Novel mechanistic link between microtubule disruption and inhibition of tumor angiogenesis

Abstract

L'angiogènesis, el desenvolupament de nous vasos sanguinis a partir de vasculatura preexistent, és un procés complex que involucra múltiples productes gènics expressats per diferents tipus cel.lulars, i tots ells contribueixen a una seqüència integrada de fenòmens. L'angiogènesis és necessària per tal de permetre el creixement tumoral més enllà d'una certa mida. La hipòxia, un fenomen inherent en els tumors, és un dels factors principals que desencadena el procés angiogènic. En concordança amb el fet que la hipòxia juga un paper clau en tot el procés, un nombre elevat de gens involucrats en diferents processos de l'angiogènesis, incloent el factor de creixement de l'endoteli vascular (VEGF), responen de manera independent a la hipòxia. El principal mecanisme de resposta dels tumors a nivells reduïts d'oxigen és a través de l'activació del factor induïble per hipòxia-1 (HIF-1). HIF-1 és un heterodímer format per dues subunitats; el factor sensible a la hipòxia HIF-1&#61537;, i el factor no regulable HIF-1&#61538;. En presència d'oxigen, HIF-1&#61537; és hidroxilat i això permet la seva interacció amb la proteïna supressora de tumors Von Hippel Lindau (VHL) que produirà la seva subseqüent i ràpida degradació a través del proteasoma. En absència d'oxigen, HIF-1&#61537; és estabilitzat i és transportat cap al nucli cel.lular on heterodimeritza amb HIF-1&#61538;, unint-se llavors als llocs de resposta a la hipòxia (HRE) i activant la transcripció de nombrosos gens que juguen un paper fonamental en la supervivència tumoral, l'adaptació metabòlica i l'angiogènesis.<br/>Per tant, el desenvolupament d'agents capaços d'inhibir l'angiogènesis ha esdevingut una important modalitat terapèutica. Fruit dels bons resultats en estudis preclínics, diversos agents antiangiogènics sols o en combinació amb teràpies convencionals estan en fase de desenvolupament clínic. Entre aquests agents trobem el 2-Metoxiestradiol (2ME2), un metabolit natural de l'estradiol, actualment en avaluació clínica com a inhibidor de l'angiogènesis tumoral. Diversos estudis han demostrat que el 2ME2 és una molècula petita, mot ben tolerada i que posseeix activitats antitumorals i antiangiogèniques en diferents models in vivo. In vitro, el 2ME2 és capaç d'unir-se a la tubulina al lloc d'unió a la colchicina i despolimeritzar els microtúbuls en interfase, produint arrest en mitosi i la posterior mort cel.lular en línies cel.lulars tumorals. A més a més, s'ha mostrat l'abilitat de diferents agents amb capacitat per inhibir la funció dels microtúbuls, sobretot d'aquells que s'uneixen al lloc d'unió a la colchicina, per fer desaparèixer ràpidament la vasculatura tumoral. Tot i això, encara que s'han proposat diferents mecanismes d'acció per al 2ME2, el seu mecanisme d'acció encara no està ben definit. La nostra hipòtesi és que el 2ME2 inhibeix l'angiogènesis tumoral mitjançant la inhibició del factor de transcripció HIF-1 un cop ja ha exercit els seus efectes sobre el citoesquelet de microtúbuls. Així doncs, l'objectiu del nostre estudi va ser I) caracteritzar el mecanisme a nivell molecular pel qual el 2ME2 inhibeix el HIF-1 i l'angiogènesis, i II) investigar si hi ha cap relació causa-efecte entre les propietats antiangiogèniques i anti-tubulina del 2ME2. <br/>El nostre treball demostra que el 2ME2 inhibeix l'angiogènesis tumoral mitjançant la inhibició dels nivells proteics del factor HIF-1&#61537; així com la seva activitat transcripcional, incloent la transcripció del VEGF, en diverses línies cel.lulars. El 2ME2 no indueix la degradació proteica a través del proteosoma ni tampoc redueix els nivells d'ARNm del HIF-1&#61537;, sinó que més aviat inhibeix la síntesi proteica de novo. Notablement, hem mostrat que el 2ME2 inhibeix el factor HIF-1 amb posterioritat a la disrupció del citoesquelet de microtúbuls aportant sòlides proves que afavoreixen una relació funcional entre els efectes anti-angiogènics i la disrupció dels microtúbuls. Aquests efectes no són una propietat única del 2ME2 sinó que és compartida per altres agents que actuen sobre els microtúbuls, com ara el taxol i la vincristina, suggerint un mecanisme d'acció semblant per a tots aquests agents. Finalment, la nostra investigació demostra per primera vegada que el 2ME2 inhibeix l'angiogènesis en dosis que són eficaces despolimeritzant els microtúbuls in vivo. Així doncs, el nostre treball aporta la primera demostració d'una associació mecanística entre la disrupció del citoesquelet de microtúbuls i la inhibició de l'angiogènesis a través del factor de transcripció HIF-1 i dóna suport a la hipòtesis que els agents que actuen sobre la tubulina inhibeixen tant el creixement tumoral com la vascularització tumoral amb posterioritat a la disrupció del citoesquelet de microtúbuls. Una caracterització més exhaustiva dels senyals que tenen lloc a nivell molecular entre la disrupció del citoesquelet de microtúbuls i l'angiogènesis mediada pel factor de transcripció HIF-1&#61537;, molt possiblement doni lloc a la identificació de noves dianes per al desenvolupament de noves estratègies terapèutiques.

Angiogenesis, the development of new vessels from preexisting vasculature, is a complex process involving multiple gene products expressed by different cell types, all contributing to an integrated sequence of events. Angiogenesis is required to support tumor growth beyond a certain threshold size. Inherent tumor hypoxia is one of the major factors triggering angiogenesis and consistent with a major role for hypoxia in the overall process, a large number of genes involved in different steps of angiogenesis, including vascular endothelial growth factor (VEGF), are independently responsive to hypoxia. The primary mechanism of tumor response to reduced oxygen levels is via activation of hypoxia inducible-factors-1 (HIF-1). HIF-1 is a heterodimer consisting of two subunits; the labile hypoxic responsive factor, HIF-1&#61537;, and the non-regulated factor HIF-1&#946;. In the presence of oxygen, HIF-1a is hydroxylated, allowing its interaction with the tumor suppressor protein Von Hippel Lindau (VHL) and its subsequent and rapid degradation by the proteasome. Following hypoxic stabilization, HIF-1&#61537; is translocated to the nucleus. There it heterodimerizes with HIF-1&#61538; and binds to hypoxia-response elements (HREs), activating the transcription of numerous genes important for cancer survival, metabolic adaptation to hypoxia and angiogenesis. <br/>Therefore, the development of agents that inhibit angiogenesis are attractive therapeutic options. Based on successful preclinical data, several anti-angiogenic agents alone or in combination with conventional therapies are now in clinical trials. Among these agents is 2-methoxyestradiol (2ME2), a natural occurring derivative of estradiol, currently undergoing clinical evaluation as an inhibitor of tumor angiogenesis. 2ME2 has been shown to be a well-tolerated small molecule posses antitumor and antiangiogenic activity in different in vivo models. In vitro, 2ME2 has been shown to compete with colchicine for tubulin binding and to disrupt interphase microtubules leading to mitotic arrest and cell death in cultured cancer cells. Furthermore, the ability of microtubule-targeting agents, especially those binding to the colchicine site, has been shown to rapidly shut down existing tumor vasculature. Although several mechanism have been proposed for 2ME2 activity, its mechanism of action still remains unclear. Our hypothesis is 2ME2 inhibits tumor angiogenesis by targeting the HIF pathway downstream of its effects on the microtubule cytoskeleton. Therefore, in this study we seek to I) characterize the molecular mechanism by which 2ME2 inhibits HIF-1 and angiogenesis, and II) Investigate whether there is cause-effect relationship between 2ME2's antiangiogenic and anti-tubulin properties. <br/>Our work demonstrated that 2ME2 inhibits tumor angiogenesis by effectively inhibiting HIF-1&#945; levels and transcriptional activity, including transcription of VEGF, in a variety of human cancer cell lines. 2ME2 does not induce proteasomal degradation of HIF-1 nor does it reduces HIF-1 mRNA levels, but rather inhibits the de novo HIF-1 protein synthesis. Notably, we showed that 2ME2 inhibits HIF-1&#945; downstream of disruption of the microtubule cytoskeleton, providing solid proof of a functional relationship between the antitubulin and antiangiogenic effects of 2ME2. These effects of 2ME2 are not unique but rather shared by other microtubule-targeting drugs, such as taxol or vincristine, suggesting a common mechanism of action for all microtubule-targeting drugs. Finally, our findings demonstrate for the first time that 2ME2 inhibits angiogenesis at doses are efficacious disrupting microtubules in vivo. Herein, our work provides the first demonstration of a mechanistic link between disruption of the microtubule cytoskeleton and inhibition of tumor angiogenesis via the HIF-pathway and supports the hypothesis that tubulin-targeting drugs inhibit both tumor cell growth and tumor vascularization following disruption of the microtubule-cytoskeleton. The further characterization of the molecular signal linking the disruption of the microtubule-cytoskeleton with the downregulation of the HIF-mediated angiogenesis, are likely to identify novel targets for the development of new anticancer therapies.