Sequence-Dependent nucleosome positioning and chromatin remolleing of hormone-responsive genes

Abstract

Evidències recents han remarcat la importància del paper de l'estructura de la cromatina i el posicionament de nucleosomes en processos cel·lulars bàsics com és la regulació de la transcripció gènica. L'avenç de noves tecnologies en el camp ha permès l'estudi detallat de la disposició de nucleosomes en genomes sencers. Hi ha hagut també molts intents per definir les característiques de la seqüència de l'ADN que podrien arribar a guiar el posicionament dels nucleosomes; sent el conjunt d'aquestes característiques l'anomenat "codi nucleosòmic". En la present tesis doctoral, s'aporten evidències experimentals sobre l'existència d'un grup de nucleosomes molt ben posicionats en el genoma humà. Això ha estat possible mitjançant tècniques com els microarray i la seqüenciació massiva en paral·lel. Aquest treball mostra com aquests nucleosomes, que anomenem "nucleosomes clau", tenen tendència a ocupar regions del genoma amb funcions específiques, la qual cosa indica el seu paper especial. L'ADN els "nucleosomes clau" resulta tenir una alta simetria de curvatura. Aquesta característica inherent a la seqüència fa que sigui possible la predicció in silico de les posicions de nucleosomes d'aquest tipus. En la segona part de la present tesi doctoral, aporto noves evidències experimentals que fan avançar el camp de la organització de la cromatina i la seva dinàmica en el context de la regulació gènica. Les hormones esteroidees indueixen la transcripció dels seus gens diana a través de la unió dels receptors hormonals amb els seu corresponent motiu de reconeixement a l'ADN (HREs), així com el reclutament d'una gran varietat de co- eguladors. El promotor del Virus de Tumor Mamari de Ratolí (MMTV) ha estat un model molt usat per l'estudi dels efectes en l'activació gènica dels receptors hormonals. És conegut que el receptor de progesterona (PR) s'uniex a l'HRE1, accessible, i recluta maquinàries de remodelament de la cromatina que utilitzen l'ATP com a font energètica per expulsar els dimers d'histones H2A/H2B del nucleosoma B del promotor de l'MMTV. Aquí demostro que la màquinaria de remodelament reclutada és específicament BAF. Treballs anteriors van demostrar que la kinasa Msk1 és la responsable de la fosforilació de la serina 10 de la histona H3. En aquesta tesi es demostra que l'acetilació de la Lysina 14 de la histona H3 és essencial per l'activació del promotor, així com per l'anclatge de BAF. Després de l'expulsió dels dimers d'H2A/H2B, la unió d'NF1 al promotor és indispensable per estabilitzar la forma remodelada del nucleosoma. Per l'estudi en més detall de l'activació del promotor de l'MMTV he utilitzat el sistema de minicromosomes, mononucleosomes i tetràmers d'histones H3/H4 reconstituïts en seqüències salvatges i mutants del promotor de l'MMTV. He demostrat que, només quan un fragment de la seqüencia de l'MMTV està reconstituïda en tetràmers, el PR i l'NF1 poden estar units simultàniament a la seva seqüència de reconeixement en el promotor. També aporto evidències on es demostra que la unió d'NF1 al promotor facilita la posterior unió de més mol·lècules de PR als HREs interns (llocs 2 i 3) caracterizant en més detall el sinergisme funcional que existeix entre el PR i l'NF1 en aquestes condicions.

Evidence has been accumulating over the last few years pointing to the importance of chromatin structure and nucleosome positioning in cellular processes such as transcriptional regulation. Recent technological advances in the field have allowed the construction of detailed genome-scale maps of nucleosome positions, and there have been several attempts to define the sequence characteristics that guide the positioning of nucleosomes, the so-called "nucleosome code". In this thesis I give experimental evidence for the existence of a subset of very well-positioned nucleosomes in the human genome based on nucleosome-resolution tilling arrays and on deep sequencing of MNase-digested chromatin using the Solexa-Illumina platform. I show that these nucleosomes, which we have named "key nucleosomes", tend to occupy genomic locations of specific function, indicative of their special role. The DNA of these "key nucleosomes" exhibits a high symmetry of curvature, allowing their precise position on the human genome to be predicted in silico based on the structural attributes of the primary DNA sequence. The second part of this thesis provides new insights into the importance of chromatin organization and dynamics in the context of gene regulation. Steroid hormones induce transcription of their target genes by a complex mechanism requiring binding of the hormone receptors to hormone responsive elements (HREs) and the recruitment of a variety of coregulators. The Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) promoter has long been used as a model for the study of hormone receptormediated gene activation. It is known that progesterone receptor (PR) binds the exposed HRE1 of the MMTV promoter chromatin and recruits chromatin remodellers that catalyse ATP-dependent histone H2A/H2B displacement. I show that the ATP- ependent chromatin remodelling complex BAF, but not PBAF, is recruited after hormone treatment and is necessary for MMTV promoter activation. Along with the previously reported osphorylation of H3S10 by Msk, I show that an early PCAF- ediated acetylation of H3K14 is essential for the activation of the promoter by anchoring the BAF complex. Following transient displacement of H2A/H2B dimers, binding of NF1 is required for stabilizing the remodelled conformation of the MMTVnucleosome. To further study the activation process I have used MMTVminichromosomes, mononucleosomes and H3/H4 tetramer particles reconstituted on wild type MMTV and MMTV promoter fragments with point mutations disrupting binding of PR and NF1. I show that only when MMTV sequences are assembled on H3/H4 tetramer particles can PR bind to all five HREs while allowing NF1 access to its cognate site. Furthermore, I found that binding of NF1 facilitates access of PR to the central HREs 2 and 3, thus contributing to the reciprocal synergism between PR and NF1.