoxitin Erythromycin Amixicillin/clavulanic acid Ticarcillin Tetracycline Ticarcillin/clavulanic acid Nalidixic acid Steptomycin Piperacillin Piperacillin/Tazobactam Ceftriaxone Cefoperazone Ceftazidime Cefotaxime Kanamycin Trimethoprim/sulfamethozazole Chloramphenicol Imipenem % R strains 100 100 100 96 68 48 28 20 16 12 12 12 12 12 8 8 8 4 4 4 Table 2. Distribution of virulence genes among 25 clinical strains of Aeromonas aquariorum Nº of strains with presence of (%) Origin Blood Wound Feces Bilis Joint fluid Sputum Ascitis Nº of strains 11 6 3 2 1 1 1 aer/hemoa 11 (100) 6 (100) 3 (100) 2(100) 1 (100) 1(100) 1 (100) actb 4 (36,6) 4 (66.6) 0 1 (50,0) 1 (100) 0 1 (100) altc 3 (27,2) 1 (16.6) 3 (100) 0 0 0 0 astc 8 (72,7) 5 (83.3) 3 (100) 2 (100) 1 (100) 1 (100) 1 (100) aexTd 4 (36,3) 2 (33,3) 3 (100) 0 0 0 0 ascF-Gd 7 (63,6) 4 (66.6) 3 (100) 0 1 (100) 0 1 (100) 16 (64) Total 25 25 (100) 11 (44) 7 (28) 21 (84) 9 (36) Primers and conditions were those described by aChacón et al.(7); bFigueras et al. (13) ; cAguilera-Arreola et al.(2); dChacón et al. (8). UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN REFERENCES 1. Abbott, S. L., W. K. Cheung, and J. M. Janda. 2003. 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Microbiol. 53:875-883. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Artículo: 4.2.3. A Alperi, MJ Figueras. Human isolates of Aeromonas possess Shiga toxin genes (stx1 and stx2) highly similar to the most virulent gene variants of E. coli. Clinical Microbiology and Infection. En revisión. Resumen Las cepas productoras de las toxinas Shiga (codificadas por los genes stx1 y stx2) pueden causar diarrea, colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico (SUH) y pertenecen principalmente a E. coli productoras de toxinas Shiga (STEC). Generalmente, estas toxinas se encuentran codificadas en bacteriófagos y sujetos, por tanto, a la transmisión horizontal. Las Aeromonas son agentes causales de diarreas y del SUH. Dos estudios previos habían demostrado la existencia del gen stx1 en Aeromonas y uno de ellos demostró, además, la producción de Stx1. Sin embargo, hasta la fecha, nunca se ha podido detectar la presencia del gen stx2 en este género. Con el ánimo de esclarecer la incidencia de estos genes en Aeromonas se investigó por PCR la presencia de los genes stx1 y stx2 en 80 cepas clínicas. Nuestros resultados mostraron la presencia de stx1 en 19 cepas, presentando sólo una ellas, además, el gen de la toxina Shiga tipo 2 (stx2). Las secuencias obtenidas, de los fragmentos amplificados de estos genes, mostraron una gran similitud con las secuencias de las variantes más virulentas para humanos de STEC. 199 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Human isolates of Aeromonas possess Shiga toxin genes (stx1 and stx2) highly similar to the most virulent gene variants of E. coli Anabel Alperi and Maria José Figueras* Unitat de Microbiologia. Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut. IISPV. Universitat Rovira i Virgili, Reus, Spain. Corresponding author and reprint request: M. J. Figueras, Unitat de Microbiologia. Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, Universitat Rovira i Virgili, Sant Llorenç 21; 43201 Reus, Spain. Phone: +34977759321. Fax: +34977759322. E-mail: mariajose.figueras@urv.cat Abstract Strains producing Shiga toxins, encoded by stx1 and stx2 genes, can cause diarrhoea, haemorrhagic colitis and haemolytic uremic syndrome (HUS). After screening both genes by PCR, 19 of the 80 clinical Aeromonas strains were stx1-positive and only one was positive for both stx1 and stx2. PCR bands could be very faint and negative results were obtained after subculturing. Aeromonas stx1 and stx2 sequences were highly similar to those of the most virulent stx gene variants of Shiga toxinproducing E. coli. These results may lead to a better understanding of the pathogenicity potential and virulence mechanisms of Aeromonas in cases of diarrhoea and HUS. Keywords: Aeromonas, stx1, stx2, HUS, diarrhoea UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Shiga toxins (Stx1 and Stx2) are important virulence factors in the pathogenesis of gastroenteritis, in hemorrhagic colitis and especially in the development of haemolytic-uremic syndrome (HUS) [1-3]. They are usually encoded in the genome of bacteriophages, which are considered highly mobile elements that play a role in Stx expression and in horizontal gene transfer, leading to the emergence of new stxvariants or stx-producing pathogens [4]. Several variants of stx1 and stx2 genes have been recognized [2, 3], stx2 (the prototype) and stx2c being considered the most important in terms of human pathogenicity because are commonly associated with HUS [2, 3]. Despite Shiga toxins being typical of Shigella dysenteriae and Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), they have also been described in Vibrio cholerae and V. parahaemolyticus [5], Citrobacter freundii [6], Enterobacter cloacae [7], Acinetobacter haemolyticus [8] and Aeromonas [9, 10]. The stx genes show instability in vivo and in vitro [1, 6, 7, 11], which may be caused by the mobility of stxphages [4, 11] and the loss of stx genes has been observed after subculturing [4, 6, 7, 11] and infection [1]. The presence of stx1 in Aeromonas was detected by Haque et al. [9] in only four strains and more recently by Snowden et al. [10] in one additional strain using different primers, while stx2 has never been detected, despite having been screened in both studies [9, 10]. So far in Aeromonas the stx1 has never been sequenced and it is not known if they have the stx2. Despite that, several cases of HUS associated with Aeromonas have been reported and a new case produced by a verotoxigenic strain of A. veronii bv sobria with a review of the literature has recently been published by our group [12]. In an attempt to characterize the stx genes (stx1 and stx2) by sequencing, 80 human Aeromonas strains of different species, including the strain associated with HUS [12] were screened by PCR in the present study. The investigated strains (33 from extra intestinal infections and 47 from diarrhoea) were genetically identified [13]. The strain of A. veronii bv sobria associated with a case of HUS [12] was also tested. Frozen stocks of the strains were streaked onto sheep blood agar and cultivated for 24 h at 30ºC and DNA was extracted from single colonies using InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad Laboratories). PCR primers and conditions for the detection of stx1 (350 bp) and stx2 (406 bp) were those of TaKaRa Biomedicals [9]. The stx1 and stx2 genes were sequenced with the TaKaRa primers (3.2 pmol/µl) using instruments and phylogenetic analysis techniques described previously [13]. Nineteen of the 80 Aeromonas strains produced a band of the expected size (350 bp) for the stx1 and one of them also the band (406 bp) of stx2 (Fig 1a). However, in 15 of the 19 strains the stx1 bands were faint as was also the stx2 band. The strain of A. veronii bv sobria associated with a case of HUS [12] did not even show faint bands. In order to verify the results, the same DNA of the 19 stx1-positive strains was evaluated again under identical conditions and only 4 (875c, 883c, 885c and 887c) strains were positive for the stx1. Negative results corresponded with strains showing faint bands in the first analysis. The 19 Aeromonas strains were grown again from the glycerol stock and stx1 was amplified from a new UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN DNA extraction. Results reproduced the initial finding with the appearance of the same 15 strains with faint stx1 bands and four with intense bands. The PCR for the stx2-positive strain (819c) was performed 5 times from 4 different DNA extractions from the same frozen stock and the expected band (406 bp) was only observed on 2 of the 5 (40%) occasions as a faint band (Fig 1b). The faint bands observed can be explained by the number of copies of stx genes in the template DNA, as described for stx2 in C. freundii [6]. Furthermore, the loss of the faint bands after subculturing is in agreement with previous findings [4, 6, 7, 11]. This could justify the non-detection of these genes in previous studies [9, 10] and explain the lack of amplification in the A. veronii bv sobria associated in a case of HUS [12] that we tested. Loss of stx genes during the course of infection has been observed in patients with HUS produced by E. coli O157:H7 [1]. In a previous study, Snowden et al. [10] detected stx1 in only 1 environmental strain of A. veronii using the primers developed by Pass et al. [14]. We evaluated these primers in the 19 stx1-positive strains, however, in none of these strains could the expected 121 bp of stx1 be amplified and this should be taken into consideration in future studies. The 23.75% (19 of 80) stx1-positive Aeromonas strains found in this study is higher than the 10.25% (4 of 39) observed by Haque et al. [9] in strains isolated from faeces and from wastewater [9]. It is also higher than the 9.1% (1 of 11) found by Snowden et al. [10] when investigating strains recovered from river water in Australia [10]. The strains that were stx1-positive in the present study belonged predominantly to A. caviae (42.1%), A. hydrophila (31.6%) and A. veronii (10.5%). All of them have been commonly associated with gastroenteritis and even with dysenteric-like syndrome and HUS [12, 16, 17]. The only stx1-stx2-positive strain (819c) belonged to A. caviae and was isolated from a urine sample. The sequences of stx1 from 4 strains with intense bands and the sequence of stx2 of strain 819c were highly similar to those found in other enterobacterias as can be observed in the constructed evolutionary trees (Fig 2a, b). Aeromonas stx1 sequences branched within the cluster that contained stx1 sequences from S. dysenteriae, S. sonnei, E. coli O157:H7 and other STEC human isolates (Fig 2a). The stx2 sequence from A. caviae (819c) cluster (Fig 2a) with the sequences of the most virulent human variants (stx2 prototype and stx2c) commonly associated with HUS [2, 3] suggesting an equal potential role of both genes in Aeromonas. This could further indicate that horizontal gene transfer [4] may have occurred among those microorganisms, which is not surprising if we consider that they may coexist in the same environments (gut, faeces or faecally contaminated water and food products). In order to find out if stx1 instability detection could be due to its plasmid location, plasmid DNA of strains 535c representative of strains with a faint band, and 887c, with a strong band was extracted using UltraClean 6 Minute Mini Plasmid Prep Kit (Mo Bio). A single band of plasmid DNA of c.a. 3.2 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN kbp could be observed in the agarose gel from both strains. This DNA was used as a template for stx1-PCR amplification [9] and a band of the stx1 expected size (350 bp) as intense as the positive control (E. coli O157:H7) was only observed from strain 535c (Fig 1c). This indicates that at least in strain 535c and in the four strains reported by Haque et al. [9], the stx1 is not chromosomally encoded. The results of the present study corroborate the mobility of the stx-phages that can be lost by subculturing [4]. To determine the production of Stx1 and Stx2 toxins by the PCR positive strains, a rapid immunochromatographic test (Duopath Verotoxin test, Merck) was used. Only strains 885c (that showed an intense stx1 band by PCR) and 535c (plasmid encoded-stx1 and faint band by PCR) showed a weak Stx1 signal but none of the strains showed a Stx2 positive reaction. In conclusion, 10.25% (2/19) of the Aeromonas strains that possessed stx1 produced the Stx1 toxin. Similar values (using the Duopath Verotoxin test) have been reported from STEC strains from human wastewater where 6.7% produced Stx1 and 6-7% produced Stx2 [15]. However, our results could be influenced by the fact that this test is designed for the detection of these toxins by STEC. Despite not being able to detect Stx2 production, it is clear that stx2 may have been expressed in Aeromonas due to the number cases of HUS in which this organism was identified as the causative agent [12 and references therein]. To our knowledge, this is the first report that provides Aeromonas stx1 and stx2 sequences and establishes their high similarity with those of STEC. This is of particular importance because these genes had been poorly studied in Aeromonas and may have an important role in inducing diarrhoea and HUS. More studies will be needed to determine the allocation of stx2 gene and to improve the molecular detection methods. Acknowledgments We thank Drs. R Bartolomé, G Prats, J Vila, I Pujol, F Ballester, J Reina and E Hofer for providing clinical strains. We are grateful to Dra. Maite Muniesa, University of Barcelona, and to Dr. Javier Pastor, University Rovira i Virgili, for their valuable suggestions. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN M 1 2 3 4 C 5 6 7 8 C M (a) M 1 2 3 C- M M 1 C+ C- (b) (c) Fig. 1. Examples of PCR amplifications demonstrating the presence of stx genes in Aeromonas strains. PCR results electrophoresed in 1% agarose gel. (a) stx1 strong and faint bands. Lanes: 1, 875c; 2, 883c; 3, 885c; 4 , 887c; 5, 194c; 6, 361c; 7, 191c; 8, 24c. (b) stx2 faint bands. Lanes: 1, 875c; 2, 819c; 3, 819c; (duplicate PCR product). (c) stx1 amplified from plasmid DNA. Lane: 1, 535c. Lane C+, positive control E. coli O157:H (CECT 4076). Lane C-, negative control (miliQ water as template DNA). Lane M, Ladder 100 bp. A. caviae strains: 535c, 819c, 875c, 883c and 885c; A. hydrophila strains: 24c, 191c, 194c and 887c; A. salmonicida strain 361c. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fig. 2. Phylogenetic analysis of nucleotide sequences of the 350-bp fragments of stx1 genes (a) and 406-bp fragments of stx2 genes (b) of Aeromonas and other enterobacteria. Phylogenetic trees were constructed with the neighbourjoining method using Kimura´s two-parameter model. Numbers at nodes indicate bootstrap values (percentage of 1000 replicates). The scale bar indicates the estimated number of substitutions per 100 and 20 bases, respectively. All numbers and accession numbers are given as cited in the GenBank database. UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN REFERENCES 1. Friedrich AW, Zhang WL, Bielaszewska M et al. Prevalence, virulence profiles and clinical significance of Shiga toxin-negative variants of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 infection in humans. Clin Infect Dis 2007; 45: 39-45. 2. Lee JE, Reed J, Shields MS, Spiegel KM, Farrell LD, Sheridan PP. Phylogenetic analysis of Shiga toxin 1 and Shiga toxin 2 genes associated with disease outbreaks. BMC Microbiol 2007; 7: 109. 3. Orth D, Grif K, Khan AB, Naim A, Dierich MP, Wurzner R. 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UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Epidemiología del género Aeromonas RESULTADOS Y DISCUSIÓN Artículo: 4.2.4. D Tena, C Aspíroz, MJ Figueras, A González-Praetorius, MJ Aldea, A Alperi, J Bisquert. Surgical site infection due to Aeromonas species: Report of nine cases and literature review. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 2009. 41: 164-170. Resumen Las infecciones de heridas son las infecciones más comúnmente asociadas a Aeromonas después de la gastroenteritis. Las infecciones de herida quirúrgica (Surgical Site Infection, SSI) debidas a estos microorganismos no son muy frecuentes y por tanto son poco conocidas. Se han estudiado las características clínicas y microbiológicas de 9 casos aparecidos en 2 hospitales españoles así como de 15 casos, publicados anteriormente, asociados a Aeromonas. Todos los pacientes, incluidos nuestros casos, tenían enfermedades gastrointestinales o del tracto hepatobiliar. Veintiuno de los pacientes desarrollaron SSI tras una cirugía abdominal o de la región pélvica. El tiempo medio transcurrido desde la cirugía y el inicio de la infección fue de 2 días en nuestros 9 pacientes. La infección fue polimicrobiana en 17 pacientes y en 19 de ellos nosocomial. La identificación bioquímica mostró que en 18 casos estaba implicada A. hydrophila, frente a 4 casos en los que se aisló A. veronii bv sobria. Sin embargo, de cinco cepas que se identificaron bioquímicamente, 4 A. hydrophila y 1 A. veronii, se confirmaron por RFLP del ADNr 16S 3 cepas de A. hydrophila y 1 de A. veronii mientras que la cuarta A. hydrophila pertenecía también a A. veronii. Todas ellas portaban genes para la serina proteasa, implicada en la activación de la aerolisina, y para la DNasa; 4 de ellas poseían el gen de la enterotoxina citotóxica termoestable Ast y 3 el gen para la enterotoxina citónica Act, las mismas que portaban el gen de la aerolisina/hemolisina. Tras el tratamiento antimicrobiano la mayoría de los casos tuvieron una buena evolución clínica. En dos pacientes la infección remitió realizándose, únicamente, un drenaje quirúrgico. En conclusión, las infecciones de herida quirúrgica asociadas a Aeromonas tienen un desarrollo más rápido que las asociadas con otros microorganismos y seguramente tienen un origen endógeno tras la cirugía abdominal o pélvica, siendo el tratamiento con antibióticos eficaz en la mayoría de los casos. 208 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL El Comité Internacional para la Sistemática de Procariotas (ICSP) recomienda que la descripción de una nueva especie bacteriana esté basada en más de un aislado y que se realice un tipado molecular de los mismos (Stackebrandt y cols., 2002). Sin embargo, esta última recomendación no se ha tenido siempre en cuenta en la descripción de nuevas especies de Aeromonas, como es el caso de A. culicicola, definida en base a 3 aislados (Pidiyar y cols., 2002) y A. simiae, definida en base a 2 aislados (Harf-Monteil y cols., 2004). En un estudio realizado en nuestro laboratorio se observó que 2 de los 3 aislados de A. culicicola parecían ser idénticos (Figueras y cols., 2005). Esta observación nos motivó a iniciar un estudio de tipado molecular, en el cual se investigaron todos los aislados incluidos en las descripciones de las últimas 3 especies definidas en el género en aquella fecha, A. culicicola (Pidiyar y cols., 2002), A. simiae (Harf-Monteil y cols., 2004) y A. molluscorum (Miñana-Galbis y cols., 2004) utilizando 3 métodos distintos, i.e. ERIC-PCR, RAPD y PFGE (estudio 4.1.1). Los resultados obtenidos demostraron que 2 de los 3 aislados de A. culicicola y los 2 de A. simiae, para los que no se habían realizado técnicas de genotipado en la descripción (Pidiyar y cols., 2002; HarfMonteil y cols., 2004), eran idénticos. Sin embargo, los tres métodos mostraron que los 5 aislados incluidos en la descripción de A. molluscorum pertenecían a cepas distintas, corroborando así los resultados incluidos en la descripción de la especie en base a la técnica de AFLP (Miñana-Galbis y cols., 2004). En conclusión este estudio 4.1.1 proponía que el tipado molecular de los aislados fuera obligatorio y no una recomendación, en la definición de nuevas especies para así evitar incluir duplicados tal y como se ha demostrado (Figueras y cols., 2006). Desde el año 2004 y hasta la fecha se han descrito 3 nuevas especies en el género, A. bivalvium con 2 cepas (Miñana-Galbis y cols., 2007), A. tecta con 5 cepas (Demarta y cols., 2008) y A. aquariorum con 19 cepas (Martínez-Murcia y cols., 2008). En la descripción de A. bivalviun se incluyó un análisis de AFLP (Miñana-Galbis y cols., 2007) mientras que en las 2 descripciones más recientes se ha realizado un análisis de genes housekeeping (Demarta y cols., 2008; Martínez-Murcia y cols., 2008), tal como recomienda también el ICSP. En la descripción de A. tecta, las 5 cepas mostraron idénticas secuencias del gen ARNr 16S, dos de ellas (MDC94 y MDC95) tenían también idénticas secuencias del gen gyrB, mientras que en el gen rpoD era distintas aunque sólo en unos pocos pares de bases. En estudios previos se había demostrado, con FAFLP y ribotipado, que las 5 cepas eran diferentes (Demarta y cols., 2008). En el caso de A. aquariorum las 13 cepa analizadas en base al gen gyrB resultaron tener secuencias distintas al igual que ocurría con las 6 en las que también se secuenció el gen rpoD (Martínez-Murcia y cols., 2008). Esto demuestra que los genes rpoD y gyrB son muy útiles, además de en la taxonomía (Saavedra y cols., 2006), en el análisis de la diversidad genética intraespecie y para el reconocimiento de clones. Podríamos, por tanto, decir que en los casos en que las secuencias de los genes rpoD y gyrB sean idénticas, como ocurría con las cepas depositadas en la CECT de A. media (CECT4234 y CECT4232T), A. allosaccharophila (CECT4200 y CECT4199T), A. encheleia (CECT4341 y CECT4342T) y A. eucrenophila (CECT4827 y CECT4224T) 223 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL en el estudio realizado por Soler y cols. (2004), no es necesario incluir otro método de tipado, ya que esto indica que se trata de aislados idénticos. Sin embargo, si sólo algunas de las secuencias de estos genes son idénticas o se estudia un sólo gen housekeeping, es importante completar el estudio con las técnicas de tipado molecular mencionadas. Esto permitirá asimismo reconocer posibles errores de secuenciación, tal y como se ha descrito previamente (Soler y cols., 2004). La presencia de microheterogeneidades en el gen ARNr 16S, tal y como se comentó en la introducción, se había descrito en diversas especies del género Aeromonas pero aún no se había estudiado en profundidad su distribución, frecuencia ni su impacto en la taxonomía del género. La localización de estas microheterogeneidades en las dianas de las endonucleasas utilizadas con el método de identificación de RFLP del ADNr 16S (Figueras y cols., 2000a), generaba la aparición de patrones de RFLP atípicos que no permitían asignar el 8.1% de las cepas a una especie concreta (estudio 4.1.3). La secuenciación del gen ARNr 16S demostró que en la cepas estudiadas existían más posiciones variables (x 3.4) en las regiones del gen que no presentaban dianas para las endonucleasas utilizadas que en las regiones diana. En total se detectaron entre 1 (0.06%) y 10 (0.6%) posiciones variables por cepa, lo que concuerda con el rango descrito (entre 1 y 11 posiciones) en otras Gammaproteobacterias (Case y cols., 2007). Asimismo, en el análisis que realizamos de los estudios en los que se había reconocido la existencia de microheterogeneidades en las especies A. popoffii (Demarta y cols., 1999), A. molluscorum y A. bivalvium (Miñana-Galbis y cols., 2004, 2007), A. veronii y A. media (Morandi y cols., 2005), A. culicicola (Figueras y cols., 2005), A. bestiarum y A. salmonicida (Martínez-Murcia y cols., 2005) y A. allosaccharophila (Saavedra y cols., 2006), se constató que las microheterogeneidades involucraban entre 1 (0.06%) y 8 (0.52%) posiciones. Esto coincidía con los datos obtenidos en nuestro estudio pero contrastaban con el 1.4% y 1.5% descrito por Morandi y cols. (2005). La prevalencia de cepas de Aeromonas con microheterogeneidad (8.1%) contrasta con el 21% descrito por Morandi y cols. (2005) a partir de 82 aislados de Aeromonas. En su estudio Morandi y cols. (2005) utilizan también un método de RFLP aunque en este caso no se secuenciaron un número representativo de aislados para confirmar esta estimación. Además, en este estudio obtienen un 1.5% de posiciones variables (21 posiciones) en una cepa de A. veronii (LMG 13695), valor muy superior al obtenido en nuestro estudio (Alperi y cols., 2008). Morandi y cols. (2005) describieron que esta cepa presentaba microheterogeneidad en la en la RV2 (posiciones 154, 155, 156, 165, 166, 167), donde nunca antes se había descrito variabilidad en ninguna otra especie de Aeromonas. La secuenciación del ADNr 16S de esta cepa en nuestro laboratorio y en el MDC (Molecular Diagnostic Center), estudio 4.1.4, sólo confirmó una transición (A/G) en la posición 167 de la RV2. Asimismo, sólo en 8 de las 21 posiciones descritas por Morandi y cols. (2005) se constató la existencia de variabilidad, siendo este resultado más acorde con lo observado en otras especies de Aeromonas (Alperi y cols., 2008) y en otras Gammaproteobacterias (Case y cols., 2007). Las posiciones variables en el gen ARNr 16S de 224 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL Aeromonas observadas en nuestro estudio se localizaban principalmente en las regiones variables (RV) 3 y 6 (Alperi y cols., 2008), que son las regiones de mayor variabilidad interespecie (MartínezMurcia y cols., 1992a). También pusimos de manifiesto por primera vez la existencia de 2 posiciones en la RV6 (posiciones 1011 y 1018) que mostraban microheterogeneidad en todas las especies del género analizadas, con excepción de la cepa tipo de A. hydrophila [al consultar el genoma completo de esta especie (Seshadri y cols., 2006)], por lo que estas se pueden definir como posiciones hipervariables del gen ARNr 16S en el género Aeromonas. Con respecto al impacto de las microheterogeneidades en la taxonomía, vimos que el 70% de las 27 cepas estudiadas mostraban una localización ambigua en el árbol filogenético del gen ARNr 16S construido a partir de las secuencias (1503 pb) que mostraban en las posiciones polimórficas la base correspondiente al pico predominante en el cromatograma de secuenciación. Asimismo, el 74% de las cepas tenían una localización ambigua cuando el árbol era construido con las secuencias que representaban el polimorfismo con el código de la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). Este incremento de cepas con posiciones ambiguas que no permitían su identificación está relacionado con el hecho de que la información del código IUPAC no se valora en los alineamientos y reconstrucciones filogenéticos (Petterson y cols., 1998). Todas las cepas con polimorfismo en el gen ARNr 16S pudieron identificarse inequívocamente con el gen rpoD como pertenecientes a las especies A. caviae, A. veronii y A. media. Las especies A. caviae y A. media se diferencian en 3 nucleótidos en el gen ARNr 16S de las especies más cercanas filogenéticamente, A. trota y A. hydrophila (MartínezMurcia y cols., 1992), por lo que cualquier polimorfismo que afectara a estas posiciones tenía repercusión en la correcta separación de estas especies de sus vecinas. Lo mismo ocurría con 2 cepas de las 8 de A. veronii que mostraron polimorfismo, una de ellas en cada una de las 8 posiciones que diferencian A. veronii y A. jandaei y que se agrupaba en el árbol con A. jandaei, mientras que la otra cepa presentaba polimorfismo en 6 de estas posiciones y ocupaba una posición filogenética ambigua. El resto de cepas mostraban sólo 2 posiciones variables y se agrupaban en la rama de A. veronii en los 2 árboles. El polimorfismo en las 6 posiciones mencionadas se había descrito previamente en A. culicicola (Figueras y cols., 2005), pero no se había tenido cuenta en la descripción de esta especie publicada 3 años antes, en la que se indicaba que su gen ARNr 16S presentaba 5 bases de diferencia con el de A. veronii (Pidiyar y cols., 2002). La omisión de esta variabilidad junto con valores de DDH [método de Kaznowski (1995), a 78ºC] del 42% obtenidos con la cepa tipo de A. veronii condujeron a su errónea identificación como nueva especie (Pidiyar y cols., 2002). Precisamente, en el mismo año que se publicó la existencia de microheterogeneidad por nuestro grupo, Huys y cols. (2005) reclasificaron A. culicicola como A. veronii en base a los nuevos valores de DDH [método de Ezaki y cols. (1989) a 46ºC y el 50% de formamida] del 75% obtenidos entre las cepas tipo de ambas especies. En vista del impacto que tiene la existencia de microheterogeneidades en el gen ARNr 16S en la identificación correcta de Aeromonas, en nuestro estudio propusimos que cuando sea detectada, ésta se refleje en publicaciones y bases de datos (GenBank, etc.) para recoger fielmente la variabilidad de este 225 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL gen. Nuestros resultados apoyan los obtenidos por otros autores en otros géneros que indicaban que aunque las mutaciones afectaran a menos del 1% de las posiciones del gen ARNr 16S éstas tenían un impacto en la taxonomía (Boucher y cols., 2004; Marchandin y cols., 2003; Vásquez y cols., 2005). El análisis filogenético de las secuencias de las copias (operones) del gen ARNr 16S (estudio 4.1.4) incluía los 5 clones de la cepa de A. veronii LMG13695 de Morandi y cols. (2005) obtenidos por subclonación y las obtenidas de los genomas completos de A. hydrophila (10 operones) y A. salmonicida (9 operones). Este análisis mostró que prácticamente todas las copias de estas dos últimas especies se agrupaban con la secuencia consenso del ADNr 16S de la cepa tipo (a excepción de un operón de A. salmonicida) mientras que sólo uno de los clones de A. veronii (clon 2) se agrupaba con la secuencia consenso de su cepa tipo y otros 2 (clon 3 y 5) en el mismo clado de esta especies dentro de la “rama Schubertii”. Estos resultados podrían indicar que en A. veronii existe mucha más diversidad en el gen ARNr 16S que en A. salmonicida o A. hydrophila, lo que concuerda con que ésta fuera una de las especies con mayor incidencia (con respecto al número de cepas) con microheterogeneidad en nuestro estudio (Alperi y cols., 2008). Sin embargo, el número máximo de posiciones variables que encontramos en una cepa de la especie A. veronii fue 11, la mitad de las 21 descritas por Morandi y cols. (2005), lo que nos indica que sus resultados pueden no ser del todo fiables. Es interesante destacar que una de las copias del gen ARNr 16S de A. salmonicida no se agrupa con la secuencia consenso de la cepa tipo de esta especie, tal como hemos indicado, sino con la de A. bestiarum, lo que ratifica lo sugerido por nuestro grupo, i.e. que ambas especies comparten operones (Martínez-Murcia y cols., 2005). En conclusión, la secuenciación del gen ARNr 16S conjuntamente con el análisis de RFLP han demostrado ser técnicas válidas para la evaluación del polimorfismo de este gen. Tal y como hemos indicado, el gen rpoD permitió identificar las cepas con patrón de RFLP atípico estudiadas como pertenecientes a A. caviae (25 cepas), A. veronii (16 cepas) y A. media (11 cepas). Estas especies son las que presentan una mayor incidencia en muestras clínicas (Abbott y cols., 2003; Figueras, 2005). Asimismo, en nuestro estudio se comprobó que existía una mayor prevalencia (P<0.01) de microheterogeneidad en las cepas de origen clínico que en las de origen ambiental (Alperi y cols., 2008). En otros estudios, la existencia de polimorfismo en el gen ARNr 16S se ha relacionado con propiedades fisiológicas de las cepas como son su temperatura de crecimiento, adaptación a distintos nichos ecológicos e incluso su virulencia y resistencia a la estreptomicina u otros antibióticos (Prüb y cols., 1999; Carter y cols., 2000; Springer y cols., 2001; Clarridge, 2003; Criswell y cols., 2006; Vickery y cols., 2007). Sin embargo, desconocemos si estas mutaciones pueden tener algún significado parecido en Aeromonas. Asimismo, cabe destacar que en una cepa de A. caviae, identificada en base al gyrB, responsable de producir una cistitis se ha descrito también la existencia de microheterogeneidad en el gen ARNr 16S (Al-Benwan y cols., 2007). Esto parecería apoyar la mayor prevalencia en cepas clínicas observada en nuestro estudio. 226 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL Durante la preparación del estudio 4.1.3 (Alperi y cols., 2008) se publicó un protocolo de RFLP del ADNr 16S para diferenciar las especies de Aeromonas de importancia clínica (Ghatak y cols., 2007). Un análisis del protocolo propuesto en esta publicación, con todas las especies de Aeromonas mediante una simulación informática, nos mostró que los patrones propuestos por Ghatak y cols. (2007) para la separación de especies no eran especie-específicos ya que otras especies del género mostraban un patrón común con los descritos por estos autores. Por ejemplo, el patrón definido para A. jandaei era idéntico al que generaban A. popoffii, A. bestiarum, A salmonicida y A. bivalvium. Tanto A. bestiarum como A. salmonicida han sido aisladas, aunque con baja incidencia, en muestras clínicas (Figueras, 2005). Asimismo, Ghatak y cols. (2007) proponen que se podrían diferenciar las dos biovariedades de A. veronii, no obstante, la simulación informática, utilizando la endonucleasa propuesta por estos autores, con cepas de referencia de ambas biovariedades de A. veronii no mostró que existiera dicha diferenciación. En base a estos datos se publicó una carta al editor (estudio 4.1.2) donde se ponían en evidencia las limitaciones del estudio de Ghatak y cols. (2007). La respuesta de estos autores incluía el número de acceso del GenBank (AY928477) de la secuencia del gen ARNr 16S de la cepa de A. veronii bv sobria (A155) con la que ellos realizaron la simulación. La búsqueda de esta secuencia en el GenBank mostró que correspondía a una copia (“heterologous copy-1”) del ADNr 16S de una cepa (A155) con microheterogeneidades en este gen, cuyas secuencias fueron depositadas en el GenBank por Morandi y cols. (2005). Sin embargo, Ghatak y cols. (2007) no tuvieron en cuenta que las cepas con las que deberían haber realizado la simulación eran las cepas de referencia de las 2 biovariedades de A. veronii ni tampoco reconocieron la existencia de polimorfismo en la cepa elegida. En conclusión, podemos decir que reconocer las microheterogeneidades en el gen ARNr 16S es fundamental ya que no sólo puede conducir a una incorrecta identificación de las especies de Aeromonas, como ya hemos comentado, sino que es esencial valorarla tanto en el diseño de protocolos de RFLP como de sondas específicas. Tal y como hemos demostrado previamente, las cepas que presentaban patrones de RFLP atípicos, es decir, distintos a los esperados para especies conocidas, estaban generados por la presencia de microheterogeneidades entre las copias del gen ARNr 16S (Alperi y cols., 2008), sin embargo, estos patrones distintos también pueden estar generados por posibles nuevas especies del género Aeromonas (Borrell y cols., 1997; Figueras y cols., 2000a). En nuestro estudio, el análisis de cepas con patrones de RFLP atípicos con el gen rpoD ha permitido reconocer 5 casos en los que las cepas han demostrado representar 5 nuevas especies para el género: A. fluvialis, aislada a partir de agua de río; A. taiwanensis y A. sanarellii, aisladas de muestras clínicas; A. piscicola, aislada de peces enfermos y A. rivuli, aislada de agua de un riachuelo; y cuyas descripciones se han incluido en la presente tesis en los estudios 4.1.6-4.1.9. En estos 5 casos el valor de similitud del gen rpoD con la especie más cercana comprendía un rango del 92.2% (entre A. sanarellii y A. caviae) y el 96% (entre A. piscicola y A. bestiarum) por lo que estaban por debajo del 97% establecido como límite para la separación de 227 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL especies (Soler y cols., 2004). La posición taxonómica de todas las cepas de estas nuevas especies de Aeromonas se analizó en base a éste y a otros genes housekeeping (gyrB, recA, dnaJ y gyrA) concatenados (3684 pb), utilizados previamente en un estudio Multi-Locus Phylogenetic Analysis (MLPA) del género (Martínez-Murcia y cols., sometido). Este análisis confirmó que se trataba de líneas filogenéticas desconocidas, tal y como indicaban los resultados obtenidos por el rpoD. Por tanto, se ha demostrado de nuevo la capacidad del gen rpoD para la diferenciación de especies de Aeromonas y comprobado que el punto de corte (97%) previamente establecido (Soler y cols., 2004) para la separación de especies, se mantiene en las 149 cepas secuenciadas en esta tesis. Por otro lado, el MLPA mostró que ninguna de las cepas incluidas en estos estudios de nuevas especies presentaba secuencias idénticas con ninguno de los 5 genes estudiados lo que indicaba que se trataba de cepas diferentes, por lo que no fue necesario realizar otras técnicas de tipado. Además, es importante señalar que éstas son las 5 primeras descripciones de nuevas especies de Aeromonas que siguen la recomendación del ICSP de realizar un análisis multi-locus que incluya 5 genes housekeeping. La DDH sigue siendo en la actualidad obligatoria para la definición de nuevas especies procariotas (Stackebrandt y Eber, 2006). No obstante, ésta es una técnica compleja que se realiza en pocos laboratorios lo que motivó la necesidad de poner a punto la técnica de DDH en nuestro laboratorio, siendo este uno de los objetivos de la presente tesis doctoral. La validación de la técnica, una vez implementada en nuestro laboratorio, se realizó mediante la determinación del RBR entre las cepas tipo de A. allosaccharophila y A. caviae y entre las cepas tipo de A. allosaccharophila y A. sobria. Los valores de DDH del 44% entre A. allosaccharophila-A. caviae y del 65% entre A. allosaccharophila-A. sobria fueron muy similares a los valores del 46% y el 64%, respectivamente, publicados recientemente por Nhung y cols. (2007), con una técnica diferente. Las desviaciones estándar de los datos obtenidos, en los diversos experimentos de evaluación de nuevas especies (estudios 4.1.6-4.1.9), bajo idénticas condiciones, variaban entre 1.2 y 14%, valores similares a los descritos en otros géneros (Goris y cols., 1989) lo que refleja la reproducibilidad del método en nuestro laboratorio. Además, la diferencia entre las medias de los valores de DDH directos y recíprocos obtenida (0.6-13%), se encontraba por debajo del límite aceptado (15%) y publicado por Stackebrandt y Ebers (2006). Por otro lado, aunque se obtuvieron algunos valores discordantes de RBR en nuestros estudios, no fueron comprables con la disparidad de resultados de DDH de los diversos trabajos recopilados en la introducción de esta tesis doctoral y que han generado importantes controversias taxonómicas. Clásicamente, se recomienda que se determine el DDH entre las cepas representantes de una posible nueva especie y las cepas tipo de las especies con las que muestren un valor de similitud del gen ARNr 16S mayor del 97% (Wayne, 1987; Strackebrandt y Gobel, 1994). Sin embargo, recientemente se ha propuesto que este valor de similitud sea del 98-99% (Stackebrandt y Ebers, 2006). En Aeromonas los valores de similitud interespecie de este gen son muy elevados, entre el 96.7% y el 100% (Martínez-Murcia y cols., 1992; Saavedra y cols., 2006), al igual que en los géneros 228 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL Streptomyces (Santpierre-Bonaccio y cols., 2004) y Mycobacterium (Rhodes y cols., 2003). Debido a la poca capacidad discriminatoria del gen ARNr 16S de Aeromonas para la separación de especies y a la congruencia de los resultados obtenidos, tanto en el análisis filogenético individual con el gen rpoD como con el MLPA, los experimentos de DDH para cada uno de las cinco especies se realizaron, por lo menos, con las cepas tipo de las especies filogenéticamente más cercanas (que aparecían en la misma rama) en base al MLPA. En las 5 descripciones de nuevas especies de Aeromonas, incluidas en la presente tesis doctoral, los valores de DDH obtenidos entre las nuevas especies y las cepas tipo de las especies agrupadas en las mismas ramas en el árbol filogenético MLPA variaban entre 40-66% en A. fluvialis, entre 50-60% en A. rivuli, entre 50-65% en A. piscicola y entre 60-65% en A. taiwanensis y A. sanarellii. Es decir, los valores máximos medios han estado por debajo del 70% establecido para considerar las cepas como pertenecientes a nuevas especies (Wayne, 1987; Stackebrandt y Ebers, 2006). Los valores de DDH superiores al 60% podrían ser considerados valores borderline, sin embargo, en el género Aeromonas así como en el género vecino Vibrio, se han publicado valores de reasociación superiores al 60% tanto en la descripción de nuevas especies (Huys y cols., 1997; Gómez-Gil y cols., 2003; Thompson y cols., 2003) como en estudios de reasociación ADN-ADN (Nhung y cols., 2007). En nuestros estudios (4.1.6-4.1.9) pudimos apreciar que especies que mostraban una similitud del gen ARNr 16S del 99.5% tenían valores de DDH del 66%, (A. fluvialis-A veronii) mientras que en otros casos una similitud del 99.7% del ADNr 16S se correlacionaba con valores de DDH del 53% (A. rivuli-A. sobria) y valores de similitud ADNr 16S del 100% con valores de DDH del 65% (A. piscicola-A. bestiarum). Estos datos corroboran que organismos con valores de similitud del gen ARNr 16S superiores al 97% pertenecían a especies diferentes, incluso con similitudes del 99.8% (Stackebrandt y Goebel, 1994) o del 100% (Martínez-Murcia y cols., 1992; Harayama y Kasai, 2006). Por tanto, los valores propuestos recientemente del 98-99% de similitud del ADNr 16S, a partir de los cuales deberían ser obligatorios los experimentos de DDH (Stackebrandt y Ebers, 2006), no reflejan la taxonomía de este gen en Aeromonas. Sin tener en cuenta los casos del 100% de similitud y la existencia de microheterogeneidad, este punto de corte de similitud del gen ARNr 16S más adecuado en Aeromonas podría estar entre el 99.5-99.7%. En el desarrollo de la presente tesis doctoral se observó que A. aquariorum, una nueva especie descrita a partir de cepas aisladas de peces ornamentales (Martínez-Murcia y cols., 2008), y A. hydrophila subsp. dhakensis, descrita a partir de aislados de heces de niños con diarrea en Bangladesh (Huys y cols., 2002) e incluida en diversos estudios de genes housekeeping (Küpfer y cols., 2006; Nhung y cols., 2007; Miñana-Galbis y cols., en prensa), ocupaban las mismas posiciones en los árboles filogenéticos construidos con los genes ARN 16S y gyrB, lo que indicaba que podría tratase de un único taxón. 229 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL En la definición de A. hydrophila subsp. dhakensis (Huys y cols., 2002) tanto los datos bioquímicos como los del AFLP indicaban que este grupo constituía un taxón diferente de A. hydrophila, sin embargo, los valores de DDH entre 3 cepas de la subespecie y la cepa tipo de A. hydrophila fueron superiores al 70% (77%). Estos autores optaron por dar una mayor importancia a los resultados de DDH que a los otros datos, lo que dio lugar a la definición de la subespecie. En los últimos años, otros autores que han incluido cepas de A. hydrophila subsp. dhakensis en sus estudios con genes housekeeping (Küpfer y cols., 2006; Nhung y cols., 2007; Miñana-Galbis y cols., en prensa) han observado con los genes ARNr 16S, gyrB y cpn60 localizaciones diferentes entre los aislados de A. hydrophila subsp. dhakensis y el resto de cepas A. hydrophila (Küpfer y cols., 2006; Miñana-Galbis y cols., en prensa). Sin embargo, las filogenias de los genes rpoB y dnaJ incluían A. hydrophila subsp. dhakensis en la misma rama que las subespecies de A. hydrophila (Küpfer y cols., 2006; Nhung y cols., 2007) pero en estos casos se incrementaba la diversidad intraespecie hasta solaparse con la diversidad interespecie media del género (Nhung y cols., 2007). A pesar de los datos existentes, sólo uno de estos autores (Miñana-Galbis y cols., en prensa) ha interpretado sus hallazgos como indicativos de que A. hydrophila subsp. dhakensis deba considerarse un taxón independiente de A. hydrophila, sin tener en cuenta que esta propuesta ya ha sido publicada. A. aquariorum, descrita en el año 2008 por Martínez-Murcia y cols., mostró resultados de DDH entre la cepa tipo y A. hydrophila del 46% (Martínez-Murcia y cols., 2008). Este resultado de DDH es congruente con los resultados de los análisis filogenéticos incluidos en la descripción de esta especie. La elaboración de un árbol filogenético (estudio 4.1.5) con los genes gyrB y rpoD que incluía las 3 cepas de la descripción original de A. hydrophila subsp. dhakensis investigadas junto a 6 de A. aquariorum y el resto de especies del género mostró que las cepas de los dos grupos constituían un clado homogéneo y robusto (100% bootstrap). Asimismo, la nueva secuencia del ADNr 16S de la cepa tipo de la subespecie, obtenida en nuestro estudio, no mostró diferencias con la cepa tipo de A. aquariorum. Todos estos datos sugieren que A. hydrophila subsp. dhakensis y A. aquariorum constituyen un único taxón, sin embargo, sería necesario realizar experimentos de DDH entre los dos grupos para corroborarlo definitivamente y resolver cuál es el nombre correcto para esta especie. A pesar de que los resultados de DDH obtenidos en nuestros estudios han sido congruentes con los resultados del MLPA y que la variabilidad observada se encontraba dentro del rango establecido (estudios 4.1.6-4.1.9), hemos de indicar que esta técnica presenta una elevada variabilidad. A nuestro entender, teniendo en cuenta el análisis comparativo realizado en la introducción con las diversas controversias taxonómicas en función de los valores de DDH, así como las reclasificaciones de A. culicicola y A. hydrophila subsp. dhakensis, se debería ser muy prudente a la hora de dar tanto peso a estos valores. La técnica del MLPA, con los cinco genes propuestos, ha demostrado ser estable y proporcionar una información más congruente y objetiva que la DDH. 230 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL Uno de los objetivos de la presente tesis doctoral, como se ha mencionado previamente, era la colaboración con diferentes hospitales en la identificación molecular de aislados de Aeromonas, ya que los métodos convencionales proporcionan identificaciones erróneas (Soler y cols., 2003; Ormen y cols., 2005) y no permiten reconocer especies poco frecuentes o raras. En este sentido, se pudo reconocer en base al gen rpoD (Soler y cols., 2004) que 22 de las 150 cepas de origen extraintestinal procedentes del Hospital Universitario National Cheng Kung de Tainan, Taiwán, pertenecían a la especie A. aquariorum (estudio 4.2.1). Estas cepas presentaron patrones de RFLP de A. caviae atípicos y típicos (Alperi y cols., 2008) y 19 de ellas se habían identificado bioquímicamente en el hospital de origen como A. hydrophila mientras que 3 sólo pudieron identificarse como Aeromonas sp. Estos datos sugerían que esta nueva especie podía estar enmascarada en el ámbito clínico por A. hydrophila y por A. caviae (en base al RFLP del ADNr 16S). Ambas especies y en especial A. caviae, son muy frecuentes en clínica (Abbott y cols., 2003; Figueras, 2005). El análisis de RFLP del ADNr 16S reveló que las cepas de A. aquariorum tenían el mismo patrón que A. caviae. Estos datos nos indicaron que podrían existir en nuestra colección cepas de origen clínico, identificadas en base su patrón de RFLP como A. caviae, que pertenecieran a A. aquariorum. Para evaluar esta posibilidad se analizó la producción de ácido de la celobiosa considerada 100% positiva para A. caviae (Abbott y cols., 2003) y negativa para A. aquariorum (Martínez-Murcia y cols., 2008), en cepas identificadas por RFLP del ADNr 16S como A. caviae en nuestro laboratorio. Todas las cepas con un resultado negativo para la celobiosa fueron identificadas en base al gen rpoD y se comprobó que sólo el 85% de las cepas de A. caviae eran capaces de producir ácido de la celobiosa, resultados concordantes con el 80% publicado previamente por otros autores (Martin-Carnahan y Joseph, 2005). Otras pruebas bioquímicas que podrían ser útiles para la diferenciación de A. caviae de A. aquariorum, según la descripción de esta última (Martínez-Murcia y cols., 2008), serían la presencia de lisina decarboxilasa (positiva para A. aquariorum y negativa para A. caviae) y la producción de ácido de la arabinosa (negativa para A. aquariorum y positiva para A. caviae). Se detectó que 2 aislados de nuestra colección pertenecían a A. aquariorum. Estos 2 aislados junto con otros 3 de origen clínico aislados en España, en el Hospital Comarcal Vega Baja de Orihuela y reconocidos en base al gen gyrB, indican que la distribución clínica de A. aquariorum no se limita a países Orientales, dónde se había aislado anteriormente enmascarada como A. hydrophila subsp. dhakensis (Kuhn y cols., 1997; Huys y cols., 2002; Martínez-Murcia y cols., 2009). Dado que el potencial virulento de las cepas de esta nueva especie no había sido investigado y sólo existían datos de la susceptibilidad frente a diversos agentes antimicrobianos obtenidos a partir de cepas ambientales, analizamos ambos aspectos en estas cepas clínicas. Los perfiles de resistencia a antibióticos de las cepas clínicas fueron similares a los obtenidos en las cepas ambientales (Martínez-Murcia y cols., 2008). Todas las cepas mostraron ser resistentes a la amoxicilina, cefalotina y cefoxitina, siendo el 96% resistente a la eritromicina mientras que el 4% lo fueron frente al cloranfenicol e imipenem. El 100% de las cepas clínicas demostraron poseer los genes que codifican para la aerolisina/hemolisina, mientras que sólo el 84% de las cepas presentó el gen de 231 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL la enterotoxina termoestable Ast y el 64% los genes pertenecientes al T3SS, lo cual demuestra el potencial patogénico de esta nueva especie y coincide con los altos valores de citotoxicidad publicados previamente en aislados de origen intestinal de A. hydrophila subsp. dhakensis (Kühn y cols., 1997). La secuenciación de los genes rpoD y gyrB mostró que 3 de los aislados de A. aquariorum de Taiwán poseían secuencias idénticas como también lo fue su perfil de ERIC-PCR y su patrón de sensibilidad a los antibióticos, lo que sugiere una relación clonal de los tres aislados. Dos de ellos pertenecían al mismo paciente, uno fue aislado de bilis y el otro se aisló 14 días después de un exudado de herida quirúrgica abdominal, lo que indicaba que la infección de la herida podía tener un carácter endógeno. El tercer aislado se recogió 7 meses antes de una ascitis en un paciente con una apendicitis aguda. Estos datos indican una fuente común de infección aunque ésta no se pudo determinar. Nuestros resultados pretenden alertar a los clínicos de la importancia de esta especie proporcionándoles herramientas para su identificación. En el año 2006 se recibió una cepa del hospital Royo Vilanova de Zaragoza, enviada por la Dra. Mª José Aldea aislada de muestras de heces de una paciente de 40 años con síndrome urémico hemolítico (SUH). Esta cepa había sido identificada bioquímicamente como A. veronii bv sobria y fue confirmada genéticamente por RFLP del ADNr 16S como A. veronii (estudio 4.2.2). Dado que existían pocos casos de SUH atribuidos a Aeromonas (San Joaquin y Pickett, 1988; Bogdanovic y cols., 1991; Robson y cols., 1992; Fang y cols., 1999; Filler y cols., 2000) se consideró importante hacer una revisión de todos ellos añadiendo el segundo caso de SUH en adultos asociado a este género. Nuestra cepa mostró citotoxicidad en células Vero. Asimismo, presentaba los genes del T3SS (ascV), relacionados con diarrea y colitis hemorrágica (Coburn y cols., 2007), el gen de la toxina efectora AexT, secretada por este sistema, y los genes para aerolisina/hemolisina, lo que puso de manifiesto su potencial virulencia. Sin embargo, el principal factor de virulencia asociado al SUH es la toxina Shiga tipo 2 (Lee y cols., 2007; Orth y cols., 2007). Existen 2 tipos de toxinas Shiga (Stx1 y Stx2) y ambas son importantes factores de virulencia en la patogénesis de la gastroenteritis y colitis hemorrágica. Dos autores (Haque y cols., 1996; Snowden y cols., 2005) habían detectado la existencia de stx1 en Aeromonas, y sólo uno su producción, pero ninguno de ellos secuenció dicho gen. Pese a los casos en los que Aeromonas se ha aislado como agente del SUH y de ser la Stx2 el principal factor de virulencia del mismo sólo 3 autores han tratado de detectar sin éxito este gen en Aeromonas (Haque y cols., 1996; Filler y cols., 2000; Snowden y cols., 2005). Teniendo en cuenta los casos de SUH mencionados anteriormente (Figueras y cols., 2007 estudio 4.2.2) y el rol que los genes stx1 y stx2 pueden jugar en este tipo de infecciones, se evaluó su presencia por PCR en 80 cepas clínicas de Aeromonas de distintas especies aisladas de diversos orígenes (estudio 4.2.3). La presencia de stx1 se detectó con mayor incidencia (en 19 de las 80 cepas, 23.75%) que en estudios anteriores, 10.25% (Haque y cols., 1996), utilizando los mismos cebadores y condiciones, y 9.1% (Snowden y cols., 2005), utilizando cebadores y condiciones de amplificación diferentes (Pass y cols., 2000). Un 74% de 232 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL las cepas stx1-positivas pertenecieron a las especies con mayor relevancia en clínica (Figueras, 2005) i.e. A. caviae (42.1%), A. veronii (31.6%) y A. hydrophila (10.5%), siendo la mayoría aisladas de heces al igual que en el estudio de Haque y cols. (1996). Se pudo detectar por primera vez la presencia del gen stx2 aunque sólo en una cepa de A. caviae que también era positiva para stx1. La amplificación de este fragmento de stx2 mostró resultados variables o inestables ya que de 5 reacciones de PCR efectuadas a partir de 4 extracciones de ADN sólo en 2 casos se pudo observar una banda tenue del tamaño esperado para este gen. La inestabilidad de stx2 se había demostrado in vitro (Karch y cols., 1992) e in vivo (Bielaszewska y cols., 2007) en E. coli, Citrobacter freundii (Schmidt y cols., 1993) y Enterobacter cloacae (Paton y Paton, 1997). Dicha inestabilidad se debe a que los genes stx están codificados en fagos que actúan como elementos genéticos móviles, facilitando la transmisión horizontal (Herold y cols., 2004), lo que puede derivar, cuando los fagos se encuentran en estado plasmídico, en la pérdida de los genes tras las resiembras puesto que no toda la descendencia recibe una copia del ADN fágico (Karch y cols., 1992; Schmidt y cols., 1993; Paton y Paton, 1997; Herold y cols., 2004). Se observó esta misma inestabilidad en la detección del gen stx1 y se corroboró que al menos en una de las cepas estudiadas el gen stx1 se localiza en un plásmido, al igual que habían demostrado Haque y cols. (1996). Los resultados de inestabilidad del gen stx2 en Aeromonas obtenidos en la presente tesis sugieren una localización equivalente a la de stx1, aunque esto debería demostrarse. La secuenciación de los fragmentos amplificados de los genes stx1 y stx2 puso de manifiesto su gran similitud con las variantes genéticas más patogénicas para humanos de E. coli productoras de toxina Shiga (STEC): la prototipo stx1 de la toxina Shiga tipo 1 asociada con diarreas (Lee y cols., 2007) y la prototipo stx2 y la variante stx2c de la toxina Shiga tipo 2 asociadas con el SUH (Lee y cols., 2007; Orth y cols., 2007). La similitud con dichas variantes sugiere un mismo potencial patogénico de estos genes en Aeromonas y podría explicar su papel como agente causal de diarreas y del SUH (Figueras y cols., 2007). El análisis de la producción de toxinas Shiga en las cepas portadoras de los genes stx1 y stx2 mostró que sólo 2 cepas producían Stx1 mientras que no se pudo detectar la producción de Stx2. Aunque la tasa de producción fue baja, 10.25% de las cepas stx1-positivas, estos valores son muy similares a los observados a partir de cepas de STEC, 6.7% para Stx1 y 6-7% para Stx2, aisladas de aguas residuales urbanas (García-Aljaro y cols., 2004, 2005). De este modo, se ha demostrado la posibilidad real de que la Stx1 producida por Aeromonas actúe como un factor de virulencia más en la patogénesis multifactorial de la diarrea producida por este microorganismo. Este estudio aporta datos que apoyan la capacidad de Aeromonas de producir diarreas, aspecto cuestionado en algunos estudios (Chu y cols., 2006; Figueras y cols., 2007). Las infecciones de herida quirúrgica (SSI) son en la mayoría de los casos nosocomiales y están asociadas con una elevada mortalidad y coste médico. Los agentes etiológicos son variados pero dependen en especial del lugar anatómico de la cirugía siendo Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., E. coli y Pseudomonas aeruginosa los microorganismos más frecuentemente aislados. Sólo 233 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL existían 15 casos en la literatura en los que Aeromonas se había relacionado con este tipo de infecciones (Slotnick, 1970; Washington, 1972; Soussy y cols., 1975; Janda y cols., 1983; Mellersh y cols., 1984; Isaacs y cols., 1988; Villuendas y cols., 1991; King y cols., 1992; Gold y Salit, 1993; Moawad y Zeiderman, 2002; Clark y Chenoweth, 2005). Por ello, la adición de 9 nuevos casos (estudio 4.2.4) procedentes 8 de ellos del Hospital Universitario de Guadalajara y 1 del Hospital Royo Vilanova de Zaragoza permitía, revisando los casos existentes, analizar las características clínicas de las SSI producidas por Aeromonas. La mayoría de pacientes con SSI asociados a Aeromonas presentaban coinfección con otros enteropatógenos y habían sido sometidos a cirugía de la región pélvica y/o abdominal, lo que sugiere una fuente de infección endógena a partir del sistema digestivo o del tracto hepatobiliar. La contribución específica de Aeromonas en estas infecciones polimicrobianas era difícil de determinar. Sin embargo, al compararse los casos de SSI de Aeromonas con los generados por otros microorganismos se observó una rápida evolución de la infección, que se manifestaba en el primer o segundo día tras la cirugía (Mangram y cols., 1999). En 5 de los 9 casos descritos en este trabajo se analizó por PCR la presencia de los genes de diversos factores de virulencia (aerolisina/hemolisina, enterotoxinas citotóxicas y citotónicas, flagelo lateral, serina proteasa, DNasa y lipasas) detectándose en 3 cepas la presencia de genes que codifican para la aerolisina/hemolisina, implicados en la degeneración tisular (Deepe y cols., 1980). Además el 100% de las cepas analizadas mediante métodos moleculares poseían los genes de la serina proteasa, asociada con la maduración/activación de la aerolisina (Chacón y cols., 2003) así como genes de diversas enterotoxinas (alt y ast), lo que demostró su potencial patogénico (Tena y cols., 2009 estudio 4.2.4). Ninguno de los pacientes desarrolló bacteriemia y la mayoría de pacientes respondieron bien al tratamiento antibiótico e incluso 2 de ellos, previamente estudiados (Villuedas y cols., 1991; Gold y Salit, 1993), al drenaje quirúrgico sin tratamiento antibiótico. Las Aeromonas son responsables del 12% de las infecciones hepatobiliares o pancreáticas, entre las cuales la más común (en el 70% de los casos) es la colangitis (Figueras, 2005). En asociación a infección de este tipo se investigó el comportamiento atípico de 9 aislados procedentes de una paciente ya que presentaban una morfología colonial, perfil bioquímico y sensibilidad a los antibióticos variable (estudio 4.2.5). La paciente había padecido, un mes antes, una infección urinaria que había sido tratada con ciprofloxacino y amoxicilina-ácido clavulánico. En el tratamiento de la colangitis se administró amoxicilina-ácido clavulánico que se sustituyó posteriormente por piperacilina-tazobactam. Tanto los aislados recuperados a partir de la primera muestra de bilis, a través de un catéter, (3 aislados) como los de la segunda muestra, obtenida de un drenaje 5 días después (6 aislados), mostraron poseer idénticos perfiles genéticos por ERIC-PCR y PFGE. La identificación por RFLP del ADNr 16S y las características bioquímicas indicaron que los aislados pertenecían a A. veronii bv sobria. Estos 9 aislados eran sensibles al ciprofloxacino y 7 de ellos resistentes a la ampicilina. Este hecho es interesante ya que la mayoría de cepas de Aeromonas, con la excepción de A. trota, son 234 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas DISCUSIÓN GENERAL resistentes a la ampicilina (Abbott y cols., 2003; Maluping y cols., 2005). También la respuesta a la cefalotina fue variable presentando 5 de los 9 aislados resistencia. Esto es llamativo ya que Abbott y cols. (2003) describen A. veronii bv sobria como sensible a la cefalotina y considera esta respuesta una prueba diferencial en su identificación. A partir de los resultados obtenidos en el presente estudio, dicha característica no debe ser considerada fiable para la identificación de A. veronii bv sobria. Además, 7 de los aislados fueron resistentes al imipenem lo que no es extraño teniendo en cuenta que previamente se había detectado en otros casos de colangitis (Clark y Chenoweth, 2003) y recientemente se ha detectado, en un estudio en Taiwán, que el 35.6% de las Aeromonas aisladas de pacientes con procesos cancerosos también lo eran (Tsai y cols., 2006). Las CMI (concentración mínima inhibitoria) del imipenem de 32 g/ml descendieron hasta 1 g/ml en presencia de EDTA (10mM), lo que sugería que esta resistencia estaba mediada por la presencia de una ß-metalo-lactasa. Entre las ß-lactamasas descritas en A. veronii bv sobria se incluye una ß-metalo-lactasa (ImiS) descrita por Tsai y cols. (2006) que pertenece a la clase B o grupo 3 muy semejante a la CphA encontrada en A. hydrophila (Hernández-Valladares y cols., 2000). La ImiS es una enzima capaz de hidrolizar carbapenenos como el imipinem (Walsh y cols., 1998). En vista a los resultados obtenidos (estudio 4.2.5) se decidió evaluar mediante RT-PCR el papel del gen imiS en la resistencia al imipenem en dos aislados, uno de ellos resistente y el otro sensible observándose una mayor expresión de este gen en el aislado resistente. Esta cepa además mostraba resistencia a la cefalotina sugiriendo una sobreexpresión de la cefalosporinasa cromosómica. De echo, las tres ß-lacatmasas cromosómicas detectadas en A. veronii (cefalosporinasas, penicilinasas y carbapenemasas) se sobre-expresan simultáneamente en cepas mutantes (Walsh y cols., 1995). El hallazgo más importante de este estudio fue el hecho de que hasta la fecha no se había descrito la inducción de resistencia al imipenem in vivo en A. veronii bv sobria. En nuestro estudio se ha observado la presencia de varios aislados imipenem-sensibles y – resistentes que pertenecían al mismo clon, lo que hace sospechar que la resistencia fue inducida con el tratamiento previo con ß-lactámicos utilizados durante la infección de orina que había padecido la paciente. 235 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas CONCLUSIONES 1. Se ha demostrado que el tipado molecular de las cepas incluidas en la definición de nuevas especies evita la inclusión de duplicados y se ha propuesto que éste sea un requisito indispensable y no una recomendación tal y como establece el Comité Internacional para la Sistemática de Procariotas. 2. Se ha comprobado que el 8.1% de las cepas de Aeromonas muestran variabilidad interoperónica en el gen ARNr 16S y que ésta, en la mayoría de los casos, afecta a su correcta identificación. La frecuencia observada de esta variabilidad fue significativamente mayor en las cepas clínicas de las especies A. caviae, A. veronii y A. media que en las ambientales. 3. Se ha propuesto que en las secuencias del gen del ARNr 16S de Aeromonas en las que se detecte variabilidad interoperónica, ésta se refleje en las secuencias que se depositen en las bases de datos ya que esto es esencial tanto para conocer su incidencia como para el diseño correcto de sondas específicas o de protocolos de RFLP. 4. Se ha confirmado que el gen rpoD permite una identificación inequívoca de Aeromonas a nivel de especie. Asimismo, se ha demostrado que el valor del 97% de similitud máxima interespecie sigue conservándose tras la identificación de 149 nuevas cepas analizadas en este trabajo. 5. Se ha puesto a punto la técnica de hibridación ADN-ADN, obteniéndose una reproducibilidad adecuada y comparable a la obtenida por otros autores que utilizan otros métodos. 6. En base a un estudio polifásico se han propuesto las siguientes nuevas especies para la ciencia: Aeromonas fluvialis, Aeromonas taiwanensis, Aeromonas sanarellii, Aeromonas piscicola y Aeromonas rivuli. Dos de ellas, A. taiwanensis y A. sanarellii, de origen clínico y A. piscicola, aislada de peces enfermos, con una demostrada virulencia. 7. Se ha demostrado, mediante el análisis filogenético de los genes rpoD y gyrB, que las cepas utilizadas en la descripción de la subespecie A. hydrophila subsp. dhakensis no pertenecen a A. hydrophila. Sin embargo, se han identificado como miembros de A. aquariorum representando un único taxón, por lo que ambos grupos deben ser considerados sinónimos. 8. Se ha comprobado que cepas de la especie A. aquariorum son capaces de producir infecciones extraintestinales y que poseen genes de diversos factores de virulencia como la 237 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas CONCLUSIONES aerolisina/hemolisina, la enterotoxina citotónica termoestable y el Sistema de Secreción Tipo 3. 9. Se ha descrito un nuevo caso de síndrome urémico hemolítico producido por Aeromonas siendo éste el sexto de los publicados hasta la fecha y el segundo en adultos. La cepa responsable se identificó como A. veronii bv sobria y era portadora de genes que codifican para proteínas del Sistema de Secreción Tipo 3. 10. Se ha observado que existen cepas de Aeromonas de origen clínico que poseen los genes stx1 y stx2, que codifican para las toxinas Shiga, demostrándose por primera vez que las secuencias de estos genes presentan una elevada similitud con los genes de las variantes más patogénicas para humanos de E. coli productoras de toxina Shiga. 11. Se ha observado que las infecciones de heridas quirúrgicas en las que están involucradas Aeromonas son relativamente frecuentes y tienen una evolución más rápida que en las que no lo están, siendo las especies implicadas A. hydrophila y A. veronii. 12. Se ha descrito por primera vez la posible inducción in vivo de resistencia al imipenem por tratamiento antibiótico previo en cepas de A. veronii bv sobria aisladas de un paciente con colangitis. Se ha demostrado que esta resistencia estaba asociada con la sobre-expresión del gen imiS que codifica una carbapenemasa capaz de hidrolizar el imipenem. 238 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO *Cepa con patrón atípico, Existe secuencia del gen rpoD. Anexo 1. Cepas de origen clínico identificadas. Fecha 05/05/2005 24/05/2005 07/06/2005 21/06/2005 01/07/2005 28/07/2005 28/07/2005 28/07/2005 16/09/2005 23/09/2005 28/10/2005 28/10/2005 28/10/2005 28/10/2005 28/10/2005 28/10/2005 28/10/2005 28/10/2005 28/10/2005 14/11/2005 21/11/2005 21/11/2005 21/11/2005 21/11/2005 21/11/2005 21/11/2005 21/11/2005 Referencia URV 752c 753c 754c 755c 756c 757c 758c 759c 760c 761c 762c 763c 764c 765c 766c 767c 768c 769c 770c 771c 772c 773c 774c 775c 776c 777c 778c Referencia hospital 439146 447255 452637 457951 461891 462485 464631 464646 483039 485198 82545/IV 82846/IV 84860/V 85499/V 85510/V 85800/V 86369/V 86373/V 86375/V 503334 68450/03 69795/03 75605/04 127290/10 133040/11 133960/11 134880/11 Hospital Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Sant Joan Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Origen Heces Heces Heces Heces Heces Heces Exudado herida Sangre Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Edad 2 1 2 2 0.6 85 29 77 ND 2 1 75 3 ND 8 32 45 3 1 1 1 1 Adulto 59 1 58 81 Fenotipo Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. caviae A. caviae A. veronii bt sobria A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae RFLP ADNr 16S A. media A. media A. trota* A. media A. veronii A. caviae A. hydrophila A. caviae A. caviae A. veronii A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. media A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii A. caviae A. caviae* A. caviae* A. caviae 1 269 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 21/11/2005 21/11/2005 21/11/2005 21/11/2005 30/11/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 02/12/2005 21/12/2005 02/02/2006 779c 780c 781c 782c 783c 784 785c 786c1 787c 788c 789c 790c 791c 792c 793c 794c 795c 796c 797c 798c 799c 800c 801c 802c 803c 804c 805c 806c 807c 808c 809c 810c 1 135300/11 135635/11 135951/11 135952/11 507108 136661 137030 137211 137900 138349 138378 139150 139559 136460 139133 139886 139907 140675 141447 141624 141651 141987 142325 142768 143088 143879 144134 144500 144505 145184 145234 522079 Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Sant Joan Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Miguel Servet Universitario Sant Joan Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces 35 2 1 1 44 81 Pediátrico Adulto 12 1 1 87 1 1 1 1 68 1 1 0.10 0.6 1 5 38 1 3 0.10 1 0.021 1 2 1 A. veronii bt sobria A. caviae A. caviae A. caviae Aeromonas sp A. caviae A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. caviae A. hydrophila A. caviae A. caviae A. hydrophila A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii bt sobria A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae Aeromonas sp Aeromonas sp A. veronii A. media A. caviae* A. caviae* A. media A. caviae A. veronii A. veronii* A. caviae A. veronii A. caviae A. caviae A. veronii A. caviae* A. caviae* A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae* A. caviae A. media A. veronii A. caviae A. caviae* A. caviae A. caviae* A. caviae* A. veronii A. veronii 270 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 16/02/2006 16/02/2006 16/02/2006 23/02/2006 21/03/2006 03/04/2006 16/05/2006 02/06/2006 22/06/2006 22/06/2006 27/07/2006 27/07/2006 31/08/2006 29/09/2006 29/09/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 811c 812c 813c 814c 815c 816c 817c 818c 819c 820c 821c 822c 823c 825c 826c 827c 828c 829c 830c 831c 832c 833c 834c 835c 836c 837c 838c 839c 840c 841c 842c 843c 15026 1185 1185 bis 53070 541508 549961 562818 570887/c 576710/o 575787/c 577810 310166 4441/c 6708/v 6611/v IOC 251/04 IOC 252/04 IOC 253/04 IOC 254/04 IOC 255/04 IOC 256/04 IOC 257/04 IOC 258/04 IOC 261/04 IOC 262/04 IOC 263/04 IOC 265/04 IOC 266/04 IOC 268/04 IOC 269/04 IOC 270/04 IOC 274/04 Royo Vilanova Royo Vilanova Royo Vilanova Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz ND ND ND Sangre Heces Heces Heces Heces Orina Heces Heces Heces Heces Pus herida Bilis Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces ND ND ND 85 ND 77 1 2 ND 0.7 4 ND 2 14 82 0.8 45 4 26 27 38 3 0.2 4 3 62 37 ND 2 2 3 11 A. veronii A. veronii A. veronii Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. caviae A. caviae A. veronii bt sobria A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii bt sobria A. caviae A. veronii A. veronii* A. veronii* A. veronii A. veronii Pseudomona A. media A. hydrophila A. caviae A. caviae A. caviae A. hydrophila A. caviae A. hydrophila A. veronii* A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. media A. caviae 271 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 03/10/2006 06/10/2006 25/10/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 844c 845c 846c 847c 848c 849c 850c 851c 852c 853c 854c 855c 856c 857c 858c 859c 860c 861c 862c 863c 864c 865c 655c 867c 868c 869c 870c 871c 872c 873c 874c 875c IOC 275/04 IOC 276/04 IOC 277/04 IOC 279/04 IOC 281/04 IOC 283/04 IOC 285/04 IOC 286/04 IOC 288/04 IOC 292/04 IOC 293/04 IOC 295/04 IOC 296/04 IOC 297/04 IOC 299/04 IOC 301/04 IOC 302/04 IOC 308/04 IOC 314/04 IOC 339/04 IOC 340/04 IOC 344/04 IOC 345/04 IOC 346/04 IOC 347/04 IOC 363/04 7674/v 8594/c IOC 264/04 IOC 289/04 IOC 300/04 IOC 304/04 Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Exudado herida Heces Heces Heces Heces Heces 1 22 1 24 2 32 32 22 72 1 3 49 9 54 4 1 12 1 5 4 78 40 38 54 14 1 84 ND 3 0.2 0.02 1 A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii bt sobria A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria Aeromonas sp Aeromonas sp A. media A. media A. media A. media A. caviae A. caviae* A. caviae A. veronii * A. veronii A. caviae A. veronii A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii A. veronii* A. veronii* A. veronii A. caviae A. caviae NO Aeromonas A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae 272 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 17/01/2007 17/01/2007 24/01/2007 14/03/2007 03/04/2007 876c 877c 878c 879c 880c 881c 882c 883c 884c 885c 886c 887c 888c 889c 890c 891c 892c 893c 894c 895c 896c 897c 898c 899c 900c 901c 902c 903c 904c 905c 906c 907c 1 IOC 316/04 IOC 331/04 IOC 309/04 IOC 315/04 IOC 317/04 IOC 319/04 IOC 322/04 IOC 324/04 IOC 325/04 IOC 327/04 IOC 272/04 IOC 284/04 IOC 287/04 IOC 291/04 IOC 313/04 IOC 337/04 IOC 356/04 IOC 371/04 IOC 259/04 IOC 260/04 IOC 278/04 IOC 282/04 IOC 298/04 IOC 305/04 IOC 335/04 IOC 367/04 3103238 45014 41961 15376/c 19766 22185 Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Universitario Sant Joan Joan XXIII Joan XXIII Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces ND ND Heces Heces Heces 8 18 40 ND 2 3 1 5 1 17 72 76 51 80 2 51 28 34 54 37 20 23 19 38 49 ND 4 ND ND 1 28 81 A. media A. media A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. jandaei A. jandaei A. trota A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria A. veronii bt sobria Aeromonas spp A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. caviae A. caviae A. caviae A. trota* A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. media A. hydrophila A. media A. caviae* A. hydrophila A. jandaei A. trota A. trota* A. veronii A. veronii A. caviae A. veronii A. veronii A. trota* A. caviae A. veronii* A. caviae* A. caviae A. veronii A. veronii A. veronii A. caviae 273 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 11/05/2007 22/05/2007 13/07/2007 13/07/2007 01/08/2007 28/08/2007 28/08/2007 30/08/2007 26/09/2007 26/09/2007 04/12/2007 21/12/2007 19/02/2008 19/02/2008 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 07/03/2008 24/04/2008 27/05/2008 27/05/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 908c 909c 910c 911c 913c 914c 915c 916c 917c 918c 919c 920c 921c 922c 923c 924c 925c 926c 927c 928c 929c 930c 931c 932c 933c 934c 935c 936c 937c 938c 939c 940c 25741/c 25969/v 30343/c 29412/c 32897/c 34135/c 34098/c 35533/v 39283 38761 43324/c 44749/c 4333/c 2933/c 68711/c 68688/c 68684/c 68667/c 69640/c 68711/c II 8747/an 13716/o 11987/c A11 A14 A17 A19 A22 A26 A3 A5 A2 Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Joan XXIII Joan XXIII Joan XXIII Joan XXIII Joan XXIII Joan XXIII Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Heces Exudado herida Heces Heces Heces Heces Heces SSI Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Sangre SSI Orina Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces 27 50 62 42 90 80 5 82 71 Adulto 54 1 78 2 1 5 1 1 36 1 84 59 60 2 ND ND ND ND ND ND ND ND Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. hydrophila A. veronii A. veronii A. veronii A. caviae A. caviae A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. hydrophila A. caviae* A. caviae A. caviae* A. caviae A. caviae A. caviae NO Aeromonas A. media A. caviae A. caviae A. caviae A. media NO Aeromonas A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae 274 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 25/06/2008 16/07/2008 22/07/2008 25/07/2008 07/08/2008 19/08/2008 02/09/2008 09/09/2008 941c 942c 943c 944c 945c 946c 947c 948c 949c 950c 951c 952c 953c 954c 955c 956c 957c 958c 959c 960c 961c 962c 963c 964c 965c 966c 967c 968c 969c 970c 971c 972c A25 A4 A8 A9 AD23 AG50 AH90 AI10 AI14 AI52 AI64 AL80 AA47 AA48 AA100 AB94 AC66 AC87 AE100 AE38 AE42 AE48 AE51 AE63 AA79 17207/AE 18760/c 19673/v 20709/c 21177/c 22577/an 23515/c Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Guadalajara Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Sangre Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Heces Esputo Sangre Heces Aspirado bronquial Heces Heces Sangre Heces ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 67 7 81 1 ND 61 1 A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. veronii Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. veronii A. caviae A. veronii A. caviae A. hydrophila A. bestiarum A. salmonicida A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. caviae A. hydrophila A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii * A. veronii * A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. caviae A. veronii No Aeromonas A. veronii A. hydrophila A. caviae A. caviae A. hydrophila A. veronii 275 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 01/10/2008 01/10/2008 09/10/2008 14/10/2008 22/10/2008 04/11/2008 973c 974c 975c 976c 977c 978c 24787/c 24746/C 24073/v 26325/c 27680/c 28387/c Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Universitario Sant Joan Heces Heces Exudado herida Heces Heces Heces 8 61 19 66 31 0.9 Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. veronii A. caviae* A. veronii 11/11/2008 979c 28876/v Universitario Sant Joan Exudado herida 57 A. caviae Universitario Sant Joan, Reus (España); Universitario Miguel Servet, Zaragoza (España); Royo Vilanova, Zaragoza (España); Instituto Oswaldo Cruz, Río de Janeiro (Brasil); Joan XXIII, Tarragona (España); Universitario de Guadalajara, Guadalajara (España) 276 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO Anexo 2. Cepas de origen animal identificadas. Fecha 27/07/2006 28/07/2006 29/07/2006 30/07/2006 31/07/2006 01/08/2006 02/08/2006 07/09/2006 08/09/2006 10/09/2006 11/09/2006 12/09/2006 13/09/2006 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 01/10/2007 Cepa 616C 701/H 302/B6 302/891 206/Gb 701/B2 701/G 316/A 316/E 616L 12It 701/Ib 701G R1 R3 R41 R51 R61 R7 R8 R91 R10 R14 R16 R20 R21 R23 R24 R25 R26 R27 R29 1 Enviadas por Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Mª Cristina Ossiprandi Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Centro Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma Università degli Studi di Parma U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela Origen del aislamiento Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Exudado absceso de hígado bovino Salmón Lamprea Salmón Lamprea Boga Rodaballo ND Trucha Trucha Trucha Trucha Trucha Salmón Rodaballo Rodaballo Rodaballo Trucha Trucha Almeja japonesa Fenotipo A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas spp. A. hydrophila Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. hydrophila Aeromonas spp. A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. media A. veronii Aeromonas spp. A. hydrophila A. sobria A. salmonicida subsp. salmonicida A. salmonicida subsp. salmonicida A. salmonicida subsp. salmonicida A. salmonicida subsp. salmonicida A. salmonicida subsp. salmonicida A. hydrophila A. hydrophila A. salmonicida subsp. pectinolitica RFLP ADNr 16S A. veronii* A. allosaccharophila A. bestiarum/A. salmonicida A. media* A. eucrenophila A. media A. veronii A. salmonicida A. salmonicida A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. media Patron común Patron común Patron común A. media/A. veronii A. hydrophila A. media Patron común A. sobria A. sobria A. sobria A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. sobria Aeromonas spp. A. salmonicida 277 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 01/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 R30 R54 R55 R56 R57 R581 R59 R60 R61 R62 R63 R641 R65 R66 R67 R68 R69 R70 R71 R72 R73 R74 R75 R76 R77 R78 R79 R80 R81a R81b R81c R82 R83 R84 R85 1 1 1 Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela Almeja japonesa Lamprea Salmón Salmón Salmón Salmón Dorosoma cepedianum ND Trucha Salmón Salmón Trucha Trucha Trucha Rodaballo Salmón Trucha Trucha Trucha Trucha Trucha Salmón Lamprea Salmón Lamprea ND Lamprea Salmón Tilapia Tilapia Tilapia Trucha Trucha ND ND A. salmonicida subsp. pectinolitica A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. salmonicida Patron común A. bestiarum A. sobria A. bestiarum Patron común A. sobria A. hydrophila A. sobria Patron común Aeromonas spp. Patron común A. hydrophila A. hydrophila Patron común A. eucrenophila A. sobria A. sobria A. hydrophila Patron común A. sobria A. hydrophila A. eucrenophila A. sobria Patron común A. media Patron común Patron común A. sobria A. hydrophila A. sobria A. sobria A. sobria No Aeromonas No Aeromonas 278 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 15/10/2007 30/11/2005 R86 R87 R88 R89 R90 R91 R92 R93 R94 R95 R96 R97 R98 R99 R100 R101 R102 R103 R104 R105 R106 R107 R108 R109 R110 R111 R112 R113 R114 R115 R116 R117 R118 R119 A138/03 Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jesús Romalde Dr. Jens Teifke U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela U. Santiago de Compostela Friedrich Loeffler Institut ND ND ND ND Salmón Trucha Trucha ND ND Trucha Trucha Trucha Salmón Trucha Trucha Rodaballo Salmón ND ND ND ND ND Salmón Trucha ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Glándulas de la sal de pato Aeromonas spp. Aeromonas spp. Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. salmonicida A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. salmonicida A. salmonicida Aeromonas spp. Aeromonas spp. Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. salmonicida A. sobria Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. salmonicida A. salmonicida Aeromonas spp. Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. salmonicida Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. hydrophila No Aeromonas No Aeromonas No Aeromonas No Aeromonas A. salmonicida A. salmonicida Patron común Patron común A. hydrophila A. sobria A. sobria A. hydrophila/A. media A. hydrophila A. sobria A. hydrophila/A. media A. hydrophila A. salmonicida A. salmonicida No Aeromonas No Aeromonas No Aeromonas No Aeromonas A. salmonicida A. sobria No Aeromonas No Aeromonas A. salmonicida A. salmonicida No Aeromonas No Aeromonas A.salmonicida A. salmonicida No Aeromonas No Aeromonas A. hydrophila 279 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 30/11/2005 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 A40/04.1 A40/04.2 A7173/04 A138/05 A129/00.1 A78/04.1 A78/04.2 A227/1/00 A02/00 A129/00.2 A227/3700 A59/02 A100/02 A62/03 A180/04 Uni37 Uni38 CVM13880 CVM18887 CVM18888 CVM18889 CVM18890 CVM18893 CVM18894 CVM18895 CVM18896 CVM18897 CVM18898 CVM18899 CVM18900 CVM18901 CVM18902 CVM18903 CVM22667 CVM22668 Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Jens Teifke Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Friedrich Loeffler Institut Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Bacteriemia en una pitón reticulada Bacteriemia en una pitón reticulada Grulla muerta Corazón de buho Bazo de cerdo Becerro Becerro Amnion jabalí Endometrio de jabalí Pulmón de cerdo Feto de cerdo Lechón muerto Raya común Bacteriemia en un lechón Pulmón de oveja Pez carbonero Pez carbonero Trucha Salmón atlántico ND Trucha marrón Trucha marrón Trucha arcoiris Salmón rojo Lucio tigre Salmón atlántico Salmón plateado Amia Trucha de lago Lobina boca pequeña Salmón atlántico Salmón atlántico Salmón atlántico Raya común Salmón plateado A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. bestiarum A. hydrophila A. bestiarum A. bestiarum A. caviae A. bestiarum/A. salmonicida A. bestiarum/A. salmonicida A. bestiarum/A. salmonicida A. bestiarum/A. salmonicida A. media A. bestiarum/A. salmonicida A. bestiarum/A. salmonicida A. sobria A. bestiarum A. bestiarum A. sobria A. bestiarum/A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida 280 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 CVM22669 CVM22670 CVM22675 CVM22678 CVM22679 CVM22680 CVM33708 CVM33709 CVM33710 CVM33711 CVM33712 CVM33713 CVM33714 CVM33715 CVM33716 CVM33717 CVM33718 CVM33719 CVM33720 CVM33721 CVM33722 CVM33723 CVM33724 CVM33725 CVM33726 CVM33730 CVM33731 CVM33732 CVM33733 CVM33734 CVM33739 CVM33741 CVM33742 CVM33743 CVM33744 Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Salmón plateado Salmón plateado Trucha marrón Salmón chinook Lucio tigre Trucha arcoiris Trucha arcoiris Trucha marrón Trucha marrón Trucha marrón Trucha arcoiris Salmón plateado Trucha arcoiris Trucha marrón Salmón chinook Salmón Salmón Salmón Salmón Salmón Salmón Salmón Salmón Salmón Salmón ND Trucha de arroyo Trucha de arroyo Trucha de arroyo Trucha marrón Trucha marrón ND ND Trucha arcoiris Salmón rojo A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida subsp salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. ichthiosmia A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida 281 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 16/11/2004 CVM33746 CVM33747 CVM33752 CVM33753 CVM33777 CVM33778 CVM33779 CVM33785 CVM33786 CVM33787 CVM33788 CVM33789 CVM33790 CVM33791 CVM33794 CVM33795 CVM33955 Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Dr. Ron A. Miller Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Center of Veterinary Medicine Salmón rojo Trucha Salmón plateado Salmón plateado Salmón plateado Salmón plateado Salmón plateado Salmón plateado Salmón atlántico ND Amia Trucha marrón Trucha marrón Trucha marrón Salmón chinook Salmón chinook ND A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida ND A. salmonicida ND A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida A. salmonicida 282 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO Anexo 3. Cepas identificadas proporcionadas por diversos autores. Referencia URV A2-001 A2-002 A2-003 1 Referencia autor A2-001 A2-002 A2-003 A2-004 A2-005 Autor Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Origen Sangre Bilis Appendix Herida Sangre Sangre Sangre Sangre Esputo Herida Sangre Sangre Sangre Sangre Herida Esputo Herida Herida Sangre Ascites Sangre Herida Sangre Viginal discharge Herida Herida Herida Sangre Patología de base Coalingitis aguda Coalingitis aguda y pancreatitis Apendicitis Quemado Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Pneumonía Celulitis Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia-quemado Bacteriemia-quemado Pneumonía Quemado Trauma Quemadura química Lobectomía de hígado Coalingitis aguda y pancreatitis Celulitis Bacteriemia ND Quemado Diabetes Celulitis Bacteriemia Fecha recepción 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 Fenotipo A. hydrophila A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. trota A.sobria A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas spp. Aeromonas spp. A. caviae A. caviae A. veronii A. hydrophila A. hydrophila A. caviae A. hydrophila A. species A. hydrophila A. species A. hydrophila A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A. sobria 16S rDNA RFLP A. media No Aeromonas A. caviae A. aquariorum A. caviae A. caviae A. veronii A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila* A. caviae A. aquariorum A. caviae A. caviae No Aeromonas A. caviae A. caviae A. caviae No Aeromonas A. caviae A. caviae A. aquariorum A. caviae A. veronii A. media A. caviae No Aeromonas A2-0041 A2-005 A2-006 A2-007 A2-0081 A2-009 A2-010 A2-011 A2-012 A2-0131 A2-014 A2-016 A2-019 A2-021 A2-022 A2-025 A2-026 A2-027 A2-028 1 1 1 A2-006 A2-007 A2-008 A2-009 A2-010 A2-011 A2-012 A2-013 A2-014 A2-016 A2-019 A2-021 A2-022 A2-025 A2-026 A2-027 A2-028 A2-030 A2-036 A2-037 A2-039 A2-040 A2-041 A2-0301 A2-036 A2-037 A2-0391 A2-040 A2-041 1 283 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO A2-0421 A2-043 A2-044 A2-045 A2-046 A2-048 A2-049 A2-0501 A2-052 A2-053 A2-054 A2-0551 A2-0561 A2-057 A2-0581 A2-061 A2-062 A2-0631 A2-0641 A2-065 A2-066 A2-0671 A2-068 A2-0701 A2-071 A2-072 A2-073 A2-074 A2-076 A2-078 A2-079 1 1 1 1 A2-042 A2-043 A2-044 A2-045 A2-046 A2-048 A2-049 A2-050 A2-052 A2-053 A2-054 A2-055 A2-056 A2-057 A2-058 A2-061 A2-062 A2-063 A2-064 A2-065 A2-066 A2-067 A2-068 A2-070 A2-071 A2-072 A2-073 A2-074 A2-076 A2-078 A2-079 Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Sangre Esputo Esputo Sangre Sangre Sangre Ascites Herida Herida Herida Herida Sangre Sangre Ascites Herida Sangre Sangre Ascites Sangre Sangre Sangre Herida Herida Sangre Herida Herida Sangre Sangre Ear discharge Sangre Herida Bacteriemia Pneumonía Pneumonía Coalingitis aguda y pancreatitis Bacteriemia Fascitis necrotizante Peritonitis Quemado Cáncer Herida Herida Bacteriemia Bacteriemia Cáncer 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. caviae A. hydrophila A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas spp. A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. sobria A. sobria A. caviae A.caviae A. hydrophila A. caviae A. sobriae A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. sobria A.caviae A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A. caviae A. caviae* A. hydrophila A. caviae* A. caviae A. hydrophila A. veronii A. taiwanensis A. hydrophila A. aquariorum A. hydrophila A. aquariorum A. aquariorum A. caviae A. aquariorum A. aquariorum A. veronii A. veronii A. caviae* A. caviae A. hydrophila A. sanarellii A. hydrophila A. aquariorum A. hydrophila No Aeromona A. veronii A. caviae A. veronii A. hydrophila A. caviae Left forearm wd infection 03/06/2005 Bacteriemia SBP SBP Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Herida Herida Bacteriemia Herida Quemado Bacteriemia r/ o portA infection Otitis Bacteriemia Abceso 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 284 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO A2-080 A2-081 A2-084 A2-085 A2-086 1 A2-080 A2-081 A2-084 A2-085 A2-086 A2-087 A2-090 A2-091 A2-092 A2-093 1 1 Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Herida Herida Sangre Herida Herida Herida Herida Bilis Sangre Esputo Sangre Ascites Herida Sangre Sangre Herida Sangre Sangre Sangre Herida Bilis Bilis Bilis joint fluid Sangre Esputo Herida Esputo Bilis Esputo Sangre Herida Quemado Coalingitis aguda Herida Herida Quemado Celulitis Coalingitis aguda Bacteriemia Bacteriemia Apendicitis Quemado Celulitis Bacteriemia Fascitis necrotizante Bacteriemia SBP Bacteriemia Quemado Coalingitis aguda Colecistitis Coalingitis aguda Artritis Bacteriemia Pneumonía Abceso Fascitis necrotizante Coalingitis aguda ND cellulitis r/o catheter related 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas spp. A. hydrophila A. hydrophila A.caviae Aeromonas spp. A.caviae A. sobria A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A.caviae A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A.caviae A. hydrophila A. sobria A. sobria A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas spp. A. caviae A. hydrophila A. media A. trota A. aquariorum A. caviae A. caviae A. aquariorum A. veronii A. veronii A. aquariorum A. aquariorum A. caviae A. aquariorum A. media A. hydrophila A. caviae A. caviae A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. trota A. aquariorum A. aquariorum A. caviae A. hydrophila A. veronii A. veronii* A. aquariorum A. caviae A. caviae A2-0871 A2-090 1 A2-0911 A2-092 A2-093 A2-094 A2-096 A2-097 A2-098 A2-099 A2-103 A2-106 A2-107 A2-108 A2-109 A2-110 A2-111 A2-1121 A2-114 A2-116 A2-118 A2-120 A2-122 A2-1261 A2-127 A2-128 1 1 A2-094 A2-096 A2-097 A2-098 A2-099 A2-103 A2-106 A2-107 A2-108 A2-109 A2-110 A2-111 A2-112 A2-114 A2-116 A2-118 A2-120 A2-122 A2-126 A2-127 A2-128 285 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO A2-130 A2-1311 A2-132 A2-134 A2-135 A2-136 A2-137 A2-138 A2-139 A2-1401 A2-141 A2-143 A2-145 A2-149 A2-152 A2-153 A2-154 A2-1551 A2-156 A2-1571 A2-1591 A2-161 A2-162 A2-163 A2-166 A2-167 A2-200 A2-201 A2-203 A2-204 A2-206 A2-207 A2-130 A2-131 A2-132 A2-134 A2-135 A2-136 A2-137 A2-138 A2-139 A2-140 A2-141 A2-143 A2-145 A2-149 A2-152 A2-153 A2-154 A2-155 A2-156 A2-157 A2-159 A2-161 A2-162 A2-163 A2-166 A2-167 A2-200 A2-201 A2-203 A2-204 A2-206 A2-207 Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Herida Herida Herida Sangre Bilis Heces Sangre Herida Heces Esputo Sangre Herida Ascites Herida Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Herida Herida Herida Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Celulitis ND Herida Bacteriemia Coalingitis aguda ND Celulitis Herida ND ND Bacteriemia Herida SBP Quemado port A infection port A infection Bacteriemia Fascitis necrotizante Abceso Bacteriemia Colecstitis Bacteriemia Quemado Fascitis necrotizante Herida Quemado Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. sobria A. hydrophila A. sobria A.caviae A. sobria A. sobria A. hydrophila Aeromonas spp. A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A.caviae A. hydrophila A. sobria A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A.caviae A.caviae A. hydrophila A. aquariorum No Aeromonas No Aeromonas A. veronii* A. caviae A. veronii A. caviae A. veronii A. aquariorum A. veronii A. caviae No Aeromonas A. media A. caviae No Aeromonas A. veronii A. aquariorum A. hydrophila A. aquariorum A. aquariorum A. caviae A. caviae A. trota No Aeromonas No Aeromonas A. caviae A. caviae A. caviae No Aeromonas A. caviae A. caviae 286 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO A2-238 A2-2391 A2-248 A2-249 A2-264 A2-265 A2-9307091 A2-9307092 A2-9307093 O. 80 P. 28 1 1 1 A2-238 A2-239 A2-248 A2-249 A2-264 A2-265 A2-9307091 A2-9307092 A2-9307093 600647 601577 537785 632706 548824 552662 Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Wen Chien Ko Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Daniel Tena Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Bilis Sangre Exudado herida Sangre Sangre Exudado herida Orina Exudado herida Exudado herida Exudado herida quirúrgica Exudado herida Exudado herida quirúrgica Aspirado traqeobronquial Líquido perihepático Exudado herida quirúrgica Exudado absceso Exudado herida Exudado herida Fascitis necrotizante Fascitis necrotizante Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Bacteriemia Pneumonía Pneumonía Pneumonía Colelitiasis y cáncer Colédocolitiasis Cáncer Cirrosis hepática Diabetes Cáncer Diabetes mellitus Cáncer Cáncer Hemorragia Diabetes mellitus Diabetes mellitus Hemorragia ND 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 03/06/2005 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 18/04/2007 03/11/2007 A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. caviae A. caviae A. caviae A. veronii bv. sobria A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. veronii bv. sobria A. hydrophila A. caviae A. caviae A. hydrophila A. veronii bv. sobria A. veronii bv. sobria A. hydrophila A. caviae A. aquariorum A. caviae A. caviae A. aquariorum A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. hydrophila A. caviae* A. salmonicida* A. caviae* A. veronii * A. salmonicida* A. salmonicida* A. hydrophila* A. hydrophila* A. hydrophila* A. veronii A. hydrophila* A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila* A. veronni A. hydrophila A. veronii AC.55 1 AG.701 AI. 7 AJ. 831 AK. 72 1 120308 640870 640836 5001155 50027025 50029324 50030190 5505186 50066470 50059061 50049882 226365 AM. 111 AM. 10 AQ. 181 AZ. 28 AZ. 991 BA. 25 BB. 14 BJ. 3 1 BH. 13 BF. 24 226365 287 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO Anexo 4. Cepas de origen ambiental identificadas. Fecha 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 28/06/2006 12/07/2006 12/07/2006 12/07/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 20/12/2006 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 Cepa 1121 1122 1123 1124 1125 11261 1127 1128 11291 1130 1131 1132 1133 1134 1135 1136 1137 1138 1139 1140 1141 1142 1143 1144 1145 1146 1147 1148 1149 1150 1151 1153 1154 1156 1159 1160 1161 1162 1163 1164 1166 1171 1172 1173 1174 1176 1177 1178 1179 1180 1181 1 Origen Balsa regadío 1S Balsa regadío 1S Balsa regadío 1S Balsa regadío 1S Balsa regadío 1S Balsa regadío 1F Balsa regadío 1F Balsa regadío 1F Balsa regadío 1F Balsa regadío 2S Balsa regadío 2S Balsa regadío 2S Balsa regadío 2S Balsa regadío 2S Balsa regadío 2S Balsa regadío 2F Balsa regadío 3S Balsa regadío 3S Balsa regadío 3S Balsa regadío 3S Balsa regadío 3F Balsa regadío 4S Balsa regadío 4S Balsa regadío 4S Balsa regadío 4I Balsa regadío 4I Balsa regadío 4I Balsa regadío 4F Fuente llarga 1º Aflojamiento Rosario Pto 1/2 Rosario IOC 463/04 Aguas Amb. Brasil IOC 465/04 Aguas Amb. Brasil IOC 501/04 Aguas Amb. Brasil IOC 579/04 Aguas Amb. Brasil IOC 593/04 Aguas Amb. Brasil IOC 596/04 Aguas Amb. Brasil IOC 601/04 Aguas Amb. Brasil IOC 462/04 Aguas Amb. Brasil IOC 464/04 Aguas Amb. Brasil IOC 505/04 Aguas Amb. Brasil IOC 612/04 Aguas Amb. Brasil T0 Aeropuerto Reus T0 Aeropuerto Reus T0 Aeropuerto Reus T1a Aeropuerto Reus T1a Aeropuerto Reus T1b Aeropuerto Reus T1b Aeropuerto Reus T1b Aeropuerto Reus T2 Aeropuerto Reus Fenotipo Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Identificación molecular A. veronii A. veronii A. salmonicida / A. bestiarum A. veronii A. sobria A. veronii* A. veronii A. veronii A. media* A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii* A. veronii* A. veronii* A. veronii* A. veronii* A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii* A. bestiarum / A. salmonicida A. bestiarum A. veronii A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. veronii* A. caviae A. caviae A. media A. caviae A. hydrophila A. hydrophila A. media A. media A. hydrophila* A. hydrophila 288 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/09/2007 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 28/02/2008 17/03/2008 17/03/2008 17/03/2008 17/03/2008 17/03/2008 17/03/2008 17/03/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 11841 1185 1186 1187 1188 1189 1190 1191 1192 1193 1194 1195 1196 1201 1203 1204 1208 1209 1210 1211 1214 1216 1217 1218 1219 1220 1221 1222 1223 1224 1225 1226 1227 WB-2.1-131 WB-2.1-141 WB-2.3-161 WB-2.3-121 WB-2.3-17 1 T4 Aeropuerto Reus T4 Aeropuerto Reus T4 Aeropuerto Reus T5 Aeropuerto Reus T5 Aeropuerto Reus T6 Aeropuerto Reus T6 Aeropuerto Reus T8 Aeropuerto Reus T8 Aeropuerto Reus T8 Aeropuerto Reus T10 Aeropuerto Reus T10 Aeropuerto Reus T10 Aeropuerto Reus Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Agua Río Llobregat Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp Aeromonas sp A. veronii* A. veronii A. caviae A. caviae A. hydrophila A. media A. caviae A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. media A. veronii A. caviae A. media A. media A. media A. hydrophila A. media A. caviae A. sobria A. caviae A. caviae A. media A. media A. media A. media A. media A. media A. media A. caviae A. media A. encheleia A. encheleia A. encheleia A. encheleia A. encheleia A. bestiarum A. encheleia A. encheleia A. encheleia A. bestiarum A. encheleia A. bestiarum A. bestiarum A. bestiarum A. bestiarum A. encheleia A. bestiarum A. encheleia A. encheleia Aeromonas rivuli A. encheleia Riachuelo de 150 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 150 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 150 m aguas abajo A. encheleia Riachuelo de 150 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 150 m aguas abajo A. sobria Riachuelo de 150 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 150 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 150 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 150 m aguas abajo A. molluscorum Riachuelo de 250 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 250 m aguas abajo A. molluscorum Riachuelo de 250 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 250 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 250 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 250 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 250 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 250 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 250 m aguas abajo A. encheleia Riachuelo de 250 m aguas abajo A .encheleia Riachuelo de 350 m aguas abajo A. sobria Riachuelo de 350 m aguas abajo A. encheleia WB-2.3-291 WB-2.3-471 WB-2.3-481 WB-2.3-501 WB-3.1-29a1 WB-3.1-59 1 WB-3.1-671 WB-3.1-811 WB-3.2-31 WB-3.2-141 WB-3.2-54 1 WB-3.4-151 WB-3.4-351 WB-3.4-411 WB-4.1-191 WB-4.1-301 289 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 12/11/2008 WB-4.1-371 WB-4.1-611 WB-4.1-911 WB-4.1-1021 WB-4.2-101 WB-4.2-11 1 Riachuelo de 350 m aguas abajo A. encheleia Riachuelo de 350 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 350 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 350 m aguas abajo A. sobria Riachuelo de 350 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 350 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 350 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 350 m aguas abajo A. salmonicida Riachuelo de 350 m aguas abajo A. encheleia Riachuelo de 350 m aguas abajo A. sobria A. encheleia A. salmonicida A. encheleia A. encheleia A. salmonicida A. encheleia A. bestiarum A. bestiarum A. encheleia Aeromonas rivuli WB-4.4-371 WB-4.4-671 WB-4.4-951 WB-4.4-1011 Anexo 5. Cepas utilizadas en el estudio 4.1.1. Cepa MTCC3249T SH SLH CIP107797 CIP107798T CECT5864 CECT5865 CECT5866 CECT5867 CECT5868 IBS S6652 DSM 16559; CCUG 47378; IBS S6874 848T; CIP 108676; LMG 22214 93M; LMG 22215 431E; LMG 22216 849T; LMG 22217 869N; LMG 22218 Otras colecciones NCIM 5147T; LMG 21852; CIP 107763;CECT5761T Origen Mosquito Culex quinquefasciatus (India) Mosquito Aedes aegyptii (India) Mosquito Aedes aegyptii (India) Heces de mono sano Macaca fascicularis (Francia) Heces de mono sano Macaca fascicularis (Francia) Coquina (Donax trunculus) (España) Mejillón (Mytilus sp.) (España) Berberecho (Cardium sp.) (España) Coquina (Donax trunculus) (España) Navaja (Ensis sp.) (España) Especie A. culicicola A. culicicola A. culicicola A. simiae A. simiae A. molluscorum A. molluscorum A. molluscorum A. molluscorum A. molluscorum Anexo 6. Cepas utilizadas en el estudio 4.1.3. Cepa 75 89 115 706 721 733 757 761 808 104c 133c 134c 145c 162c 176c 204c 219c 261c 296c 315c 320c 356c Aislado ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico Origen St.Pere Pescador Cubelles Llobregat Bota Badalona Gava Llobregat Parc Litoral La Muga Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón ND Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Especie RFLP ADNr 16S A.caviae* A.caviae* A.caviae* A.caviae* A.caviae* A.caviae* A.caviae* A.caviae* A.caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* Numero patrón Identificación Nº acceso al GenBank asignado por rpoD ADNr 16S rpoD 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae FJ168776 EU488671 EU488667 EU488669 EU488666 EU488673 A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae FJ168775 EU488668 EU488675 EU488672 EU488670 A. caviae A. caviae A. caviae FJ168770 FJ168769 EU488677 EU488678 EU488661 290 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 359c 360c 462c 499c 555c 622c 694c 698c 782c 792c 793c 800c 805c 280 610 743 136c 225c 309c 370c 566c 770c 776c 777c 781c 808c 93c 98c 141c 317c 625c 633c 813c 236 922 924 925 938 974 975 750 796 39c 41c 43c 121c 153c 178c 741c 83 302c 542c 480 457c clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico ambiental ambiental ambiental clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental clinico clinico clinico clinico clinico clinico clinico ambiental clinico clinico ambiental clinico Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Sant Joan ND ND Miguel Servet Miguel Servet Miguel Servet Miguel Servet Miguel Servet Banyoles ND St. Simo Valle Hebrón La Concha Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Miguel Servet Miguel Servet Miguel Servet Miguel Servet Miguel Servet Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Royo Vilanova ND 422 Llobregat 422 Llobregat 422 Llobregat 425 Llobregat Pozo 18S Pozo 19S Rec Moli Emb. San Antonio Palma Palma Palma Valle Hebrón Valle Hebrón Valle Hebrón Sant Joan Castelldefels Valle Hebrón ND ND Valle Hebrón A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. jandaei* A. jandaei* A. media* A. veronii* A. jandaei* A. caviae* A. jandaei* A. jandaei* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. caviae* A. veronii* A. veronii* A. caviae* A. veronii* A. veronii* A. veronii* A. veronii* A. jandaei* A. jandaei* A. jandaei* A. jandaei* A. jandaei* A. jandaei* A. jandaei* A. veronii* A. allossaccharophila* A. veronii* A. veronii* A. veronii* A. caviae* A. veronii* A. veronii* A. veronii* A.caviae* A. caviae* A. media* A. veronii* 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 7 7 8 8 8 9 10 A. media A. veronii FJ168773 EU488696 AY308844[54 EU488642 A. veronii A. veronii A. media A. media EU488681 EU488694 EU488634 EU488653 EU488648 EU488658 A. media A. media A. media A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii A. caviae EU488685 EU488692 EU488697 EU488682 EU488683 EU488684 EU488646 EU488647 EU488652 EU488663 EU488654 EU488635 EU488636 EU488676 EU488639 A. media EU488680 A. caviae A. caviae A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii EU488693 EU488695 EU488686 EU488687 EU488637 EU488638 EU488674 EU488641 EU488655 EU488645 A. caviae EU488656 A. caviae EU488688 EU488640 A. media A. media AY308846[54] AY308847[54] A.caviae EU488660 A. caviae FJ168777 EU488662 A. caviae FJ168772 EU488659 A. caviae A. caviae EU488689 EU488690 EU488643 EU488644 A. caviae FJ168774 EU488665 291 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO 126c 616c 702c 786c 812c 807c clinico clinico clinico clinico clinico clinico Valle Hebrón ND Sant Joan Miguel Servet Royo Vilanova Miguel Servet A. jandaei* A. jandaei* A. jandaei* A. veronii* A. veronii* A. caviae* 11 11 11 11 11 12 A. veronii A. veronii A. veronii A. veronii EU488699 EU488650 EU488657 FJ168771 EU488691 EU488679 EU488664 EU488649 Anexo 7. Cepas utilizadas en el estudio 4.2.1. Identificación RFLP ADNr 16S Secuencia rpoD A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. caviae A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum A. aquariorum Cepa Centro de origen National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan National Cheng Kung University Hospital, Taiwan Hospital Comarcal Vega Baja, Orihuela, España Hospital Comarcal Vega Baja, , Orihuela, España Hospital Comarcal Vega Baja, , Orihuela, España Origen Patología Fenotipo A2.004 A2.013 A2.040 A2.042 A2.053 A2.056 A2.058 A2.061 A2.070 A2.086 A2.094 A2.096 A2.098 A2.107 A2.112 A2.114 A2.126 A2.131 A2.140 A2.155 A2.157 A2.159 MDC 562 MDC 573 MDC 671 Herida Sangre Herida Sangre Herida Sangre Herida Sangre Sangre Herida Sangre Ascites Sangre Sangre Bilis joint fluid Bilis Herida Esputo Sangre Sangre Sangre Heces Heces Heces Quemado Bacteriemia Celulitis Bacteriemia Herida Bacteriemia Left forearm wd infection Bacteriemia Bacteriemia Herida Bacteriemia Apendicitis con peritonitis celulitis SBP Coalingitis aguda septic arthritis Coalingitis aguda ND ND Fascitis necrotizante Bacteriemia Colecistitis aguda Diarrea Diarrea Diarrea A. hydrophila Aeromonas spp A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila Aeromonas spp A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila ND ND ND 292 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas ANEXO Anexo 8. Cepas utilizadas en el estudio 4.2.3. Especie A. salmonicida A. caviae Origen Absceso Orina Sangre Bilis Absceso Heces Cepa 361c 363c, 533c, 737c, *819c 19c, 224c, 290c, 431c, 535c, 600c, 664c, 759c 468c, 540c 25c 800c, 466c, 576c, 414c, 426c, 444c, 478c, 509c, 340c, 477c, 495c, 872c, 874c, 875c, 876c, 877c, 878c, 882c, 883c, 884c, 885c A. hydrophila Orina Sangre Herida Absceso Líquido úlcera Extra-intestinal Heces A. jandaei Sangre Heces A. media Orina Sangre Heces A. veronii Sangre Heces 366c 24c 221c, 758c 602c 603c 191c, 194c 825c, 506c, 364c, 482c, 887c 721c 891c 541c 717c 394c, 507c, 886c, 888c 187c, 195c, 22c, 283c, 568c, 362c 729c, 178c, 126c, 357c, 365c, 473c, 589c, 489c, 575c, 410c, 472c, 469c, 471c, 480c, 901c, 741c Se destacan en negrita las cepas que poseen el gen stx1 Anexo 9. Cepas utilizadas en el estudio 4.2.4. Identificación Cepa Centro de origen Hospital Universitario de Guadalajara. Hospital Universitario de Guadalajara Edad Fenotipo AQ.18 77 A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. hydrophila A. veronii bt sobria RFLP rDNA 16S A. hydrophila Secuencia rpoD A. hydrophila Cáncer de colon Diabetes mellitus y Colelitiasis Cáncer de recto Oclusión intestinal Cáncer de colon y diabeles mellitus Exudado de herida quirúrgica Exudado de herida quirúrgica (absceso de pared abdominal) Exudado de herida quirúrgica Exudado de herida quirúrgica Exudado de herida quirúrgica E. coli, Morganella morganii Si E. anaerogenes, E. faecalis Klebsiella pneumoniae, S. anginosus ND Patología de base Infección monomicrobiana Aislamiento BJ.3 80 A. hydrophila A. hydrophila Hospital Universitario de Guadalajara Hospital 226365 Universitario de Guadalajara AZ.99 22748 Hospital Royo Vilanova 81 A. hydrophila A. hydrophila 88 A. veronii A. veronii 62 A. veronii A. veronii 293 UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI TAXONOMÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL GÉNERO AEROMONAS Anabel Alperi Vega DL:T. 1022-2011 Taxonomía y Epidemiología del género Aeromonas BIBLIOGRAFÍA ABBOTT SL, CHEUNG WK, JANDA JM. 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