Detección de ADN tumoral y análisis del gen de la tubulina en el suero de pacientes intervenidos de cáncer de pulmón no microcítico

Abstract

El cáncer de pulmón de célula no pequeña es una patología de gran trascendencia sanitaria mundial. Aproximadamente 11 millones de personas en el mundo mueren de cáncer de pulmón cada año, y en un 80% de los casos, es debido a cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). El tratamiento del CPNM estadio I-IIIA no está bien establecido y los factores pronósticos actuales (estado basal del paciente, clasificación TNM) son claramente insuficientes como factores predictivos.<br/>Los objetivos de este trabajo son determinar la posibilidad de aislar el ADN tumoral en el suero de pacientes con CPNM estadio I-IIIA intervenidos quirúrgicamente, y valorar el significado de este hallazgo; y segundo, estudiar las mutaciones del gen de la b-tubulina en el ADN genómico de los pacientes, y determinar su importancia como factor pronóstico de CPNM.<br/>Se estudió una serie de 52 pacientes intervenidos de CPNM estadio I-IIIA en el Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. Se aisló sangre periférica de los 52 pacientes y de 112 individuos sanos utilizados como muestra control. Se procedió a (1) aislar y cuantificar el ADN sérico, mediante un espectrofotómetro, y (2) se amplificó el gen de la b-tubulina mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y se estudiaron las mutaciones de dicho gen por secuenciación directa de los productos de la PCR. Los resultados se correlacionaron con la evolución clínica de los pacientes. <br/>Se detectó ADN en el suero de todos los pacientes con una concentración media de ADN sérico de 7.5 µg/mL, frente a una concentración media de 3.6 µg/mL en los individuos sanos (p= 0.0001). La concentración media de los pacientes que presentaban mutación en el gen de la b-tubulina era similar a la de los pacientes sin mutación. El estudio del gen de la b-tubulina mostró la presencia de mutaciones en 21 de 52 pacientes (40%). Todas las mutaciones se encontraron en el exón 4 del gen de la b-tubulina, y localizadas en dos regiones principales que llamamos región 1 y región 2. Las mutaciones en la región 1 (codones 102-264, en la zona de unión al GTP) mostraban una tendencia hacia una peor supervivencia, frente a las mutaciones localizadas en la región 2 (codones 277-425, región más superficial de la proteína) que tenían una tendencia hacia una mejor supervivencia.<br/>Por tanto, en la práctica clínica, disponemos de una muestra tumoral fácilmente accesible (ADN sérico) que nos permite estudiar parámetros biomoleculares (gen de la b-tubulina) como marcadores pronósticos en pacientes afectos de CPNM.

Lung cancer is among the most commonly occurring malignancies in the world. Approximately one million people worldwide die from lung cancer each year, and 80 percent of all cases are non-small-cell lung cancer (NSCLC). Treatment in NSCLC is not well established, and the actual prognostic factors (performance status and TNM stage) are clearly insufficient as predictive factors. <br/>The purposes of this study were to determine tumor-derived serum DNA in resected NSCLC stage I-IIIA and to correlate the results with clinical outcome; and second, we evaluated whether b-tubulin mutations could be detected in serum DNA and whether they could be a prognostic marker in human NSCLC.<br/>Fifty-two stage I-IIIA non-small-cell lung cancer patients from the Hospital Universitario Germans Trias i Pujol were included in this study. DNA was extracted from the patients' serum as well as from the serum of 112 healthy control subjects. We have first isolated serum DNA and then we have quantified the serum DNA with a spectrophotometer, and (2) b-tubulin gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and b-tubulin mutations were detected by direct sequencing of the PCR product in both directions. Results were correlated with clinical outcome.<br/>We detected serum DNA in all patients; the median concentration of soluble DNA in serum was 3.6 µg/ml in control subjects and 7.5 µg/ml in patients (p= 0.0001). The median concentration for patients with b-tubulin mutations was similar to that for patients without mutations. b-tubulin mutations were detected in serum DNA from 21 of 52 patients (40 percent). b-tubulin mutations were detected in exon 4 and clustered in two main domains that we called region 1 and 2. Mutations in region 1 (codons 102-264, near or at the GTP binding sites) were associated with a tendency forward worse survival; and mutations in region 2 (codons 277-425, located at the surface of the protein) were associated with better survival. <br/>In conclusion, in the clinical practice, we can easily isolate tumor-derived DNA from the serum/plasma of patients with resected stage I-IIIA NSCLC, and therefore we can study bio molecular parameters (b-tubulin gene) as a prognostic marker in NSCLC.